CN108562471B - 植物根系活力的快速检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物营养与生理领域，公开了一种植物根系活力的快速检测方法，包括以下步骤：S1：将植物根系样品浸没在TTC溶液和磷酸缓冲液的混合溶液中，在37℃下暗保温1~2h后加入硫酸终止反应，此时植物根系样品变成红色；S2：将红色的植物根系样品转入由乙酸乙酯和甲醇配制而成的浸提液中，在55~60℃水浴中浸提15~25min后，取出已褪色变白的植物根系样品，并使用浸提液对已经变红的浸提液进行定容；S3：以空白实验为对照，用分光光度计检测485nm波长下红色浸提液中TTF的吸光度，然后根据标准曲线，求出TTC溶液的还原量。本方法对TTF具有快速高效的浸出效果，重现性好、操作简便，更适合样本的批量检测。

Description

植物根系活力的快速检测方法

技术领域

本发明涉及植物营养与生理领域，特别涉及一种植物根系活力的快速检测方法。

背景技术

植物根系是吸收水分、养分及固定植株的器官，同时，根系还具有重要的合成及代谢功能。旺盛的根系活力对作物生长、产量形成具有直接而重要的影响，是制约作物产量潜力进一步发挥的关键因素。因此，根系活力是反映根系吸收功能、促进光合物质形成的一项综合生理指标。

根系活力的测定主要有甲烯蓝法、α-奈胺法、TTC（氯化三苯基四氮唑）法等多种方法。由于TTC法结果准确、重现性好，因此，目前被广泛采用。

TTC法检测根系活力的传统方法是待测根系经TTC溶液反应后，采用乙酸乙酯研磨法提取三苯甲瓒（TTF）[张雄．测定小麦根和花粉的活力及其应用[J]．植物生理学通讯，1982，(3)：48-50．]，然后，检测485nm波长下的OD值，最后，根据标准曲线计算出TTC的还原量。在此基础上，有研究者对TTC法进行了改进，尝试了用浸提方式提取TTF的方法[白宝璋,陈凤云, 付菊华. 向日葵根系活力TTC测定法的改良, 中国油料作物学报, 1988, (3):57-60.

白宝璋, 金锦子, 白崧等. 玉米根系活力TTC测定法的改良, 玉米科学, 1994,2 (4) : 44-47. ]。

以上的根系活力检测方法尚存在一些不足：

（1）对于传统的研磨法，由于需要研磨、冲洗、过滤、定容等步骤，操作较为繁琐，耗时较长，不利于进行大批量样本的根系活力检测；

（2）利用传统的研磨法提取TTF的过程中，正是由于研磨、过滤等环节，往往导致TTF的损失，致使样本中TTF的提取率降低，从而影响实验结果的可靠性；

（3）已报道的浸提法，虽然避免了传统研磨法的提取率较低的缺点，但TTF的提取过程一般需要4-6小时或更长的时间，而且单一的甲醇或二甲基亚砜提取液对TTF的提取效率尚不令人满意。因此，此法也不利于大批量样本根系活力的快速检测。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种植物根系活力的快速检测方法，能够实现对植物根系活力的快速检测，且操作简便高效。

技术方案：本发明提供了一种植物根系活力的快速检测方法，包括以下步骤：S1：将植物根系样品浸没在TTC溶液和磷酸缓冲液的混合溶液中，在37℃下暗保温1~2h后加入硫酸终止反应，此时所述植物根系样品变成红色；S2：将红色的所述植物根系样品转入由乙酸乙酯和甲醇配制而成的浸提液中，在55~60℃水浴中浸提15~25min后，取出已褪色变白的所述植物根系样品，并使用所述浸提液对已经变红的所述浸提液进行定容；S3：以空白实验为对照，用分光光度计检测485nm波长下红色的所述浸提液中TTF的吸光度，然后根据标准曲线，求出所述TTC溶液的还原量（mg/g•h）。

优选地，在所述S2中，所述浸提液中乙酸乙酯与甲醇的体积比为1~3:1。

优选地，在所述S1中，所述TTC 溶液与所述的磷酸缓冲液的体积比为1:1。

优选地，所述TTC 溶液的质量体积比为0.4%，所述磷酸缓冲液的物质的量浓度为1/15mol/L，pH值为7.0。

优选地，在所述S1中，所述硫酸的物质的量浓度为1mol/L。

有益效果：本发明中，首先，在植物根系样品内的脱氢酶催化作用下， TTC溶液中的TTC被还原转化为TTF，TTF使得植物根系样品呈红色，然后，使用乙酸乙酯和甲醇配制而成的浸提液浸提具有TTF的红色植物根系样品，待植物根系样品褪色变白、浸提液变成红色，说明TTF被溶出到浸提液中，整个浸提过程仅20min左右即可将植物根系样品中的TTF全部浸提出来，与现有技术中4-6hr的浸提，甚至过夜浸提（约10h左右）相比，时间大大缩短，实现对植物根系中TTF的快速浸提，从而实现对植物根系活力的快速检测。

浸提原理：在本发明的浸提过程中，之所以能够如此快速地将植物根系中的TTF提取出来，是因为本发明利用甲醇与乙酸乙酯的混合溶液作为浸提液代替现有技术中单一试剂的TTF的提取液。虽然乙酸乙酯对TTF的溶解度较高，但是，由于其对组织细胞的穿透力较差，因此，导致在浸提过程中对TTF的浸出率较低；而甲醇虽然对TTF的溶解度逊色于乙酸乙酯，但其对组织细胞的穿透力较强；本发明中将二者配合使用，甲醇分子可以在细胞内外穿梭往返，能够将根系组织细胞内的TTF溶出到细胞外，被溶出细胞外的TTF则会迅速溶入细胞外部的乙酸乙酯中，本发明就是通过甲醇和乙酸乙酯的上述协同作用达到对TTF快速高效的浸出效果；在此基础上，60℃的水浴加热，则进一步提高了TTF的浸出效率。本发明的方法重现性好、操作简便，更适合大量样本的批量检测。

附图说明

图1为实施方式1中乙酸乙酯和甲醇混合浸提液中的TTF的吸收光谱扫描曲线；

图2为实施方式2中乙酸乙酯和甲醇混合浸提液中的TTF的吸收光谱扫描曲线；

图3为实施方式3中乙酸乙酯和甲醇混合浸提液中的TTF的吸收光谱扫描曲线；

图4为乙酸乙酯单一浸提液中的TTF的吸收光谱扫描曲线。

具体实施方式

下面结合附图对本发明进行详细的介绍。

实施方式1：

称取经清洗、吸干表面水分的小麦根系样品0.5g，置于小烧杯中，加入质量体积比为0.4%的TTC溶液和物质的量浓度为1/15mol/L，pH为7.0的磷酸缓冲液各5ml，使小麦根系样品充分浸没在溶液中，在37℃下暗保温1h后，立即加入物质的量浓度为1mol/L硫酸2ml，终止反应，此时小麦根系样品变成红色。然后，将已变成红色的小麦根系样品转入盛有10ml的体积比为1：1的乙酸乙酯和甲醇混合浸提液的刻度试管中，然后，将以上刻度试管置于60℃水浴中，浸提20min后，小麦根系样品变成白色，浸提液变成红色，然后用乙酸乙酯-甲醇混合浸提液定容至10ml。最后以空白实验为对照，用分光光度计检测485nm波长下上述红色的浸提液中TTF的吸光度，根据标准曲线，求出TTC的还原量（mg/g•h）。以37℃下，使用体积比为1：1的乙酸乙酯和甲醇混合浸提液浸提过夜（约10hr）的处理作为参照，本实施方式TTF的提取率为99.98%（因为在485nm波长下，在37℃下浸提过夜（约10hr）的样品被认为是TTF被完全从根系中浸出了（100%），此时，浸提液的吸光值应该达到最大值，根据这个吸光值可以计算出一个TTC的还原量A，以此值为参照，根据本实施方式中在485nm波长下，60℃浸提20min的浸提液的吸光值可以计算出另一个TTC的还原量B，则本实施方式中TTF的提取率q=(B/A)×100%）。

如图1所示为使用体积比为1:1的乙酸乙酯和甲醇混合液配制而成的浸提液浸提出的TTF的吸收光谱扫描曲线，图1可以看出TTF的最大吸收峰在485nm处，说明与溶解于单一提取液——乙酸乙酯中的TTF相比（如图4），溶解于体积比为1:1的乙酸乙酯和甲醇混合液中的TTF的最大吸收峰没有改变，因此，可以在485nm波长下检测其含量。

实施方式2：

称取经清洗、吸干表面水分的玉米根系样品0.5g，置于小烧杯中，加入质量体积比为0.4%的TTC溶液和物质的量浓度为1/15mol/L，pH为7.0的磷酸缓冲液各5ml，使玉米根系样品充分浸没在溶液中，在37℃下暗保温1h后，立即加入物质的量浓度为1mol/L硫酸2ml，终止反应，此时玉米根系样品变成红色。然后，将已变成红色的玉米根系样品转入盛有10ml的体积比为2：1的乙酸乙酯和甲醇混合浸提液的刻度试管中，然后，将以上刻度试管置于60℃水浴中，浸提25min后，玉米根系样品变成白色，浸提液变成红色，然后用乙酸乙酯-甲醇混合浸提液定容至10ml。最后以空白实验为对照，用分光光度计检测485nm波长下上述红色的浸提液中TTF的吸光度，根据标准曲线，求出TTC的还原量（mg/g•h）。以37℃下，使用体积比为2：1的乙酸乙酯和甲醇混合浸提液浸提过夜（约10hr）的处理作为参比对照，本实施方式TTF的提取率为99.99%。

如图2所示为使用体积比为2:1的乙酸乙酯和甲醇混合液配制而成的浸提液浸提出的TTF的吸收光谱扫描曲线，图2可以看出TTF的最大吸收峰在485nm处，说明与溶解于单一提取液——乙酸乙酯中的TTF相比（如图4），溶解于体积比为2:1的乙酸乙酯和甲醇混合液中的TTF，其最大吸收峰没有改变，因此，可以在485nm波长下检测其含量。

实施方式3：

称取经清洗、吸干表面水分的黄瓜根系样品0.5g，置于小烧杯中，加入质量体积比浓度为0.4%的TTC溶液和物质的量浓度为1/15mol/L，pH为7.0的磷酸缓冲液各5ml，使黄瓜根系样品充分浸没在溶液中，在37℃下暗保温1h后，立即加入物质的量浓度为1mol/L硫酸2ml，终止反应，此时黄瓜根系样品变成红色。然后，将已变成红色的黄瓜根系样品转入盛有10ml的体积比为3：1的乙酸乙酯和甲醇混合浸提液的刻度试管中，然后，将以上刻度试管置于60℃水浴中，浸提15min后，黄瓜根系样品变成白色，浸提液变成红色，然后用乙酸乙酯-甲醇混合浸提液定容至10ml。最后以空白实验为对照，用分光光度计检测485nm波长下上述红色的浸提液中TTF的吸光度，根据标准曲线，求出TTC的还原量（mg/g•h）。以37℃下，使用体积比为3：1的乙酸乙酯和甲醇混合浸提液浸提过夜（约10hr）的处理作为参比对照，本实施方式TTF的提取率为99.98%。

如图3所示为使用体积比为3:1的乙酸乙酯和甲醇混合液配制而成的浸提液浸提出的TTF的吸收光谱扫描曲线，图3可以看出TTF的最大吸收峰在485nm处，说明与溶解于单一提取液——乙酸乙酯中的TTF相比（如图4），溶解于体积比为3:1的乙酸乙酯和甲醇混合液中的TTF，其最大吸收峰没有改变，因此，可以在485nm波长下检测其含量。

如图4所示为只使用乙酸乙酯作为浸提液浸提出的TTF的吸收光谱扫描曲线，图4可以看出TTF的最大吸收峰在485nm处，说明对于溶解于单一提取液——乙酸乙酯中的TTF，可以在485nm波长下检测其含量。

上述实施例1至3中以乙酸乙酯和甲醇的混合液作为浸提液与现有技术中仅以甲醇或二甲基亚砜作为提取液对植物根系中TTF提取率的比较如下表1：

提取液	小麦根系	黄瓜根系	玉米根系
				甲醇	0.9243 <sup>B</sup>	0.9163 <sup>C</sup>	0.9256 <sup>B</sup>
二甲基亚砜	0.9253 <sup>B</sup>	0.9351 <sup>B</sup>	0.9244 <sup>B</sup>
				乙酸乙酯-甲醇	0.9998 <sup>A</sup>	0.9998 <sup>A</sup>	0.9999 <sup>A</sup>

注：表中不同的大写字母表示检测结果在1%水平差异显著，相同的大写字母表示检测结果在1%水平差异不显著。

由表1可以看出利用乙酸乙酯-甲醇混合提取液对植物根系中TTF的提取率明显高于单一提取液对植物根系中TTF的提取率，而且，其差异达到了1%的显著水平。

上述实施方式只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种植物根系活力的快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：将植物根系样品浸没在TTC溶液和磷酸缓冲液的混合溶液中，在37℃下暗保温1~2h后加入硫酸终止反应，此时所述植物根系样品变成红色；

S2：将红色的所述植物根系样品转入由体积比为1~3:1的乙酸乙酯和甲醇配制而成的浸提液中，在55~60℃水浴中浸提15~25min后，取出已褪色变白的所述植物根系样品，并使用所述浸提液对已经变红的所述浸提液进行定容；

S3：以空白实验为对照，用分光光度计检测485nm波长下红色的所述浸提液中TTF的吸光度，然后根据标准曲线，求出所述TTC溶液的还原量。

2.根据权利要求1所述的植物根系活力的快速检测方法，其特征在于，在所述S1中，所述TTC 溶液与所述的磷酸缓冲液的体积比为1:1。

3.根据权利要求1或2所述的植物根系活力的快速检测方法，其特征在于，所述TTC 溶液的质量体积比为0.4%，所述磷酸缓冲液的物质的量浓度为1/15mol/L，pH值为7.0。

4.根据权利要求1或2所述的植物根系活力的快速检测方法，其特征在于，在所述S1中，所述硫酸的物质的量浓度为1mol/L。

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