CN117801038A - 一种毛蕊花糖苷的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于中药技术领域，具体涉及一种毛蕊花糖苷的制备方法，其包括：以酸性乙醇第一次回流提取，得第一滤液和第一滤渣；第一滤渣经第二次回流提取，得第二滤液；合并第一滤液和第二滤液后浓缩、静置、过滤，得第三滤液；第三滤液中加入含壳聚糖酸性水溶液，混合均匀后静置过夜、过滤，得第四滤液；D101大孔树脂柱纯化第四滤液、洗脱，收集洗脱组分、浓缩，静置过夜，得上清液；SP825大孔树脂柱纯化上清液、洗脱，收集洗脱组分、浓缩，干燥，得粗提物，粉碎后添加丙酮，搅拌后过滤，得第五滤液，浓缩、真空干燥，得提取物，粉碎后加入甲醇、二氯甲烷重结晶，减压干燥，得毛蕊花糖苷。所述方法提取纯度高，再现性好，适合工业化生产。

Description

一种毛蕊花糖苷的制备方法

技术领域

本发明属于中药技术领域，具体涉及一种毛蕊花糖苷的制备方法。

背景技术

毛蕊花糖苷是由咖啡酸、羟基酪醇、葡萄糖和鼠李糖组成的苯乙醇苷类衍生物，广泛存在于多种天然药用植物中，具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、镇痛、神经保护、免疫调节和改善细胞记忆等多方面的生物活性。然而，植物提取来源的毛蕊花糖苷存在含量低、环境污染问题，无法实现规模化生产。

中国专利申请202310829807.5公开了一种提取密蒙花有效活性成分的方法及其应用，本方法是将粉碎后的密蒙花先用密蒙花经过乙醇回流提取，浓缩，获得的密蒙花醇提取物再分别利用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，剩余的水相在经过减压浓缩，经过D101大孔树脂柱进行提纯处理，干燥后获得的目标产物经过结构鉴定，确定为毛蕊花糖苷单体化合物。

中国专利申请202110558109.7公开了一种熟地黄中毛蕊花糖苷的制备方法，包括提取、干燥、纯化，馏分收集和浓缩步骤，使用液相色谱柱对熟地黄提取物直接进行分离纯化，操作简单，转移率高，只需在相应时间收集洗脱液即可获取高纯度毛蕊花糖苷。

目前本领域毛蕊花糖苷的工艺大多仅限于实验室提取，不适合工业化提取，以中国专利申请202110558109.7为例，该申请仅从100g地黄中提取毛蕊花糖苷。此外，大多数毛蕊花糖苷仅采用地黄的药用部位制备，未充分利用非主要药用部位的药用价值。

因此，本领域需要适用于工业化、大批量制备毛蕊花糖苷的工艺。

发明内容

为了实现上述技术目的，本发明采用地黄传统非主要药用部位地黄叶的制备毛蕊花糖苷，特此提出了以下技术方案：

在一个方面，本发明提供了一种毛蕊花糖苷的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

(1)对毛蕊花糖苷原料以酸性乙醇进行第一次回流提取，得第一滤液和第一滤渣；

(2)对所述第一滤渣以酸性乙醇进行第二次回流提取，得第二滤液和第二滤渣；

(3)将所述第一滤液和第二滤液合并后进行浓缩，浓缩至无醇味后静置、过滤，得第三滤液；

(4)向所述第三滤液中加入含壳聚糖的酸性水溶液，混合均匀后静置过夜、过滤，得第四滤液；

(5)取第五滤液加入到D101大孔树脂柱中进行纯化，纯化后采用第一洗脱液进行第一洗脱，收集第一洗脱组分；

(6)对所述第一洗脱组分进行浓缩，浓缩至无醇味后静置过夜，得上清液；

(7)取所述上清液加入到SP825大孔树脂柱中进行纯化，纯化后采用第二洗脱液进行第二洗脱，收集第二洗脱组分；

(8)对所述第二洗脱组分进行浓缩，浓缩至无醇味后真空干燥，得毛蕊花糖苷粗提物；

(9)粉碎所述毛蕊花糖苷粗提物后添加丙酮，搅拌后过滤，得第五滤液；

(10)对所述第五滤液进行浓缩、真空干燥，得丙酮提取物；

(11)将所述丙酮提取物粉碎为细粉后，加入甲醇溶解，再缓慢加入二氯甲烷至溶液浑浊，得混合溶液；

(12)对所述混合溶液进行重结晶后减压干燥，得毛蕊花糖苷。

在一些实施方式中，步骤(1)中所述毛蕊花糖苷原料可以为地黄叶。

在一些实施方式中，步骤(1)和(2)中所述酸性乙醇为包含0.5％冰乙酸的60％-80％乙醇溶液，优选包含0.5％冰乙酸的80％乙醇溶液。

其中百分比为体积比，体积以mL计。

在一些实施方式中，步骤(1)和(2)中所述酸性乙醇与所述毛蕊花糖苷原料的质量体积比为8：1。其中酸性乙醇的体积以L计，毛蕊花糖苷原料的质量以kg计。

在一些实施方式中，步骤(1)中所述毛蕊花糖苷原料与步骤(5)中D101大孔树脂柱中的D101大孔树脂的质量体积比为1：1。

在一些实施方式中，步骤(1)中所述毛蕊花糖苷原料与步骤(5)中所述SP825大孔树脂柱的SP825大孔树脂的质量体积比为1：1，其中所述毛蕊花糖苷原料的质量以kg计，所述SP825大孔树脂的体积以L计。

在一些实施方案中，步骤(4)中所述第三滤液的温度为30-40℃。

在一些实施方式中，步骤(4)中所述酸性水溶液包含1％壳聚糖，其中百分比为质量体积比，质量以g计，体积以mL计。

在一些实施方式中，步骤(4)中所述酸性水溶液与步骤中(1)中所述毛蕊花糖苷原料的质量体积比为0.3-0.4：1，优选0.3：1。

在一些实施方式中，步骤(4)中所述酸性水溶液为含0.5％冰乙酸的水溶液，其中百分比为体积比，

在一些实施方式中，步骤(5)中所述第一洗脱液包括15％乙醇和40％乙醇，其中百分比为体积比。

在一些实施方式中，步骤(5)中所述第一洗脱包括：

以5倍柱体积的15％乙醇洗脱，最后以5倍柱体积的40％乙醇洗脱。

在一些实施方式中，步骤(5)中所述第一洗脱组分为40％乙醇的洗脱物。

在一些实施方式中，步骤(7)中所述第二洗脱液包括水和95％乙醇，其中百分比为体积比。

在一些实施方式中，步骤(7)中所述第二洗脱包括：

5倍柱体积的水洗脱后，再以3倍柱体积的95％乙醇洗脱。

在一些实施方式中，步骤(7)中所述第二洗脱组分为95％乙醇洗脱物。

在一些实施方式中，步骤(9)中所述丙酮与步骤(8)中所述毛蕊花糖苷粗提取物的质量体积比为20：1，其中所述丙酮的体积以mL计，所述毛蕊花糖苷粗提取物的质量以g计。

在一些实施方式中，步骤(9)中所述搅拌的时间为60-70min。

在一些实施方式中，步骤(9)还包括：

添加丙酮后再加入活性炭。

在一些实施方式中，步骤(11)中所述细粉、甲醇和二氯甲烷的质量体积比为1：3：9，其中所述细粉的质量以g计，所述甲醇的体积以mL计，所述二氯甲烷的体积以mL计。

在一些实施方式中，步骤(12)中所述重结晶的次数为2-3次，优选2次。

在另一个方面，本发明提供了前述任一制备方法所得的毛蕊花糖苷。

在又一个方面，本发明提供了所述毛蕊花糖苷在制备预防和/或治疗慢性肾炎肾小球的药物中的应用。

为确保毛蕊花糖苷的质量，保证提取、分离及精制工艺的可靠性、重现性及合理性，本发明对毛蕊花糖苷的提取、分离和精制工艺进行了探究，最终确定了毛蕊花糖苷的提取工艺，所述工艺重现性可靠，提取得率高，适合于工业生产。由于采用地黄的非主要药用部位，显著节约了成本，充分实现了地黄叶的药用价值，践行了变废为宝以及环保的理念。

具体实施方式

除非另有定义，否则本发明使用的所有技术术语和科技术语都具有如在本发明所属领域中通常使用的相同含义。出于解释本说明书的目的，将应用以下定义，并且在适当时，以单数形式使用的术语也将包括复数形式，反之亦然。

除非上下文另有明确说明，否则本文所用的表述“一种”和“一个”包括复数指代。

本发明涉及的材料及仪器：

地黄叶，秋季采摘，除去杂质，切碎，脱水干燥。

壳聚糖，生产企业：山东桓台县金湖甲壳制品有限公司，生产批号：0701-1。

JA503-1/10千级电子天平(上海舜宇恒平仪器有限公司)；

Mix-3000振荡混匀器(杭州米欧仪器有限公司)；

本发明涉及的试验方法：

HPLC检测毛蕊花糖苷含量：

参照高效液相色谱法(中华人民共和国药典2005年版一部附录D)测定。

色谱条件与系统适应性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填料；甲醇-冰醋酸-水(32：1：67)为流动相，流速1mL/min，检测波长330nm，柱温35℃。理论板数按毛蕊花糖苷峰计算，应不低于8500。

对照品溶液的制备取毛蕊花糖苷对照品约8mg，精密称定，置50mL量瓶中，加甲醇-冰醋酸-水(32：1：67)混合溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品浓溶液。精密量取此溶液2mL，置10mL量瓶中，用上述混合溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

供试品溶液的制备：取本品细粉约0.5g，精密称定，置50mL具塞锥形瓶中，精密加入含1％冰醋酸的甲醇25mL，称定重量，加热回流提取1小时，冷却至室温。称定重量，并补足损失的溶剂，摇匀，静置，滤过。精密量取续滤液2mL，置10mL量瓶中，用上述混和溶液稀释至刻度，摇匀。微孔滤膜(0.45μm)滤过，滤液作为供试品溶液。

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，测定峰面积，以外标法计算，即得。

HPLC检测ACT有关物质含量：

SP液相色谱仪配置有8810泵、SP-100紫外检测器、JS-3030色谱工作站；色谱柱：WGY C18键合硅柱，5μm，4.60×250mm；检测波长为330nm；柱温为35℃；流动相为水-甲醇-冰醋酸(67：32：1)；流速为1mL/min；进样体积：20L；十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂。

为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所有试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购的常规产品。为了更好地说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于构成对本发明的任何限制。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本发明的概念。这样的结构和技术在许多出版物的出版中也进行了描述。

实施例1

对80kg干燥地黄叶，回流提取两次，第一次8倍(640L)，第二次8倍量(640L)酸性80％乙醇(含0.5％冰乙酸)，每次回流60min。回流结束后，合并两次提取液，对提取液进行浓缩，浓缩至无醇味(即浓缩后的液体体积为65-80L，相对密度为rd 1.04-1.05(45℃))。静置30min后，加水至110-120L，静置，冷却，过滤，得滤液。向滤液(温度在35℃左右)中加入10L酸性水溶液(含1％壳聚糖，即100g)，酸性水溶液为含0.5％冰乙酸的水溶液，边加边搅拌，冷藏过夜。次日倾出上清液，过滤，滤液加入到D101大孔树脂柱上，洗脱时以5BV(柱体积)的10％乙醇洗脱后，再以4BV的40％乙醇洗脱，收集40％乙醇洗脱物，浓缩至无醇味(即浓缩后的体积约为100L)，冷藏，静置过夜，得上清液。次日将上清液加入到已处理过的SP825大孔树脂柱上，先以水(3BV自来水，2BV蒸馏水)洗脱，再以3BV的95％乙醇洗脱，收集95％乙醇洗脱液并回收乙醇至无醇味，减压真空干燥95％乙醇浓缩液(温度为55-60℃；真空度大于0.08MP)，得干燥的粗提物。粉碎所得粗提物后加入丙酮，丙酮和粗提取物的质量体积比为20：1，微热(35-40℃)搅拌60min，过滤。滤液中加入活性炭粉末(重量为粗提物的30％)，脱色60分钟，滤过。浓缩滤液至小体积，低温真空干燥(温度为55-60℃；真空度大于0.08MP)，得丙酮提取物。将丙酮提取物粉碎并过80目筛，细粉用甲醇溶解后，缓慢加入二氯甲烷，细粉、甲醇和二氯甲烷的质量体积比为1：3：9，至溶液浑浊，冷藏放置，待大量结晶析出后，过滤，减压干燥，(温度为55-60℃；真空度大于0.08MP)。重复结晶2-3次，即得毛蕊花糖苷。

实施例2-实施例5

实验条件与实施例1相同。

实施例1-5提取的毛蕊花糖苷的各项参数如表1所示。结果显示，实施例1-5中的毛蕊花糖苷提取物中毛蕊花糖苷含量均在93％以上。

表1

试验例1提取工艺的正交试验研究

地黄叶中毛蕊花糖苷类成分的结构，属苯乙醇苷类成分，易溶于稀醇及水，不易溶于苯、二氯甲烷等弱极性有机溶剂。前期研究发现，此类成分在偏酸性条件下稳定，选用的提取溶剂中均含0.5％冰乙酸，以保持溶液的酸性状态。为了有效地提取毛蕊花糖苷活性成分，本发明采用正交试验探究了提取溶剂、溶剂用量、提取时间和提取次数共四个因素对活性成分提取的影响。

称取地黄叶10g选用L₉(3)⁴正交表进行正交试验，见表2。以提取液干膏得率(取提取液10mL，按中国药典2005年版一部附录X.60页法测定)及毛蕊花糖苷提取量为指标。

表2

正交实验结果如表3所示，影响毛蕊花糖苷提取量的最相关因素为溶剂，其次是提取溶剂的用量，毛蕊花糖苷提出量最高的优选条件为A2B2C2D2。干膏得率最低的优选条件为A3B3C2D2，综合两个提取率的优选条件及适与工业化生产，以A2B2C2D2为最佳优选工艺。即以80％乙醇(含0.5％冰乙酸)做溶剂用量为生药量8倍，回流两次，每次回流60分钟。以80％乙醇(含0.5％冰乙酸)做溶剂用量为生药量8倍，回流两次，每次回流60分钟的工艺结果如表4所示。

表3

表4

试验例2壳聚糖沉淀工艺的试验研究

地黄叶中含有大量的叶绿素。地黄叶在80％乙醇提取提取过程中，叶绿素也被提取出，提取液经浓缩后，叶绿素在溶液中以漂浮状态存在，离心或滤过很难除去。通过在浓缩液中加入沉淀剂，使漂浮在溶液中的叶绿素和其他不溶性悬浮物沉淀，倾出上清液，从而达到除去杂质的目的。过量的壳聚糖在树脂分离工程中，水洗脱既可自然除去。为此，选择壳聚糖作沉淀剂，并确定了壳聚糖作为沉淀剂的沉淀分离工艺。

(1)沉淀温度的选择

由于溶液温度对壳聚糖沉淀悬浮物影响较大，不同的温度范围对沉淀状态和沉淀量均有应得影响，因此，我们根据壳聚糖的性质和此步生产工艺的特点，选择了35±2℃，45±2℃，55±2℃三个温度范围进行了考察，考察方法及结果如下：

方法：称取地黄叶300g，按上述提取方法进行提取浓缩，浓缩液300mL，分成三等分，每份100mL(相当于100g地黄叶药材)，待浓缩液降温至55±2℃，45±2℃，35±2℃时，分别加入含1％壳聚糖的酸水溶液10mL，放置过夜，倾出上清液，测定毛蕊花糖苷含量，沉淀部分干燥，计算重量。

表5沉淀时溶液的温度考察

结果如表5所示，在加入壳聚糖时的药液温度为45±2℃，所除去的沉淀状态最佳，除取的杂质量最多，而上清溶液中毛蕊花糖苷含量最高。

(2)沉淀剂用量的选择

作为沉淀剂使用的壳聚糖用量，一般加入量为溶液重量的1％，但在溶液中悬浮物的多少与壳聚糖的用量有直接的关系，为此，根据壳聚糖的壳聚糖的性质和一般用量特点，我们选择了四个比例，考察壳聚糖的用量与沉淀除杂的优选工艺，考察方法及结果如下：

方法：称取地黄叶400g，按上述提取方法进行提取浓缩，浓缩液400mL，分成四等分，每份100mL(相当于100g地黄叶药材)，待浓缩液降温至45±2℃时，分别加入含1％壳聚糖的酸水溶液10mL、20mL、30mL、40mL，放置过夜，倾出上清液，测定毛蕊花糖苷含量，沉淀部分干燥，计算重量。

结果见表6。

表6沉淀剂用量的考察

结果表明：加入30mL壳聚糖溶液，沉淀效果好，毛蕊花糖苷的提取率高。

(3)三次重复试验结果

根据以上考察结果，称取地黄叶100g，选择了溶液温度在45±2℃条件下，加入含有1％的壳聚糖酸水溶液30mL，放置过夜，倾出上清液，测定毛蕊花糖苷含量，同时干燥沉淀，称重。

表7三次沉淀结果的考察

结果如表7所示，三次考察结果，在溶液温度在45±2℃条件下，加入含有1％的壳聚糖酸水溶液30mL，沉淀效果好，毛蕊花糖苷的转移率高。

试验例3大孔吸附树脂分离条件的研究

为进一步纯化地黄叶提取物，本发明选择大孔树脂吸附法对毛蕊花糖苷进行分离，先后筛选了日本三菱公司生产的SP825、HP-20，南开大学化工厂生产的D101、H103、NKA-Ⅱ以及天津农药厂生产的D101共五种树脂。

(1)大孔吸附树脂种类的筛选

取地黄叶500g，按实施例1提取方法提取，壳聚糖沉淀，得上清液500mL，量取上清液50mL(相当于50g地黄叶药材)，均分为五份，分别加入到已处理好的树脂H103、NKA-Ⅱ、D101以及SP825、HP-20柱上，树脂用量为200mL，分别以水洗脱，每种树脂柱水洗脱量为1000mL，再以50％乙醇洗脱1000mL，最后再以95％乙醇1000mL洗脱，分别吸取各样品溶液25mL，按中国药典2005年版第一部附录X.60页“浸出物测定法”测定干膏得率，取少量样品液以微孔膜过滤，测定毛蕊花糖苷在各洗脱溶液中的含量。

结果如表8所示，结果表明：大孔吸附树脂SP825对毛蕊花糖苷的吸附能力强，水洗脱除去杂质最多(2.29g)，除杂率约为4.5％(按生药计：2.29g膏/50g生药)，解吸附率强，以50％乙醇洗脱，近95％的毛蕊花糖苷成分被洗脱下来。因此，本发明选择大孔吸附树脂SP825作为分离用树脂，进一步探究树脂用量和洗脱溶媒等分离条件。

表8

(2)大孔吸附树脂用量及洗脱试剂的选择

大孔吸附树脂D101\SP825在水中对毛蕊花糖苷具有良好的吸附及解吸附能力，为进一步发挥树脂的分离作用，减少树脂及乙醇用量，降低生产成本，考虑第一次用D101树脂作为吸附剂洗脱，第二次用SP825树脂洗脱，并进一步考察了树脂用量及乙醇梯度洗脱对毛蕊花糖苷分离的影响。

量取壳聚糖沉淀后的上清液50mL(相当于50g地黄叶药材)，均分为四份，分别加入到装有20mL、30mL、40mL、50mL D101树脂柱上，先以水洗脱，洗脱量为柱体积的5倍，再以柱体积5倍量的15％、40％、65％、95％乙醇洗脱，分别收集各部分的洗脱液，按中国药典2005年版第一部附录X.60页“浸出物测定法”测定干膏得率，取少量样品液以微孔膜过滤，测定毛蕊花糖苷在各洗脱溶液中的含量。

表9

结果如表9所示，生药量与树脂用量之比以1：1的比例最适宜，在50g：50mL的用量比条件下，水及15％乙醇洗脱部分中，未检测到毛蕊花糖苷，但除去了其他杂质类成分近50％。40％乙醇洗脱部分可使90％以上的毛蕊花糖苷洗脱溶出，故而，本工艺采用先以10％乙醇洗脱(约5倍柱体积)，再以40％乙醇洗脱(约4倍柱体积)，收集40％乙醇洗脱液。

试验例4第二次洗脱工艺研究

如表10所示，在第一次通过大孔吸附树脂D101的分离过程中，毛蕊花糖苷主要集中在40％乙醇洗脱下的部分，但40％乙醇洗脱溶液在浓缩过程中含有大量的水，使得浓缩后期(主要是水溶液)，浓缩液温度增高(高于60℃)，浓缩时间过长，毛蕊花糖苷破坏分解较为严重，且在无醇味的水溶液中产生部分沉淀。

表10

结果显示，40％乙醇洗脱液直接浓缩干燥，约有50％的毛蕊花糖苷破坏分解。为降低浓缩时溶液的温度，减少浓缩时间，并除去水溶状态下的沉淀，本工艺采用浓缩40％乙醇洗脱液至无醇味时，浓缩液再次通过树脂，先以水洗脱，在以95％乙醇洗脱，浓缩95％乙醇洗脱药液至无醇味，减压干燥。

(1)第二次使用SP825大孔吸附树脂分离

量取上述上清液，直接SP825通过大孔吸附树脂(生药量与树脂用量之比100g：80-100mL)，先以水洗脱，洗脱量为树脂体积的5倍，再以95％乙醇洗脱，洗脱量为树脂体积的5倍，浓缩95％乙醇洗脱液至无醇味，减压真空干燥，干燥温度小于55℃，真空压力大于0.08MP。

结果如表11所示，95％乙醇洗脱溶液浓缩干燥，比40％乙醇洗脱溶液直接浓缩干燥的回收率大幅度提高，可达90％以上。以40％乙醇溶液洗脱液，浓缩至无醇味，加入壳聚糖沉淀后，再次(第二次)通过大孔吸附树脂处理，浓缩95％乙醇洗脱液至无醇味，减压真空干燥，得毛蕊花糖苷粗提物，毛蕊花糖苷的破坏损失率小于20％。因此，本阶段工艺回收率高，操作可行。

表11

试验例5毛蕊花糖苷精制工艺研究

毛蕊花糖苷属苯乙醇苷类成分，易溶于甲醇、乙醇、水，溶于丙酮、正丁醇，不溶于二氯甲烷、石油醚等有机溶剂，特别是在甲醇溶液中，溶解度极好。根据我们多年的研究，针对毛蕊花糖苷精制生产工艺研究，既要考虑到生产成本，又要考虑生产的可操作性，本发明选择了溶剂法进行精制，采用丙酮提取、活性炭脱色工艺，与甲醇溶解二氯甲烷沉淀的方法，精制毛蕊花糖苷粗提物，最终使毛蕊花糖苷的纯度超过90％。

(1)毛蕊花糖苷丙酮提取、活性炭脱色工艺的探究

毛蕊花糖苷在丙酮中溶解性好，在一定得温度条件下，丙酮可最大限度的溶出毛蕊花糖苷成分，同时除去丙酮不溶物，是一种较为理想的纯化毛蕊花糖苷的分离手段，因此，以丙酮溶解毛蕊花糖苷粗提物，在溶解过程中，控制一定的溶液温度，不断搅拌，可使80％以上的毛蕊花糖苷溶出。在丙酮溶出液中，加入适量的活性炭，脱去溶液的色泽，从而使下一步结晶工艺得到保障。

称取毛蕊花糖苷粗提物共4份，每份10g，分别加入丙酮溶液100mL(10倍)、150mL(15倍)、200mL(20倍)、250mL(25倍)，控制溶液温度30-35℃，磁力搅拌器搅拌，分别在30分钟、40分钟、50分钟、60分钟，70分钟时取出丙酮溶出液2mL。测定毛蕊花糖苷含量，同时蒸干丙酮溶出液，计算膏重。

结果如表12所示，毛蕊花糖苷粗提物在使用20倍的丙酮用量，在室温30-35℃条件下，搅拌提取60分钟，丙酮提取物中毛蕊花糖苷含量最高，即0.52g/g，毛蕊花糖苷的转移率可达85％以上。

表12

丙酮提取溶液过滤后，其溶液颜色呈淡褐色，溶液中加入适量活性炭，可使丙酮提取液的颜色呈黄色。经本发明研究发现，脱色后的丙酮提取物，有利于下一步的结晶工艺，因此，选择加入适宜的活性炭粉末进行脱色，成为毛蕊花糖苷生产中不可缺少的工艺之一。

量取已滤过的丙酮溶出液三份，每份100mL，分别按溶液体积的1％、2％、3％加入活性炭粉末，搅拌60分钟，滤过，减压浓缩，真空干燥成粉末，按结晶方法进行结晶试验，观察结晶状态，过滤，干燥结晶成粉末状态，测定其中毛蕊花糖苷的含量。

结果如表13所示，在丙酮提取物液中，加入2％活性炭粉末，搅拌60分钟，滤过，浓缩干燥后的粉末(丙酮提取物)，有利于结晶，且结晶状态好，得率高，毛蕊花糖苷含量高。

表13

(2)毛蕊花糖苷结晶条件工艺的确定

根据毛蕊花糖苷易溶于甲醇，不溶于二氯甲烷等溶解性能，经大量的重结晶方法研究，最终选择了以甲醇溶解，加入二氯甲烷，边加边搅拌，冷藏放置(一般在零度左右)的重结晶方法，取得了令人满意的结果。

称取丙酮提取物10g，加入30mL甲醇溶解(约为丙酮提取物的3倍量)，缓慢加入二氯甲烷，边加边搅拌，直到溶液发生混浊，既加入约甲醇用量的3.5倍，放入到冷藏库内(温度在0±5℃)，约48小时后，出现大量类白色粉状物，过滤，在小于55℃温度下，减压真空干燥成粉。

结果如表14所示，通过第一次重结晶后，毛蕊花糖苷的含量可达70％以上，得率大于30％。

表14

试验次数	色泽	状态	得量(g)	得率(％)	含量(％)
						1	灰白色	粉末	3.2	32	74.2
2	灰白色	粉末	3.1	31	72.2
						3	灰白色	粉末	3.4	34	76.1

称取第一次结晶10g，加入40mL甲醇溶解(体积约为第一次结晶量的4倍)，缓慢加入二氯甲烷，边加边搅拌，直到溶液发生混浊，既加入约甲醇用量的3倍，放入到冷藏库内(温度在0±5℃)，约24小时后，出现大量白色粉状物，滤过，在小于55℃温度下，减压真空干燥成粉。

结果如表15所示，通过第二次重结晶后，毛蕊花糖苷的含量可达93％以上，得率大于75％。

表15

试验次数	色泽	状态	得量(g)	得率(％)	含量(％)
						1	类白色	粉末	7.8	78	94.2
2	类白色	粉末	8.2	82	93.7
						3	类白色	粉末	8.1	81	95.4

最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种毛蕊花糖苷的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

(1)对毛蕊花糖苷原料以酸性乙醇进行第一次回流提取，得第一滤液和第一滤渣；

(2)对所述第一滤渣以酸性乙醇进行第二次回流提取，得第二滤液和第二滤渣；

(3)将所述第一滤液和第二滤液合并后进行浓缩，浓缩至无醇味后静置、过滤，得第三滤液；

(4)向所述第三滤液中加入含壳聚糖的酸性水溶液，混合均匀后静置过夜、过滤，得第四滤液；

(5)取第四滤液加入到D101大孔树脂柱中进行纯化，纯化后采用第一洗脱液进行第一洗脱，收集第一洗脱组分；

(6)对所述第一洗脱组分进行浓缩，浓缩至无醇味后静置过夜，得上清液；

(7)取所述上清液加入到SP825大孔树脂柱中进行纯化，纯化后采用第二洗脱液进行第二洗脱，收集第二洗脱组分；

(8)对所述第二洗脱组分进行浓缩，浓缩至无醇味后真空干燥，得毛蕊花糖苷粗提物；

(9)粉碎所述毛蕊花糖苷粗提物后添加丙酮，搅拌后过滤，得第五滤液；

(10)对所述第五滤液进行浓缩、真空干燥，得丙酮提取物；

(11)将所述丙酮提取物粉碎为细粉后，加入甲醇溶解，再缓慢加入二氯甲烷至溶液浑浊，得混合溶液；

(12)对所述混合溶液进行重结晶后减压干燥，得毛蕊花糖苷；

优选地，步骤(1)和(2)中所述酸性乙醇为包含0.5％冰乙酸的60％-80％乙醇溶液，其中百分比为体积比，体积以mL计；

优选地，步骤(4)中所述第三滤液的温度为43-47℃。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)和(2)中所述酸性乙醇与所述毛蕊花糖苷原料的质量体积比为8：1，其中酸性乙醇的体积以L计，毛蕊花糖苷原料的质量以kg计；

和/或，步骤(1)中所述毛蕊花糖苷原料与步骤(5)中D101大孔树脂柱的D101大孔树脂的质量体积比为1：1；

和/或，步骤中(1)中所述毛蕊花糖苷原料与步骤(7)中所述SP825大孔树脂柱的SP825大孔树脂的质量体积比为1：0.8-1，其中所述毛蕊花糖苷原料的质量以kg计，所述SP825大孔树脂的体积以L计。

3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述酸性水溶液包含1％壳聚糖，其中百分比为质量体积比，质量以kg计，体积以L计；

和/或，步骤(4)中所述酸性水溶液与步骤中(1)中所述毛蕊花糖苷原料的质量体积比为0.3-0.4：1，优选0.3：1。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)中所述第一洗脱液包括15％乙醇和40％乙醇，其中百分比为体积比；

和/或，步骤(5)中所述第一洗脱包括：

以5倍柱体积的15％乙醇洗脱，最后以5倍柱体积的40％乙醇洗脱。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(7)中所述第二洗脱液包括水和95％乙醇，其中百分比为体积比；

和/或，步骤(7)中所述第二洗脱包括：

5倍柱体积的水洗脱后，再以3倍柱体积的95％乙醇洗脱。

6.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于，步骤(9)中所述丙酮与步骤(8)中所述毛蕊花糖苷粗提取物的质量体积比为20：1，其中所述丙酮的体积以mL计，所述毛蕊花糖苷粗提取物的质量以g计；

和/或，步骤(9)中所述搅拌的时间为60-70min；

和/或，添加丙酮后再加入活性炭。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(11)中所述细粉、甲醇和二氯甲烷的质量体积比为1：3：9，其中所述细粉的质量以g计，所述甲醇的体积以mL计，所述二氯甲烷的体积以mL计。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤(12)中所述重结晶的次数为2-3次，优选2次。

9.根据权利要求1-8中任一所述的制备方法所得的毛蕊花糖苷。

10.根据权利要求9所述的毛蕊花糖苷在制备预防和/或治疗慢性肾炎肾小球的药物中的应用；

优选地，所述慢性肾小球肾炎为小儿慢性肾小球肾炎。