CN116239581A - 鸡头黄精中提取的黄酮类生物碱及其提取方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及植物提取，具体涉及一种鸡头黄精中提取的黄酮类生物碱及其提取方法和应用。所述黄酮类生物碱选自式I所示的化合物、式II所示的化合物、式III所示的化合物、式IV所示的化合物、式V所示的化合物和式VI所示的化合物中的至少一种，其中，式I、式II、式III、式IV、式V和式VI如下：式I：
Figure DDA0003857681860000011
式II：
Figure DDA0003857681860000012
式III：
Figure DDA0003857681860000013
式IV：
Figure DDA0003857681860000014
式V：
Figure DDA0003857681860000015
式VI：
Figure DDA0003857681860000016
该黄酮类生物碱可以抑制α‑葡萄糖苷酶的活性，具有抗氧化作用，能够用于制备治疗或预防糖尿病药物以及抗氧化药物。

Description

鸡头黄精中提取的黄酮类生物碱及其提取方法和应用
技术领域
本发明涉及植物提取，具体涉及一种鸡头黄精中提取的黄酮类生物碱及其提取方法和应用。
背景技术
鸡头黄精(Polygonatum sibiricum Red.)为百合科黄精属植物，《中国药典》2020版记载，黄精有补气养阴，健脾，润肺，益肾等功效，用于脾胃气虚，体倦乏力，胃阴不足，口干食少，肺虚燥咳，劳嗽咳血，精血不足，腰膝酸软，须发早白，内热消渴。
黄精含有多糖、皂苷、三萜、生物碱、木脂素、黄酮、植物甾醇及挥发油等多种化学成分，其中多糖和皂苷类成分在黄精中量较大，为其主要药效成分。据相关文献报道，黄精多糖是黄精主要的生物学活性成分之一，具有增强免疫功能、抗肿瘤、抗辐射等多种生物学活性。黄精中含有的中性皂苷为甾体皂苷，皂苷类成分主要有薯蓣皂苷元、毛地黄糖苷和菝葜皂苷元。现代药理研究表明，甾体皂苷具有调节血糖、防治心脑血管疾病、抗肿瘤、改善学习记忆等多种药理活性。另外，黄酮类化合物具有抗肿瘤、抗病毒、防衰老、抗菌消炎、防动脉粥样硬化以及保护心脑血管等功能。但是，现有技术中对黄精属植物中提取物的研究还不全面。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的问题，提供一种鸡头黄精中提取的黄酮类生物碱及其提取方法和应用，该黄酮类生物碱可以抑制α-葡萄糖苷酶的活性，具有抗氧化作用，能够用于制备治疗或预防糖尿病的药物以及抗氧化药物。
本发明第一方面提供一种鸡头黄精中提取的黄酮类生物碱，所述黄酮类生物碱选自
Figure SMS_1
/>
Figure SMS_2
中的至少一种。
本发明第二方面提供上述第一方面所述的黄酮类生物碱的提取方法，包括如下步骤：
(1)将鸡头黄精与提取溶剂I混合进行提取得到提取液，将所述提取液浓缩后得到总浸膏；
(2)将所述总浸膏用水分散后，用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取后进行浓缩得到石油醚浸膏、乙酸乙酯浸膏和正丁醇浸膏；
(3)将所述乙酸乙酯浸膏经分离处理，得到所述黄酮类生物碱。
优选地，所述提取方法还包括：在步骤(1)的混合前，对所述鸡头黄精进行干燥、粉碎处理。
优选地，步骤(1)中，所述提取溶剂I为乙醇-水溶液。
优选地，所述提取溶剂I中乙醇与水的体积比为3-9:1。
优选地，步骤(1)中，所述提取的方法为渗漉提取。
优选地，所述渗漉提取的次数为3-6次，每次所述渗漉提取的条件包括：温度为20-30℃，时间为3-4天。
优选地，步骤(2)中，所述总浸膏与所述水的重量比为1:10-20。
优选地，相对于1g的总浸膏，所述石油醚的用量为1-3g，所述乙酸乙酯的用量为1-3g，所述正丁醇的用量为1-3g。
优选地，步骤(3)中，所述分离处理包括：S1、将所述乙酸乙酯浸膏经硅胶柱分离I，并用二氯甲烷-甲醇混合液梯度洗脱，得到Fr.A-Fr.K十一个组分；S2、对所述Fr.D组分、所述Fr.E组分和所述Fr.F组分提纯。
优选地，步骤S2中，所述提纯包括：将所述Fr.D组分经硅胶柱分离II-1，并用二氯甲烷-甲醇混合液梯度洗脱，得到Fr.D.1-Fr.D.10十个组分；将所述Fr.D.10组分经凝胶柱分离II-2，用甲醇等度洗脱后，继续经半制备高效液相分离II-3，并用乙腈-水混合液梯度洗脱；将所述Fr.E组分经硅胶柱分离III-1，并用二氯甲烷-甲醇混合液梯度洗脱，得到Fr.E.1-Fr.E.8八个组分；将所述Fr.E.5组分经凝胶柱分离III-2，并用二氯甲烷-甲醇混合液等度洗脱，得到Fr.E.5.1-Fr.E.5.4四个组分；将所述Fr.E.5.4 组分经半制备高效液相分离III-3，并用乙腈-水混合液梯度洗脱；将所述Fr.F组分经硅胶柱分离IV-1，并用二氯甲烷-甲醇混合液梯度洗脱，得到Fr.F.1-Fr.F.17十七个组分；将所述Fr.F.2组分经反相柱分离IV-2，并用甲醇-水混合液梯度洗脱，得到Fr.F.2.1-Fr.F.2.16十六个组分；将所述Fr.F.2.14组分经凝胶柱分离IV-3，用二氯甲烷-甲醇混合液等度洗脱后，继续经半制备高效液相分离IV-4，并用乙腈- 水混合液等度洗脱；将所述Fr.F.2.10组分经凝胶柱分离IV-5，用二氯甲烷-甲醇等度洗脱后，继续经半制备高效液相分离IV-6，并用乙腈-水混合液等度洗脱；将所述Fr.F.17组分经反相柱分离IV-7，并用甲醇-水溶液梯度洗脱，得到Fr.F.17.1-Fr.F.17.20二十个组分；将所述Fr.F.17.14组分经凝胶柱分离 IV-8，用二氯甲烷-甲醇混合液等度洗脱后，继续经半制备高效液相分离IV-9，并用乙腈-水混合液等度洗脱。
本发明第三方面提供上述第一方面所述的鸡头黄精中提取的黄酮类生物碱、上述第二方面所述的提取方法提取得到的黄酮类生物碱在制备治疗或预防糖尿病药物以及抗氧化药物中的应用。
通过上述技术方案，本发明的有益效果为：
(1)本发明在鸡头黄精中提取出六个新的化合物，且该化合物能够抑制α-葡萄糖苷酶的活性，具有良好的抗氧化能力，可以用于制备治疗或预防糖尿病药物以及抗氧化药物。
(2)式IV、式V、式VI所示的化合物对α-葡萄糖苷酶活性具有一定的抑制效果，式II、式III、式IV、式V、式VI所示的化合物对ABTS自由基具有强清除能力，可以用于制备治疗或预防糖尿病药物以及抗氧化药物。
附图说明
图1是式I所示化合物的HR-ESI-MS谱图；图2是式I所示化合物的1H NMR谱图；图3是式 I所示化合物的13C NMR谱图；图4是式I所示化合物的HSQC谱图；图5是式I所示化合物的1H-1H COSY谱图；图6是式I所示化合物的HMBC谱图；图7是式I所示化合物的手性色谱图；
图8是式II所示化合物的HR-ESI-MS谱图；图9是式II所示化合物的1H NMR谱图；图10 是式II所示化合物的13C NMR谱图；图11是式II所示化合物的HSQC谱图；图12是式II所示化合物的1H-1H COSY谱图；图13是式II所示化合物的HMBC谱图；图14是式II所示化合物的手性色谱图；
图15是式III所示化合物的HR-ESI-MS谱图；图16是式III所示化合物的1H NMR谱图；图17是式III所示化合物的13C NMR谱图；图18是式III所示化合物的HSQC谱图；图19是式III所示化合物的1H-1H COSY谱图；图20是式III所示化合物的HMBC谱图；图21是式III所示化合物的手性色谱图；
图22是式IV所示化合物的HR-ESI-MS谱图；图23是式IV所示化合物的1H NMR谱图；图24是式IV所示化合物的13C NMR谱图；图25是式IV所示化合物的HSQC谱图；图26是式IV所示化合物的1H-1H COSY谱图；图27是式IV所示化合物的HMBC谱图；图28是式IV所示化合物的手性色谱图；
图29是式V所示化合物的HR-ESI-MS谱图；图30是式V所示化合物的1H NMR谱图；图31 是式V所示化合物的13C NMR谱图；图32是式V所示化合物的HSQC谱图；图33是式V所示化合物的1H-1H COSY谱图；图34是式V所示化合物的HMBC谱图；图35是式V所示化合物的手性色谱图；
图36是式VI所示化合物的HR-ESI-MS谱图；图37是式VI所示化合物的1H NMR谱图；图38是式VI所示化合物的13C NMR谱图；图39是式VI所示化合物的HSQC谱图；图40是式VI所示化合物的1H-1H COSY谱图；图41是式VI所示化合物的HMBC谱图；图42是式VI所示化合物的手性色谱图；图43是式VI所示化合物的CD谱图。
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
本发明第一方面提供一种鸡头黄精中提取的黄酮类生物碱，所述黄酮类生物碱选自式I所示的化合物、式II所示的化合物、式III所示的化合物、式IV所示的化合物、式V所示的化合物和式VI 所示的化合物中的至少一种，其中，式I、式II、式III、式IV、式V和式VI如前所示。
具体地，所述黄酮类生物碱可以为式I所示的化合物、式II所示的化合物、式III所示的化合物、式IV所示的化合物、式V所示的化合物或式VI所示的化合物，也可以为式I所示的化合物、式II 所示的化合物、式III所示的化合物、式IV所示的化合物、式V所示的化合物和式VI所示的化合物中的两者混合，也可以为式I所示的化合物、式II所示的化合物、式III所示的化合物、式IV所示的化合物、式V所示的化合物和式VI所示的化合物中的三者混合，也可以为式I所示的化合物、式II 所示的化合物、式III所示的化合物、式IV所示的化合物、式V所示的化合物和式VI所示的化合物中的四者混合，也可以为式I所示的化合物、式II所示的化合物、式III所示的化合物、式IV所示的化合物、式V所示的化合物和式VI所示的化合物中的五者混合，也可以为式I所示的化合物、式II 所示的化合物、式III所示的化合物、式IV所示的化合物、式V所示的化合物和式VI所示的化合物的混合。
本发明的发明人在研究过程中发现，式I所示的化合物、式II所示的化合物、式III所示的化合物、式IV所示的化合物、式V所示的化合物和式VI所示的化合物均可以抑制α-葡萄糖苷酶的活性，具有抗氧化作用，能够用于制备治疗或预防糖尿病的药物以及抗氧化药物。
本发明第二方面提供一种鸡头黄精中提取的黄酮类生物碱的提取方法，包括如下步骤：
(1)将鸡头黄精与提取溶剂I混合进行提取得到提取液，将所述提取液浓缩后得到总浸膏；
(2)将所述总浸膏用水分散后，用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取后进行浓缩得到石油醚浸膏、乙酸乙酯浸膏和正丁醇浸膏；
(3)将所述乙酸乙酯浸膏经分离处理，得到所述黄酮类生物碱；
所述黄酮类生物碱选自式I所示的化合物、式II所示的化合物、式III所示的化合物、式IV所示的化合物、式V所示的化合物和式VI所示的化合物中的至少一种。
根据本发明，优选地，所述提取方法还包括：在步骤(1)的混合前，对所述鸡头黄精进行干燥、粉碎处理。本发明中，鸡头黄精指的是百合科黄精属植物(Polygonatumsibiricum Red.)的根茎，其具体的干燥、粉碎可以采用本领域内常规的干燥和粉碎的方式，例如干燥可以采用烘干、晒干或者真空干燥等方式，粉碎可以采用粉碎机、研磨等方式，然后可以将粉碎后的鸡头黄精过筛，选择合适的鸡头黄精颗粒进行下一步操作。
根据本发明，提取溶剂I可以采用低级脂肪醇或者低级脂肪醇的水溶液，其中，低级脂肪醇可以是甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇等。为了提高黄酮类生物碱从鸡头黄精中溶出与提取的效果，优选地，步骤(1)中所述提取溶剂I为乙醇-水溶液。进一步优选地，所述提取溶剂I中乙醇与水的体积比为3-9:1。
根据本发明，所述提取的方法可以采用任意可行的提取方法，如高压提取法、超声提取法等。优选地，步骤(1)中，所述提取的方法为渗滤提取。该方法能够进一步提高有效成分的提取效率。
根据本发明，对鸡头黄精进行渗漉提取的次数、提取溶剂的用量和时间没有特殊的限定，能够包括黄酮类生物碱在内的物质进行有效提取即可。从更进一步提高有效成分的提取效率来考虑，优选地，所述渗漉提取的次数为3-6次，每次所述渗滤提取的条件包括：温度为20-30℃，时间为3-4天。
本发明中，步骤(1)和步骤(2)中浓缩的方式均可以采用减压蒸馏的方式，也可以采用其他常规的浓缩方式。
根据本发明，在提取溶剂I对鸡头黄精进行提取后，通过固液分离的方式获得提取液，例如采用过滤、离心的方式。
根据本发明，优选地，步骤(2)中，所述总浸膏与所述水的重量比为1:10-20。发明人发现，在该优选地具体实施方式下，总浸膏在水中有较好的分散效果，便于后期有效成分的萃取，进一步提高萃取效率。
本发明中，利用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇的用量和时间没有特殊的限定，能够将含有黄酮类生物碱的组分分离出并经乙酸乙酯进行有效提取即可。优选地，相对于1g的总浸膏，所述石油醚的用量为1-3g，所述乙酸乙酯的用量为1-3g，所述正丁醇的用量为1-3g。在本发明的一个具体实施方式中，相对于1g的总浸膏，所述石油醚的用量为2g，所述乙酸乙酯的用量为2g，所述正丁醇的用量为2g。
根据本发明，为了能够进一步提高分离效果，优选地，步骤(3)中，所述分离处理包括：S1、将所述乙酸乙酯浸膏经硅胶柱分离I，并用二氯甲烷-甲醇混合液梯度洗脱，得到Fr.A-Fr.K十一个组分；S2、对所述Fr.D组分、所述Fr.E组分和所述Fr.F组分提纯。
根据本发明，为了能够更进一步提高分离效果，优选地，步骤S2中，所述提纯包括：将所述 Fr.D组分经硅胶柱分离II-1，并用二氯甲烷-甲醇混合液梯度洗脱，得到Fr.D.1-Fr.D.10十个组分；将所述Fr.D.10组分经凝胶柱分离II-2，用甲醇等度洗脱后，继续经半制备高效液相分离II-3，并用乙腈 -水混合液梯度洗脱；将所述Fr.E组分经硅胶柱分离III-1，并用二氯甲烷-甲醇混合液梯度洗脱，得到 Fr.E.1-Fr.E.8八个组分；将所述Fr.E.5组分经凝胶柱分离III-2，并用二氯甲烷-甲醇混合液等度洗脱，得到Fr.E.5.1-Fr.E.5.4四个组分；将所述Fr.E.5.4组分经半制备高效液相分离III-3，并用乙腈-水混合液梯度洗脱；将所述Fr.F组分经硅胶柱分离IV-1，并用二氯甲烷-甲醇混合液梯度洗脱，得到 Fr.F.1-Fr.F.17十七个组分；将所述Fr.F.2组分经反相柱分离IV-2，并用甲醇-水混合液梯度洗脱，得到Fr.F.2.1-Fr.F.2.16十六个组分；将所述Fr.F.2.14组分经凝胶柱分离IV-3，用二氯甲烷-甲醇混合液等度洗脱后，继续经半制备高效液相分离IV-4，并用乙腈-水混合液等度洗脱；将所述Fr.F.2.10组分经凝胶柱分离IV-5，用二氯甲烷-甲醇等度洗脱后，继续经半制备高效液相分离IV-6，并用乙腈-水混合液等度洗脱；将所述Fr.F.17组分经反相柱分离IV-7，并用甲醇-水溶液梯度洗脱，得到Fr.F.17.1-Fr.F.17.20二十个组分；将所述Fr.F.17.14组分经凝胶柱分离IV-8，用二氯甲烷-甲醇混合液等度洗脱后，继续经半制备高效液相分离IV-9，并用乙腈-水混合液等度洗脱。
本发明中，硅胶柱分离为现有技术中公开的柱层析硅胶分离方法，硅胶柱可以选用本领域常规的柱层析硅胶，可以商购或者自行制备获得，例如，采用青岛海洋化工厂生产的规格为80-100目、 100-200目、200-300目、300-400目的柱层析硅胶。在硅胶柱分离I、硅胶柱分离II-1、硅胶柱分离III-1、硅胶柱分离IV-1中，用二氯甲烷-乙醇混合液进行梯度洗脱，二氯甲烷与甲醇的体积比为1:0至0:1。
本发明中，凝胶柱分离为现有技术中公开的柱层析凝胶分离方法，凝胶柱可以选用美国GE Healthcare有限公司生产的规格为500g的Sephadex LH-20凝胶柱。在凝胶柱分离III-2、凝胶柱分离 IV-3、凝胶柱分离IV-5、凝胶柱分离IV-8中，用二氯甲烷-甲醇混合液进行等度洗脱，二氯甲烷与甲醇的体积比可以是任意值，能够将含有黄酮类生物碱的有效成分提取出来即可。例如，在凝胶柱分离 III-2、凝胶柱分离IV-3、凝胶柱分离IV-5、凝胶柱分离IV-8中，二氯甲烷与甲醇的体积比为0:1，1:1 或3:7。
本发明中，反相柱分离采用本领域内常规的反相柱分离方法，反相柱选用本领域内常规的硅胶填料，可以商购或者自行制备获得。在反相柱分离IV-2、反相柱分离IV-7中，用甲醇-水混合液进行梯度洗脱，甲醇与水的体积比可以是任意值，能够将含有黄酮类生物碱的有效成分提取出来即可。示例性地，在反相柱分离IV-2、反相柱分离IV-7中，甲醇与水的体积比依次为10:90，20:80，30:70， 40:60，50:50，60:40，70:30，80:20，90:10，100:0。
本发明中，半制备高效液相分离可以采用本领域内常规的方法和仪器设备进行。在半制备高效液相分离II-3、半制备高效液相分离III-3中，用乙腈-水混合液进行梯度洗脱，乙腈与水的体积比可以是任意值，能够将含有黄酮类生物碱的有效成分提取出来即可。示例性地，在半制备高效液相分离 II-3、半制备高效液相分离III-3中，乙腈与水的体积比依次为20:80至70:30。在半制备高效液相分离 IV-4、半制备高效液相分离IV-6、半制备高效液相分离IV-9中，用甲醇-水混合液进行等度分离。例如，在半制备高效液相分离IV-4、半制备高效液相分离IV-6中，甲醇与水的体积比为32:68、35:65 或30:70。
本发明第三方面提供上述第一方面所述的鸡头黄精中提取的黄酮类生物碱、上述第二方面所述的提取方法提取得到的黄酮类生物碱在制备治疗或预防糖尿病药物以及抗氧化药物中的应用。
本发明中，鸡头黄精中提取的黄酮类生物碱用于制备治疗或预防糖尿病药物以及抗氧化药物时，可以直接使用或者以药物组合物的形式使用。所述治疗或预防糖尿病药物以及抗氧化药物可以含有 0.1-99.9重量％的黄酮类生物碱，其余为药用载体或赋形剂，所述药用载体或赋形剂可以是一种或多种固体、半固体和液体的稀释剂、填料以及药物制品辅剂。
本发明中，所述治疗或预防糖尿病药物以及抗氧化药物的剂型有：注射剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、冲剂、喷剂、气雾剂。
根据本发明一种特别优选的实施方式，提供一种鸡头黄精中提取的黄酮类生物碱的提取方法，包括如下步骤：
(1)将鸡头黄精干燥、粉碎后，与乙醇-水溶液(乙醇与水的体积比为3-9：1)按重量比1:1.5-3 混合提取，经固液分离后得到提取液，将提取液浓缩后得到总浸膏；
(2)将总浸膏用水分散后(总浸膏和水的重量比为1:10-20)，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取后进行浓缩得到石油醚浸膏、乙酸乙酯浸膏和正丁醇浸膏，其中，相对于1g的总浸膏，石油醚的用量为1-3g，乙酸乙酯的用量为1-3g，正丁醇的用量为1-3g；
(3)将乙酸乙酯浸膏经硅胶柱分离I，并用二氯甲烷-甲醇混合液(二氯甲烷和甲醇的体积比为 1:0至0:1)梯度洗脱，10％浓硫酸香草醛作为显色剂，进行TLC薄层检识，得到Fr.A-Fr.K十一个组分；
将Fr.D组分经硅胶柱分离II-1，并用二氯甲烷-甲醇混合液(二氯甲烷和甲醇的体积比为1:0至 0:1)梯度洗脱，得到Fr.D.1-Fr.D.10十个组分；将Fr.D.10组分经凝胶柱分离II-2，用甲醇等度洗脱后，继续经半制备高效液相分离II-3，并用乙腈-水混合液(乙腈和水的体积比依次为20:80至70:30)梯度洗脱，得到式I所示化合物；
将Fr.E组分经硅胶柱分离III-1，并用二氯甲烷-甲醇混合液(二氯甲烷和甲醇的体积比为1:0 至0:1)梯度洗脱，得到Fr.E.1-Fr.E.8八个组分；将Fr.E.5组分经凝胶柱分离III-2，并用二氯甲烷-甲醇混合液(体积比为1:1)等度洗脱，得到Fr.E.5.1-Fr.E.5.4四个组分；将Fr.E.5.4组分经半制备高效液相分离III-3，并用乙腈-水混合液(乙腈和水的体积比依次为20:80至70:30)梯度洗脱，得到式V 所示化合物；
将Fr.F组分经硅胶柱分离IV-1，并用二氯甲烷-甲醇混合液(二氯甲烷和甲醇的体积比为1:0 至0:1)梯度洗脱，得到Fr.F.1-Fr.F.17十七个组分；将Fr.F.2组分经反相柱分离IV-2，并用甲醇-水混合液(甲醇和水的体积比依次为10:90，20:80，30:70，40:60，50:50，60:40，70:30，80:20，90:10， 100:0)梯度洗脱，得到Fr.F.2.1-Fr.F.2.16十六个组分；将Fr.F.2.14组分经凝胶柱分离IV-3，用二氯甲烷-甲醇混合液(二氯甲烷和甲醇的体积比为1:1)等度洗脱后，继续经半制备高效液相分离IV-4，并用乙腈-水混合液(乙腈和水的体积比为35：65)等度洗脱，得到式VI所示化合物；将Fr.F.2.10 组分经凝胶柱分离IV-5，用二氯甲烷-甲醇(二氯甲烷和水的体积比为1:1)等度洗脱后，继续经半制备高效液相分离IV-6，并用乙腈-水混合液(乙腈和水的体积比为30:70)等度洗脱，得到式II所示化合物；将Fr.F.17组分经反相柱分离IV-7，并用甲醇-水溶液(甲醇和水的体积比依次为10:90，20:80， 30:70，40:60，50:50，60:40，70:30，80:20，90:10，100:0)梯度洗脱，得到Fr.F.17.1-Fr.F.17.20二十个组分；将Fr.F.17.14组分经凝胶柱分离IV-8，用二氯甲烷-甲醇混合液(二氯甲烷和甲醇的体积比为 3:7)等度洗脱后，继续经半制备高效液相分离IV-9，并用乙腈-水混合液(乙腈和水的体积比为32:68) 等度洗脱，得到式III所示的化合物和式IV所示化合物。
上述提取方法提取得到的化合物，可以抑制α-葡萄糖苷酶的活性，具有抗氧化作用，能够用于制备治疗或预防糖尿病药物以及抗氧化药物。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
以下实施例中，鸡头黄精药材于2020年1月采购于陕西省宝鸡市眉县，经湖南中医药大学中医药民族医药国际联合实验室王炜教授鉴定为百合科黄精属植物Polygonatumsibiricum Red.的根茎。药材标本(No.20200112)现存放于湖南中医药大学中医药民族医药国际联合实验室。
暗箱式紫外分析仪购于杭州齐威仪器有限公司，仪器型号为WFH-203B；傅立叶变换红外光谱仪购于美国珀金埃尔默股份有限公司，仪器型号为Frontier MIR；紫外可见分光光度计购于美国珀金埃尔默股份有限公司，仪器型号为Lambda650；旋光仪购于美国鲁道夫公司，仪器型号为AUTOPOL Ⅲ；半制备高效液相色谱仪购于美国安捷伦科技有限公司，仪器型号为Agilent 1260；分析型高效液相色谱仪购于美国安捷伦科技有限公司，仪器型号为Agilent 1260；核磁共振仪购于德国布鲁克科技有限公司，仪器型号为AV-600；质谱仪购于美国waters公司，仪器型号为Xevo G2-S QTOF；圆二色谱仪购于法国biologic公司，仪器型号为MOS-500。
石油醚、乙酸乙酯和二氯甲烷购于上海泰坦科技股份有限公司；氯仿购于湖南汇虹试剂有限公司；甲醇和乙腈购于德国默克生命科学技术有限公司；环己烷和无水甲醇购于国药集团化学试剂有限公司；氘代甲醇购于美国剑桥同位素实验室；薄层色谱硅胶板购于烟台江友硅胶开发有限公司，规格为GF254(5×10cm)；柱层析硅胶购于青岛海洋化工有限公司，规格为80-100目/200-300目；Sephadex LH-20凝胶购于美国GE Healthcare有限公司，规格为500g；浓硫酸-香草醛显色剂为本实验室自配，规格为10％硫酸-香草醛。在无特别说明的情况下，其他试剂和原料均为常规的市售品。
以下实施例中，在无特别说明的情况下，室温为25±5℃。
实施例1
(1)取37Kg干燥的鸡头黄精粉碎，用75L乙醇浓度为90体积％的乙醇-水溶液渗漉提取三次，每次时长3天，回收提取液，减压浓缩得到鸡头黄精90％乙醇提取物。经90％乙醇提取后，利用酒精计将回收的90％乙醇配成75％乙醇，继续渗漉提取，每次时长为3天，期间不断进行搅拌，提取完成后，减压浓缩提取液，得到鸡头黄精75％乙醇提取物。合并90％乙醇提取物与75％乙醇提取物，干燥，得到10Kg总浸膏；
(2)将10Kg总浸膏用15L水分散，分两批进行萃取，依次用2倍量石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取3次，分别合并三种有机相，减压浓缩得到石油醚浸膏183g、乙酸乙酯浸膏85g和正丁醇浸膏800g；
(3)将85g乙酸乙酯浸膏经硅胶柱色谱，用二氯甲烷-甲醇混合液(二氯甲烷和甲醇的体积比依次为1:0，100:1，90:1，80:1，70:1，60:1，50:1，40:1，30:1，20:1，10:1，8:1，5:1，2:1，1:1，0:1) 梯度洗脱，经TLC分析，合并其他显色和极性相似的馏分，得到Fr.A-Fr.K十一个组分；
将10.5g Fr.D组分经300-400目硅胶柱色谱，用二氯甲烷-甲醇混合液(二氯甲烷和甲醇的体积比依次为1:0，100:1，90:1，80:1，70:1，60:1，50:1，40:1，30:1，20:1，10:1，8:1，5:1，2:1，1:1，0:1) 梯度洗脱，得到Fr.D.1-Fr.D.10十个组分；将527.9mg Fr.D.10组分经Sephadex-LH20柱色谱，用100％甲醇等度洗脱，再经半制备高效液相，并用乙腈-水混合液(乙腈和水的体积比依次为25:75，30:70， 35:65，40:60，45:55，50:50，55:45，60:40，65:35，70:30)梯度洗脱，得到5.0mg式I所示的化合物；
将7.5g Fr.E组分经300-400目硅胶柱色谱，用二氯甲烷-甲醇混合液(二氯甲烷和甲醇的体积比依次为1:0，100:1，90:1，80:1，70:1，60:1，50:1，40:1，30:1，20:1，10:1，8:1，5:1，2:1，1:1，0:1) 梯度洗脱，得到Fr.E.1-E.8八个组分；将7.5g Fr.E.5组分过Sephadex-LH20柱色谱，用二氯甲烷-甲醇混合液(体积比为1：1)等度洗脱，得到Fr.E.5.1-E.5.4四个组分；将22.5mg Fr.E.5.4组分经半制备高效液相，并用乙腈-水混合液(乙腈和水的体积比依次为20:80，25:75，30:70，35:65，40:60，45:55， 50:50，55:45，60:40，65:35，70:30)梯度洗脱，得到2.0mg式V所示的化合物；
将14.3g Fr.F组分经300-400目硅胶柱色谱，用二氯甲烷-甲醇混合液(二氯甲烷和甲醇的体积比依次为1:0，100:1，90:1，80:1，70:1，60:1，50:1，40:1，30:1，20:1，10:1，8:1，5:1，2:1，1:1， 0:1)梯度洗脱，得到Fr.F.1-F.17十七个组分；1.2g Fr.F.2组分经反相ODS柱色谱，用甲醇-水混合液(甲醇和水的体积比依次为10:90，20:80，30:70，40:60，50:50，60:40，70:30，80:20，90:10，100:0) 梯度洗脱，得到Fr.F.2.1-F.2.16十六个组分；将85.8mg Fr.F.2.14组分经Sephadex-LH20柱色谱，用二氯甲烷-甲醇混合液(二氯甲烷和甲醇的体积比为1:1)等度洗脱后，再经半制备高效液相，并用乙腈 -水混合液(乙腈和水的体积比为35:65)等度洗脱，得到3.8mg式VI所示的化合物；将35.0mg Fr.F.2.10 组分过Sephadex-LH20柱色谱，用二氯甲烷-甲醇(二氯甲烷和水的体积比为1:1)等度洗脱后，再经半制备高效液相，并用乙腈-水混合液(乙腈和水的体积比为30:70)等度洗脱，得到2.4mg式II所示的化合物；将1.8g Fr.F.17组分经反相ODS柱色谱，用甲醇-水溶液(甲醇和水的体积比依次为10:90， 20:80，30:70，40:60，50:50，60:40，70:30，80:20，90:10，100:0)梯度洗脱，得到Fr.F.17.1-F.17.20二十个组分；将13.7mg Fr.F.17.14组分过Sephadex-LH20柱色谱，用二氯甲烷-甲醇混合液(二氯甲烷和甲醇的体积比为3:7)等度洗脱后，再经半制备高效液相，并用乙腈-水混合液(乙腈和水的体积比为32:68)等度洗脱，得到2.0mg式III所示的化合物和3.2mg式IV所示的化合物。
测试例1
式I所示的化合物的表征：
该化合物为白色无定形粉末(DMSO)，香草醛-浓硫酸反应(TLC)为红棕色，FeCl3显色反应呈阳性，提示含有酚羟基；UV光谱在290nm、224nm和205nm处有最大吸收；IR光谱显示出羟基(3374cm-1)、羰基(1674cm-1和1639cm-1)和苯环(1500cm-1和1452cm-1)的特征吸收；HR-ESI-MS分析结果见图1， HR-ESI-MS谱显示准分子离子峰m/z 386.1242[M+H]+(calcdfor C20H20NO7：386.1240)，可确定该化合物的分子式为C20H19NO7。
如图2所示，该化合物的1H NMR谱(600MHz，DMSO-d6)显示出两组非常相近的质子信号，其中一些质子信号出现重叠现象。包括4对酚羟基氢信号[δH 12.22(1H，s，5-OH)和12.21(1H，s，5-OH)， 10.76(1H，s，7-OH)和10.75(1H，s，7-OH)，9.29(1H，s，4'-OH)和9.28(1H，s，4'-OH)，9.27(2H，s， 2'-OH)]、4对苯环氢信号[δH 6.80(1H，s，H-6')和6.76(1H，s，H-6')，6.38(2H，s，H-3')，5.87(2H，d， J＝2.1Hz，H-6)，5.86(1H，m，H-8)和5.85(1H，d，J＝1.9Hz，H-8)]。
值得注意的是，如图3所示，该化合物的13C NMR谱(150MHz，DMSO-d6)的碳棒出现裂分，显示出两组化学位移非常相近的碳信号，故解析过程时，碳的化学位移将保留两位小数。每组具有20 个碳信号。结合DEPT 135°谱，提示其中包括2对羰基碳信号[δC 198.19(C-4)和198.17(C-4)，177.08(C-2”) 和177.06(C-2”)]，2组苯环的碳信号[δC 166.46(C-7)和166.43(C-7)，163.78(C-5)，162.83(C-8a)和 162.81(C-8a)，154.84(C-2')和154.78(C-2')，153.57(C-4')，127.84(C-6')和127.75(C-6')，120.02(C-5')和 119.98(C-5')，114.47(C-1')和114.27(C-1')，102.39(C-3')和102.38(C-3')，101.28(C-4a)和101.24(C-4a)， 95.84(C-6)和95.82(C-6)，94.66(C-8)和94.63(C-8)。此外，还有4对亚甲基碳信号[δC 69.07(C-2)和 68.98(C-2)，30.10(C-3”)和30.06(C-3”)，29.40(C-4”)和29.39(C-4”)，26.65(C-9)和26.38(C-9)]。
根据1H NMR、13C NMR、1H-1H COSY、HSQC和HMBC谱的信息，参见图2-图6。在1H-1HCOSY 谱中，可观察到2组质子耦合体系，分别为：δH 4.25(H-2a)，
Figure SMS_3
2.43(H-9b)和
Figure SMS_4
在HMBC谱中，δH 4.25(H-2a)，4.15(H-2b)与δC 198.19(C-4)/162.81(C-8a)，δH3.02(H-9a)，2.43(H-9b) 与δC 69.07(C-2)/127.84(C-6')/154.78(C-2')具有远程相关，构成了一个高异黄酮骨架。除去高异黄酮片段的数据，δH 4.76(H-5”)与δC 127.84(C-6')/153.57(C-4')/177.08(C-2”)有远程相关，构成了一个连接在C-5' 位置且含有羰基的五元环。从C-5”的化学位移来看，推测其与N相连。
综上所述，可确定该化合物的平面结构为一个在B环C-5'位置连接有五元内酰胺环的高异黄酮生物碱，其平面结构如下：
Figure SMS_5
在确定其绝对构型时，该化合物旋光值接近于0，且没有明显的cotton效应，由于该化合物的分子结构中含有2个手性中心，故猜测其可能为两组对映异构体外消旋体的混合物。利用
Figure SMS_6
OJ30CE-WA008对其进行手性分析，色谱条件[流动相：n-hexane/ethanol/diethylamine＝ 60/40/0.1(v/v/v)，流速：0.8mL/min，进样量：10μL，检测波长：210nm，柱温：35℃]，出现峰面积比约为1:2:1的三个色谱峰。对三个色谱峰进行全波长扫描，其紫外吸收完全一致，故确定该化合物为两组对映异构体外消旋体Ia和Ib，其手性分析色谱见图7。
该化合物的结构式为：
Figure SMS_7
测试例2
式II所示的化合物的表征：
该化合物为白色无定形粉末(CH3OH)，香草醛-浓硫酸反应(TLC)为红棕色，提示该化合物含有黄酮类结构片段；FeCl3显色反应呈阳性，提示含有酚羟基；UV光谱在290nm、224nm和203nm处有最大吸收；IR光谱显示出羟基(3238cm-1)、羰基(1634cm-1和1603cm-1)和苯环(1501cm-1和1454cm-1) 的特征吸收；HR-ESI-MS分析结果见图8，HR-ESI-MS谱显示准分子离子峰m/z 386.1232[M+H]+(calcd for C20H20NO7：386.1240)，可确定该化合物的分子式为C20H19NO7。
如图9所示，该化合物的1H NMR谱(600MHz，CD3OD)显示出两组重叠度较高的质子信号，解析时将采用其中的一组质子信号。该化合物包括4个苯环氢信号[δH 6.85(1H，d，J＝8.3Hz，H-6')和6.34(1H，d，J＝8.2Hz，H-5')，5.87(1H，d，J＝2.2Hz，H-6)和5.84(1H，d，J＝2.1Hz，H-8)]。
如图10所示，该化合物的13C NMR谱(150MHz，CD3OD)中，大部分碳信号成对出现，解析过程将选择其中一组数据作为依据。结合DEPT 135°谱，提示其中包括2对羰基碳信号[δC200.2(C-4)和 181.9(C-2”)]，2个苯环的碳信号[δC 168.4(C-7)，165.7(C-5)，164.9(C-8a)，157.1(C-4')，155.2(C-2')， 131.5(C-6')，118.0(C-1')，117.6(C-3')，108.9(C-5')，102.9(C-4a)，97.0(C-6)和95.8(C-8)。此外，还有4 对亚甲基碳信号[δC 70.7(C-2)，32.3(C-3”)，27.0(C-4”)和27.9(C-9)]。
根据1H NMR、13C NMR、1H-1H COSY、HSQC和HMBC谱的信息，参见图9-图13。在1H-1HCOSY谱中，可观察到3组质子耦合体系，分别为：δH 4.31(H-2a)，
Figure SMS_8
2.68(H-9b)，/>
Figure SMS_9
和
Figure SMS_10
2.41(H-3”b)。
在HMBC谱中，δH 4.31(H-2a)，4.10(H-2b)与δC 200.2(C-4)/164.9(C-8a)，δH 3.11(H-9a)，2.68(H-9b) 与δC 70.7(C-2)/131.5(C-6')/155.2(C-2')具有远程相关，构成了一个高异黄酮骨架。除去高异黄酮片段的数据，δH 4.76(H-5”)与δC 155.2(C-2')/157.1(C-4')/181.9(C-2”)有远程相关，结合质子耦合体系推测在C-3' 位置连有含羰基的五元环。从C-5”的化学位移来看，推测其与N相连。
综上所述，可确定化合物II的平面结构为一个在B环C-3'位置连接有五元内酰胺环的高异黄酮生物碱，其平面结构如下：
Figure SMS_11
在确定该化合物的绝对构型时，发现其与式I所示的化合物类似。利用
Figure SMS_12
AD30CE-WE006对其进行手性分析，色谱条件[流动相：n-hexane/isopropanol＝85/15(v/v)，流速： 1.0mL/min，进样量：5μL，检测波长：210nm，柱温：35℃]，呈现峰面积比为1:1:1:1的4个色谱峰。经全波长扫描，4个色谱峰的紫外吸收完全相同，证明4个色谱峰为同一个类型的化合物。由此可见，该化合物同为两对对映异构体外消旋体，分别为IIa、IIb、IIc和IId，其手性分析色谱图见图14。手性分析表明，该化合物分子结构中的两个手性中心C-3和C-5”均能以R或S构型同时存在，产生(3R， 5”S)、(3R，5”R)、(3S，5”R)和(3S，5”S)四种异构体。
该化合物的结构式为：
Figure SMS_13
测试例3
式III所示的化合物的表征：
该化合物为白色无定形粉末(CH3OH)，香草醛-浓硫酸反应(TLC)为红棕色，提示该化合物含有黄酮类结构片段；FeCl3显色反应呈阳性，提示含有酚羟基；UV光谱在290nm和224nm处有最大吸收；IR光谱显示出羟基(3348cm-1)、羰基(1618cm-1)和苯环(1519cm-1和1449cm-1)的特征吸收； HR-ESI-MS分析结果见图15，HR-ESI-MS谱显示准分子离子峰m/z384.1076[M-H]+(calcd for C20H18NO7：384.1083)，可确定该化合物的分子式为C20H19NO7。
如图16所示，该化合物的1H NMR谱(600MHz，CD3OD)显示两组重叠度较高的质子信号，解析过程将采用其中一组作为依据。该化合物具有4个苯环氢信号[δH 6.86(1H，d，J＝8.1Hz，H-6')，6.30(1H， d，J＝1.9Hz，H-3')，6.23(1H，dd，J＝8.1，2.4Hz，H-5')和5.90(1H，s，H-8)]。
如图17所示，该化合物的13C NMR谱(150MHz，CD3OD)中，大部分碳信号成对出现，解析过程将选择其中一组数据作为依据。结合DEPT 135°谱，提示其中包括2对羰基碳信号[δC200.6(C-4)和 181.6(C-2”)]，2个苯环的碳信号[δC 166.1(C-7)，163.9(C-8a)，163.7(C-5)，158.4(C-4')，157.6(C-2')， 132.6(C-6')，116.7(C-1')，109.2(C-6)，107.4(C-5')，103.5(C-3')，102.6(C-4a)和95.4(C-8)。此外，还有 4对亚甲基碳信号[δC 70.6(C-2)，32.0(C-3”)，26.6(C-4”)和28.2(C-9)]。
根据1H NMR、13C NMR、1H-1H COSY、HSQC和HMBC谱的信息，参见图16-图20。在1H-1HCOSY谱中，可观察到3组质子耦合体系，分别为：δH 4.24(H-2a)，
Figure SMS_14
2.56(H-9b)，/>
Figure SMS_15
和
Figure SMS_16
2.38(H-3”b)。
在HMBC谱中，δH 4.24(H-2a)，4.10(H-2b)与δC 200.6(C-4)/163.9(C-8a)，δH 3.14(H-9a)，2.56(H-9b) 与δC 70.6(C-2)/132.6(C-6')/157.6(C-2')具有远程相关，构成了一个高异黄酮骨架。除去高异黄酮片段的数据，δH 5.34(H-5”)与δC 166.1(C-7)/163.7(C-5)/181.6(C-2”)有远程相关，结合质子耦合体系推测在C-6 位置连有含羰基的五元环。从C-5”的化学位移来看，推测其与N相连。
综上所述，可确定该化合物的平面结构为一个在A环C-6位置连接有五元内酰胺环的高异黄酮生物碱，其平面结构如下：
Figure SMS_17
该化合物的平面结构与式I所示的化合物和式II所示的化合物相似，仅仅只有内酰胺环的取代位置不同。确定其立体构型时，发现其旋光值接近于0，没有明显的cotton效应，且从该化合物的氢谱和碳谱核磁数据成对出现的情况来看，推测其同样以2对对映异构体外消旋体的形式同时存在。经
Figure SMS_18
AYH0CE-VB023手性分析(色谱条件：流动相：n-hexane/ethanol＝80/20(v/v)，流速： 1.0mL/min，进样量：5μL，检测波长：210nm，柱温：35℃)，该化合物呈现峰面积比约为1:1:1:1的 4个色谱峰。全波长扫描发现4个色谱峰的紫外吸收一致，证明该化合物是以2对对映异构体外消旋体，分别为IIIa、IIIb、IIIc和IIId，其手性分析色谱图见图21。手性分析证明，该化合物分子结构中的内酰胺环连接在高异黄酮A环的III同样以(3R，5”S)、(3R，5”R)、(3S，5”R)和(3S，5”S)四种异构体同时存在。/>
该化合物的结构式为：
Figure SMS_19
测试例4
式IV所示的化合物的表征：
该化合物为白色无定形粉末(CH3OH)，香草醛-浓硫酸反应(TLC)为红棕色，提示该化合物含有黄酮类结构片段；FeCl3显色反应呈阳性，提示含有酚羟基；UV光谱在292nm和224nm处有最大吸收；IR光谱显示出羟基(3387cm-1)、羰基(1637cm-1)、苯环(1500cm-1和1436cm-1)和甲基(1379cm-1)的特征吸收；HR-ESI-MS分析结果见图22，HR-ESI-MS谱显示准分子离子峰m/z 398.1227[M-H]+(calcd for C21H20NO7：398.1240)，可确定该化合物的分子式为C20H21NO7。
如图23所示，该化合物的1H NMR谱(600MHz，CD3OD)显示出化学位移非常相近甚至重叠的两组氢信号，所以在该化合物平面构型的确定中以其中一组作为依据进行结构解析。该氢谱显示了3 个苯环氢信号[δH 6.84(1H，s，H-6')，6.35(1H，s，H-3')和5.91(1H，s，H-6)]及1个甲基信号[δH 1.91(3H， s，8-CH3)]。
如图24所示，该化合物的13C NMR谱(150MHz，CD3OD)中，多数碳信号成对出现，解析过程将选择其中一组数据作为依据。结合DEPT 135°谱，提示其中包括2对羰基碳信号[δC200.5(C-4)和 181.4(C-2”)]、2个苯环的碳信号[δC 166.0(C-7)，163.2(C-5)，161.6(C-8a)，156.8(C-2')，155.5(C-4')， 129.6(C-6')，120.8(C-5')，116.6(C-1')，104.2(C-8)，103.6(C-3')，102.8(C-4a)和96.1(C-6)。此外，还有 4对亚甲基碳信号[δC 70.6(C-2)，31.4(C-3”)，30.0(C-4”)和28.2(C-9)]及一个甲基碳信号[δC 7.4(8-CH3)]。
根据1H NMR、13C NMR、1H-1H COSY、HSQC和HMBC谱的信息，参见图23-图27。在1H-1HCOSY谱中，可观察到2组质子耦合体系，分别为：δH 4.29(H-2a)，
Figure SMS_20
2.60(H-9b)和
Figure SMS_21
2.36(H-3”b)。
在HMBC谱中，δH 4.29(H-2a)，4.15(H-2b)与δC 200.5(C-4)/161.6(C-8a)，δH 3.15(H-9a)，2.60(H-9b) 与δC 70.6(C-2)/129.6(C-6')/156.8(C-2')具有远程相关，构成了一个高异黄酮骨架。除去高异黄酮片段的数据，δH 4.96(H-5”)与δC 129.6(C-6')/155.5(C-4')/181.4(C-2″)有远程相关，推测在B环C-5'位置连有含羰基的五元环。从C-5”的化学位移来看，推测其与N相连。此外，δH 1.91(CH3)与δC 166.0(C-7)/161.6(C-8a) 具有远程相关，故甲基连接在A环的8位碳原子上。
综上所述，可确定该化合物的平面结构为一个在B环C-5'位置连接有五元内酰胺环，A环8位连有的高异黄酮生物碱，其平面结构如下：
Figure SMS_22
与式I所示化合物的结构相比，该化合物在式I所示化合物的结构基础上C-8多了一个甲基，且旋光值接近于0，没有明显的cotton效应。利用
Figure SMS_23
ADH0CD-XC030对其进行手性分析(色谱条件：流动相：n-hexane/ethanol＝75/25(v/v)，流速：1.0mL/min，进样量：5μL，检测波长：210nm，柱温：35℃)，发现其同为2对对映异构体外消旋体，分别为IVa、IVb、IVc和IVd，其手性分析色谱图见图28。
该化合物的结构式为：
Figure SMS_24
测试例5
式V所示的化合物的表征：
该化合物为白色粉末(CH3OH)，香草醛-浓硫酸反应(TLC)呈红棕色，FeCl3显色反应呈阳性，提示含有酚羟基；UV光谱在294nm和224nm处有最大吸收；IR光谱显示出羟基(3351cm-1)、羰基 (1618cm-1)和苯环(1493cm-1和1449cm-1)的特征吸收；HR-ESI-MS分析结果见图29，HR-ESI-MS谱显示准分子离子峰m/z 410.1242[M+H]+(calcd for C22H20NO7：410.1240)，可确定该化合物的分子式为 C22H19NO7。
如图30所示，该化合物的1H NMR谱(600MHz，CD3OD)显示出1个醛基氢信号[δH 9.30(1H， s，H-6”)]，1组苯环氢信号[δH 6.77(1H，s，H-6')，6.38(1H，s，H-3')，5.86(1H，d，J＝2.3Hz，H-6)和 5.85(1H，d，J＝2.0Hz，H-8)]及2个烯烃氢信号[δH 6.84(1H，t，J＝3.1Hz，H-4”)和5.87(1H，d，J＝2.9Hz， H-3”)]。
如图31所示，该化合物的13C NMR谱(150MHz，CD3OD)显示出22个碳信号，结合DEPT135°谱，提示其中包括1个酮羰基碳信号[δC 198.3(C-4)]，1个醛基碳信号[δC 177.9(C-6”)]，3个亚甲基信号[δC 69.1(C-2)，26.6(C-9)和27.1(C-1”)]。此外，还显示出12个苯环碳信号[δC 166.5(C-7)，163.8(C-5)， 162.8(C-8a)，154.6(C-2')，154.2(C-4')，132.1(C-6')，114.5(C-1')，115.5(C-5')，102.4(C-3')，101.2(C-4a)， 95.9(C-6)和94.7(C-8)]及两对双键碳信号[δC 142.6(C-2”)和109.3(C-3”)，131.6(C-5”)和121.5(C-4”)]。
根据1H NMR、13C NMR、1H-1H COSY、HSQC和HMBC谱的信息，参见图30-图34。在1H-1HCOSY谱中，可观察到2组质子耦合体系，分别为：δH 4.23(H-2a)，
Figure SMS_25
2.43(H-9b)和/>
Figure SMS_26
在HMBC谱中，δH 4.23(H-2a)，4.08(H-2b)与δC 198.3(C-4)/162.8(C-8a)，δH 2.96(H-9a)，2.43(H-9b) 与δC 69.1(C-2)/132.1(C-6')/154.6(C-2')具有远程相关，构成了一个高异黄酮骨架。除此之外，还有6个碳原子未归属，根据δH 5.87(H-3”)与δC 131.6(C-5”)，δH 6.84(H-4”)与δC 142.6(C-2”)分别具有远程相关，且考虑到化学位移的大小，猜测该结构中含有一个吡咯环。通过δH 3.72(H-1”)与δC132.1(C-6')/154.2(C-4')/109.3(C-3”)的远程相关，可知该吡咯环的5位通过1”-CH2与高异黄酮B环的 5'位相连。最后根据醛基质子δH 9.30(H-6”)与δC 131.6(C-5”)具有相关关系，故确定醛基连接在吡咯环的 2位。
综上所述，可确定V为具有另一新颖骨架结构的高异黄酮生物碱，其平面结构如下：
Figure SMS_27
在确定其绝对构型时，发现其CD谱没有明显的cotton效应，旋光值接近于零。我们利用Chiral NQ(2)-RH 5μ型手性分析柱对其进行分析，色谱条件为：CH3CN:H2O＝35:65，0.7mL/min，发现其为峰面积比为1:1的外消旋体Va和Vb，其手性分析色谱图见图35。
该化合物的结构式为：
Figure SMS_28
测试例6
式VI所示的化合物的表征：
该化合物为白色粉末(CH3OH)，香草醛-浓硫酸反应(TLC)呈红棕色，FeCl3显色反应呈阳性，提示含有酚羟基；UV光谱在294nm、224nm处有最大吸收；IR光谱显示出羟基(3223cm-1)、羰基(1615cm-1) 和苯环(1512cm-1，1482cm-1和1448cm-1)的特征吸收；HR-ESI-MS分析结果见图36，HR-ESI-MS谱显示准分子离子峰m/z 496.1601[M+H]+(calcd forC26H26NO9：496.1608)，可确定该化合物的分子式为 C26H25NO9。
如图37所示，该化合物的1H NMR谱(600MHz，CD3OD)显示出1个醛基氢信号[δH 9.30(1H，s， H-6”)]，1组苯环氢信号[δH 6.69(1H，s，H-6')，6.37(1H，s，H-3')，5.85(1H，d，J＝2.2Hz，H-6)和5.81(1H， d，J＝2.2Hz，H-8)]及2个烯烃氢信号[δH 6.96(1H，d，J＝4.1Hz，H-4”)和5.98(1H，d，J＝4.1Hz，H-3”)]。
如图38所示，该化合物的13C NMR谱(150MHz，CD3OD)显示出26个碳信号，结合DEPT135°谱，提示其中包括1个酮羰基碳信号[δC 200.1(C-4)]，1个醛基碳信号[δC 179.8(C-6”)]和1个羧基碳信号[δC 176.4(C-10”)]，6个亚甲基信号[δC 70.7(C-2)，45.5(C-7”)，31.9(C-9”)，28.2(C-9)，27.3(C-8”)和 26.6(C-1”)]。此外，还显示出12个苯环碳信号[δC168.0(C-7)，165.7(C-5)，164.8(C-8a)，156.3(C-2')，155.6(C-4')，133.5(C-6')，116.9(C-1')，116.3(C-5')，103.5(C-3')，102.9(C-4a)，97.0(C-6)和95.7(C-8)] 及两对双键碳信号[δC 146.8(C-2”)和111.9(C-3”)，132.6(C-5”)和127.4(C-4”)]。
根据1H NMR、13C NMR、1H-1H COSY、HSQC和HMBC谱的信息，参见图37-图41。在1H-1HCOSY谱中，可观察到3组质子耦合体系，分别为：δH 4.22(H-2a)，
Figure SMS_29
2.55(H-9b)，/>
Figure SMS_30
和
Figure SMS_31
在HMBC谱中，δH 4.22(H-2a)，4.06(H-2b)与δC 200.1(C-4)/164.8(C-8a)，δH 3.10(H-9a)，2.55(H-9b) 与δC 70.7(C-2)/133.5(C-6')/156.3(C-2')具有远程相关，构成了一个高异黄酮骨架。除此之外，还有10 个碳原子未归属，根据δH 5.98(H-3”)与δC 132.6(C-5”)，δH 6.96(H-4”)与δC 146.8(C-2”)及δH 4.35(H-7”)与δC 146.8(C-2”)/132.6(C-5”)分别有远程相关，且考虑到化学位移的大小，猜测该结构中含有N上被取代的吡咯环，又因为1H-1H COSY谱中
Figure SMS_32
的质子耦合体系及δH 1.88(H-8”)与δC176.4(C-10”)的远程相关，确定N上取代基为丁酸。通过δH 3.87(H-1”)与δC 133.5(C-6')/155.6(C-4')/111.9(C-3”)的远程相关，可知该吡咯环的5位通过1”-CH2与高异黄酮B环的5'位相连。最后根据醛基质子δH 9.30(H-6”)与δC 132.6(C-5”)具有相关关系，故确定醛基连接在吡咯环的2位。
综上所述，可确定化合物VI为与V具有相同骨架的高异黄酮生物碱对映异构体，其平面结构如下：
Figure SMS_33
在确定其绝对构型时，发现其CD谱没有明显的cotton效应，旋光值接近于零。我们利用Chiral NQ(2)-RH 5μ型手性分析柱对其进行分析，发现其为1:1的外消旋体VIa和VIb，其手性分析色谱图见图42。通过Chiral NQ(2)-RH 5μ型制备柱，我们成功对其分离。为了确定其绝对构型，我们运用Guassian 09软件的密度泛函方法(DFT)计算了该化合物两种绝对构型的理论CD谱，并分别于该化合物的实测CD谱比较(见图43)，进一步确定VIa手性中心的绝对构型是S，比旋度为
Figure SMS_34
Figure SMS_35
反之，VIb的绝对构型则为R，其比旋度为
Figure SMS_36
综上所述，确定化合物VIa和VIb的结构，为一具有新颖骨架结构的高异黄酮生物碱。
该化合物的结构式为：
Figure SMS_37
测试例7
α-葡萄糖苷酶抑制活性测定：
化合物先用DMSO溶解，再用磷酸缓冲盐(PBS，pH＝7.2-7.4)稀释成需要的浓度梯度。同时，将p-NPG用DMSO溶解，并用PBS将其稀释成1mM。另外，用PBS溶解α-葡萄糖苷酶并用PBS稀释成0.5U/mL。在96孔板中，实验孔中加入50μL PBS，50μL样品，50μLα-葡萄糖苷酶；对照孔中加入100μL PBS，50μLα-葡萄糖苷酶；空白孔中加入100μL PBS，50μL样品。将96孔板放在37℃恒温水浴锅中孵育10min之后，每个孔中加入50μL p-NPG之后，再37℃孵育30min，用酶标仪在410nm 处测量其OD值。以阿卡波糖为该实验的阳性对照。
对从鸡头黄精中分离得到的式I所示的化合物、式II所示的化合物、式III所示的化合物、式 IV所示的化合物、式V所示的化合物和式VI所示的化合物进行α-葡萄糖苷酶抑制活性筛选，结果见表1。
表1
化合物 IC50(μM)
式I所示的化合物 ＞50
式II所示的化合物 ＞50
式III所示的化合物 ＞50
式IV所示的化合物 16.87±3.35
式V所示的化合物 6.03±0.42
式VI所示的化合物 15.13±3.43
阿卡波糖 0.53±0.32
表1的数据显示，通过与阳性药物阿卡波糖进行对比，式IV所示的化合物、式V所示的化合物和式VI所示的化合物均具有较强的α-葡萄糖苷酶抑制活性，有降血糖的潜力，可以用于制备预防或治疗糖尿病的药物。
测试例8
ABTS自由基清除活性测定：
ABTS自由基清除能力检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司。试剂盒中包括提取液，试剂一至试剂五等6个试剂，按照使用说明对试剂二至试剂四进行前处理。
测定步骤：
将样品用提取液充分溶解，并用提取液配成相应的浓度梯度。在96孔板中加入下列试剂，样品孔中加入10μL样品提取液，20μL试剂四工作液和170μL ABTS工作液；对照孔中加入10μL样品提取液，190μL试剂一；空白孔中加入10μL水，20μL试剂四工作液和170μLABTS工作液；阳性对照孔中加入10μL不同浓度的维生素C溶液，20μL试剂四工作液和170μLABTS工作液。充分混匀后室温避光静置8min，在410nm处测定其吸光度。根据样品和维生素C的浓度梯度制定标准曲线，计算 IC50值，结果见表2。清除率的计算公式如下：
阳性药ABTS清除率(％)＝[(Ablank–Apositive control)/Ablank]×100％；
样品ABTS清除率(％)＝[1-(Asample–Acontrol)/Ablank]×100％；
Asample为样品孔的吸光度；Acontrol为对照孔的吸光度；Ablank为空白孔的吸光度；Apositive control为阳性对照孔的吸光度。
表2
化合物 ABTS自由基清除能力IC50(μM)
式I所示的化合物 ＞100
式II所示的化合物 12.40±0.11
式III所示的化合物 12.60±0.35
式IV所示的化合物 19.91±0.93
式V所示的化合物 26.64±3.05
式VI所示的化合物 28.46±0.07
维生素C 23.58±1.32
表2的数据显示，式II所示的化合物、式III所示的化合物和式IV所示的化合物对ABTS自由基的清除能力均强于对照药维生素C，因此，式II所示的化合物、式III所示的化合物和式IV所示的化合物具有良好的抗氧化能力，可以用于制备抗氧化的药物。
测试例9
DPPH自由基清除活性测定：
DPPH自由基清除能力检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司。试剂盒中包括提取液，试剂一至试剂三等4种试剂，按照使用说明将试剂二和三要进行前处理。
测定步骤：
将样品用提取液充分溶解，并用提取液稀释成需要的浓度梯度。在96孔板中加入以下试剂，测定孔中加入10μL样品提取液，190μL工作液；对照孔中加入10μL样品提取液，190μL试剂一；空白孔中加入10μL提取液，190μL工作液；阳性对照管中加入10μL维生素C标准溶液，190μL工作液。混匀室温静置30min，在515nm处测定其吸光度。根据样品和维生素C的浓度梯度制定标准曲线，计算IC50值，结果见表3。清除率的计算公式如下：
阳性药DPPH清除率(％)＝[(Ablank–Apositive control)/Ablank]×100％；
样品DPPH清除率(％)＝[1-(Asample–Acontrol)/Ablank]×100％；
Asample为样品孔的吸光度；Acontrol为对照孔的吸光度；Ablank为空白孔的吸光度；Apositive control为阳性对照孔的吸光度。
表3
化合物 DPPH自由基清除能力IC50(μM)
式I所示的化合物 ＞300
式II所示的化合物 97.02
式III所示的化合物 ＞300
式IV所示的化合物 217.45
式V所示的化合物 198.52
式VI所示的化合物 187.98
维生素C 24.14±0.30
表3的数据显示，式I所示的化合物、式II所示的化合物、式III所示的化合物、式IV所示的化合物、式V所示的化合物和式VI所示的化合物对DPPH自由基均有清除活性。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种鸡头黄精中提取的黄酮类生物碱，其特征在于，所述黄酮类生物碱选自
Figure FDA0003857681830000011
Figure FDA0003857681830000012
中的至少一种。
2.如权利要求1所示的黄酮类生物碱的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将鸡头黄精与提取溶剂I混合进行提取得到提取液，将所述提取液浓缩后得到总浸膏；
(2)将所述总浸膏用水分散后，用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取后进行浓缩得到石油醚浸膏、乙酸乙酯浸膏和正丁醇浸膏；
(3)将所述乙酸乙酯浸膏经分离处理，得到所述黄酮类生物碱。
3.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，所述提取方法还包括：在步骤(1)的混合前，对所述鸡头黄精进行干燥、粉碎处理。
4.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，步骤(1)中，所述提取溶剂I为乙醇-水溶液；
优选地，所述提取溶剂I中乙醇与水的体积比为3-9:1。
5.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，步骤(1)中，所述提取的方法为渗漉提取；
优选地，所述渗漉提取的次数为3-6次，每次所述渗漉提取的条件包括：温度为20-30℃，时间为3-4天。
6.根据权利要求2至5中任意一项所述的提取方法，其特征在于，步骤(2)中，所述总浸膏与所述水的重量比为1:10-20。
7.根据权利要求6所述的提取方法，其特征在于，相对于1g的总浸膏，所述石油醚的用量为1-3g，所述乙酸乙酯的用量为1-3g，所述正丁醇的用量为1-3g。
8.根据权利要求2至5中任意一项所述的提取方法，其特征在于，步骤(3)中，所述分离处理包括：
S1、将所述乙酸乙酯浸膏经硅胶柱分离I，并用二氯甲烷-甲醇混合液梯度洗脱，得到Fr.A-Fr.K十一个组分；
S2、对所述Fr.D组分、所述Fr.E组分和所述Fr.F组分提纯。
9.根据权利要求8所述的提取方法，其特征在于，步骤S2中，所述提纯包括：将所述Fr.D组分经硅胶柱分离II-1，并用二氯甲烷-甲醇混合液梯度洗脱，得到Fr.D.1-Fr.D.10十个组分；将所述Fr.D.10组分经凝胶柱分离II-2，用甲醇等度洗脱后，继续经半制备高效液相分离II-3，并用乙腈-水混合液梯度洗脱；
将所述Fr.E组分经硅胶柱分离III-1，并用二氯甲烷-甲醇混合液梯度洗脱，得到Fr.E.1-Fr.E.8八个组分；将所述Fr.E.5组分经凝胶柱分离III-2，并用二氯甲烷-甲醇混合液等度洗脱，得到Fr.E.5.1-Fr.E.5.4四个组分；将所述Fr.E.5.4组分经半制备高效液相分离III-3，并用乙腈-水混合液梯度洗脱；
将所述Fr.F组分经硅胶柱分离IV-1，并用二氯甲烷-甲醇混合液梯度洗脱，得到Fr.F.1-Fr.F.17十七个组分；将所述Fr.F.2组分经反相柱分离IV-2，并用甲醇-水混合液梯度洗脱，得到Fr.F.2.1-Fr.F.2.16十六个组分；将所述Fr.F.2.14组分经凝胶柱分离IV-3，用二氯甲烷-甲醇混合液等度洗脱后，继续经半制备高效液相分离IV-4，并用乙腈-水混合液等度洗脱；将所述Fr.F.2.10组分经凝胶柱分离IV-5，用二氯甲烷-甲醇等度洗脱后，继续经半制备高效液相分离IV-6，并用乙腈-水混合液等度洗脱；将所述Fr.F.17组分经反相柱分离IV-7，并用甲醇-水溶液梯度洗脱，得到Fr.F.17.1-Fr.F.17.20二十个组分；将所述Fr.F.17.14组分经凝胶柱分离IV-8，用二氯甲烷-甲醇混合液等度洗脱后，继续经半制备高效液相分离IV-9，并用乙腈-水混合液等度洗脱。
10.权利要求1所述的鸡头黄精中提取的黄酮类生物碱、权利要求2至9中任意一项所述的提取方法提取得到的黄酮类生物碱在制备治疗或预防糖尿病药物以及抗氧化药物中的应用。
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Title
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