BRPI0313082B1 - "processo para preparação de extrato de raiz de echinacea angustifólia e uso do extrato assim obtido para preparação de composições farmacêuticas ou nutracêuticas e suplementos alimentícios". - Google Patents

Abstract

"extratos de echinacea angustifolia". a presente invenção refere-se a um extrato de echinacea angustifolia e um processo para a sua preparação. o extrato é caracterizado por um teor de alquilamidas menor do que 0,1 %, um teor de equinacosídeo variando de 1 a 10% e contendo de 1 a 15% de um polissacarídeo característico de echinacea angustifolia. o extrato pode ser usado no tratamento de condições patológicas, nas quais é desejável fortalecer as defesas imunes.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROCESSO PARA PREPARAÇÃO DE EXTRATO DE RAIZ DE ECHINACEA ANGUS-TIFÔUA E USO DO EXTRATO ASSIM OBTIDO PARA PREPARAÇÃO DE COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS OU N UTRACÊUTICAS E SUPLEMENTOS ALIMENTÍCIOS”.

Campo da Invenção A presente invenção refere-se a um extrato obtenível a partir de raízes de Echinacea angustifolia e a um processo para a sua preparação, O extrato pode ser usado no tratamento de condições patológicas, nas quais é desejável fortalecer as defesas imunes.

Antecedente da Invenção A Equinaoea é uma planta que se origina na América do Norte e do México; suas propriedades terapêuticas eram bastante conhecidas para os americanos nativos, que a usavam para cicatrizarem feridas. Devido ao fato que a Echinacea foi considerada capaz de aumentar a resistência a infecções, o seu uso para o tratamento de infecções locais e generalizadas tornou-se muito difundido durante os primeiros anos do último século. A Echinacea, em particular a Echinacea angustifolia, é hoje em dia altamente recomendada para o tratamento de síndromes de influenza e, em particular, para o tratamento de resfriado, para cicatrizar feridas e para o tratamento de micose, A ação geral é aparentemente devido ao estímulo específico do sistema imune e à sensibilização de germes e patógenos às substâncias quimioterapêu-ticas e aos antibióticos. As propriedades cicatnzantes parecem atribuíveis à capacidade de estabilizar os ácidos híalurônicos através da inibição da hialuronidase exercida por um dos princípios ativos contidos na planta, isto é o equinacosídeo, e à ativação maciça dos macrófagos induzida per políssacarídeos. Neste modo, quaisquer focos de infecção permanecem localizados e é favorecido o acúmulo de mucopolis-sacarídeos e material histoplástico necessários para os processos reparadores.

Portanto, para otimizar a capacidade da Echinacea de estimular o sistema imune, seria desejável proporcionar extratos enriquecidos em e-quinaeosídeo e políssacarídeos.

Entre os componentes ativos da planta, existem também substâncias que pertencem à classe das alquílamidas, em particular a equinaceína e as isobutilamidas de ácidos undecilênico e dodecaenínico que, além de exercerem propriedades fitoterapêuticas, inibem a ciclooxigenase (Planta Med. 60(1):37-40,1994) e a 5-lipoxigenase in vitro.

As alquilamidas, embora dotadas com atividade biológica, provaram ser altamente tóxicas. Na realidade, os estudos realizados pelo Requerente em esplenócitos de murino co-estimulados com concanavalina - A (Con-A) ou lipopolissacarídeo (LPS), in vitro, evidenciaram que as alquilamidas são ci-totóxicas começando a partir de concentrações de 1 pg/ml. Além disso, os extratos contendo 20% de alquilamidas inibem significativamente a motilida-de intestinal em camundongos, quando administrados i.p. em doses de 5 mg/ml ou maiores, e têm uma DL50 de 236 mg/kg quando administrados oralmente. Os extratos contendo 0,5% de alquilamidas mostraram também serem tóxicos em experiências de toxicidade subaguda, isto é quando os animais foram tratados por 30 dias com doses farmacologicamente ativas.

Seria, portanto, desejável preparar extratos de Echinacea com teor reduzido de alquilamidas e enriquecidos em equinacosídeo e polissaca-rídeos.

Os extratos de Equinacea podem ser preparados com solventes, por exemplo com misturas de etanol-água ou com dióxido de carbono su-percrítico. O WO 01/22977 divulga um processo para a preparação de extratos de Echinacea contendo quantidades padronizadas de dois ou três componentes da planta, em particular os polissacarídeos, o ácido cicórico e as alquilamidas. Cada componente é extraído de diferentes partes da planta com as misturas de etanol-água, por tempos prolongados. Os extratos são subseqüentemente combinados para a preparação de composições farmacêuticas.

Descrição Detalhada da Invenção O objeto da presente invenção é um extrato de Echinacea an-gustifolia caracterizado por um teor de alquilamidas menor do que 0,1%, um teor de equinacosídeo variando de 1 a 10% e contendo de 1 a 15% de um polissacarídeo característico de Echinacea angustifolia (daqui por diante re- ferido como "o polissacarídeo"). O polissacarídeo pesa 1,3 x 105 Da e consiste em ramnose, arabinose, galactose e ácido galacturônico em razão de 0,5:2,5:1,75:10,25, tem um esqueleto em que as porções retas e ramificadas se alternam, as porções retas consistindo em resíduos de ácido galacturônico parcialmente acetilados (9%) e metilados (35%), ligados via ligação a-(1-4), e as porções ramificadas consistindo em uma alternação de ácido galacturônico e ramnose, aos quais estão ligadas cadeias laterais contendo arabinose e galactose em razão de 2,5:1,75. O extrato é preparado a partir das raízes de Echinacea angusti-folia natural ou cultivada, por meio de um processo compreendendo as seguintes etapas: 1. extrair as raízes com um solvente orgânico ou com uma mistura de solvente orgânico-água tendo um teor de água não maior do que 40% (v/v) e repetidamente lavar os extratos reunidos e concentrados com um solvente apoiar; 2. extrair as raízes com água ou com uma mistura de solvente or-gânico-água tendo um teor de água de 60% (v/v) ou maior, preferivelmente de 80 a 85% (v/v); 3. misturar os extratos obtidos nas etapas precedentes.

Para os propósitos da presente invenção, "solvente orgânico" significa um solvente orgânico selecionado a partir de acetona ou um álcool contendo um a três átomos de carbono, preferivelmente o etanol. A primeira etapa, que permite remover os componentes de al-quilamidas e obter o extrato enriquecido em Equinacosídeo, preferivelmente compreende: 1a. extrair as raízes em temperatura variando de 20°C até a temperatura de refluxo do solvente orgânico ou da mistura de água-solvente orgânico, preferivelmente sob refluxo; 1 b. concentrar os extratos combinados até volume pequeno; lc. dissolver o concentrado em uma mistura de água-solvente orgânico tendo um teor de água não menor do que 50%; ld. repetidamente lavar a mistura de água-solvente orgânico com um solvente apoiar, selecionado, por exemplo, a partir de éter de petróleo, pentano, hexano ou heptano, preferivelmente he-xano; 1e. evaporar a mistura de água-solvente orgânico. A segunda etapa, que permite obter um extrato enriquecido em polissacarídeo, preferivelmente compreende: 2a. extrair as raízes da etapa de extração em uma temperatura variando de 20°C até a temperatura de ebulição da água ou da mistura de solvente, preferivelmente de 40 a 70°C; 2b. concentrar o extrato até volume pequeno; 2c. dissolver o resíduo em uma mistura de água-solvente orgânico, o teor de solvente orgânico variando de 50 a 70% (v/v), para obter um precipitado; 2d. filtrar e lavar o precipitado com a mesma mistura de solvente.

De acordo com uma modalidade preferida da invenção, a etapa 2c é realizada com etanol, mais preferivelmente com 66,5% (v/v) de etanol, isto é dissolvendo o resíduo obtido na etapa 2b em três partes de água e diluindo com 7 volumes de 95% de etanol (v/v), na temperatura ambiente e sob agitação. A terceira etapa preferivelmente compreende: 3a. dissolver os extratos reunidos das etapas precedentes em uma mistura de água-solvente orgânico, o solvente orgânico preferido sendo o etanol tendo um teor de água de 60% (v/v) ou maior, preferivelmente variando de 80 a 85% (v/v); 3b. concentrar a solução de água-solvente orgânico e secar sob pressão reduzida. A extração da etapa 1a é preferivelmente realizada com 90% (v/v) de etanol, enquanto que a extração da etapa 2a é preferivelmente realizada com 15% (v/v) de etanol. O extrato da invenção mostrou propriedades imune-estimula-doras em camundongos, em particular provou ser capaz de estimular a ativação dos linfócitos T e reduzir a mortalidade devida à infecção por Candida albicans em camundongos imunossuprimidos com ciclosporina A. O extrato da invenção pode ser, portanto, usado para a preparação de medicamentos, suplementos alimentícios ou composições nutracêuticas, para administrar em condições nas quais é desejável um aumento das defesas do sistema imune do corpo. O extrato pode ser formulado de acordo com técnicas convencionais, por exemplo em conformidade com aquelas descritas no Remington's Pharmaceutical Sciences Handbook, XVII ed. Mack Pub., N.Y., E.U.A. A presente invenção é, nas partes que se seguem, ilustrada por meio de alguns exemplos.

Exemplos Exemplo 1 Etapa 1: Preparação do extrato enriquecido em equinacosídeo 600 gramas de raízes moídas de Echinacea angustifolia são colocados em um percolador e extraídos sob refluxo, por quatro horas, com 2,5 L de 90% (v/v) de etanol. Após coletar o percolado, sete extrações adicionais são realizadas com o mesmo solvente; os percolados são reunidos e as raízes são preservadas para a etapa seguinte.

Os percolados combinados são filtrados e concentrados até volume pequeno, sob pressão reduzida. O concentrado é diluído com água e etanol para dar uma solução de 50% (v/v) de etanol, que é então extraída dez vezes com hexano. As camadas de hexano, que contêm alquilamidas, são descartadas. A solução hidroetanólica purificada é concentrada até a secura, sob pressão reduzida, para proporcionar 78,5 g de extrato (título de equinacosídeo por HPLC: 9,8%; título de alquilamidas por HPLC: 0,07%).

Exemplo 2 Etapa 2: Preparação do extrato enriquecido em polissacarídeo As raízes de Echinacea angustifolia obtidas da extração com 90% (v/v) de etanol, de acordo com o exemplo 1, são adicionalmente extraídas oito vezes com 2,5 L de 15% (v/v) de etanol, a 70°C.

Os percolados combinados são filtrados e concentrados até a secura, sob pressão reduzida. O extrato seco resultante (171 g) é dissolvido em 510 ml de água, e 1200 ml de 95% (v/v) de etanol são adicionados, sob agitação. O precipitado é filtrado, lavado com 66,5% (v/v) de etanol e secado a 60°C, sob pressão reduzida, para proporcionar 130 g de extrato purificado (título de polissacarídeo por GPC: 8,9%).

Exemplo 3 Mistura dos extratos intermediários 78,5 g do extrato enriquecido em equinacosídeo são combinados com 106,5 g do extrato enriquecido em polissacarídeo. A mistura é absorvida com 925 ml de 15% (v/v) de etanol, agitada por 1 hora e concentrada até a secura, sob pressão reduzida, para proporcionar 185 g de extrato de Echi-nacea angustifolia (título de equinacosídeo por HPLC: 4,2%; título de alqui-lamidas por HPLC: 0,04%; título de polissacarídeo por HPLC: 5,12%). O perfil do extrato por HPLC é descrito nas figuras 1 (fração que não é de polissacarídeo) e 2 (fração de polissacarídeo).

Exemplo 4 Determinação do teor de polissacarídeo por HPLC A caracterização dos extratos que contêm o polissacarídeo da invenção é efetuada com uma coluna TosoHaas TSK-Gel G 5000 PWXL eluída com água, contendo 0,5% de trietilamina, em condições isocráticas, em uma vazão de 0,5 ml/min. Durante a análise, que dura 30 minutos, a coluna é mantida a 50°C. O volume de injeção é 50 μΙ. Um detector evaporativo ELSD (Detector de Espalhamento de Luz Evaporativo) Sedex mod. 75 (S. E. D. E. R. E.) - cujo nebulizador é mantido a 60°C com pressão de gás de 2,2 x 105 Pa (2,2 bar), é acoplado à coluna.

Exemplo 5 Determinação do teor de equinacosídeo e alauilamidas por HPLC A determinação do teor de equinacosídeo e alquilamidas por HPLC nos extratos de Echinacea angustifolia é realizada com uma coluna de fase reversa Agilent Zorbax SB-C18 acoplada a um detector de UV visível (comprimento de ondas 235 nm), eluída com um gradiente adequado de água/aceto- nitrila contendo 0,01% de ácido trifluoracético, em uma vazão de 1,0 ml/min. Durante a análise, que dura 60 minutos, a coluna é mantida na temperatura ambiente. O volume de injeção é 10 μΙ.

Seção Biológica Experiência 1 Teste quanto à produção de y-interferon em linfócitos T (Zucca M. e outros, New Microbiol. 1996, 39-46) Os linfócitos T de murino, obtidos por separação dos esplenócitos sobre coluna de náilon-lã, foram cultivados em meio RPMI 1640 com 4% de soro de bezerro fetal, em placas de microtítulo opcionalmente pré-incubadas com oc-CD3 (anticorpo monoclonal anti-CD3 como ativador da função da célula, responsável pela produção de interferon). 48 Horas após a adição das substâncias para testar, foi avaliada a liberação de γ-interferon no meio de incubação.

Claims (8)

1. Processo para a preparação de extrato de raiz de Echinacea angustifólia, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas: 1. extrair as raízes com um solvente orgânico ou com uma mistura de solvente orgânico-água tendo um teor de á-gua não maior do que 40% (v/v) e subseqüentemente lavar os extratos reunidos e concentrados com um solvente apoiar; 2. extrair as raízes com água ou com uma mistura de solvente orgânico-água tendo um teor de água de 60% (v/v) ou maior; 3. misturar os extratos obtidos nas etapas precedentes, em que o solvente orgânico é selecionado a partir de acetona ou um álcool de 1 a 3 átomos de carbono e o solvente apoiar é selecionado a partir de éter de petróleo, pentano, hexano ou heptano, e em que o extrato de raiz de Echinacea angustifólia apresenta um teor de alquilamidas menor do que 0,1%, um teor de equinacosídeo variando de 1 a 10% e um teor de polissacarídeo variando de 1 a 15%, o polissacarí-deo pesando 1,3 x 105 Da e consistindo em ramnose, arabinose, galactose e ácido galacturônico em razão de 0,5:2,5:1,75:10,25, e o polissacarídeo tendo um esqueleto com porções retas e ramificadas alternadas, as porções retas consistindo em resíduos de ácido galacturônico parcialmente acetilados e metilados ligados via ligação a-(1-4) e as porções ramificadas consistindo em uma alternação de ácido galacturônico e ramnose, aos quais estão ligadas cadeias laterais contendo arabinose e galactose em razão de 2,5:1,75.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o solvente orgânico é o etanol.

3. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a etapa 1 compreende: 1a. extrair as raízes em temperatura variando de 20Ό até a temperatura de refluxo do solvente orgânico ou da mis tura de água-solvente orgânico; 1 b. concentrar os extratos combinados até volume pequeno; lc. dissolver o concentrado em uma mistura de água-solvente orgânico tendo um teor de água não menor do que 50% (v/v); ld. repetidamente lavar a mistura de água-solvente orgânico com um solvente apoiar; le. evaporar a mistura de água-solvente orgânico.

4. Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o solvente apoiar é o hexano.

5. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a etapa 2 compreende: 2a. extrair as raízes obtidas da extração da etapa precedente em temperatura variando de 20Ό até a tempera -tura de ebulição da água ou da mistura de solvente; 2b. concentrar o extrato até volume pequeno; 2c. dissolver o resíduo em uma mistura de água-solvente orgânico tendo um teor de solvente orgânico variando de 50 a 70%, para obter um precipitado; 2d. filtrar e lavar o precipitado com a mesma mistura de solvente.

6. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a etapa 3 compreende: 3a. dissolver os extratos combinados obtidos nas etapas precedentes em uma mistura de água-solvente orgânico, com um teor de água de 60% (v/v) ou maior; 3b. concentrar a solução de água-álcool e secar sob pressão reduzida.

7. Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o solvente orgânico é o etanol.

8. Uso do extrato obtido pelo processo como definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de composições farmacêuticas ou nutracêuticas e suplementos alimentícios.