CN115304571B

CN115304571B - 一种利用药蜀葵制备高纯度槲皮素的方法

Info

Publication number: CN115304571B
Application number: CN202211071786.7A
Authority: CN
Inventors: 杨建刚; 任建平; 李晓杰; 王惟; 郭珮怡; 麻纪斌; 倪亚会; 翟帆
Original assignee: Medicine Research Institute Of Shaanxi Pharmaceutical Holding Cooperation
Current assignee: Medicine Research Institute Of Shaanxi Pharmaceutical Holding Cooperation
Priority date: 2022-09-02
Filing date: 2022-09-02
Publication date: 2024-03-12
Anticipated expiration: 2042-09-02
Also published as: CN115304571A

Abstract

本发明公开了一种利用药蜀葵制备高纯度槲皮素的方法：取药蜀葵根茎干品进行水提除杂、醇提、脱色后调节pH为11左右，经静置沉淀后进行减压浓缩获得总黄酮粗品；总黄酮粗品洗至中性后采用甲醇‑5％盐酸溶液水解，过滤，将滤液上样于高压制备液相色谱柱，在紫外检测器监测下经甲醇‑0.5％磷酸溶液洗脱并收集洗脱液，再经减压浓缩、水洗、干燥，即得到产物。本发明制得的槲皮素纯度高达98％以上，并且工艺运行成本低、环境友好，适合工业化生产。

Description

一种利用药蜀葵制备高纯度槲皮素的方法

技术领域

本发明属于天然产物提取分离技术领域，涉及一种从药蜀葵中提取分离槲皮素的方法。

背景技术

药蜀葵(Althaea officinalis Linn.)是锦葵科、蜀葵属多年生直立草本植物。药蜀葵一般以根入药，功效包括解表散寒、利尿、止咳、消炎解毒(《新疆百科知识辞典》)；具有较好的祛痰、止咳作用，并有一定的平喘作用，此外还具有降血压、增强毛细血管抵抗力、减少毛细血管脆性、降血脂、扩张冠状动脉，及增加冠状动脉血流量等作用。药蜀葵可以用于治疗慢性支气管炎，对冠心病及高血压也有辅助治疗作用。

在利用植物原材料提取分离槲皮素时，有报道对经硅胶柱层析分离的总黄酮，采用酸水解-重结晶工艺进行处理(CN103467425A)，但该处理工艺的槲皮素收率低(约0.001％)、制备周期长。还有报道在通过酶解辅助溶剂提取总黄酮后，直接采用硅胶柱层析分离槲皮素，但使用的有机溶剂种类多(CN104530022A)，而且在制备过程中杂质较难完全去除。

已有报道涉及药蜀葵总黄酮的提取分离方法(药蜀葵中总黄酮提取工艺优化及其生物活性研究.中南药学,2022,20(02):334-339)，并且通过对乙醇回流提取的总黄酮粗品采用大孔树脂吸附等分离纯化手段进行处理，结果表明槲皮素是药蜀葵总黄酮的主要组分之一(CN101757058A)，但采用这些提取分离方法尚无法获得高纯度的槲皮素。

另外，药蜀葵中含有大量具有较强极性的多羟基物，例如鞣质等，这些物质在乙醇溶液中易溶解、不易去除，影响提取进程和质量，尤其是采用制备色谱进行分离时，随色谱柱压力升高，鞣质存留于色谱柱中、无法全部清除，造成色谱柱堵塞，降低色谱柱寿命。

目前亟待提高从药蜀葵中提取分离槲皮素的效率。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用药蜀葵制备高纯度槲皮素的方法，该方法操作简单、分离时间短、成本低、所制得产物槲皮素纯度高，并且槲皮素的收率高。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

1)将取自药蜀葵的原材料于水进行浸提以除去该原材料中含有的糖类、部分鞣质等水溶性杂质，然后于醇溶液中进行浸提，得到提取液；

2)用非极性吸附剂处理提取液以除去脂溶性杂质，然后在加入的碱性试剂作用下使溶解在提取液中的杂质析出，然后通过溶液的蒸发使提取液中的黄酮类物质析出，得到总黄酮粗品；

3)将总黄酮粗品用酸化醇试剂水解，得到水解液；

4)将水解液中的槲皮素通过硅胶柱层析进行分离。

优选的，所述步骤1具体包括以下步骤：

1.1预处理

将利用药蜀葵的根或/和茎(茎带有皮)加工形成的药材成品，提前用水洗涤干净，晾干，得原材料；

1.2水提除杂

将原材料以水为溶剂提取1～3次，每次提取后过滤并收集料渣；进行水提除杂时，每次提取中水的用量(mL)为所述原材料质量(g)的10～15倍(即液固比为10～15)，提取时间为1～2小时/次，提取温度为90～100℃；

1.3醇提

将料渣以浓度75％(质量分数)以上的乙醇溶液为溶剂提取2～3次，每次提取后过滤，将滤液合并，得到乙醇提取液；进行醇提时，每次提取中乙醇溶液的用量(mL)为所述原材料质量(g)的6～12倍(即液固比为6～12)，提取时间为1.5～2小时/次，提取温度为60～85℃。

优选的，所述步骤2具体包括以下步骤：将提取液(例如上述乙醇提取液)用活性炭进行若干次(例如1～3次)脱色后调节pH至碱性并进行醇沉除杂，然后减压浓缩并收集析出的不溶物(简称析出物)。

优选的，所述脱色的条件包括：每次加入提取液(例如上述乙醇提取液)质量0.3％～1.0％的活性炭，搅拌吸附时间为15～60分钟/次，吸附温度为40～80℃。

优选的，所述提取液(例如上述乙醇提取液)经过脱色后用0.5～1.0mol/L氢氧化钠溶液调节pH为9～11，然后静置8～12小时，通过过滤去除静置中生成的沉淀后将滤液减压浓缩(在40～60℃下，真空度达到0.09～0.15Mpa)至原体积(即滤液浓缩前体积)的1/5～1/3，然后再通过过滤将析出物(即总黄酮粗品)分离。

优选的，所述步骤3中，酸化醇试剂为甲醇与3％～10％(质量分数)盐酸溶液按照体积比(30～60):(40～70)混合形成的液体(例如甲醇-5％盐酸溶液)。

优选的，所述步骤3中，水解的条件包括：料液比(总黄酮粗品:酸化醇试剂)为1:10～30(g/mL)，水解时间为0.5～2.0小时，水解温度为50～80℃。

优选的，所述步骤3还包括以下步骤：在水解前将总黄酮粗品洗至pH为6～8。

优选的，所述步骤4具体包括以下步骤：将水解液上样于高压制备液相色谱柱，上样后以甲醇-磷酸溶液为流动相，并以10～200mL/min的速度洗脱30～40min，将收集的洗脱液减压浓缩(在40～60℃下，真空度达到0.09～0.18Mpa)并对析出物依次进行水洗、干燥；其中，甲醇-磷酸溶液为甲醇与0.2％～0.8％(质量分数)磷酸溶液按照体积比(55～65)：(35～45)混合形成的液体(例如甲醇-0.5％磷酸溶液)。

优选的，所述色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，十八烷基硅烷键合硅胶的粒径为5～20μm、孔径为

优选的，所述色谱柱的柱长为10～30cm、直径为2～15cm，采用分次上样，水解液上样量为10～20mL/次。

优选的，所述洗脱中采用紫外检测器在线监测产物(即槲皮素)和杂质的分离(色谱分离中，槲皮素峰型比较对称，但峰没有达到基线分离，故在峰开始上升时收集，峰下降至整个峰高的五分之一至六分之一时结束收集)。

优选的，所述色谱柱柱效降低后，用质量分数3％～7％的盐酸溶液进行活化再生，然后用质量分数2％～5％的乙腈溶液清洗色谱柱上多余的氯离子。

优选的，所述步骤4中，水洗的温度为80～100℃(用这样温度的热水可以让水溶性物质更好的溶解，从而更容易去除这部分残余杂质，同时起到去除流动相成分残留的作用；槲皮素难溶于该热水，所以不会造成槲皮素损失)，干燥的温度为50～80℃。

本发明的有益效果体现在：

本发明通过采用浸提、吸附、硅胶柱层析等提取分离手段，并优化溶剂和提取分离路线，实现了从药蜀葵中制得纯度高达98％以上的槲皮素。本发明能快速分离得到槲皮素，并且槲皮素损失小，收率明显提高。本发明在提取分离槲皮素中使用的有机溶剂种类少、产生的废料少，具有环境友好的特点，适合工业化生产。

进一步的，本发明通过调节脱色后提取液至碱性，使得鞣质等杂质难以再溶于醇类溶剂中，可以通过静置沉淀、过滤，除去这些杂质，从而提高分离效率、延长下游工艺设备寿命。

进一步的，本发明通过实验确定了采用一定浓度稀盐酸酸化的甲醇为水解试剂，同时，通过控制甲醇和稀盐酸的比例以及总黄酮用量，保证加入的总黄酮能全部溶解，并将其中所有的苷水解成苷元(槲皮素为苷元)，从而提高分离效率。

进一步的，本发明将高压制备液相色谱分离技术首次应用于药蜀葵中槲皮素的提取分离中，采用填料为硅胶的色谱柱(例如使用十八烷基硅烷键合硅胶为填料)，分离过程中只使用甲醇-磷酸溶液这一种色谱体系的流动相进行恒流等速等梯度洗脱，不仅柱效高，而且可以通过在线监测精确收集产物，使得产物的分离过程简单快捷，在进行一次洗脱后就可以分离出高纯度的槲皮素。另外，所需的流动相体积小，并且流动相的溶剂在洗脱后可回收利用，降低了整个工艺的成本。

附图说明

图1为本发明实施例中分离得到的槲皮素的HPLC测定色谱图(最右侧的峰为槲皮素)。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明，所述实施例仅用于解释本发明，而非对本发明保护范围的限制。

(一)药蜀葵根茎干品、试剂及实验仪器

1.药蜀葵根茎干品

采购于药材市场，为含有根及茎的饮片产品，水分小于10％。

2.试剂

提取分离中使用的氢氧化钠、乙醇、甲醇、盐酸、磷酸均为分析纯，纯水为二次重蒸水；HPLC定量分析中使用的乙腈为色谱纯。

3.实验仪器

大直径(8cm)制备柱为安捷伦高压色谱柱，柱填料为十八烷基硅烷键合硅胶(粒径为5μm、孔径为)，高压制备液相系统为安捷伦公司产品，紫外检测器为安捷伦公司产品，自动馏分收集器为安捷伦公司产品，高效液相色谱仪为Waters生产。

(二)从药蜀葵中提取分离高纯度槲皮素的方法

实例1

1)取药蜀葵根茎干品1Kg，用水洗涤干净，晾干后加入到10L纯水中，加热煮沸1.5小时，倾去水煮液并滤出料渣；将料渣用90％乙醇溶液分3次加热回流，每次90％乙醇溶液用量为6L，加热温度为65℃，回流时间为1.5小时，回流结束后过滤，合并各次所得滤液，得乙醇提取液；

2)在乙醇提取液中加入该提取液质量0.3％的活性炭，在50℃下搅拌吸附1小时进行脱色，然后滤除活性炭；用1.0mol/L氢氧化钠溶液调节脱色后的乙醇提取液的pH为11左右，静置12小时后通过过滤去除沉淀(含鞣质等杂质)，将过滤沉淀后所得滤液减压浓缩(在60℃下，真空度达到0.09Mpa)至浓缩前体积的1/3左右(5L)，过滤大量析出的不溶物，滤出的不溶物即为总黄酮粗品(8.6g，收率为0.86％)；

3)将8.6g总黄酮粗品用纯水洗至中性(总黄酮粗品加入纯水中后搅拌、过滤出不溶物；如此重复洗几次即可)后，用100mL甲醇-5％盐酸溶液(甲醇:5％盐酸溶液的体积比为50:50)溶解，加热(80℃)回流1小时，趁热过滤以除去不溶物(含水解后残留物、不溶于甲醇的杂质等)，将所得滤液(即水解液)作为上样液；

4)将上样液分次上样于高压制备液相进行分离，每次上样10mL样品，色谱柱柱长为10cm；以甲醇-0.5％磷酸溶液为流动相，以20mL/min的速度恒流洗脱，所述流动相中甲醇与0.5％磷酸溶液的体积比为55:45；

5)在紫外检测器监测下(检测波长为360nm)，依据色谱出峰时间进行分段收集，通过软件观察色谱峰，在8.4min槲皮素产物峰上升，在槲皮素对应峰开始上升时通过自动馏分收集器进行收集，具体收集时间从槲皮素对应峰上升阶段的8.45分钟开始，当该峰下降至整个峰高的六分之一时结束收集；30min后结束本次洗脱，进行重复上样及收集，直至上样液进样完毕，将收集的洗脱液在旋转蒸发仪中回收溶剂，待洗脱液减压浓缩(在60℃下，真空度达到0.09Mpa)至无甲醇味后将析出的不溶物滤出，再用沸蒸馏水水洗，然后干燥(80℃)，得到0.63g粉末；通过高效液相色谱法(HPLC)定量分析表明，粉末中槲皮素含量为98.9％，同时计算表明槲皮素收率为0.063％(相对于药蜀葵根茎干品，相对于总黄酮收率为7.3％)。

实例2

1)取药蜀葵根茎干品1Kg，用水洗涤干净，晾干后加入到12L纯水中，加热煮沸1.0小时，倾去水煮液并滤出料渣；将料渣用95％乙醇溶液分3次加热回流，每次95％乙醇溶液用量为8L，加热温度为75℃，回流时间为2小时，回流结束后过滤，合并各次所得滤液，得乙醇提取液；

2)在乙醇提取液中加入该提取液质量0.6％的活性炭，在60℃下搅拌吸附0.8小时进行脱色，然后滤除活性炭；用0.6mol/L氢氧化钠溶液调节脱色后的乙醇提取液的pH为11左右，静置10小时后通过过滤去除沉淀，将过滤沉淀(杂质)后所得滤液减压浓缩(在60℃下，真空度达到0.10Mpa)至浓缩前体积的1/4左右(6L)，过滤大量析出的不溶物，滤出的不溶物即为总黄酮粗品(8.1g)；

3)将8.1g总黄酮粗品用纯水洗至中性(总黄酮粗品加入纯水中后搅拌、过滤出不溶物；如此重复洗几次即可)后，用120mL甲醇-5％盐酸溶液(甲醇:5％盐酸溶液的体积比为50:50)溶解，加热(80℃)回流1小时，趁热过滤以除去不溶物，将所得滤液作为上样液；

4)将上样液分次上样于高压制备液相进行分离，每次上样15mL样品，色谱柱柱长为20cm；以甲醇-0.5％磷酸溶液为流动相，以40mL/min的速度恒流洗脱，所述流动相中甲醇与0.5％磷酸溶液的体积比为57:43；

5)在紫外检测器监测下(检测波长为360nm)，依据色谱出峰时间进行分段收集，通过软件观察色谱峰，在8.0min槲皮素产物峰上升，在槲皮素对应峰开始上升时通过自动馏分收集器进行收集，具体收集时间从槲皮素对应峰上升阶段的8.05分钟开始，当该峰下降至整个峰高的六分之一时结束收集；40min后结束本次洗脱，进行重复上样及收集，直至上样液进样完毕，将收集的洗脱液在旋转蒸发仪中回收溶剂，待洗脱液减压浓缩(在60℃下，真空度达到0.10Mpa)至无甲醇味后将析出的不溶物滤出，再用沸蒸馏水水洗，然后干燥(80℃)，得到0.78g粉末；通过高效液相色谱法定量分析表明，粉末中槲皮素含量为98.6％(图1)，同时计算表明槲皮素收率为0.078％。

实例3

1)取药蜀葵根茎干品1Kg，用水洗涤干净，晾干后加入到15L纯水中，加热煮沸2.0小时，倾去水煮液并滤出料渣；将料渣用85％乙醇溶液分3次加热回流，每次85％乙醇溶液用量为12L，加热温度为80℃，回流时间为2小时，回流结束后过滤，合并各次所得滤液，得乙醇提取液；

2)在乙醇提取液中加入该提取液质量1.0％的活性炭，在55℃下搅拌吸附0.6小时进行脱色，然后滤除活性炭；用0.8mol/L氢氧化钠溶液调节脱色后的乙醇提取液的pH为11左右，静置8小时后通过过滤去除沉淀，将过滤沉淀(杂质)后所得滤液减压浓缩(在55℃下，真空度达到0.13Mpa)至浓缩前体积的1/5左右(7L)，过滤大量析出的不溶物，滤出的不溶物即为总黄酮粗品(7.5g)；

3)将7.5g总黄酮粗品用纯水洗至中性(总黄酮粗品加入纯水中后搅拌、过滤出不溶物；如此重复洗几次即可)后，用80mL甲醇-5％盐酸溶液(甲醇:5％盐酸溶液的体积比为50:50)溶解，加热(70℃)回流1小时，趁热过滤以除去不溶物，将所得滤液作为上样液；

4)将上样液分次上样于高压制备液相进行分离，每次上样20mL样品，色谱柱柱长为15cm；以甲醇-0.5％磷酸溶液为流动相，以10mL/min的速度恒流洗脱，所述流动相中甲醇与0.5％磷酸溶液的体积比为60:40；

5)在紫外检测器监测下(检测波长为360nm)，依据色谱出峰时间进行分段收集，通过软件观察色谱峰，在7.4min槲皮素产物峰上升，在槲皮素对应峰开始上升时通过自动馏分收集器进行收集，具体收集时间从槲皮素对应峰上升阶段的7.45分钟开始，当该峰下降至整个峰高五分之一时结束收集；30min后结束本次洗脱，进行重复上样及收集，直至上样液进样完毕，将收集的洗脱液在旋转蒸发仪中回收溶剂，待洗脱液减压浓缩(在50℃下，真空度达到0.15Mpa)至无甲醇味后将析出的不溶物滤出，再用沸蒸馏水水洗，然后干燥(80℃)，得到0.75g粉末；通过高效液相色谱法定量分析表明，粉末中槲皮素含量为98.3％，同时计算表明槲皮素收率为0.075％。

按以上不同实例进行多次色谱分离，高压制备液相色谱柱的分离柱效降低，此时可用以下措施来恢复色谱柱柱效：用质量分数5％的盐酸溶液反向冲洗色谱柱，柱流速为色谱分离流速的10％～20％，然后用质量分数3％的乙腈水溶液冲洗色谱柱，直至流出液中无氯离子。

(三)对比实验

1.水提除杂对提取分离结果的影响

以下实例中省略了通过“水提”除去杂质的步骤，并与实例2进行比较。

1)取药蜀葵根茎干品1Kg，用水洗涤干净，晾干后用95％乙醇溶液分3次加热回流，每次95％乙醇溶液用量为8L，加热温度为75℃，回流时间为2小时，回流结束后过滤，合并各次所得滤液，得乙醇提取液；

2)在乙醇提取液中加入该提取液质量0.6％的活性炭，在60℃下搅拌吸附0.8小时进行脱色，然后滤除活性炭；用0.6mol/L氢氧化钠溶液调节脱色后的乙醇提取液的pH为11左右，静置10小时后通过过滤去除沉淀，将过滤沉淀(杂质)后所得滤液减压浓缩(在60℃下，真空度达到0.10Mpa；)至浓缩前体积的1/4左右(6L)，过滤大量析出的不溶物，滤出的不溶物即为总黄酮粗品(26.7g)；

3)将26.7g总黄酮粗品用纯水洗至中性(总黄酮粗品加入纯水中后搅拌、过滤出不溶物；如此重复洗几次即可)后，用350mL甲醇-5％盐酸溶液(甲醇:5％盐酸溶液的体积比为50:50)溶解，加热(80℃)回流1小时，趁热过滤以除去不溶物，将所得滤液作为上样液；

5)在紫外检测器监测下(检测波长为360nm)，依据色谱出峰时间进行分段收集，通过软件观察色谱峰，在槲皮素对应峰开始上升时通过自动馏分收集器进行收集，当该峰下降至整个峰高的六分之一时结束收集；进行重复上样及收集，直至上样液进样完毕，将收集的洗脱液在旋转蒸发仪中回收溶剂，待洗脱液减压浓缩(在60℃下，真空度达到0.10Mpa)至无甲醇味后将析出的不溶物滤出，再用沸蒸馏水水洗，然后干燥(80℃)，得到0.56g粉末；通过高效液相色谱法定量分析表明，粉末中槲皮素含量为98.2％，同时计算表明槲皮素收率为0.056％。

通过比较发现，去掉水提除杂步骤后，分离的粗黄酮的总量增加(原因包括：有一部分既溶于水又溶于醇的杂质也相应的被分离出来，无法去除)，同时粗黄酮颜色较深；上样次数以及时间增加(上样次数以及时间增加3倍左右)，同时也增加了大量的溶剂回收时间；获得的最终产品量减少(原因包括：上样次数增加后导致损失量相应的增加)，同时获得的产品颜色较深，收率减少了28.2％，但槲皮素含量变化不大。

2.调碱对提取分离结果的影响

前期实验发现，在脱色后若不用氢氧化钠调节滤液pH为碱性，那么减压浓缩所得总黄酮粗品，对下游工艺最主要的影响对象为高压制备液相色谱分离：随色谱柱压力升高，存留的鞣质造成色谱柱堵塞，降低色谱柱寿命。此外，所得总黄酮粗品容易返潮、形成结块，不利于下一步的分离操作，最终都导致无法完成提取分离的全过程。

3.酸化甲醇试剂(用作水解试剂)组成对提取分离结果的影响

前期实验表明，甲醇-盐酸溶液若采用浓度2％的稀盐酸进行配制，会使水解不完全，造成收率较低(收率约0.046％)；但稀盐酸浓度高于7％后对最终结果影响不大。

4.流动相组成对提取分离结果的影响

前期实验表明，流动相中磷酸溶液的比例过大，将直接影响色谱柱寿命，或者造成其损坏。以上实例表明，小量的增加和减少流动相中磷酸溶液的比例，不影响产品的量和纯度，但直接影响洗脱样品的收集时间。

总之，本发明所提供的从药蜀葵中提取分离槲皮素的方法，首次将高压制备液相色谱引入槲皮素的提取分离工艺中，可以在紫外检测器在线监测下进行产物分离和精确收集，不仅一次分离就能获得目的产物(即槲皮素)、分离过程简单快捷，而且具有槲皮素损失少，以及分离过程用时短、填料可以长期重复循环使用、溶剂可回收重复使用的优势。本发明提供的方法可以制得纯度达到98％以上的槲皮素、槲皮素收率明显提高，并且运行成本低、环境友好，适合工业化生产。

Claims

1.一种利用药蜀葵制备高纯度槲皮素的方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)将取自药蜀葵的根或/和茎的原材料于水中进行浸提，然后将在水中浸提后的料渣于醇溶液中进行浸提，得到提取液；

2)用非极性吸附剂处理提取液后加入碱性试剂，经碱性试剂作用后进行溶液的蒸发，使提取液中的黄酮类物质析出，得到总黄酮粗品；

3)将总黄酮粗品用酸化醇试剂水解，得到水解液；

4)将水解液中的槲皮素通过硅胶柱层析进行分离；

所述步骤2具体包括以下步骤：将提取液用活性炭进行若干次脱色，然后调节pH至碱性并进行醇沉除杂，然后减压浓缩并收集析出物；

所述步骤3中，酸化醇试剂为甲醇与3％～10％盐酸溶液按照体积比(30～60):(40～70)混合形成的液体；

所述步骤4中，硅胶柱层析采用高压制备液相色谱柱，所述色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，以甲醇-磷酸溶液为流动相，甲醇-磷酸溶液为甲醇与0.2％～0.8％磷酸溶液按照体积比(55～65):(35～45)混合形成的液体。

2.根据权利要求1所述一种利用药蜀葵制备高纯度槲皮素的方法，其特征在于：所述步骤1中，于水中进行浸提的条件包括：提取时间为1～2小时/次，提取温度为90～100℃；于醇溶液中进行浸提的条件包括：提取时间为1.5～2小时/次，提取温度为60～85℃。

3.根据权利要求1所述一种利用药蜀葵制备高纯度槲皮素的方法，其特征在于：所述步骤3中，水解的条件包括：酸化醇试剂用量按照1g总黄酮粗品使用10～30mL酸化醇试剂进行确定，水解时间为0.5～2.0小时，水解温度为50～80℃。

4.根据权利要求1所述一种利用药蜀葵制备高纯度槲皮素的方法，其特征在于：所述步骤4具体包括以下步骤：将水解液上样于高压制备液相色谱柱，上样后以甲醇-磷酸溶液为流动相，并以10～200mL/min的速度洗脱，将收集的洗脱液减压浓缩并对析出物进行水洗、干燥；其中，甲醇-磷酸溶液为甲醇与0.2％～0.8％磷酸溶液按照体积比(55～65)：(35～45)混合形成的液体。

5.根据权利要求4所述一种利用药蜀葵制备高纯度槲皮素的方法，其特征在于：所述十八烷基硅烷键合硅胶的粒径为5～20μm、孔径为

6.根据权利要求4所述一种利用药蜀葵制备高纯度槲皮素的方法，其特征在于：所述色谱柱的柱长为10～30cm、直径为2～15cm，水解液上样量为10～20mL/次。

7.根据权利要求4所述一种利用药蜀葵制备高纯度槲皮素的方法，其特征在于：所述洗脱中采用紫外检测器在线监测，并在峰开始上升时收集，峰下降至整个峰高的五分之一至六分之一时结束收集。

8.根据权利要求4所述一种利用药蜀葵制备高纯度槲皮素的方法，其特征在于：所述步骤4中，水洗的温度为80～100℃，干燥的温度为50～80℃。