CN100522191C - 一种丹参药材指纹图谱检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高含量丹参多酚酸盐粉针剂指纹图谱检测方法。本发明的检测方法包括丹参药材、丹参多酚酸盐及其粉针剂的指纹图谱检测方法。本发明的方法能有效地控制丹参多酚酸盐制备的全过程，确保产品的质量与含量。

Description

一种丹参药材指纹图谱检测方法

技术领域：

本发明涉及中药技术领域。具体涉及一种一种丹参药材指纹图谱检测方法。

背景技术：

丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)是传统的活血化瘀中药之一有长期的临床应用基础。丹参注射液是临床上治疗冠心病、心绞痛、心肌梗塞、缺血性中风等疾病的常用药物，但现有的注射剂因有效成分不明确、质量控制指标不严格导致临床疗效不稳定，不良反应时常出现。这些问题的出现，关键是丹参的有效成分未能完全阐明。

本发明人针对这些问题开展了丹参的水溶性成分的系统研究，发现丹参的水溶性有效成分是以盐的形式存在于生药材中，这些成分主要为丹参乙酸镁以及同系物等。通过活性筛选和药理学研究发现：丹参乙酸镁和它的同系物均为活性成分，其中以丹参乙酸镁药理作用最强，它是丹参的主要活性成分

丹参乙酸镁结构式

并首次阐明了以丹参多酚酸盐粉针剂为主要成分的多酚酸盐是丹参中最重要的有效活性部位。

本发明人在此基础上，成功地提供了丹参的新制剂，该制剂为一种高含量丹参多酚酸盐粉针剂，其中丹参乙酸镁含量超过80％，其余成分为紫草酸镁、迷迭香酸钠以及少量丹参素。

发明内容：

本发明所要解决的技术问题在于研究设计高含量丹参多酚酸盐粉针剂指纹图谱检测方法。

本发明经大量研究，提拱了一种高含量丹参多酚酸盐粉针剂指纹图谱检测方法。

本发明的指纹图谱检测方法包括三个部分：

(1)丹参药材指纹图谱检测方法；

(2)丹参多酚酸盐指纹图谱检测方法；

(3)丹参多酚酸盐粉针剂指纹图谱检测方法。

下面具体描述本发明的检测方法和制定该方法的试验：

1、丹参多酚酸盐粉针剂的药材指纹图谱检测方法：

本发明的方法基于下列试验：

丹参多酚酸盐粉针剂所用原药材为丹参，汉语拼音为Danshen。

(1)来源

丹参为唇形科植物，其拉于学名为Savia miltiorrhiza Bge，药用部分为根有根茎。药材共10批，产地分别为安徽省毫州市五马(一号)、安徽省毫州市五马(二马)、安徽省张店(一号)、安徽省张店(二号)、安徽省毫州市大扬(一号)、安徽省毫州市大扬(二号)、安徽省毫州市十九里(一号)、安徽省毫州市十九里(二号)、安徽省毫州市十字河、安徽省毫州市义门。编号分别为A，B，C，D，E，F，G，H，I，J。

(2)供试品的制备

丹参多酚酸为水溶性成分，因此采用水浸泡后，回流提取的方法可以将其中多数丹参多酚酸类成分提取出。调节pH使其成为酸性，然后用乙酸乙酯萃取，萃取液定容后用于液相色谱分析，结果证明该提取方法可行，与中间体和成品指纹图谱间的相关性良好。

(3)参照物的制备

丹参药材经上述方法提取后，经HPLC分析出现多个色谱峰，但以丹参乙酸为其主要成分，丹参乙酸的积分面积在指纹图谱中所占的比例较大且较稳定，因此我们选之为参照物。其制备方法为直接将丹参乙酸镁盐对照品溶解于流动相进行分析，结果证明该制备方法可行。

(4)流动相的确定

药材提取液的测定共选择了5种流动相系统：(1)甲醇-0.1％冰乙酸(5：95)；(2)甲醇-5mol/L磷酸二氢钾液(30：70)；(3)甲醇-5mol/L磷酸二氢钾液(25：75)；(4)甲醇-乙腈-水(41.5：1：48.5，用甲酸调pH至2.20)；(5)甲醇-乙腈-水-甲酸(42：1：59：0.2)。结果表明，各种流动相中以甲醇-乙腈-水-甲酸(42：1：59：0.2)系统为最佳，谱图上各个色谱峰(254nm)分离度较好，保留时间适宜，因此选此流动相系统作为丹参注射液的HPLC指纹图谱检测的流动相。

(5)检测波长的选择

共选择了254nm、290nm2种波长，在这两种波长下的HPLC谱图中均有多个色谱峰，但在检测波长为254nm时色谱峰较多且峰型较好，综合考虑，选择254nm为制作指纹图谱的测定波长。

(6)稳定性及精密度试验

以编号为C的药材的制备样品为供试品，分别于0天，10天和30天进样，记录各共有色谱峰保留时间和积分面积，以丹参乙酸镁的保留时间和积分面积为参照，换算出各共有峰的相对保留时间和相对积分面积，结果表明供试品的稳定性良好。另外编号为C的药材的制备样品连续进样6次，记录各共有色谱峰保留时间和积分面积，以丹参乙酸镁的保留时间和积分面积为参照，换算出各共有峰的相对保留时间和相对积分面积，结果见表1。由表1可见，各共有峰的(相对)保留时间和(相对)积分面积基本一致，相对标准偏差均小于3.0％。

表1 丹参多酚酸盐粉针剂药材指纹图谱精密度试验

 

共有峰编号	相对保留时间(RSD，％)	相对峰面积(RSD，％)
			1	1.03	1.24
2	0.94	2.35
			3	1.09	2.01
4	0.92	2.45
			5	0.51	1.56
6	1.63	1.12
			7(S)	1.39	2.15

注：“S”表示参照物

(7)重现性试验

取编号为C的供试品5份，按上述方法进行制备并进行检测，考察各色谱峰相对保留时间、峰面积比值的一致性，结果见表2。所考察的7个共有峰(其中编号为1和2的色谱峰为组峰)的相对保留时间及相对峰面积的相对标准偏差均小于3％。

表2 丹参多酚酸粉针剂药材指纹图谱重现性试验

 

色谱峰编号   相对保留时间(RSD，％)   相对峰面积(RSD，％)
	1                   1.2                     2.52                   1.4                     2.63                   1.9                     2.84                   2.1                     2.75                   2.0                     2.86                   1.9                     3.07(S)                1.8                     2.9

注S为参照物

(8)指纹图谱及技术参数

1)指纹图谱

根据10批供试品HPLC图谱所给出的相关参数，丹数药材按样品制备方法进行制备所得供试品的色谱峰在60min之内全部出现；2小时的色谱图表明1小时以后未出现任何色谱峰。比较各批样品的色谱图发现其中有7个色谱峰是各批样品所共有的，编号分别为1、2、3、4、5、6、7，其中1和2为组峰。

2)共有指纹峰面积及保留时间的比值

10批药材供试品，以丹参乙酸镁为参照物，各指纹峰的积分面积及积分面积，保留时间及相对保留时间见表3；表4所示为各共有指纹峰占总峰面积的比例、差值，结果可见各批供试品的重现性较好，也符合《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求》(暂行)。其中共有峰1和2的保留时间按组峰各色谱峰保留时间的平均值计算，峰面积按组峰各色谱峰面积之和计算。

表3 丹参多酚酸盐粉针剂药材共有指纹峰面积及保留时间的比值

注：S为参照物，^*为参照物的绝对保留时间

表4 药材各共有指纹峰所占总峰面积的比例及其差值

3)非共有峰面积

试验的10批样品中计算了非共有峰面积所占总峰面积的比值，结果表5。

由表5可见，各批药材非共有峰面积占总峰面积均小于10％，符合《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求》(暂行)，也即说明生产丹参多酚酸盐注射剂粉针剂所用药材符合要求。

表5 丹参多酚酸盐粉针剂HPLC指纹图谱非共有纹峰面积的百分比

 

批次编号	非共有指纹峰面积的百分比(％)
		A	7.94
B	5.39
		C	9.18
D	6.13
		E	3.57
F	7.97
		G	7.35

 

H	6.9
		I	9.1
J	8.74

在上述大量试验的基础上，确定了高含量丹参多酚酸盐丹参药材纹图谱检测方法。

本发明提供了高含量丹参多酚酸盐粉针剂的丹参药材指纹图谱检测方法，该方法包括下列步骤：

丹参(Danshen)拉丁名Rakix Salviae Miltiorrhizae

(1)来源

来源于唇形科植物丹参Salviae miltiorrhizae Bge的干燥根及根茎。

(2)供试品的制备

药材经粉碎机粉碎后过40目筛，取各批药材粉末500mg，精密称定，置于100ml具塞三角瓶中，各加30ml蒸馏水浸泡过夜，转移至圆底烧瓶中，再用30ml蒸馏冷却后用10％盐酸调pH值至2.0(用酸度计测定)，再用乙酸乙酯萃取3次，每次80ml。萃取液减压浓缩后用流动相超声溶解，并用容量瓶定容至10ml，作为供试品溶液。HPLC分析前用微孔滤膜过滤。

(3)参照物溶液的制备

丹参乙酸作为参照物，准确称取4.0mg，用流动相定容至5ml，作为参照物溶液。

(4)检测方法

测定方法为高效液相色谱法(HPLC)。

1)仪器与试剂

Agilent1100高效液相色谱仪及Chemstation色谱工作站，ZorbaxC₁₈(4.6mm×25cm，5μm)色谱分析柱。所用甲醇为色谱纯，水为重蒸水，甲酸为分析纯。

2)测定条件和测定方法

a测定方法

流动相为甲醇-乙腈-水-甲酸(42：1：59：0.2)，检测波长为254nm，柱温为30℃，斜率2，峰宽0.05，最小峰面积为50，最小峰高为2，流速为0.7ml/min；

b.测定方法

分别取各批药材供试品溶液5μL，注入高效液相色谱仪中进行色谱分析，记录各个峰的保留时间和积分面积。

(5)丹参多酚酸盐粉针剂药材指纹图谱及技术参数

1)指纹图谱及共有指纹峰的标定

根据10批供试品HPLC图谱所给出的相关参数，丹参药材的色谱图中有7个色谱峰是各批样品所共有的，其峰面积总和占总峰面积之和的百分比为91.87％，编号分别为1、2、3、4、5、6、7，其中1和2为组峰，各峰相对保留时间的比值为1：2：3：4：5：6：7＝0.22：0.32：0.47：0.55：0.60：0.77：1.00(见HPLC图谱)。图1

2)共有指纹峰面积的比值

10批供试品中7个指定的共有峰峰面积的比值为1：2：3：4：5：6：7＝0.109：0.172：0.121：0.020：0.035：0.126：1.00。各共有峰所占总峰面积的百分比平均值分别为组峰1，6.35％；组峰2，9.50％；峰3，7.06％；峰4，1.16％；峰5，2.07％；峰6，7.35％；峰7(参照物)，58.38％。由此可见，7个共有峰中只有峰7的相对峰面积超过10％，而其它6个共有峰的相对峰面积均在10％以下，因此只要求其色谱峰的存在，而不要求其峰面积比值的一致性，峰7的相对峰面积允许变化范围是46.28％-70.48％。

2、丹参多酚酸盐指纹图谱检测方法：

本发明的方法基于下列试验：

(1)供试品的制备

丹参多酚酸盐为本发明的中间体产品共10批。

(2)参照物(对照品)溶液的制备

由于丹参多酚酸盐中也是丹参乙酸为其主要成分，考虑其峰面积在指纹图谱中所占的比例较大且较稳定，因此我们选之为参照物。制备方法也为直接溶解在流动相中，结果证明方法可行，效果良好。

(3)流动相的确定

试验共选择了5种流动相系统：(1)甲醇-0.1％冰乙酸(5：95)；(2)甲醇-5mol/L磷酸二氢钾液(30：70)；(3)甲醇-5mol/L磷酸二氢钾液(25：75)；(4)甲醇-乙腈-水(41.5：1：48.5，用甲酸调pH至2.20)；(5)甲醇-乙腈-水-甲酸(42：1：59：0.2)。结果表明，各种流动相中以甲醇-乙腈-水-甲酸(42：1：59：0.2)系统为最佳，谱图上各个色谱峰(254nm)分离度较好，保留时间适宜，因此选此流动相系统作为丹参注射液的HPLC指纹图谱检测的流动相。

(4)检测波长的选择

试验过程中共选择了254nm、290nm2种波长，在这两种波长下的HPLC谱图中均有多个色谱峰，但在检测波长为254nm时色谱峰较多且峰型较好，综合考虑，选择254nm为制作指纹图谱的测定波长。

(5)稳定性及精密度试验

以批号为000717的丹参多酚酸盐为供试品，分别在0天，10天和30天进样，结果样品在30天内稳定。取样品连续进样6次，记录各共有色谱峰保留时间和积分面积，以丹参乙酸镁的保留时间和积分面积为参照，换算出各共有峰的相对保留时间和相对积分面积，结果(表1)显示丹参多酚酸盐各共有峰的(相对)保留时间和积分面积基本一致，相对标准偏差均小于3％。

表1 丹参多酚酸盐HPLC色谱分析的精密度试验

注：S表示参照物

(6)重现性试验

取批号为000717的丹参供试品6份，按上述方法进行制备并进行检测，考察各色谱峰相对保留时间、峰面积比值的一致性，结果(表2)表明6份供试品3个共有峰的相对保留时间及相对峰面积的相对标准偏差均小于3％。

表2 丹参多酚酸盐HPLC分析重现性试验

 

色谱峰编号	相对保留时间(RSD，％)	相对峰面积(RSD，％)
			1	2.21	1.64
3	2.52	1.35
			4(S)	2.46	1.24

4、丹参多酚酸盐HPLC指纹图谱及技术参数

(1)指纹图谱及共有指纹峰的标定

根据10批供试品HPLC图谱所给出的相关参数，丹参多酚酸盐的所有成分的色谱峰在60min之内全部出现，并且各批样品中均有4个色谱峰。考虑到成品中有些批次样品只出现3个共有峰，而且这三个共有峰均在丹参多酚酸盐中出现，且三个峰面积之和大于95％，因此确定与成品中相同的三个峰为丹参多酚酸盐指纹图谱的共有指纹峰。

(2)共有指纹峰面积及保留时间的比值

10批中间体供试品，以丹参乙酸镁为参照物，各共有指纹峰的积分面积及相对积分面积，保留时间及相对保留时间见表3；表4所示中共有指纹峰占总峰面积的比例、差值，结果可见各批供试品的重现性较好，也符合《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求》(暂行)。

表3 丹参多酚酸盐注射剂粉针剂共有指纹峰面积及保留时间的比值

 

指纹峰编号	指纹峰相对面积	指纹峰相对保留时间
			1	0.02	0.77
3	0.07	0.93
			4(S)	1.0	1.0(18.31±0.56<sup>*</sup>)

注：^*为参照物的绝对保留时间

在上述大量试验基础上，本发明提供了高含量丹参多酚酸盐指纹图谱检测方法。

本发明提供了丹参多酚酸盐指纹图谱检测方法，该方法包括下列步骤：

1、供试品溶液的制备

分别取丹参多酚酸盐5.0mg，精密称重，置5ml容量瓶中，用流动相甲醇-乙腈-水甲酸(42：1：59：0.2)定容，吸取5μL注入高效液相色谱柱进行分析。

2、参照物(对照品)溶液的制备

准确取丹参乙酸镁照品4.0mg，精密称重，置5ml容量瓶中，用流动相甲醇-乙腈-水-甲酸(42：1：59：0.2)定容，用丹参多酚酸盐指纹图谱的参照物(对照品)。

3、检测方法

测定方法为高效液相色谱法(HPLC)。

4、指纹图谱及共有指纹峰的指定

(1)10批丹参多酚酸盐供试品HPLC图谱均出现4个色谱峰，确定峰1(相对保留时间0.77)，峰3(相对保留时间0.93)和峰4(相对保留时间1.00)为共有指纹峰，即各批样品均应出现这3个共有峰。(见HPLC图谱)图2

(2)共有指纹峰面积的比值

10批供试品，以丹参乙酸镁为参照物，超过总峰面积5％的共有指纹峰的积分面积的比值为峰3：峰4＝0.07:1.00，其中峰3的允许变化范围为4.33％-8.05％，峰4为参照物。

3、高含量丹参多酚酸盐粉针剂的指纹图谱检测方法：

本发明的方法基于下列试验：

(1)供试品的制备

丹参多酚酸盐粉针剂为本发明产品共10批。该品为冻干粉针，考虑到其中成分相对单一，因此用流动相直接溶解作为供试品溶液，以避免应用其他溶剂出现溶剂峰。结果证明制备方法可行。

(2)参照物的制备

由于丹参多酚酸盐粉针剂中丹参乙酸为其主要成分，10批粉针剂经高效液相色谱分析后最多出现4个色谱峰，丹参乙酸的积分面积在指纹图谱中所占的比例较大且较稳定，因此我们选之为参照物。其制备方法也是参照供试品的制备方法直接将丹参乙酸镁盐对照品溶解于流动相行分析。

(3)流动相的确定

试验过程共选择了5种流动相系统：(1)甲醇-0.1％冰乙酸(5：95)；(2)甲醇-5mol/L磷酸二氢钾液(30：70)；(3)甲醇-5mol/L磷酸二氢钾液(25：75)；(4)甲醇-乙腈-水(41.5：1：48.5，用甲酸调pH至2.20)；(5)甲醇-乙腈-水-甲酸(42：1：59：0.2)。结果表明，各种流动相中以甲醇-乙腈-水-甲酸(42：1：59：0.2)系统为最佳，谱图上各个色谱峰(254nm)分离度较好，保留时间适宜，因此选此流动相系统作为丹参注射液的HPLC指纹图谱检测的流动相。

(4)检测波长的选择

试验过程中共选择了254nm、290nm2种波长，在这两种波长下的HPLC谱图中均有3个色谱峰，另外在分析药材时，检测波长为254nm时色谱峰较多且峰型较好，综合考虑，选择254nm为制作指纹图谱的测定波长。

(5)稳定性

以批号为0001216粉针剂为供试品，分别于0天，10天和30天进样，记录各进有色谱峰保留时间和积分面积，以丹参乙酸镁的保留时间和积分面积为参照，换算出各共有峰的相对保留时间和相对积分面积，结果表明供试品的稳定性良好。

(6)精密度试验

以批号为001216的样品为供试品连续进样6次，记录各共有色谱峰保留时间和积分面积，以丹参乙酸镁的保留时间和积分面积为参照，换算出各共有峰的相对保留时间和相对积分面积，结果(表1)显示丹参酚酸盐粉针剂共有峰的(相对)保留时间和(相对)积分面积一致，相对标准偏差均小于1.5％。结果表明仪器的精密度良好。

表1 丹参多酚酸盐粉针剂HPLC分析精密度试验

注：S为参照相物

(7)重现性试验

取批号001216的供试品5份，按上述方法时行制备并进行检测，考察各色谱峰相对保留时间、峰面积比值的一致性，结果(表2)表明5份供试品都有4个色谱峰，其中3个为共有峰，其相对保留时间及相对峰面积的相对联标准偏差均小于3％，表明其重现性良好。

表2 丹参多酚酸盐粉针剂HPLC分析重现性试验

注：S为参照物

4、指纹图谱及技术参数

(1)指纹图谱

在指定的色谱条件下，考察了洗脱1小时和2小时的色谱图的出峰情况，结果所有色谱峰均在25分钟以内洗脱完全。10批样品各共有峰的相对保留时间和峰面积见表3。

表3 丹以多酚酸盐粉针剂共有指纹峰面积及保留时间比值

注：S为参照物，^*为参照物的绝对保留时间

(2)共有指纹峰的标定

按指纹图谱技术要求，共有指纹峰的峰面积之和应在95％以上，根据10批样品的测试结果，5批样品出现4个色谱峰，而另外5批样品出现3个色谱峰，这3个色谱峰是10批样品中所共有的色谱峰，其峰面积总和平均值为99.69％，因此选择这3个峰作为共有指纹峰。共有峰所占总峰面积的比例及实测各批样品峰面积的最大值和最小值见表4。

在上述大量试验基础上确定了高含量丹参酚酸盐粉针剂指纹图检测方法。

本发明提供了高含量丹参多酚酸盐粉针剂指纹图谱检测方法，该方法包括下列步骤：

(1)供试品溶液的制备

分别取粉针剂5.0mg，精密称重，置5mL容量瓶中，用流动相甲醇-乙腈-水甲酸(42：1：59：0.2)定容，吸取5μL注入高效液相色谱柱进行分析。

(2)参照物溶液的制备

准确取丹参乙酸镁对照品4.0mg，精密称重，置5mL容量瓶中，用流动相甲醇-乙腈-水甲酸((42：1：59：0.2))定容，用于丹参多酚酸盐粉针剂指纹图谱的参照物(对照品)。

(3)检测方法

测定方法为高效液相色谱法(HPLC)。

1)仪器与试剂

Agilent1100高效液相色谱仪及Chemstation色谱工作站，ZorbaxC₁₈(4.6mm×25cm，5μm)色谱分析柱。所用甲醇为色谱纯，水为重蒸水，甲酸为分析纯。

2)测定条件与测定方法

a.测定条件

流动相为甲醇-乙腈-水-甲酸(42：1：59：0.2)，检测波长为254nm，柱温为30℃，斜率2，峰宽0.05，最小峰面积为20，最小峰高为1，流速为0.7ml/min；

b.测定方法

分别取各批注射剂供试品溶液5μL，注入高效液相色谱仪中进行分析，记录各峰的保留时间和积分面积。

(4)指纹图谱及技术参数

1)指纹图谱及共有指纹峰的标定

根据10批供试品HPLC图谱所给出的相关参数，丹参多酚酸盐粉针剂所有成分的色谱峰在60min之内全部出现，并确定3个色谱峰(峰1：保留时间为14.10min；峰2：保留时间为17.00min；峰3：保留时间为18.25min)为共有指纹峰。(见HPLC指纹图谱)图3

2)共有指纹峰面积及保留时间的比值

各共有指纹峰的相对保留时间的比值为：峰1/峰2/峰3＝0.78/0.93/1.00。峰1所占总峰面积的百分比平均值为1.75％，峰2占总峰面积的百分比的平均值为4.97％，峰3所占总峰面积的百分比的平均值为92.97％，因此3个共有峰中只有峰3即参照物的峰面积超过5％，无法按指纹图谱技术要求计算其比值，该峰理论上的允许变化范围是74.38％-111.56％。

本发明的方法实现了在同一色谱条件(甲醇-乙腈-水-甲酸(42：1：59：0.2，检测波长254nm)下，直接进样就可完成指纹图谱的测试，经多批成品、中间体及药材的检查，结果表明这种方法稳定、可靠、简便、可以有效地控制丹能多酚酸盐粉针剂中主要成分(丹参乙酸镁)及其它组分的质量，同时表明不同批号的成品、中间体、药材的稳定性、重现性良好。

本发明提供了丹参多酚酸盐的质量标准如下：

【制法】取丹参，加水煎煮三次，每次煎煮2小时。合并煎煮液，滤过，滤液通过大孔树脂，依次用水、20％乙醇溶液、50％乙醇溶液洗脱。收集50％乙醇溶液的洗脱液，减压浓缩至丹参量的1/10，于搅拌下缓缓加入乙醇使溶液含醇量达90％，静置，取上清液滤过，滤液再浓缩至丹参量的1/20，于搅拌下缓缓加入无水乙醇使溶液含醇量达95％，静置，取上清液滤过，滤液减压浓缩至干，粉碎即得。

【性状】本品为浅棕色粉末，味微苦，微涩。

【鉴别】(1)取本品0.2g，炽灼灰化后，加少量6％醋酸溶液使溶解，加水至10ml，滤过，滤液应显镁盐的鉴别反应(中国药典2000年版一部附录IV)。

(2)在含量测定项下记录的色谱图中，供试品应具与丹参乙酸镁对照品保留时间一致的色谱峰。

【检查】酸度 取本品，加水制成每1ml含5mg的溶液，依法测定(中国药典2000年版一部附录VII G)测定，pH值应为4.0—6.0。

水分 取本品，照水分测定法(中国药典2000年版一部附录IX H第三法)测定，不得过5.0％。

蛋白质 取本品50mg，加水10ml使溶解。取1ml，加新配制的30％磺基水杨酸溶液1ml，混合，放置5分钟，不得出现浑浊。

鞣质 取本品50mg，加水10ml使溶解，滤过，用截留分子量3000的超滤膜截留鞣质，滤膜及滤器用水洗涤二次，每次10ml，取出滤膜，用水10ml洗涤，取洗液1ml，加新配制的含1％鸡蛋清的生理盐水5ml，放置10分钟，不得出现浑浊或沉淀。

树脂 取本品50mg，加水10ml使溶解。取5ml，加盐酸1滴，放置30分钟，应无絮状物析出。

草酸盐 取本品50mg，加水10ml使溶解，取2ml，加3％氯化钙溶液2—3滴，放置10分钟，不得出现浑浊或沉淀。

炽灼残渣 取本品0.2g，依法检查(中国药典2000年版一部附录IX J)，遗留残渣应为4.5—7.5％。

重金属 取炽灼残渣项下遗留的残渣，依法检查(中国药典2000年版一部附录IXE第二法)，含重金属不得过百万分之十。

砷盐 取本品1.0g，加2％硝酸镁乙醇溶液5ml，点燃，燃尽后，先用小火炽灼使碳化，再在500—600℃炽灼至完全灰化，放冷，加盐酸5ml和水21ml使溶解，依法检查(中国药典2000年版一部附录IX F第一法)，含砷量不得过百万分之二。

钾离子 精密称取本品20mg，依法检查(中国药典2000年版一部附录IX S)，应符合规定。

大孔吸附树脂有机残留物 照气相色谱法(中国药典2000年版二部附录VIII P第二法)测定。

大孔吸附树脂有机残留物 正己烷、苯、甲苯、对二甲苯、邻二甲苯、苯乙烯和1，2-二乙基苯 精密称取正己烷、苯、甲苯、对二甲苯、邻二甲苯、苯乙烯和1，2-二乙基苯适量，加0.6％十二烷基硫酸钠溶液制成每1ml中分别含15μg、10μg、12μg、12μg、13μg、16μg和13μg的溶液，摇匀，精密量取5ml，置20ml顶空取样瓶中，作为对照溶液；另取本品约0.2g，精密称定，置20ml顶空取样瓶中，精密加入0.6％十二烷基硫酸钠溶液5ml，摇匀，作为供试品溶液。照有机溶剂残留量测定法(中国药典2000年版二部附录VIII P第二法)测定，用交联聚乙二醇毛细管色谱柱(30m×0.25mm，涂层厚0.25μm)，柱温50℃；理论塔板数以甲苯峰计算应不低于7000，各成分峰之间的分离度应符合规定。取对照溶液和供试品溶液在120℃加热15分钟后，依法测定，记录色谱图。供试品溶液的色谱图中如显与对照溶液相应的色谱峰，按外标法以峰面积计算，含正己烷、甲苯、对二甲苯、邻二甲苯、苯乙烯和1，2-二乙基苯均不得过0.002％，含苯不得过0.0002％。

溶血 2％兔血红细胞混悬液的制备

取家兔心脏血，置有珠玻璃的容器内，振摇数分钟，除去纤维蛋白原，使成脱纤血，加生理氯化纳溶液，摇匀，离心，倾去上清液，沉淀的红细胞再用生理氯化钠溶液洗涤3—4次，至离心后上清液不显红色为止，然后按所得红细胞体积，用生理氯化钠溶液稀释成2％混悬液。当天使用，用时摇匀。

供试品溶液的配制

取本品，加生理氯化钠溶液制成每1ml含5mg的溶液。

试验方法取试管若干，每批供试品设5组，每组2管，另设阴性和阳性对照各2管，按下表配比量依次加入2％红细胞混悬液、生理氯化钠溶液和蒸馏水，摇匀后，于37℃恒温水浴内，保持30分钟，然后分别加入不同量的供试品溶液，摇匀后，置37℃恒温水浴内。开始每15分钟观察一次，1小时后每1小时观察一次，共观察4小时。阳性对照管应呈透明红色，阴性对照管及0.3ml供试管不得有溶血及凝聚现象。

 

供试品1  2  3  4  5

阴性对照

阳性对照

 

2％红细胞混悬液(ml)	2.5  2.5  2.5  2.5  2.5	2.5	2.5
				生理氯化钠溶液(ml)	2.0  2.1  2.2  2.3  2.4	2.5
蒸馏水(ml)			2.5
				供试品(ml)	0.5  0.4  0.3  0.2  0.1

【指纹图谱】照高效液相色谱法(中国药典2000年版一部附录VI D)测定。

色谱条件与系统适应性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇—乙腈—水—甲酸(42：1：59：0.2)为流动相，流速为每分钟0.7ml；检测波长为254nm，柱温30℃。理论塔板数按丹参乙酸镁峰计算应不低于7000。

参照物溶液的制备 称取丹参乙酸镁对照品适量，精密称定，加流动相制成每1ml含0.8mg的溶液，即得。

供试品溶液的制备 取本品适量，精密称定，置5ml量瓶中，加流动相制成每1ml含1.0mg的溶液，即得。

测定法 分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

以供试品指纹图谱中与参照物保留时间相同的峰为S峰，计算相对保留时间和峰面积比值，应符合下列要求：

供试品指纹图谱应与标准指纹图谱相似；

指纹图谱应有3个共有峰；

相对保留时间 0.77(1)、0.93(2)、1.00(s)，其相对偏差不得过±10％；

峰面积比值：以S峰峰面积比值为1.00，峰面积比值不得大于0.088(2号峰)

非共有峰面积 不得大于总峰面积的5％

标准指纹图谱图4

仪器、色谱柱及积分参数：Agilent 1100系列高效液相色谱仪，Chemstation色谱工作站。色谱柱为ZorbaxC₁₈(4.6mm×25cm，5μm)；柱温30℃。斜率：2，峰宽：0.05；最小峰面积为20，最小峰高为1。

【含量测定】

丹参乙酸镁 照高效液相色谱法(中国药典2000年版一部附录VI D)测定。

色谱条件与系统适应性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇—5mmol/L磷酸二氢钾溶液(30：70)为流动相；检测波长为290nm。理论板数按丹参乙酸镁峰计算应不低于1500，丹参乙酸镁峰与相邻峰的分离度应大于2.0。

对照品溶液的制备 取丹参乙酸镁对照品适量，精密称定，加流动相制成每1ml含30μg的溶液，即得。

供试品溶液的制备 取本品20mg，精密称定，置50ml量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取2ml，置20ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得。

测定法 分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

本品含丹参乙酸镁量应为80～90％。

【功能主治】活血、化瘀、通脉。用于冠心病稳定型心绞痛，分级为I、II级，心绞痛症状表现为轻、中度，中医辨证为心血瘀阻证者，症见胸痛、胸闷、心悸。

【用法用量】静脉滴注。一次200mg，用5％葡萄糖注射液250ml—500ml溶解后使用。一日1次。疗程2周。

【不良反应】

1.少数患者发生头晕、头昏、头胀痛。

2.偶有患者在输液中因静滴速度快致轻度头痛。

3.偶尔有血谷丙转氨酶升高，在停药后消失。

【注意事项】

1.有出血倾向者慎用。

2.孕妇、哺乳期妇女慎用。

3.目前尚无充分的药物相互作用研究资料。

【贮藏】密封，避光保存。

【规格】每袋装1kg(含丹参乙酸镁0.8kg)。每袋装3kg(含丹参乙酸镁2.4kg)。每瓶装5kg(含丹参乙酸镁4.0kg)。

【包装】铝箔复合膜袋。

【制剂】注射用丹参多酚酸盐

【有效期】暂定18个月。

本发明还提供了注射用丹参多酚酸盐的质量标准如下：

本品为丹参多酚酸盐制成无菌粉末。

【制法】取丹参多酚酸盐50g、100g或200g，以注射用水溶解，经滤过除菌、分装成1000瓶，冷冻干燥即得。

【性状】本品为浅棕色疏松块状物，味微苦，微涩。

【鉴别】(1)取本品0.2g，炽灼灰化后，加少量6％醋酸溶液使溶解，加水至10ml，滤过，滤液应显镁盐的鉴别反应(中国药典2000年版一部附录IV)。

(2)在含量测定项下记录的色谱图中，供试品应具与丹参乙酸镁对照品保留时间一致的色谱峰。

【检查】澄明度 在超净台内操作。取洁净具塞纳氏比色管5支，分别加入预先滤过的注射用水10ml，按《澄明度检查细则和判断标准》注射用无菌粉末项，于伞棚边沿处轻轻旋转，使溶剂形成旋流，随即用目检视，记录毛，点数，作为空白，然后分别加入1瓶供试品，使完全溶解，于伞棚边沿处横置观察，轻轻旋转或左右摆动，用目检视，记录毛、点数，扣除空白，即得。

本品每瓶所含短于0.5cm的毛及200—500μm的白点、白块和色点总数不得超过10个。

不溶性微粒 取本品1瓶的内容物，用净化水125ml溶解，用净化水作空白，依法测定(中国药典2000年版一部附录IX R光阻法)，应符合规定。

酸度 取本品，加水制成每1ml含5mg的溶液，依法测定(中国药典2000年版一部附录VII G)，pH值应为4.0—6.0。

水分 取本品，照水分测定法(中国药典2000年版一部附录IX H第三法)测定，不得过5.0％。

蛋白质 取本品50mg，加水10ml使溶解。取1ml，加新配制的30％磺基水杨酸溶液1ml，混合，放置5分钟，不得出现浑浊。

鞣质 取本品50mg，加水10ml使溶解，滤过，用截留分子量3000的超滤膜截留鞣质，滤膜及滤器用水洗涤二次，每次10ml，取出滤膜，用水10ml洗涤，取洗液1ml，加新配制的含1％鸡蛋清的生理盐水5ml，放置10分钟，不得出现浑浊或沉淀。

树脂 取本品50mg，加水10ml使溶解。取5ml，加盐酸1滴，放置30分钟，应无絮状物析出。

草酸盐 取本品50mg，加水10ml使溶解，取2ml，加3％氯化钙溶液2—3滴，放置10分钟，不得出现浑浊或沉淀。

炽灼残渣 取本品0.2g，依法检查(中国药典2000年版一部附录IX J)，遗留残渣应为4.5—7.5％。

重金属 取本品1.0g，依法检查(中国药典2000年版一部附录IX E第二法)含重金属不得过百万分之十。

砷盐 取本品1.0g，加2％硝酸镁乙醇溶液5ml，点燃，燃尽后，先用小火炽灼使碳化，再在500—600℃炽灼至完全灰化，放冷，加盐酸5ml和水21ml使溶解，依法检查(中国药典2000年版一部附录IX F第一法)含砷量不得过百万分之二。

热原 取本品，加灭菌注射用水制成每1ml含5mg的溶液，依法检查(中国药典2000年版一部附录XIII A)，剂量按家兔体重每1Kg注射2ml，应符合规定。

溶血 2％兔血红细胞混悬液的制备

取家兔心脏血，置有珠玻璃的容器内，振摇数分钟，除去纤维蛋白原，使成脱纤血，加生理氯化纳溶液，摇匀，离心，倾去上清液，沉淀的红细胞再用生理氯化钠溶液洗涤3—4次，至离心后上清液不显红色为止，然后按所得红细胞体积，用生理氯化钠溶液稀释成2％混悬液。当天使用，用时摇匀。

供试品溶液的配制

取本品，加生理氯化钠溶液制成每1ml含5mg的溶液。

试验方法 取试管若干，每批供试品设5组，每组2管，另设阴性和阳性对照各2管，按下表配比量依次加入2％红细胞混悬液、生理氯化钠溶液和蒸馏水，摇匀后，于37℃恒温水浴内，保持30分钟，然后分别加入不同量的供试品溶液，摇匀后，置37℃恒温水浴内。开始每15分钟观察一次，1小时后每1小时观察一次，共观察4小时。阳性对照管应呈透明红色，阴性对照管及0.3ml供试管不得有溶血及凝聚现象。

 

供试品

阴性对照

阳性对照

 

	1    2    3    4    5
				2％红细胞混悬液(ml)	2.5  2.5  2.5  2.5  2.5	2.5	2.5
生理氯化钠溶液(ml)	2.0  2.1  2.2  2.3  2.4	2.5
				蒸馏水(ml)			2.5
供试品(ml)	0.5  0.4  0.3  0.2  0.1

【指纹图谱】照高效液相色谱法(中国药典2000年版一部附录VI D)测定。

色谱条件与系统适应性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇—乙腈—水—甲酸(42：1：59：0.2)为流动相，流速为每分钟0.7ml；检测波长为254nm，柱温30℃。理论塔板数按丹参乙酸镁峰计算应不低于7000。

参照物溶液的制备 称取丹参乙酸镁对照品适量，精密称定，加流动相制成每1ml含0.8mg的溶液，即得。

供试品溶液的制备 取本品适量，精密称定，置5ml量瓶中，加流动相制成每1ml含1.0mg的溶液，即得。

测定法 分别精密吸取参照物和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

以供试品指纹图谱中与参照物保留时间相同的峰为S峰，计算相对保留时间和峰面积比值，应符合下列要求。

供试品指纹图谱应与标准指纹图谱相似；

指纹图谱应有3个共有峰；

相对保留时间0.78(1)、0.93(2)、1.00(s)，其相对偏差不得过±10％；

非共有峰面积 不得大于总蜂面积的5％

标准指纹图谱

仪器、色谱柱及积分参数：HP 1100系列高效液相色谱仪，Chemstation色谱工作站。色谱柱Zorbax C₁₈(4.6mm×25cm，5μm)；柱温30℃。斜率：2，峰宽：0.05；最小峰面积为20，最小峰高为1。

【含量测定】

丹参乙酸镁 照高效液相色谱法(中国药典2000年版一部附录VID)测定。

色谱条件与系统适应性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇—5mmol/L磷酸二氢钾溶液(30：70)为流动相；检测波长为290nm。理论板数按丹参乙酸镁峰计算应不低于1500，丹参乙酸镁峰与相邻峰的分离度应大于2.0。

对照品溶液的制备 取丹参乙酸镁对照品适量，精密称定，加流动相制成每1ml含30μg的溶液，作为对照品溶液。

供试品溶液的制备 取装量差异项下的内容物，混匀，取20mg，精密称定，置50ml量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取2ml，置20ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得。

测定法 分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

本品每瓶含丹参乙酸镁量应为标示量的90—110％。

【功能主治】活血、化瘀、通脉。用于冠心病稳定型心绞痛，分级为I、II级，心绞痛症状表现为轻、中度，中医辨证为心血瘀阻证者，症见胸痛、胸闷、心悸。

【用法用量】静脉滴注。一次200mg，用5％葡萄糖注射液250ml—500ml溶解后使用。一日1次。疗程2周。

【不良反应】

4.少数患者发生头晕、头昏、头胀痛。

5.偶有患者在输液中因静滴速度快致轻度头痛。

6.偶尔有血谷丙转氨酶升高，在停药后消失。

【注意事项】

4.有出血倾向者慎用。

5.孕妇、哺乳期妇女慎用。

6.目前尚无充分的药物相互作用研究资料。

【规格】每瓶装50mg(含丹参乙酸镁40mg)。每瓶装100mg(含丹参乙酸镁80mg)。每瓶装200mg(含丹参乙酸镁160mg)。

【贮藏】密封，避光保存。

【包装】西林瓶包装。

【有效期】暂定18个月。

附图说明：

图1丹参药材HPLC图。

图2丹参多酚酸盐HPLC图。

图3高含量丹参多酚酸盐粉针剂HPLC图。

具体实施方式

实施例1：

丹参药材指纹图谱检测

【指纹图谱】照高效液相色谱法(中国药典2000年版一部附录VI D)测定。

色谱条件与系统适应性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇—乙腈—水—甲酸(42：1：59：0.2)为流动相，流速为每分钟0.7ml；检测波长为254nm，柱温30℃。理论塔板数按丹参乙酸镁峰计算不低于7000。

参照物溶液的制备 精密称定丹参乙酸镁对照品4.1mg，加流动相稀释至5ml量瓶，即得。

供试品溶液的制备 取丹参粉碎，过3号药筛，精密称取0.5002g，置100ml碘瓶中，加水30ml浸泡过夜，再转移至圆底烧瓶中，用水30ml清洗碘瓶，清洗液并入圆底烧瓶，加热回流2小时，趁热滤过，滤液冷却后用10％盐酸溶液调节pH值至2.0(用酸度计测定)，用醋酸乙酯萃取3次，每次80ml。萃取液减压回收溶剂，加流动相超声溶解，转移至10ml量瓶中，并用流动相稀释至刻度，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，取续滤液即得。

测定法 分别精密吸取参照物和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

以供试品指纹图谱中与参照物保留时间相同的峰为S峰，计算相对保留时间和峰面积比值。

供试品指纹图谱有7个共有峰；

相对保留时间：0.200.23(1)、0.310.34(2)、0.47(3)、0.55(4)、0.60(5)、0.78(6)、1.00(s)，其相对偏差不超过±10％；

峰面积：821.2(1)、915.4(2)、1468.9(3)、657.8(4)、1165.5(5)、2359.6(6)、15441.2(s)

非共有峰面积百分比为7.31％，小于总蜂面积的10％

供试品指纹图谱与丹参药材标准指纹图谱一致，符合规定要求。

实施例2：

丹参多酚酸盐指纹图谱检测

【指纹图谱】照高效液相色谱法(中国药典2000年版一部附录VI D)测定。

色谱条件与系统适应性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇—乙腈—水—甲酸(42：1：59：0.2)为流动相，流速为每分钟0.7ml；检测波长为254nm，柱温30℃。理论塔板数按丹参乙酸镁峰计算不低于7000。

参照物溶液的制备 精密称定丹参乙酸镁对照品4.8mg，加流动相稀释至5ml量瓶，即得。

供试品溶液的制备 取本品5.5mg，置5ml量瓶中，加流动相稀释至5ml量瓶，即得。

测定法 分别精密吸取参照物和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

以供试品指纹图谱中与参照物保留时间相同的峰为S峰，计算相对保留时间和峰面积比值。

供试品指纹图谱有3个共有峰；

相对保留时间：0.76(1)、0.89(2)、1.00(s)，其相对偏差不超过±10％；

峰面积：154.38(1)、359.80(2)、7697.9(s)

非共有峰面积百分比为1.93％，小于总蜂面积的5％

供试品指纹图谱与丹参多酚酸盐标准指纹图谱一致，符合规定要求。

实施例3：

丹参多酚酸盐粉针剂指纹图谱检测

【指纹图谱】照高效液相色谱法(中国药典2000年版一部附录VI D)测定。

色谱条件与系统适应性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇—乙腈—水—甲酸(42：1：59：0.2)为流动相，流速为每分钟0.7ml；检测波长为254nm，柱温30℃。理论塔板数按丹参乙酸镁峰计算不低于7000。

参照物溶液的制备 精密称定丹参乙酸镁对照品4.3mg，加流动相稀释至5ml量瓶，即得。

供试品溶液的制备 取本品5.0mg，置5ml量瓶中，加流动相稀释至5ml量瓶，即得。

测定法 分别精密吸取参照物和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

以供试品指纹图谱中与参照物保留时间相同的峰为S峰，计算相对保留时间和峰面积比值。

供试品指纹图谱有3个共有峰；

相对保留时间：0.79(1)、0.94(2)、1.00(s)，其相对偏差不超过±10％；

峰面积：526.20(1)、1072.74(2)、21240(s)

非共有峰面积百分比为2.62％，小于总蜂面积的5％

供试品指纹图谱与丹参多酚酸盐粉针剂标准指纹图谱一致，符合规定要求。

Claims (1)

1、一种丹参药材指纹图谱检测方法，其特征在于该检测方法包括下列步骤：

①丹参供试品的制备

药材经粉碎机粉碎后过40目筛，取各批药材粉末500mg，精密称定，置于100ml具塞三角瓶中，各加30ml蒸馏水浸泡过夜，转移至圆底烧瓶中，再用30ml蒸馏水清洗三角瓶，清洗液一并转入圆底烧瓶中，回流提取2h，趁热过滤，滤液冷却后用10％盐酸调pH值至2.0，再用乙酸乙酯萃取3次，每次80ml，萃取液减压浓缩后用流动相超声溶解，并用容量瓶定容至10ml，作为供试品溶液，HPLC分析前用微孔滤膜过滤；

②参照物溶液的制备

丹参乙酸镁作为参照物，准确称取4.0mg，用流动相定容至5ml，作为参照物溶液；

③检测方法

测定方法为高效液相色谱法：

1)仪器与试剂

Agilent1100高效液相色谱仪及Chemstation色谱工作站，ZorbaxC₁₈ 4.6mm×25cm，5μm色谱分析柱，所用甲醇为色谱纯，水为重蒸水，甲酸为分析纯；

2)测定条件和测定方法

a测定方法

流动相为甲醇-乙腈-水-甲酸42：1：59：0.2，检测波长为254nm，柱温为30℃，斜率2，峰宽0.05，最小峰面积为50，最小峰高为2，流速为0.7ml/min；

b.测定方法

分别取各批药材供试品溶液5μl，注入高效液相色谱仪中进行色谱分析，记录各个峰的保留时间和积分面积；

④丹参药材指纹图谱及技术参数

1)指纹图谱及共有指纹峰的标定

根据10批供试品HPLC图谱所给出的相关参数，丹参药材的色谱图中有7个色谱峰是各批样品所共有的，其峰面积总和占总峰面积之和的百分比为91.87％，编号分别为1、2、3、4、5、6、7，其中1和2为组峰，各峰相对保留时间的比值为1：2：3：4：5：6：7＝0.22：0.32：0.47：0.55：0.60：0.77：1.00；

2)共有指纹峰面积的比值

10批供试品中7个指定的共有峰峰面积的比值为1：2：3：4：5：6：7＝0.109：0.172：0.121：0.020：0.035：0.126：1.00；各共有峰所占总峰面积的百分比平均值分别为组峰1，6.35％；组峰2，9.50％：峰3，7.06％；峰4，1.16％；峰5，2.07％；峰6，7.35％；峰7参照物，58.38％，由此可见，7个共有峰中只有峰7的相对峰面积超过10％，而其它6个共有峰的相对峰面积均在10％以下，因此只要求其色谱峰的存在，而不要求其峰面积比值的一致性，峰7的相对峰面积允许变化范围是46.28％-70.48％。

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