CN112500284A - 水麦冬酸的对照品的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种水麦冬酸的对照品的制备方法，包括色谱柱提纯工序，将虎掌药材粉碎物的萃取物浓缩液上样至反相色谱柱，以压力为0.05～0.5Mpa进行梯度洗脱，洗脱过程为，用以体积比计含0.1～0.6%的甲酸或者三氟乙酸和1～3%乙腈的水洗脱去除杂质，再以含0.3～0.6%的甲酸或者三氟乙酸的4～7%乙腈的洗脱，收集该洗脱液进行浓缩，得到第二粗品浓缩液；将第二粗品浓缩液冷冻干燥除去水分，得到含有水麦冬酸的半成品，精制处理工序，将水麦冬酸的半成品研磨成粉末，对该粉末进行重复进行2～4次溶剂清洗后，干燥得到水麦冬酸的成品，所述溶剂清洗，为在所述粉末中加入乙酸乙酯：丙酮=8～12：1的溶剂，使粉末均匀分散1～20分钟，过滤取得沉淀部分，将沉淀干燥。

Description

水麦冬酸的对照品的制备方法

技术领域

本发明涉及一种水麦冬酸的制备方法，尤其涉及能够大量的制备高纯度的水麦冬酸的固体对照品的制备方法。

背景技术

中药半夏为天南星科植物半夏（Pinellia ternata( Thunb.) Breit.）的干燥块茎。夏、秋二季采挖，洗净，除去外皮和须根，晒干。东北、华北以及长江流域诸地均有分布。具有燥湿化痰，降逆止呕，消痞散结的功效。用于湿痰寒痰，咳喘痰多，痰饮眩悸，风痰眩晕，痰厥头痛，呕吐反胃，胸脘痞闷，梅核气；外治痈肿痰核。市场上半夏的伪品较多，其中虎掌（Pinelliae Pedatisecta Schott）是半夏中常见的掺伪品，半夏与虎掌药材的鉴别方法主要是性状鉴别，但鉴别难度非常大。半夏与虎掌属同科同属植物，虎掌因有较多小块茎，形似“虎掌”而得名。不乏商贩为了谋取利益，将虎掌加工后经过筛选、打磨，原有的子块茎特征不明显，与半夏非常相似，难以鉴别；如果炮制成饮片，几乎无法通过外形和粉末的性状进行鉴别。

目前唯一可靠的两者鉴别方法是化学鉴别。研究发现半夏中不含有水麦冬酸，但是虎掌中大量含有，通过鉴别药材中水麦冬酸成分的有无，即可鉴别半夏是否是伪品，或者是否有虎掌掺伪。鉴别过程简单快捷有效，即使是虎掌经炮制后依旧可以鉴别。

水麦冬酸的结构式如下，作为半夏、虎掌药材的鉴别及药材质量标准能够实施的重要物质基础，具有非常高的经济价值。

然而，市场上目前能购买的水麦冬酸的对照品、标注品的纯度并不高，最高的只有98%左右的产品。而且目前没有水麦冬酸的提取分离方法的报道。专利CN106831404A利用高压制备色谱，从虎掌提取物制备水麦冬酸的方法，其获得了少量的98%左右的纯品，但是本发明的发明人基于CN106831404A公开的方法，试图放大制备量，却发现其无法大量获得纯度达到98%的产品，并非成本的原因，而是该方法直接放大之后，无法获得水麦冬酸高纯度纯品。令人惊讶的是，从化学结构来看，水麦冬酸本身的合成工艺也并不复杂，市场上确也并没有98%以上的高纯度的对照品出售。

现状是，对于水麦冬酸这种在中药质量控制至关重要的化合物，迄今为止尚无高效、成本合理的制备方法。如何能提供一种纯度达到98.5%以上的水麦冬酸的固体对照品的制备方法，特别是能容易的进行10g级别以上的水麦冬酸的固体对照品的制备方法是业界迫切需要解决的技术问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高纯度水麦冬酸（以下，有时也称为目标物）的对照品的制备方法。

如果并未特殊说明，本发明中目标物的纯度和含量的百分数，为以质量比计的含量。如果并未特殊说明，本发明中液体与液体含量配比的百分数，例如甲酸在乙腈水溶液中的含量配比，以体积分数计量。

本发明通过简单高效的操作流程，能够分离得到纯度很高的水麦冬酸。本发明的制备分离方法依次包括以下步骤：

色谱柱提纯工序，将虎掌药材粉碎物的萃取物浓缩液上样至反相色谱柱，以压力为0.05～0.5Mpa进行梯度洗脱，洗脱过程为，用以体积比计含0.1～0.6%的甲酸或者三氟乙酸和1～3%乙腈的水洗脱去除杂质，再以含0.3～0.6%的甲酸或者三氟乙酸的4～7%乙腈的洗脱，收集该洗脱液进行浓缩，得到第二粗品浓缩液；将第二粗品浓缩液冷冻干燥除去水分，得到含有水麦冬酸的半成品，

精制处理工序，将水麦冬酸的半成品研磨成粉末，对该粉末进行重复进行2～4次溶剂清洗后，干燥得到水麦冬酸的成品，所述溶剂清洗，为在所述粉末中加入乙酸乙酯：丙酮=8～12：1的溶剂，使粉末均匀分散1～20分钟，过滤取得沉淀部分并干燥。

在优选的本发明的制备方法中，精制处理工序中，所述溶剂清洗中使用的乙酸乙酯：丙酮的比例，为9.5～10.5:1。

在优选的本发明的制备方法中，色谱柱提纯工序中，洗脱过程为，用以体积比计含0.4～0.5%的甲酸和2～3%乙腈的水洗脱去除杂质，再以含0.4～0.5%的甲酸5～6%乙腈的洗脱。

在优选的本发明的制备方法中，反相色谱柱的填料为粒径为40～60μm的十八烷基硅烷键合硅胶。

在优选的本发明的制备方法中，色谱柱提纯工序中，得到第二粗品浓缩液的浓缩过程，在60℃以下的温度进行。

在优选的本发明的制备方法中，精制处理工序，将水麦冬酸的半成品研磨至能够通过100目孔筛的粒度以下。

在优选的本发明的制备方法中，所述虎掌药材粉碎物的萃取物浓缩液为，将虎掌药材用酸化水提取，再利用有机溶剂进行萃取得到萃取物，将萃取物浓缩得到的液体。具体而言，可以将虎掌药材粉碎为粉末，利用水或者极性溶剂进行浸泡，将浸泡液浓缩得到第一原料浓缩液，将第一原料浓缩液上样至活性碳，静态吸附10～30小时，用水洗脱去除杂质，再利用以体积比计含有10～30%的乙醇或甲醇的水洗脱获得含目标物的溶液，浓缩得到第二原料浓缩液，将第二原料浓缩液调节至PH为3～4的酸性，利用有机溶剂进行萃取，将有机溶剂萃取液浓缩得到浓缩液。

在优选的本发明的制备方法中，利用乙酸乙酯或者正丁醇对调节至PH为3～4的酸性的第二原料浓缩液进行萃取。

在优选的本发明的制备方法中，精制处理工序中，所述溶剂清洗中的干燥，在60℃以下的温度下进行干燥。

本发明具有以下特点：

本发明通过上述方法得到水麦冬酸的固体粉末纯度可以达到98.5%以上甚至更高，是简便可行，成本合理的水麦冬酸的对照品的制备方案的首次披露，该方法简便易行，而且所有的步骤都适合进行工艺放大，可以进行工业化的制备生产。后续的实施例中制备的水麦冬酸纯度甚至超过了99%，特别适合作为标准品分发，贩卖。

本发明的开发过程中，对水麦冬酸的稳定性进行了验证，发现其几乎无法以在常见溶剂的溶液中稳定存在，这提示其难以用色谱法进行高纯度的精制提纯。

附图说明

图1为利用本发明的实施例1获得固体水麦冬酸纯品的HPLC图谱；

图2为利用本发明的比较例1获得固体水麦冬酸的HPLC图谱；

图3为实施例2中水麦冬酸纯品的水溶液放置不同时长后的HPLC图谱汇总图；

图4为实施例2中水麦冬酸纯品的甲醇溶液放置不同时长后的HPLC图谱汇总图；

图5为实施例2中水麦冬酸纯品的5%乙腈水放置不同时长后的HPLC图谱汇总图；

图6为实施例2中水麦冬酸纯品的0.1%磷酸水的溶液放置不同时长后的HPLC图谱汇总图；

图7为实施例2中水麦冬酸纯品的水溶液连续多次进样后的HPLC图谱汇总图；

图8为水麦冬酸纯品的H-NMR图谱；

图9为水麦冬酸纯品的C-NMR图谱；

图10为水麦冬酸纯品的质谱图。

具体实施方式

以下记载本发明的具体实施方式。

本发明的制备分离方法依次包括以下步骤：

色谱柱提纯工序，将虎掌药材粉碎物的萃取物浓缩液上样至反相色谱柱，以压力为0.05～0.5Mpa进行梯度洗脱，洗脱过程为，用以体积比计含0.1～0.6%的甲酸或者三氟乙酸和1～3%乙腈的水洗脱去除杂质，再以含0.3～0.6%的甲酸或者三氟乙酸的4～7%乙腈的洗脱，收集该洗脱液进行浓缩，得到第二粗品浓缩液；将第二粗品浓缩液冷冻干燥除去水分，得到含有水麦冬酸的半成品，

精制处理工序，将水麦冬酸的半成品研磨成粉末，对该粉末进行重复进行2～4次溶剂清洗后，干燥得到水麦冬酸的成品，所述溶剂清洗，为在所述粉末中加入乙酸乙酯：丙酮=8～12：1的溶剂，使粉末均匀分散1～20分钟，过滤取得沉淀部分并干燥。

本发明中，上述色谱柱提纯工序与精制处理工序的有机组合和协同，是能够提供高纯度样品的关键，具体进行以下说明。

通常的标准品制备思路，是不断的增加色谱分离的分辨率，利用更高压力和分离度更好的色谱柱进行不断的纯度提高。然而本发明的发明人发现该技术思路对于水麦冬酸并不起作用，当通过色谱柱提纯工序获得的粗品纯度达到95%以上之后，即使继续加大制备分离的分辨率，纯度也非常难于提高。最后经过深入研究发现，水麦冬酸在任何常用的反相色谱分离洗脱溶剂（例如，水、酸性水、甲醇、乙腈）中都难以长时间稳定的存在，这使得其难以按照原有的思路得到更高纯度的物质。如果仅仅为了得到毫克级别的纯品，由于制备时间短，有可能抢先在不稳定分解之前完成制备分离，得到毫克级别的高纯度纯品，但是如果需要制备克级别、十克级别以上的高纯度纯品，由于必将导致色谱分离时间延长，由于水麦冬酸在洗脱剂中不稳定而发生分解，因此难以提高纯度。

基于这样的认知，申请人继续研发，发现利用快速的中压反相分离色谱（上述色谱柱提纯工序）将水麦冬酸的半成品浓度提高的95%之后，利用特定组成配比的溶剂进行反复清洗，可以获得98.5%甚至更高纯度的水麦冬酸。

色谱柱分离工序通过极性差别进行分离，获得95%水麦冬酸中的杂质虽然获得极性相似，但是基于本发明人的大量研究，其在特定的溶剂（具体为乙酸乙酯和丙酮按照特定比例混合的溶剂）中的溶解性差别较大，通过这种特殊的溶剂组合进行分散化清洗处理，对于纯度为95%水麦冬酸中的杂质的清除效果出人意料的优异，重复进行溶剂清洗处理，可以极大的提高纯度，而且不会触发水麦冬酸的不稳定分解。

本发明的色谱柱分离工序中，基于上述用以体积比计含0.1～0.6%的甲酸或者三氟乙酸和1～3%乙腈的水洗脱去除杂质，再以含0.3～0.6%的甲酸或者三氟乙酸的4～7%乙腈的洗脱，即可以迅速有效的大量分离目标物质，但是为了更好平衡效率和效果，在优选的本发明的制备方法中，色谱柱提纯工序中，洗脱过程为，用以体积比计含0.4～0.5%的甲酸和2～3%乙腈的水洗脱去除杂质，再以含0.4～0.5%的甲酸5～6%乙腈的洗脱。

本发明中的用于溶剂清洗处理的具体特定溶剂，是本发明中非常重要的技术特征，该比例保证了精制处理的效果，即直接关系到最后的产品纯度。在优选的本发明的制备方法中，精制处理工序中，所述溶剂清洗中使用的乙酸乙酯：丙酮的比例，为9.5～10.5:1。利用此比例的溶剂进行溶剂清洗，能够提升溶剂清洗的效率，减少时间花费。

本发明中色谱柱制备工序中使用的反相色谱柱的反相填料，可以用公知的非极性的，键合的官能团为烷烃的（例如：C18(ODS)、C8、C4等）的硅胶。优选C18(ODS)硅胶柱，即十八烷基硅烷键合硅胶，优选使用40～60μm的填料，合理的粒径有利于维持适当的柱压和分辨率，十八烷基硅烷键合硅胶在市场上易于购买。从效率和填料易得的角度出发，在优选的本发明的制备方法中，反相色谱柱的填料为粒径为40～60μm的十八烷基硅烷键合硅胶。

由于发明人已经探明目标物在水中稳定性差，在优选的本发明的制备方法中，色谱柱提纯工序中，得到第二粗品浓缩液的浓缩过程，在60℃以下的温度进行。并且应该尽快的进行浓缩，然后利用冷冻干燥。

只要将含有水麦冬酸的半成品研磨成粉末，进行本发明中的溶剂冲洗工序即可实现非常理想的精制效果，可以兼顾目标物的稳定性。研磨太细会导致耗时过长，不利于效率，多长时间研磨导致的发热也容易触发不稳定分解，因此，在优选的本发明的制备方法中，精制处理工序中，将水麦冬酸的半成品研磨至能够通过100目孔筛的粒度以下，只要是这样粒度以下的粉末，与溶剂充分接触，已经能够提供足够好的溶剂清洗的效率，更快速的完成精制过程。

将水麦冬酸粉末进行分散化，浸泡而溶剂清洗的方法没有特别限制，只要是使得粉末在溶剂中分散的方法即可，例如可以利用机械搅拌、超声波震荡等的方法，但不限于这些方法。

本发明的制备方法中作为原料的虎掌药材粉碎物的萃取物浓缩液可以使用现有公知的方法提取，例如可以使用专利CN106831404A中的前处理中使用的方法得到浓缩液。虎掌药材通过常规的植物萃取方法得到的浓缩液都可以经由本发明获得高纯度的目标物。但是如果考虑高纯度以外的情况，为了解决进一步的提高提取收率而有效利用药材的技术问题，并且兼顾时间成本，在优选的本发明的制备方法中，所述虎掌药材粉碎物的萃取物浓缩液为，将虎掌药材用酸化水提取，再利用有机溶剂进行萃取得到萃取物，将萃取物浓缩得到的液体。具体而言，可以将虎掌药材粉碎为粉末，利用水或者极性溶剂进行浸泡，将浸泡液浓缩得到第一原料浓缩液，将第一原料浓缩液上样至活性碳，静态吸附10～30小时，用水洗脱去除杂质，再利用以体积比计含有10～30%的乙醇或甲醇的水洗脱获得含目标物的溶液，浓缩得到第二原料浓缩液，将第二原料浓缩液调节至PH为3～4的酸性，利用有机溶剂进行萃取，将有机溶剂萃取液浓缩得到浓缩液。

在优选的本发明的制备方法中，有机溶剂萃取酸处理液是常规方案，利用乙酸乙酯或者正丁醇对调节至PH为3～4的酸性的第二原料浓缩液进行萃取，能够进一步兼顾收率和分离效率。

考虑到目标物不稳定，在优选的本发明的制备方法中，精制处理工序中，所述溶剂清洗中的干燥，在60℃以下的温度下进行干燥。

综上，本发明通过以上的制备方法，首次获得了固体纯度98.5%以上的的水麦冬酸化合物。

实施例

以下，通过实施例进一步详细说明本发明的典型的提取方式。以下实验方案仅仅是示例，并非对本发明的限定。本领域人员可以在理解实施例原理和发明精神的前提下进行任意的变更。

实施例1

A.药材提取：取虎掌药材100kg粉碎成粗颗粒状，加入水1000L冷浸提取48h，提取2次，合并提取液并过滤，滤液于60℃下浓缩至100L得提取浓缩液；

B.活性碳富集：取活性碳净品100kg，将步骤A浓缩液采用静态吸附方法吸附24h，并装柱，采用700L水洗脱除杂，20%乙醇（乙醇采购于上海星可高纯溶剂有限公司，30L/桶）200L收集目标物，目标部分于60℃下浓缩至20L;

C.酸化萃取：将步骤B浓缩液采用盐酸（采购于上海泰坦科技股份有限公司，500ml/瓶）调PH至3，采用乙酸乙酯：酸化液--2：1萃取5次，合并乙酸乙酸（采购于上海泰坦科技股份有限公司，30L/桶）层于40℃下浓缩至无乙酸乙酯，3000ml纯水溶解得纯度为50%水麦冬酸粗品；

D.中压柱制备：Daiso RPS-C18，40-60um，1.8-2.0kg填料，柱尺寸460×100mm（采购于苏州汇通色谱分离纯化有限公司）流速：70mL/min。水麦冬酸易溶于水中，柱压在0.3-0.5MPa。

2%乙腈（乙腈采购于上海星可高纯溶剂有限公司）（含0.5%甲酸）洗脱约6h，体积约30L去除前杂，5%乙腈（含0.5%甲酸）洗脱5-6h出目标，体积约25-30L，目标洗脱液于55℃下浓缩至2L左右，平均装入4个冻干瓶中冻干，冻干机（采购于宁波新芝生物科技股份有限公司）冷井温度-45℃,真空为50pa，冻干时长为40h，冻干后得到纯度为85%左右水麦冬酸混合物粉末约60g，目标含量约25g；

E.溶剂法处理提纯：将步骤C得到的水麦冬酸半成品研碎成粉末状，加入乙酸乙酯：丙酮10：1混合溶剂100-130ml超声处理（乙酸乙酯、丙酮均采购于上海泰坦科技股份有限公司、500ml/瓶），期间充分搅拌使样品均匀分散，每次15min，过滤取沉淀部分如此反复操做3-5次，过滤得沉淀部分纯品，HPLC纯度大于98.5%；

F.固体产品回收：将步骤E过滤后沉淀放入干净的容器中，55℃真空干燥8h，期间不断搅拌使样品受热均匀，将干燥后样品取出研磨成均匀的粉末，55℃再次真空干燥12h，干燥后得水麦冬酸纯品16g。

通过质谱、核磁共振图谱可以确认其结构，质谱与核磁的图谱请参照图6-图8，固体产品回收工序前目标物的HPLC谱图和真空干燥后固体的HPLC图谱可以参照图1，能够稳定的提供高纯度的目标化合物。

比较例1

A.药材提取：取虎掌药材100kg粉碎成粗颗粒状，加入水1000L冷浸提取48h，提取2次，合并提取液并过滤，滤液于60℃下浓缩至100L得提取浓缩液；

B.活性碳富集：取活性碳净品100kg，将步骤A浓缩液采用静态吸附方法吸附24h，并装柱，采用700L水洗脱除杂，20%乙醇（乙醇采购于上海星可高纯溶剂有限公司，30L/桶）200L收集目标物，目标部分于60℃下浓缩至20L;

C.酸化萃取：将步骤B浓缩液采用盐酸（采购于上海泰坦科技股份有限公司，500ml/瓶）调PH至3，采用乙酸乙酯：酸化液--2：1萃取5次，合并乙酸乙酸（采购于上海泰坦科技股份有限公司，30L/桶）层于40℃下浓缩至无乙酸乙酯，3000ml纯水溶解得纯度为50%水麦冬酸粗品；

D.中压柱制备：Daiso RPS-C18，40-60um，1.8-2.0kg填料，柱尺寸460×100mm（采购于苏州汇通色谱分离纯化有限公司）流速：70mL/min。水麦冬酸易溶于水中，柱压在0.3-0.5MPa。

2%乙腈（乙腈采购于上海星可高纯溶剂有限公司）（含0.5%甲酸）洗脱约6h，体积约30L去除前杂，5%乙腈（含0.5%甲酸）洗脱5-6h出目标，体积约25-30L，目标洗脱液于55℃下浓缩至2L左右，平均装入4个冻干瓶中冻干，冻干机（采购于宁波新芝生物科技股份有限公司）冷井温度-45℃,真空为50pa，冻干时长为40h，冻干后得到纯度为85%左右水麦冬酸混合物粉末约60g，目标含量约25g；

E.高压制备：取步骤D所得到的HPLC纯度为85%的水麦冬酸冻干后粉末1g，加入10ml纯水溶解，配制成浓度为0.1g/ml的样品；采用LC-20AP制备型液湘制备（采购于岛津株式会社），色谱柱采用YMC-Triart C18，250*50mm、7um，流速为60ml/min、柱压控制在6.5-8.0之间，检测波长为210nm，乙腈：水（0.5%甲酸）8：92等度洗脱，收集20-23min色谱峰，

F.产品回收方案一：将制备后样品采用45℃浓缩20min，并冷冻干燥20h，得干燥后粉末80mg，经检测HPLC纯度反而降至94%；

产品回收方案二：将高压制备后纯度为98.1%的溶液，采用直接冻干，得干燥后粉末80mg，经检测HPLC纯度反而降至97%，此方案处理的量小，并且需占用大量的资源，对于获得大量高纯度的水麦冬酸是不可取的。

比较例与实施例的主要区别在于，最后的纯化步骤使用更高压力的制备色谱技术，但是由于水麦冬酸本身的特点，无法实现纯度的提高，甚至会导致纯度降低。

实施例2

在实验过程中发现水麦冬酸在溶液状态下极不稳定，因此针对其稳定性做了不同溶剂（水、甲醇、5%乙腈水、酸水、碱水及固体粉末）的不同放置时间的稳定性实验，具体实验过程如下：

A.分析方法：

仪器：Agilent 1260 VWD

色谱柱：Agilent SB-c18 4.6*250mm 5um

柱温：30℃

进样量：5ul

检测波长：210nm

流动相组成：A-水（0.05%磷酸） B-乙腈

时间 (min)	流速 (mL/min)	%B
			0.0	1.000	4
14	1.000	4
			16	1.000	90
18	1.000	90

B.取干燥后粉末1.8mg，加入纯水4ml溶解，制成0.45mg/ml的溶液，于0、2、4、6、24、48h时对同一溶液检测分析（图3中从下至上顺序对应上述样品），样品纯度依次为98.7%、93.0%、90.8%、89.4%、86.8%、84.1%，说明样品在水溶液中是不稳定的。

C.取干燥后粉末1.8mg，加入4ml甲醇溶解，制成0.45mg/ml的溶液，于0、2、4、6、24、48h时对同一溶液检测分析（图4中从下至上顺序对应上述样品），样品纯度依次为98.7%、92.2%、88.2%、87.1%、86.0%、85.0%，说明样品在甲醇溶液中是不稳定的。

D.取干燥后粉末1.8mg，加入5%乙腈水4ml溶解，制成0.45mg/ml的溶液，于0、2、4、6、24、48h时对同一溶液检测分析（图5中从下至上顺序对应上述样品），样品纯度依次为98.7%、92.0%、90.1%、88.1%、86.6%、85.3%，说明样品在5%乙腈水中是不稳定的。

E.取干燥后粉末1.7mg，加入4ml（0.1%磷酸）水溶解，制成0.425mg/ml的溶液，于0、6、24h时对同一溶液检测分析（图6中从下至上顺序对应上述样品），样品纯度依次为98.7%、91.2%、89.2%，说明样品在酸水中不稳定。

F.取干燥后粉末1.8mg，加入4ml纯水溶解，制成0.45mg/ml溶液，连续对同一溶液进样4次，每次间隔20min（图7中从下至上顺序对应上述样品），样品纯度依次为98.7%、96.9%、95.7%、94.6%，说明样品在溶液状态中极不稳定。

以上各实验结果参照图3～图7，说明水麦冬酸在常见反相色谱洗脱剂系统下难以稳定存在，因此通常的利用反相色谱进行最后的纯化是难以实现的。

参考图8和图9，获得的水麦冬酸NMR图谱归属数据如下：

¹H-NMR

H原子序号	氢个数	测试δ<sub>H</sub>/ppm(600M Hz,MeOD)
			1	2H	3.28(d，j=7.2Hz)
2	1H	7.14（t，j=7.2Hz）
			4	2H	3.36（s）

¹³C-NMR

C原子序号	测试δ<sub>C</sub>/ppm(150M Hz,MeOD)
		1	34.75
2	138.37
		3	129.81
4	33.13
		1<sup>’</sup>	173.65
2<sup>’</sup>	169.87
		3<sup>’</sup>	174.28

获得的水麦冬酸的质谱信息如下（参照图10）：

条件：Sciex Triple TOF 4600 LC/MS，正离子模式

MS数据：211（M+Na），189（M+H）

上述披露的各技术特征并不限于已披露的与其它特征的组合，本领域技术人员还可根据发明之目的进行各技术特征之间的其它组合，以实现本发明之目的，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (11)

1.一种水麦冬酸的对照品的制备方法，其特征在于，依次包括以下步骤：

色谱柱提纯工序，将虎掌药材粉碎物的萃取物浓缩液上样至反相色谱柱，以压力为0.05～0.5Mpa进行梯度洗脱，洗脱过程为，用以体积比计含0.1～0.6%的甲酸或者三氟乙酸和1～3%乙腈的水洗脱去除杂质，再以含0.3～0.6%的甲酸或者三氟乙酸的4～7%乙腈的洗脱，收集洗脱液进行浓缩，得到第二粗品浓缩液；将第二粗品浓缩液冷冻干燥除去水分，得到含有水麦冬酸的半成品，

精制处理工序，将水麦冬酸的半成品研磨成粉末，对该粉末进行重复进行2～4次溶剂清洗后，干燥得到水麦冬酸的成品，所述溶剂清洗，为在所述粉末中加入乙酸乙酯：丙酮=8～12：1的溶剂，使粉末均匀分散1～20分钟，过滤取得沉淀部分并干燥。

2.根据权利要求1所述的水麦冬酸的对照品的制备方法，其特征在于，精制处理工序中，所述溶剂清洗中使用的乙酸乙酯：丙酮的比例，为9.5～10.5:1。

3.根据权利要求1所述的水麦冬酸的对照品的制备方法，其特征在于，色谱柱提纯工序中，洗脱过程为，用以体积比计含0.4～0.5%的甲酸和2～3%乙腈的水洗脱去除杂质，再以含0.4～0.5%的甲酸5～6%乙腈的洗脱。

4.根据权利要求1所述的水麦冬酸的对照品的制备方法，其特征在于，反相色谱柱的填料为粒径为40～60μm的十八烷基硅烷键合硅胶。

5.根据权利要求1所述的水麦冬酸的对照品的制备方法，其特征在于，色谱柱提纯工序中，得到第二粗品浓缩液的浓缩过程，在60℃以下的温度进行。

6.根据权利要求1所述的水麦冬酸的对照品的制备方法，其特征在于，精制处理工序，将水麦冬酸的半成品研磨至能够通过100目孔筛的粒度以下。

7.根据权利要求1所述的水麦冬酸的对照品的制备方法，其特征在于，

所述虎掌药材粉碎物的萃取物浓缩液为，将虎掌药材用酸化水提取，再利用有机溶剂进行萃取得到萃取物，将萃取物浓缩得到的液体。

8.根据权利要求1所述的水麦冬酸的对照品的制备方法，其特征在于，

所述虎掌药材粉碎物的萃取物浓缩液的制备方法如下，

将虎掌药材粉碎为粉末，利用水或者极性溶剂进行浸泡，将浸泡液浓缩得到第一原料浓缩液，将第一原料浓缩液上样至活性碳，静态吸附10～30小时，用水洗脱去除杂质，再利用以体积比计含有10～30%的乙醇或甲醇的水洗脱获得含目标物的溶液，浓缩得到第二原料浓缩液，将第二原料浓缩液调节至PH为3～4的酸性，利用有机溶剂进行萃取，将有机溶剂萃取液浓缩得到浓缩液。

9.根据权利要求8所述的水麦冬酸的对照品的制备方法，其特征在于，利用乙酸乙酯或者正丁醇对调节至PH为3～4的酸性的第二原料浓缩液进行萃取。

10.根据权利要求1所述的水麦冬酸的对照品的制备方法，其特征在于，精制处理工序中，所述溶剂清洗中的干燥，在60℃以下的温度下进行干燥。

11.一种纯度为98.5%以上的水麦冬酸的固体对照品，其通过权利要求1的制备方法制备得到。

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