CN108072742A

CN108072742A - 一种鉴别成熟油蜂蜜的方法

Info

Publication number: CN108072742A
Application number: CN201711388507.9A
Authority: CN
Inventors: 曹炜; 程妮; 马天琛; 高慧; 吕新刚; 邓建军; 张颖
Original assignee: SHAANXI BEE PRODUCT ENGINEERING TECHNOLOGY RESEARCH CENTER; Northwest University
Current assignee: SHAANXI BEE PRODUCT ENGINEERING TECHNOLOGY RESEARCH CENTER; Northwest University
Priority date: 2017-12-21
Filing date: 2017-12-21
Publication date: 2018-05-25

Abstract

本发明公开了一种鉴别成熟油菜蜜和非成熟油菜蜜的方法。首先通过实验测定不同酿制时间油菜蜜的理化指标，包括水分、电导率、色值、pH、游离酸、内酯、总酸、葡萄糖、果糖、蔗糖、总酚、蛋白质、脯氨酸、羟甲基糠醛、淀粉酶、葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶等理化指标，然后通过主成分分析和聚类分析，鉴别出成熟油菜蜜。本发明首次利用多指标结合数学统计学的方法鉴别出成熟油菜蜜与非成熟油菜蜜。本发明设计合理，操作简单，可行性强，可准确鉴别出成熟油菜蜜，为其他种类成熟蜜的鉴别提供可靠依据。

Description

一种鉴别成熟油蜂蜜的方法

技术领域

本发明涉及一种鉴别成熟油菜蜜与非成熟油菜蜜的方法，属于食品科学领域。

背景技术

蜂蜜是蜜蜂采集的植物花蜜或者植物渗出的蜜露，与蜜蜂自身的分泌物混合，并在蜜蜂体内充分转化酿造，终贮存至蜂巢中的一种天然甜物质。蜂蜜是一种天然药物，也是一种天然抗氧化剂，对调节消化功能紊乱，辅助治疗便秘，溃疡以及促进创伤、烧伤组织愈合等有积极作用。

成熟蜂蜜是指经蜜蜂采蜜后7-10天，通过物理、化学等作用将水分含量降至18%以下，葡萄糖、果糖等还原糖的含量升高至70%-80%左右而酿成的蜂蜜。而非成熟蜜是指经1-3天的酿造，后期加工将水分含量降低，还原糖等活性成分未得到很好的转化而生成的蜂蜜。

目前，成熟蜂蜜由于其较高的市场价值已成为一种深受世界各国消费者青睐的产品。中国是世界养蜂大国和蜂产品消费大国，同时也是蜂产品出口大国。据统计，2012年我国蜂蜜出口量已达到11万吨，直接经济效益2.15亿美元。但相比于其他蜂蜜出口国家，我国的蜂蜜出口价格低，产品质量较差，不能在国际市场上占据有利地位。造成此现象的原因主要有以下两点：（1）生产不成熟蜂蜜。中国大多蜂农采取“追花夺蜜式”的养蜂方式，采蜜时间间隔短，“三天一取蜜”甚至“每天都取蜜”，因而造成蜂蜜中水分含量高，微生物滋生容易，保存困难，营养价值低，适口性差等问题。（2）生产管理方式落后，市场监管机制不严格。目前鉴别成熟蜂蜜的方法还不够完善，检测水平较低，检验程序复杂，不利于营造生产销售出口成熟蜂蜜的市场环境。

聚类分析是一种研究“物以类聚”的多元统计方法，它可以根据样品的相似度对样品进行分类，将差别较大的样品分离出来。主成分分析是一种降维的统计学方法，可以从众多相关变量中提取出少数几个不相关的主成分，可以以一种最优化的方法去提取原始数据中的信息。

发明内容

本发明目的是提供一种鉴别成熟油菜蜜的方法，为进一步鉴别其他种类成熟蜜与非成熟蜜提供依据。

本发明通过以下方案实现：

一种鉴别成熟油菜蜜的方法，其特征在于：通过测定不同酿制时间油菜蜜的理化指标，分析各项理化指标与成熟度之间的关系，揭示成熟蜂蜜和非成熟蜂蜜在理化指标方面的差别，结合主成分分析和聚类分析的方法鉴别出成熟油菜蜜和非成熟油菜蜜，所述的理化指标包括：水分、电导率、色值、pH、游离酸、内酯、总酸、糖类、总酚、蛋白质、脯氨酸、羟甲基糠醛、淀粉酶、葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶。

一种鉴别成熟油菜蜜的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）选取不同成熟度的油菜蜜样品（非成熟油菜蜜、成熟油菜蜜），分别测定其水分、电导率、色值、pH、游离酸、内酯、总酸、糖类（葡萄糖、果糖、蔗糖）、总酚、蛋白质、脯氨酸、羟甲基糠醛、淀粉酶、葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶理化指标；

（2）使用进出口蜂蜜检验方法SN/T 0852-2003测定所有样品的水分、电导率、色值、pH、游离酸、内酯、总酸、总酚；

（3）使用国标方法GB/T 18932.18-2003测定所有样品中蛋白质、脯氨酸、羟甲基糠醛、淀粉酶、葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶的含量；

（4）使用GB/T18932.22中液相色谱示差折光检测法测定所有样品中的葡萄糖、果糖、蔗糖含量；

（5）以水分、电导率、色值等理化指标为变量，运用化学计量学中的聚类分析方法和主成分分析对所有样品进行分析，聚类分析将成熟油菜蜜从所有样品中分离出来。

上述葡萄糖、果糖、蔗糖测定的液相色谱条件为：色谱柱：Waters WATC44355(4.6× 250 mm, 4 µm)；流动相：乙腈和超纯水；流动相流速：1.0 mL/min；检测器池温度：35℃；柱温：35℃；进样量：15µL。

本发明的优点与积极效果：（1）本发明建立的以水分、电导率、色值、pH、游离酸、内酯、总酸、糖类（葡萄糖、果糖、蔗糖）、总酚、蛋白质、脯氨酸、羟甲基糠醛、淀粉酶、葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶含量为变量，应用主成分分析和聚类分析方法多理化指标分离出成熟油菜蜜。（2）本发明是首次基于蜂蜜基础理化指标来鉴别成熟油菜蜜和非成熟油菜蜜是一种简单有效的新方法。（3）本发明采用化学计量学方法建立了一种鉴别成熟油菜蜜的方法，为其他种类成熟蜜的质量鉴别提供了可靠依据。

附图说明

图1为主成分分析碎石图；

图2为主成分分析PC1、PC2得分图；

图3为聚类分析判别分数图；

图4 聚类分析谱系图，A 代表成熟油菜蜜；B代表非成熟油菜蜜；1—52表示不同样品。

具体实施方式

下面结合附图与实施例作进一步的说明。

不同成熟度油菜蜜样品信息

样品编号	名称	花源	地理源	采集时间
					A1—A32	成熟油菜蜜	Brassica campestris L.	陕西汉中	2017年4月
B33—B52	非成熟油菜蜜	Brassica campestris L.	陕西汉中	2017年4月

1、水分的测定：室温下用阿贝折光仪测定，调节折光计的水流温度，使其通过折光计的温度为40℃，按下式计算：

X=100－[78＋390.7×（n－1.4768）]

式中X表示试样中水分的含量，％；n表示试样在40℃时的折光指数。

2、电导率的测定：准确称取10 g（精确至0.01g）蜂蜜，加入50 mL超纯水或煮沸冷却后的蒸馏水，在25 ℃下水浴加热30 min，用电导率仪测定，结果用mS/cm表示。

3、色值的测定：准确称取5g蜂蜜于样品盒中，在色差仪“反射”模式下测定其 L*值、a*值和b*值。

4、pH的测定：称量10 g（精确至0.01g）蜂蜜溶解在75 mL的超纯水或煮沸冷却后的蒸馏水中，搅拌均匀后用pH计测定，直接读取数值即可。

5、游离酸、内酯、总酸的测定：称取蜂蜜10g（精确至0.01g)溶于75ml煮沸冷却后的蒸馏水中，搅拌均匀。用NaOH (0.05M)以5.0ml/min的速度滴定至pH=8.50后停止滴定，迅速加入10ml 0.05M NaOH，立即用HCL (0.05M) 返滴至pH=8.30。用未加蜂蜜样品的二次蒸馏水作为空白对照。游离酸、内酯及总酸含量（meq/kg)按下式计算:

游离酸含量=（0.05M NaOH体积ml-空白ml)×50/样品克数

内酯含量=（10.00-0.05M HCL体积ml）×50/样品克数

总酸含量=游离酸+内酯。

6、糖类的测定：参照GB/T18932.22中液相色谱示差折光检测法进行测定。（1）样品处理：称取5 g蜂蜜样品溶解于乙腈：超纯水（4:6）的混合溶液中，定容至100 mL。用0.45 µm有机膜过滤后HPLC进样检测。（2）标准溶液的配制：果糖、葡萄糖标准储配液配制：分别称取5 g果糖和4 g葡萄糖标准物质，加入60 mL抽滤过的超纯水，再用乙腈定容至100 mL。蔗糖标准储备液配制：称取2 g蔗糖标准物质，加入60 mL抽滤过的超纯水溶解，再用乙腈定容至100 mL。（3）果糖、葡萄糖、蔗糖标准工作溶液：参照标准溶液配制表，吸取不同体积的上述标准储备液，用乙腈：水（4:6）的混合液定容到相应值，配成不同浓度的标准液，绘制标准工作曲线。具体配置见下表1。

表1.标准溶液配置表

7、总酚的测定：取1ml适当浓度的蜂蜜水溶液于10ml试管中，加入1ml Folin-Ciocalteu 溶液和5ml 1moL/L的碳酸钠溶液后，用蒸馏水定容至10ml刻度线，充分混匀，于暗处静置1h，以蒸馏水为参比，在760nm下测定其吸光值。以原儿茶酸标准品绘制标准曲线，所测蜂蜜样品中的总酚含量表示为原儿茶酸当量。

8、蛋白质的测定：采用考马斯亮蓝法测定蛋白质的含量，牛血清蛋白作为对照品。（1）样品制备：取油菜蜜样品10 g ，超声溶解于 100mL蒸馏水。（2）考马斯亮蓝溶液制备：准确称取100mg考马斯亮蓝G-250，置于50mL的容量瓶中，用90% 的乙醇定容，再加入100mL85%(W/V) 的磷酸，用蒸馏水定容至1L，贮于棕色瓶中，常温下可保存一个月。（3）蛋白含量测定：取上述蜂蜜水溶液1mL于柱塞试管中，加入5mL考马斯亮蓝G-250溶液，漩涡混勻，静置5min,用1cm比色皿在595nm下比色测定吸光度。以牛血清蛋白作为标准品，绘制标准曲线。所测样品的吸光值通过标准曲线计算，蛋白质含量结果表示为mg/kg。

9、脯氨酸的测定：采用AOAC法，（1）样品的制备：取油菜蜜样品10g，超生溶解于100mL蒸馏水。（2）标准曲线的制定：准确吸取脯氨酸标准溶液0，0.2mL，0.4mL，0.6mL，0.8mL，1.0mL置于10mL的试管中，脯氨酸的浓度为25μg/mL。加入蒸馏水补足体积到1mL，然后分别加入0.25mL甲酸和1.0mL茚三酮乙二醇甲醚溶液。在沸水中加热15min，然后置于70℃恒温水浴锅中继续发色10min。再加入5mL异丙醇溶液，放置5min后，于510nm处测定吸光度。（3）准确吸取油菜蜜溶液1mL，移入试管中，加入0.25mL甲酸和1.0mL茚三酮乙二醇甲醚溶液。在沸水中加热15min，然后置于70℃恒温水浴锅中继续发色10min。再加入5mL异两醇溶液，放置5min后，于510nm处测定吸光度，并从标准曲线上查得脯氨酸含量。结果表示为mg/kg。

10、羟甲基糠醛的测定：准确称取蜂蜜样品5g（精确至0.001g)溶于约25ml蒸馏水中，加入0.5ml澄清剂Ⅰ和0.5ml澄清剂Ⅱ，定容至50ml。将上述蜂蜜样液过滤（弃去最初10ml滤液）后，吸取滤液各5ml于2支试管，一支试管加入5ml亚硫酸氢钠溶液（0.2%）作为参比液，另一支试管加入5ml蒸馏水作为待测液，测定其在284nm和336nm处的吸光值，按下式计算羟甲基糠醛含量：

式中：

A₂₈₄—284nm下的吸光值； A₃₃₆—336nm下的吸光值。

11、淀粉酶的测定：在准确称取的10 g（精确到0.01 g)样品中加入20 ml蒸馏水和5 ml浓度为1.59 mol/L，pH为5.3的乙酸盐缓冲液，再加入3 ml，0.5 mol/L的氯化钠溶液，最后定容至100 ml,此溶液即为待测蜂蜜样液。将2%淀粉溶液（临用时新配并标定）、待测蜂蜜样液、碘溶液在40 ℃水浴锅中加热15 min，然后吸取5.0 mL淀粉溶液和10.0 mL待测蜂蜜样液于小烧杯中混合均匀，此时开始计时。每隔5 min取1.0 ml上述混合液和10.0 ml碘溶液，加入到含有标定淀粉溶液所需稀释水体积的锥形瓶中，充分混匀，蒸馏水作为参比，测定其在660 nm处的吸光值。重复此操作直至吸光值小于0.235，记下所需的时间t。

按下式计算淀粉酶值：淀粉酶值= 300/t

式中：t为A_0.235（即为吸光值为0.235）时所需的反应时间。

12、葡萄糖氧化酶的测定：（1）溶液配制:3.5mg辣根过氧化物酶和3.5mg 4-氨基安替比林溶解在20mL，pH4.7，浓度为0.02mol/L的磷酸缓冲液中，再加入1mL 3% 的苯酚溶液，即为溶液A；溶液B为6.5% 的葡萄糖溶液；用磷酸缓冲液将蜂蜜样品稀释至0.2g/mL。（2）标准曲线的配制：在9支棕色具塞试管中分别加入一定量的缓冲液和A溶液，再加入2mmol/L的过氧化氢溶液，35℃反应5min，在500nm波长下测定吸光值，绘制标准曲线。（3）样品酶值测定：将处理过的蜂蜜样品在沸水中加热10min，作为空白组；实验组为1.5mL溶液A，1.5mL溶液B，缓冲液200μl，再加入800μl蜂蜜样品溶液，在35℃，500nm波长下测定吸光值变化情况。

13、过氧化氢酶的测定：（1）将含有6.8mL待测蜂蜜透析液的棕色试管置于37℃水浴中加热10min后，向其中加入200μL H₂O₂溶液，混匀，此即为反应立即开始计时（共反应30min）。每隔5min取反应液200μL加入到在37℃水浴保温的待测管中（含6.4mL磷酸缓冲液、200uL邻联茴香胺溶液和100μL过氧化物酶溶液）。（2）将待测管置于25℃水浴中反应5min后，加入100μL 酸（1:1）终止反应，以磷酸缓冲液（0.06M, pH 7.0)为参比，于400nm波长下测定吸光值A_s。空白对照组不加H₂O₂，其余操作相同，每个10min取样一次，测定吸光值，共测定3次，取平均值为空白对照组的吸光值A_b。待测蜂蜜透析液的净吸光值为A_net=A_s-A_b。（3）通过H₂O₂标准曲线查得7ml待测液中过氧化氢含量x（μg)，计算相应时刻7ml反应液中过氧化氢含量X（mg)，X=[7/(0.2×1000)]x。本实验中7ml反应液中过氧化氢初始量X₀=0.714。绘制ln(X₀/X)-t图线，其斜率即为蜂蜜中过氧化氢酶分解过氧化氢的速率k。按下式计算蜂蜜过氧化氢酶活性：

蜂蜜过氧化氢酶活性K_f=k×(50/6)×(1/5)

油菜蜜样品所有理化指标见下表2，其组别分类A为成熟油菜蜜；B为非成熟油菜蜜。

以各理化指标为参数，运用化学计量学中的聚类分析和主成分分析对样品进行分析，结果分别参见图1、图2、表3和表4。

Claims

1.一种鉴别成熟油菜蜜的方法，其特征在于：通过测定不同酿制时间油菜蜜的理化指标，分析各项理化指标与成熟度之间的关系，揭示成熟蜂蜜和非成熟蜂蜜在理化指标方面的差别，结合主成分分析和聚类分析的方法鉴别出成熟油菜蜜和非成熟油菜蜜，所述的理化指标包括：水分、电导率、色值、pH、游离酸、内酯、总酸、糖类、总酚、蛋白质、脯氨酸、羟甲基糠醛、淀粉酶、葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶。

2.根据权利要求1所述鉴别成熟油菜蜜的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）选取不同成熟度的非成熟油菜蜜和成熟油菜蜜，分别测定其水分、电导率、色值、pH、游离酸、内酯、总酸、糖类、总酚、蛋白质、脯氨酸、羟甲基糠醛、淀粉酶、葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶理化指标；

（5）以水分、电导率、色值理化指标为变量，运用化学计量学中的聚类分析方法和主成分分析对所有样品进行分析，聚类分析将成熟油菜蜜从所有样品中分离出来。

3.根据权利要求2所述鉴别成熟油菜蜜的方法，其特征在于：上述葡萄糖、果糖、蔗糖测定的液相色谱条件为：色谱柱：Waters WATC44355，4.6 × 250 mm, 4 µm；流动相：乙腈和超纯水；流动相流速：1.0 mL/min；检测器池温度：35℃；柱温：35℃；进样量：15µL。

4.根据权利要求2所述鉴别成熟油菜蜜的方法，其特征在于：所述糖类为葡萄糖、果糖和蔗糖。