CN103642693A - 一种红酵母的破壁方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种红酵母的破壁方法，包括：不同浓度梯度盐酸的配制，酸热法处理红酵母，有机溶剂提取色素及破壁效果比较。本发明提供的红酵母破壁方法使用的盐酸浓度低，破壁时间短，效率高，类胡萝卜素的提取率较其他浓度酸处理提高近40%，且能耗低，工艺简单，对设备要求低，低浓度的盐酸处理减少了类胡萝卜素的污染，该方法具有很强的实用价值和开发前景。有利于提高红酵母发酵生产类胡萝卜素的产量、质量和降低生产成本。

Description

一种红酵母的破壁方法

技术领域

本发明涉及生物技术，具体涉及一种红酵母的破壁方法，利用酸热法对红酵母细胞进行破壁，从而达到提取胞内色素的目的。

背景技术

类胡萝卜素是一种广泛存在于植物和微生物中的天然色素。除具有转化为维生素A的生物活性外，还具有预防癌症和心血管疾病等多种生理功能。红酵母产类胡萝卜素具有营养要求简单、生长周期短及菌体营养丰富等优点，具有很大的实用价值和开发前景。但类胡萝卜素是红酵母细胞内产物,破壁效果及提取方法直接影响红酵母发酵生产类胡萝卜素的产量、质量和生产成本。因此，研究红酵母破壁及提取方法具有重要的现实意义。

红酵母属于单细胞真核微生物，其细胞壁的厚度大约为0.1～0.3μm，当细胞老化时，厚度还会增加。红酵母细胞壁结构坚韧，像三明治——外层为甘露聚糖，内层为葡聚糖，它们都是复杂的分枝状聚合物，中间夹有1层蛋白质分子。目前报道的关于红酵母的破壁方法有很多，常用的红酵母破壁方法有高压均质法、研磨法、酸法、酶法、碱法、自溶法、甲苯法、二甲亚砜法、超声波法等。酶法及自溶法由于破壁时间较长(4～24h)，可能造成类胡萝卜素的降解。碱法破壁容易使类胡萝卜素变性，造成提取率偏低。高压均质及研磨法存在破壁效率低(不高于80%)、温度不易控制、类胡萝卜素易氧化等局限性。虽然二甲亚砜、甲苯法及超声波法能取得良好的破壁效果，但这两种有机溶剂非常容易产生残留毒性，所提取出的类胡萝卜素不能作为食品及药品原料使用。超声波破碎法对设备要求高，成本相对较高。因此相对于以上几类方法，酸法破壁虽然在一定程度上会引起类胡萝卜素的降解，但该法破壁效果好，如能控制好破壁条件，就有可能开发出一种破壁效果良好、类胡萝卜素损失较少、安全、卫生的破壁方法。

由于酸热法使用了对细胞壁中原来结构紧密的某些成分(多糖和蛋白质等)具有强力疏松作用的盐酸，并配合沸水浴处理及速冷处理，使细胞壁结构得以破坏，胞内物质溶出。该法设备简单、能耗小、成本低，对胞内溶出物破坏性也较小，是值得进一步深入探讨的方法。然而目前国内外学者多采用3mol/L盐酸，浸泡40min进行破壁，此法经常出现菌体破壁过头的现象，离心时往往会产生悬浮，需加入大量水进行稀释方可离心，但有时加水稀释也不能达到离心效果，反而导致提取率下降。

发明内容

本发明的目的在于提供一种红酵母的破壁方法，对现行的酸热破壁技术中存在的盐酸浓度高，用量大，耗时长，色素提取率低等问题，采用低浓度的盐酸加热处理红酵母达到了破壁的目的，且色素提取率提高了40%。

一种红酵母的破壁方法，该方法包括：不同浓度梯度盐酸的配制，酸热法处理红酵母，有机溶剂提取色素及破壁效果比较。本发明解决了高浓度的盐酸处理后，破壁后的细胞碎片在离心体系中无法沉淀的技术问题，同时采用低浓度的盐酸破壁也不会影响类胡萝卜素的提取。

具体技术方案如下：

一种红酵母的破壁方法，包括如下步骤：

（1）配制不同浓度梯度的盐酸；

（2）酸热法处理红酵母：

（2-1）红酵母的发酵培养；

（2-2）不同浓度盐酸处理红酵母；

（3）破壁效果比较：

（3-1）恒质量法测定酵母细胞生物量；

（3-2）类胡萝卜素提取与测定。

步骤（1）进一步包括如下步骤：

（1-1）取一定量的浓盐酸加蒸馏水稀释至相关浓度梯度；

（1-2）确定盐酸浓度梯度分别为1mol/L、2mol/L、3mol/L、4mol/L、5mol/L、6mol/L。

进一步地，步骤（1）中盐酸试剂为分析纯AR，物质量浓度为12mol/L。

进一步地，步骤（2-1）中进一步包括如下步骤：

将保藏的红酵母菌种移接到PDA培养基上，在28℃下活化48h；

挑2环接入装有50mL的液体种子培养基的250mL三角瓶中，28℃振荡培养24h；

按10％的接种量接入装有80mL发酵培养基的250mL三角瓶中，于28℃下振荡（180r／min）培养72h。

进一步地，步骤（2-2）中进一步包括如下步骤：

取六只离心管，分别加入10mL上述发酵液，4000r/min离心10min；

倒去上清液，各加入1-6mol/L的盐酸6ml浸泡40min；

于沸水浴中加热4-5min，迅速冷却离心，洗涤沉淀部分；

弃去上清液，即得细胞碎片。

进一步地，步骤(2)中六只离心管中加入6mL1mol/L的盐酸，浸泡时间分别设置为10min、20min、30min、40min、50min、60min。

进一步地，步骤（3-1）中进一步包括如下步骤：

取10mL发酵液于离心管中，4000r/min离心10min；

倒掉上清液，用蒸馏水洗涤2次；

用蒸馏水将菌体移入预先干燥至恒质量M0的称量瓶中，置90℃电热恒温干燥箱中，干燥至恒质量；

用精密电子天平称量称量瓶与菌体总质量M0

进一步地，步骤（3-2）中进一步包括如下步骤：

不同处理方法得到的细胞碎片中加入10mL丙酮；

在室温下振荡浸泡1h提取类胡萝卜素；

在转速4000r/min离心15min，得到上清液即为类胡萝卜素提取液；

如残留的细胞碎片中仍有色素，加丙酮进一步提取，合并上清液；

将浸提液适当稀释后，用756型分光光度计在波长475nm下测定吸光度值。

进一步地，

细胞生物量公式为： $W_c=1000\×\frac{M-M_0}{10}$

式中：W_c——细胞生物量，g/ml；M——称量瓶与菌体的总质量，g；M₀——称量瓶的质量，g。进一步地，

类胡萝卜素产率（ρ）计算公式为：

$W=\frac{A_{\mathrm{\λ}\max }\×D\×V}{0.16m}$

式中：W——发酵液类胡萝卜素的质量分数，μg/g；A_λmax——最大吸收波长475nm下的吸光度；

D—测定试样的稀释倍数；V—提取色素用有机溶剂体积，ml；m—干酵母菌体质量，g；0.16—类胡萝卜素的摩尔消光系数。

与目前现有技术相比，本发明包括：不同浓度梯度盐酸的配制，酸热法处理红酵母，

有机溶剂提取色素及破壁效果比较。本发明提供的红酵母破壁方法使用的盐酸浓度低，破

壁时间短，效率高，类胡萝卜素的提取率较其他浓度酸处理提高近40%，且能耗低，工艺

简单，对设备要求低，低浓度的盐酸处理减少了类胡萝卜素的污染，该方法具有很强的实

用价值和开发前景。有利于提高红酵母发酵生产类胡萝卜素的产量、质量和降低生产成本。

具体实施方式

本发明多种实施方式中的一种优选实施例。

1、不同浓度梯度盐酸的配制

取一定量的浓盐酸加蒸馏水稀释至相关浓度梯度，根据查阅相关文献，确定盐酸浓度梯度分别为1mol/L、2mol/L、3mol/L、4mol/L、5mol/L、6mol/L。

上述的盐酸试剂为分析纯AR，物质量浓度为12mol/L，上海博河精细化学品有限公司生产，所有浓度的盐酸必须现配现用。

2、酸热法处理红酵母的步骤

（1）红酵母的发酵培养

将保藏的红酵母菌种移接到PDA培养基上，在28℃下活化48h。挑2环接入装有50mL的液体种子培养基的250mL三角瓶中，28℃振荡培养24h。然后按10％的接种量接入装有80mL发酵培养基的250mL三角瓶中，于28℃下振荡（180r／min）培养72h。

（2）不同浓度盐酸处理红酵母

取六只离心管，分别加入10mL上述发酵液，4000r/min离心10min，倒去上清液，各加入1-6mol/L的盐酸6mL浸泡40min后，于沸水浴中加热4-5min，迅速冷却离心，洗涤沉淀部分，弃去上清液，即得细胞碎片。

（3）不同酸浸泡时间

六只离心管中加入6mL1mol/L的盐酸，浸泡时间分别设置为10min、20min、30min、40min、50min、60min，后续操作同步骤（2）。

（4）不同处理下的破壁效果比较

a、酵母细胞生物量的测定———恒质量法

取10mL发酵液于离心管中，4000r/min离心10min，倒掉上清液，用蒸馏水洗涤2次；用蒸馏水将菌体移入预先干燥至恒质量M₀的称量瓶中，置90℃电热恒温干燥箱中，干燥至恒质量，用精密电子天平称量称量瓶与菌体总质量M。细胞生物量公式为： $w_c=1000\×\frac{M-M_0}{10}$

式中：W——细胞生物量，g/ml；M——称量瓶与菌体的总质量，g；M0——称量瓶的质量，g。b、类胡萝卜素提取与测定

不同处理方法得到的细胞碎片中加入10mL丙酮，在室温下振荡浸泡1h提取类胡萝卜素，然后在转速4000r/min离心15min，得到上清液即为类胡萝卜素提取液，如残留的细胞碎片中仍有色素，可加丙酮进一步提取，合并上清液。将浸提液适当稀释后，用756型分光光度计在波长475nm下测定吸光度值。类胡萝卜素产率(ρ)计算公式为：

$W=\frac{A_{\mathrm{\λ}\max }\×D\×V}{0.16m}$

式中：W——发酵液类胡萝卜素的质量分数，μg/g；A_λmax——最大吸收波长475nm下的吸光度；

D—测定试样的稀释倍数；V—提取色素用有机溶剂体积，ml；m—干酵母菌体质量，g；0.16—类胡萝卜素的摩尔消光系数。

1、不同浓度梯度盐酸处理的效果

1mol/L的盐酸处理可以解决菌体悬浮问题，加大量水稀释处理后，测定类胡萝卜素含量，发现1mol/L盐酸破壁后，类胡萝卜素的提取率提高近40%。

2、不同酸浸泡时间的效果

不同浸泡时间处理后，发现浸泡时间对酸热破壁效果影响较小，类胡萝卜素的提取率相差并不显著。因此，在保证破壁效果的条件下，可以适当缩短浸泡时间。

本发明针对目前的破壁方法进行了改进，采用1mol/L盐酸，浸泡20min即可达到良好的破壁效果，且提取率较其他浓度的酸处理提高近40%，因此，此发明具有一定的实用价值。

1、主要技术指标：盐酸浓度为1mol/L，浸泡时间为20min，沸水浴时间为4-5min。

2、用途：可广泛运用于红酵母的破壁，缩短破壁时间，减少盐酸的使用量，达到节能减排的效果，为酵母进一步加工利用提供有力的技术支撑。

3、预期的效益：本实验采用1mol/L的盐酸浓度，相比以往的酸碱破壁法的酸的用量要小很多，基本无残留，安全卫生。解决了高浓度盐酸破壁离心时菌体碎片悬浮导致类胡萝卜素提取量下降的问题。其次比以往的酸热破壁法减少了反应时间，具有很高的节能效率，可为企业减少能源的使用。

Claims (10)

1.一种红酵母的破壁方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）配制不同浓度梯度的盐酸；

（2）酸热法处理红酵母：

（2-1）红酵母的发酵培养；

（2-2）不同浓度盐酸处理红酵母；

（3）破壁效果比较：

（3-1）恒质量法测定酵母细胞生物量；

（3-2）类胡萝卜素提取与测定。

2.如权利要求1所述的红酵母的破壁方法，其特征在于，步骤（1）进一步包括如下步骤：

（1-1）取一定量的浓盐酸加蒸馏水稀释至相关浓度梯度；

（1-2）确定盐酸浓度梯度分别为1mol/L、2mol/L、3mol/L、4mol/L、5mol/L、6mol/L。

3.如权利要求1或2所述的红酵母的破壁方法，其特征在于，步骤（1）中盐酸试剂为分析纯AR，物质量浓度为12mol/L。

4.如权利要求1-3中任一项所述的红酵母的破壁方法，其特征在于，步骤（2-1）中进一步包括如下步骤：

将保藏的红酵母菌种移接到PDA培养基上，在28℃下活化48h；

挑2环接入装有50mL的液体种子培养基的250mL三角瓶中，28℃振荡培养24h；

按10％的接种量接入装有80mL发酵培养基的250mL三角瓶中，于28℃下振荡（180r／min）培养72h。

5.如权利要求1-4中任一项所述的红酵母的破壁方法，其特征在于，步骤（2-2）中进一步包括如下步骤：

取六只离心管，分别加入10mL上述发酵液，4000r/min离心10min；

倒去上清液，各加入1-6mol/L的盐酸6mL浸泡40min；

于沸水浴中加热4-5min，迅速冷却离心，洗涤沉淀部分；

弃去上清液，即得细胞碎片。

6.如权利要求1-5中任一项所述的红酵母的破壁方法，其特征在于，步骤（2）中六只离心管中加入6mL1mol/L的盐酸，浸泡时间分别设置为10min、20min、30min、40min、50min、60min。

7.如权利要求1-6中任一项所述的红酵母的破壁方法，其特征在于，步骤（3-1）中进一步包括如下步骤：

取10mL发酵液于离心管中，4000r/min离心10min；

倒掉上清液，用蒸馏水洗涤2次；

用蒸馏水将菌体移入预先干燥至恒质量M₀的称量瓶中，置90℃电热恒温干燥箱中，干燥至恒质量；

用精密电子天平称量称量瓶与菌体总质量M。

8.如权利要求1-7中任一项所述的红酵母的破壁方法，其特征在于，步骤（3-2）中进一步包括如下步骤：

不同处理方法得到的细胞碎片中加入10mL丙酮；

在室温下振荡浸泡1h提取类胡萝卜素；

在转速4000r/min离心15min，得到上清液即为类胡萝卜素提取液；

如残留的细胞碎片中仍有色素，加丙酮进一步提取，合并上清液；

将浸提液适当稀释后，用756型分光光度计在波长475nm下测定吸光度值。

9.如权利要求7所述的红酵母的破壁方法，其特征在于，

细胞生物量公式为： $W=1000\×\frac{M-M_0}{10}$

式中：W——细胞生物量，g/ml；M——称量瓶与菌体的总质量，g；M₀——称量瓶的质量，g。

10.如权利要求8所述的红酵母的破壁方法，其特征在于，

类胡萝卜素产率计算公式为：

$W=\frac{A_{\mathrm{\λ}\max }\×D\×V}{0.16m}$

式中：W—发酵液类胡萝卜素的质量分数，μg/g；A_λmax——最大吸收波长475nm下的吸光度；D—测定试样的稀释倍数；V—提取色素用有机溶剂体积，mL；m—干酵母菌体质量，g；0.16—类胡萝卜素的摩尔消光系数。