IT201900001405A1

IT201900001405A1 - Estratto di echinacea pallida, relativo processo di preparazione, e relative composizioni farmaceutiche, cosmetiche e nutraceutiche

Info

Publication number: IT201900001405A1
Application number: IT102019000001405A
Authority: IT
Inventors: Giovanni Baratto
Original assignee: Unifarco S P A
Priority date: 2019-01-31
Filing date: 2019-01-31
Publication date: 2020-07-31
Also published as: ES2966756T3; EP3689359B1; EP3689359A1

Description

ESTRATTO DI ECHINACEA PALLIDA, RELATIVO PROCESSO DI PREPARAZIONE, E RELATIVE COMPOSIZIONI FARMACEUTICHE, COSMETICHE E NUTRACEUTICHE CAMPO DELL’INVENZIONE

La presente invenzione riguarda un estratto di Echinacea pallida a molto basso contenuto in alchilammidi per uso in composizioni farmaceutiche, nutraceutiche ed in campo alimentare. STATO DELLA TECNICA

Il genere Echinacea (Asteracee) comprende un piccolo numero di specie resistenti erbacee e perenni originarie del Nord America. Tre di queste specie Echinacea angustifolia, Echinacea pallida ed Echinacea purpurea erano considerate differenti varietà della stessa specie, ora invece, in seguito ad una revisione tassonomica del genere, questa pianta comprende due sottogeneri e 4 specie.

E. purpurea, E. pallida, E. atrorubens ed E.laevigata, per cui E. angustifolia ed E. pallida sono ora state classificate come E. pallida var. angustifolia ed E. pallida var. pallida. In ogni caso Joanne Barnes et al. nella rassegna dal titolo Echinacea species (Echinacea angustifolia (DC) Hell: Echinacea pallida (Nutt.) Nut., ,Echinacea purpurea (L.) Moench): a review of their chemistry, pharmacology and clinical properties) le descrive come 3 specie: E. angustifolia, E. pallida ed E. purpurea.

Come riportato in questa rassegna, l’Echinacea è da tempo usata in campo medicinale, principalmente nel campo delle infezioni quali la sifilide e le ferite settiche, ma anche come antitossina per i morsi di serpente.

L’interesse corrente è principalmente focalizzato sulle sue proprietà immunostimolanti in particolare nel trattamento e prevenzione del comune raffreddore, influenza e altre infezioni del tratto superiore respiratorio, le cosiddette URTI.

I principali costituenti del genere Echinacea sono i caffeoil derivati (Echinacoside, gli acidi cicorico, clorogenico e caftarico).

Per quanto concerne le alcammidi o alchilammidi sono presenti sia in E. purpurea ed in E. angustifolia, mentre sono presenti in un contenuto decisamente più basso in E. pallida. Anche se le alcammidi mostrano elevate proprietà immunomodulanti via il recettore di tipo 2 cannabinoide, tuttavia, a causa della elevata lipofilicità e la loro probabile tendenza ad accumularsi nei tessuti, sono necessari maggiori studi di approfondimento per testarne l’effettiva non tossicità.

Come riportato nella suddetta rassegna di Barnes et al., vi sono alcune differenze nei costituenti di ciascuna Echinacea, come meglio identificati nella seguente tabella proveniente dalla suddetta rassegna di Joanne Barnes et al.

Come si può osservare, ad esempio, l’echinacoside è presente in E. angustifolia ed in E. pallida, mentre è assente in E. purpurea, mentre le alcammidi sono invece contenute in E. pallida in quantitativi decisamente più bassi rispetto alle altre due specie.

EP1539203 descrive un estratto di radici di E. angustifolia, avente un contenuto più basso dello 0,1% in alchilammidi, ed un contenuto in polisaccaridi compreso tra 1 e 15%, ed in cui il polisaccaride ha peso molecolare di 1.3x10<5 >Da ed è costituito da ramnosio, arabinosio, galattosio ed acido galatturonico in uno specifico rapporto di 0.5:2.5:1.75:10.25.

Anche se l’estratto divulgato in questa anteriorità è un ottimo prodotto, destinato ad un uso nutraceutico, farmaceutico o anche in campo alimentare, presenta una discreta quantità di alchilammidi, i cui inconvenienti sono riportati sopra, inoltre il processo di estrazione contempla moltissimi stadi di lavaggio con solventi che inevitabilmente rimangono intrappolati, seppure in modeste quantità, nel prodotto finale.

E’ sentita quindi l’esigenza di disporre un estratto di Echinacea, che non presenti i suddetti inconvenienti e che nel contempo possa essere prodotto con un processo meno laborioso e in forma più pura consentendo il suo utilizzo in tutta tranquillità anche in campo alimentare. SOMMARIO DELL’INVENZIONE

La richiedente ha ora trovato che è possibile superare i suddetti problemi dello stato della tecnica con l’estratto secondo la presente invenzione.

Oggetto della presente invenzione è quindi un estratto dalle radici di Echinacea pallida. Viene descritto un estratto di Echinacea pallida avente:

• un contenuto in alchilammidi < 0,05% sul peso totale dell’estratto;

• un contenuto in echinacoside ≥2% in peso sul peso totale dell’estratto,

• un contenuto totale in polisaccaridi ≥ 30% in peso sul peso totale dell’estratto

• ed un contenuto in polisaccaridi con peso molecolare ponderale medio superiore o uguale a 12.000 Da ≥5%.

Questo estratto viene ottenuto con un processo che comprende i seguenti stadi:

a) estrazione della frazione contenente echinacoside per miscelazione a caldo delle radici di Echinacea pallida, in solvente idroalcolico,

b) concentrazione a piccolo volume del solvente della miscela proveniente dal precedente stadio sino ad ottenimento di un estratto molle con concentrazione compresa tra 20°Bx e 40°Bx,

c) estrazione della frazione contenente polisaccaridi per miscelazione in acqua a caldo di radice di Echinacea pallida,

d) concentrazione a piccolo volume dell’acqua sino ad ottenimento di un estratto molle con concentrazione compresa tra 20°Bx e 40°Bx.

e) unione dei due estratti molli ottenuti negli stadi b) e d) ed essiccazione con uno dei metodi noti dalla pratica tecnica, preferenzialmente in granulatore a letto fluido contenente maltodestrina e silice. Ulteriore oggetto della presente invenzione è l’uso di detto estratto come medicamento, come cosmetico o come nutraceutico.

Infine oggetto della presente invenzione sono composizioni nutraceutiche, composizioni cosmetiche o composizioni farmaceutiche che contengono come principio attivo l’estratto oggetto della presente invenzione in combinazione con adatti eccipienti e/o diluenti.

DESCRIZIONE DELLE FIGURE

Le figure 1 e 2 riportano i cromatogrammi della frazione dell’estratto dell’invenzione di echinacoside e alchilammidi.

La figura 3 riporta il cromatogramma della frazione dell’estratto contenente polisaccaridi. La figura 4 riporta le concentrazioni di IL-1β misurata in ng/ml espressa da macrofagi isolati da buffy coat di sangue venoso umano in assenza o a differenti concentrazioni dell’estratto di E.pallida in assenza o in presenza dell’agente infiammatorio LPS.

La figura 5 riporta le concentrazioni di TNF-α misurato in ng/ml espressa da macrofagi isolati da buffy coat di sangue venoso umano in assenza o a differenti concentrazioni dell’estratto di E.pallida in assenza o in presenza di LPS.

La figura 6 riporta IL-1β espressa da cellule dendritiche (monociti) da buffy coat di sangue venoso umano coltivate per 7 g in RPMI1640, in presenza o meno di Echinacea.

La figura 7 riporta TNF-α espresso da cellule dendritiche (monociti) da buffy coat di sangue umano venoso coltivate per 7 g in RPMI1640 in presenza o meno di Echinacea.

La figura 8 riporta la concentrazione di cellule dendritiche (monociti) da buffy coat di sangue umano venoso incubate in presenza o meno di Salmonella ed in presenza o meno di Echinacea sottoposte a colorazione CD80 (marcatore di attivazione).

La figura 9 riporta la concentrazione delle medesime cellule al termine dell’incubazione sottoposte a colorazione con anti-CD11c (marcatore per cellule dendritiche).

La figura 10 riporta la concentrazione delle stesse cellule dendritiche (monociti) da buffy coat di sangue umano venoso in presenza o meno di Salmonella ed in presenza o meno di Echinacea sottoposte ad analisi citofluorimetrica per determinare la percentuale di cellule CD11c positive per i due marcatori di attivazione (CD80 e HLA-DR grafici di figura 10 e 11) e per l’intensità del segnale fluorescente (MFI) indicativo dell’espressione di ciascuna proteina.

La figura 11 riporta la concentrazione dello stesso tipo di cellule sottoposte ad HLA-DR (marcatore di attivazione).

DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL’INVENZIONE

Per gli scopi della presente invenzione le definizioni “comprendente/i” o “contenente/i” non escludono la presenza di ulteriori componenti oltre a quelli esplicitati dopo tale definizione, ben diversa dalle definizioni “costituita /e” o “costituito/i” o “consistente/i” che escludono la presenza di ulteriori componenti esplicitati successivamente a tali definizioni.

Per gli scopi della presente invenzione come nutraceutico si intende la definizione data da Stephan Defelice nel 1989 ovvero un alimento (o parte di esso), preferibilmente una parte di esso (nello specifico l’estratto oggetto della presente invenzione) e che ha effetti positivi per il benessere e la salute, inclusi la prevenzione e il trattamento delle malattie.

Per composizione nutraceutica si intende una formulazione orale contenente detto nutraceutico in combinazione con adatti eccipienti e/o diluenti.

Per composizione farmaceutica si intende una formulazione preferibilmente orale contenente l’estratto oggetto della presente invenzione come principio attivo farmaceutico in combinazione con adatti eccipienti e/o diluenti.

Per composizione cosmetica si intende una formulazione, preferibilmente topica, contenente il suddetto estratto come principio attivo in combinazione con adatti eccipienti e/o diluenti Preferibilmente il contenuto in echinacoside è compreso tra 2 e 5%, più preferibilmente è compreso tra 2 e 3% in peso sul peso totale di estratto. Il contenuto in alchilammidi è preferibilmente compreso tra 0,01 e 0,05% sul peso totale dell’estratto.

Il contenuto totale in polisaccaridi è preferibilmente compreso tra 30 e 80% in peso, mentre il contenuto in polisaccaridi con peso molecolare medio ponderale superiore o uguale a 12.000 Da è preferibilmente compreso tra 5 e 12% in peso sul peso totale dell’estratto. Nel processo di preparazione dell’estratto secondo la presente invenzione, la temperatura alla quale viene condotto lo stadio a) è preferibilmente compresa tra 20 e 40°C. Il solvente idroalcolico è preferibilmente etanolo ad una concentrazione compresa tra 40 e 80%, preferibilmente all’80%.

Nello stadio b) l’estratto ottenuto viene concentrato a piccolo volume sino ad ottenere un estratto molle con concentrazione di 31,5° Bx.

Lo stadio c) viene condotto preferibilmente a temperatura compresa tra 20 e 80°C, mentre nello stadio d) si concentra fino a 25,5° Bx.

Nello stadio e), preferibilmente, la maltodestrina è il 23% sul peso totale dell’estratto e la silice è il 5% sul peso totale dell’estratto

L’estratto oggetto della presente invenzione viene in particolare usato nel trattamento e prevenzione del comune raffreddore, influenza e ed altre infezioni del tratto superiore respiratorio (URTI).

Si riportano a scopo illustrativo ma non limitativo i seguenti esempi di preparazione dell’estratto di Echinacea pallida e delle relative prove dell’effetto immunomodulante esercitato dall’estratto di Echinacea pallida secondo la presente invenzione.

Esempio 1 ottenimento dell’estratto molle arricchito in echinacoside.

267 g di radice di Echinacea pallida sono posti in un estrattore/miscelatore a cui si aggiungono 3,2 kg di una soluzione idroalcolica (etanolo all’80%) ed estratti per 4 ore. Quindi si procede a concentrare l’estratto ottenuto fino ad ottenere un estratto molle con una concentrazione di 31,5 Bx. Si ottengono 130 g di estratto molle.

Esempio 2 ottenimento dell’estratto molle in polisaccaridi

Procedendo utilizzando all’incirca gli stessi quantitativi di radice e stesso volume (acqua) si procede all’estrazione della frazione ricca di polisaccaridi. Dopo quattro ore si concentra a piccolo volume sino a 25,5 Bx. Si ottengono in questo modo 125 g di estratto molle.

Esempio 3 miscelazione degli estratti molli ed essiccazione

Si uniscono 130 g di estratto molle pari a 40,95 g di estratto secco contenente il 4,92% di echinacoside con 80,3 g di estratto ricco in polisaccaridi corrispondenti a 20,48 g di estratto secco in essiccatore a letto fluido a cui si aggiungono 23,7 g di maltodestrine e 6,8 g di silice. Si ottengono 80 g di estratto contenenti il 2% di echinacoside.

Esempio 4 Determinazione mediante HPLC del contenuto di polisaccaridi.

Per la caratterizzazione degli estratti contenenti i polisaccaridi si utilizza una colonna Phenomenex Polysep -GFC-P3000 (300 x7,8 mm con precolonna Guard Column), come eluente tampone ammonio acetato 0,1M e acetonitrile (99:1) in condizioni isocratiche ad un flusso di 0,5 ml/min. Durante l’analisi della durata di 30 minuti, la colonna è mantenuta ad una temperatura di 50°C.

Il volume di iniezione è di 10 µl ed alla colonna sopra descritta è accoppiato un rivelatore ELSD Sedex mod.60LT, il cui nebulizzatore è mantenuto ad una temperatura di 60°C, con una pressione del gas pari a 2,3 bar.

Nelle figura 3 si riporta il cromatogramma della frazione contenente i polisaccaridi.

Esempio 5 Determinazione mediante HPLC del contenuto di echinacoside ed alchilammidi

Per la determinazione del contenuto di echinacoside ed alchilammidi nell’estratto di E. pallida oggetto dell’invenzione si utilizza una colonna in fase inversa Agilent SB C- 18 (4,6 x50mm 1,8 µm, utilizzando per l’eluizione acqua acida (1% acido formico) e acetonitrile, ad un flusso di 1,0 ml/minuto. Durante l’analisi della durata di 7,5 minuti, la colonna viene mantenuta a temperatura ambiente. Il volume d’ iniezione è di 10µl, ed alla colonna sopra descritta si accoppia un rivelatore UV-visibile, la lunghezza d’onda di rivelazione è di 330 nm.

Nelle figure 1 e 2 si riportano i cromatogrammi rispettivamente di echinacoside e delle alchilammidi.

Esempio 6 Valutazione dell’attività immunomodulante di un estratto di Echinacea pallida.

Esempio 6-1 Attività antiinfiammatoria

L’attività anti-infiammatoria è stata saggiata in vitro su macrofagi differenziati a partire da monociti umani circolanti.

I macrofagi sono stati ottenuti isolando dal buffy coat di sangue venoso umano i monociti. Questi sono stati coltivati in RPMI 1640 contenente 5% FCS, 1% antibiotici e rh M-CSF (10 ng/ml) per 10 giorni. Il terreno è stato sostituito ogni 48 ore. Il giorno dell’esperimento le cellule sono state poste in terreno fresco completo con o senza LPS in presenza o assenza di estratto di Echinacea alla concentrazione di 10 -1 - 0.1 µg/ml. Il terreno è stato raccolto dopo 24 ore ed immediatamente congelato. Per il dosaggio delle citochine di interesse sono stati utilizzati saggi ELISA specifici per IL-1β, TNF-α. I dati ottenuti sono riportati nelle figure Esempio 6-2 Attività immunomodulante

L’attività immuno-modulante è stata saggiata in vitro su cellule dendritiche differenziate a partire da monociti umani circolanti con due tipi di misurazioni.

Le cellule dendritiche sono state ottenute isolando dal buffy coat di sangue venoso umano i monociti. Questi sono stati coltivati in RPMI 1640 contenente 5% FCS, 1% antibiotici e rh GM-CSF ed rh IL-4. (10 ng/ml ciascuno) per 7 giorni. Il terreno è stato sostituito ogni 48 ore mediante centrifugazione delle cellule dendritiche che crescono in sospensione.

In una prima serie di saggi il giorno dell’esperimento le cellule sono state poste in terreno fresco completo con o senza estratto di Echinacea alla concentrazione di 10 - 1 - 0.1 µg/ml. Il terreno è stato raccolto dopo 24 ore ed immediatamente congelato. Per il dosaggio delle citochine di interesse sono stati utilizzati saggi ELISA specifici per IL-1β, TNF-α. I dati ottenuti sono riportati nei grafici delle figure 6 e 7.

In una seconda serie di esperimenti, le cellule dendritiche sono state incubate per un’ora con o senza Salmonella (MOI 1:1) in terreno privo di antibiotico a 37°C. Al termine dell’incubazione le cellule sono state raccolte mediante centrifugazione a bassa velocità e lavate due volte con RPMI sterile per rimuovere i batteri non penetrati nelle cellule. Al termine le cellule dendritiche sono state risospese in terreno fresco completo contenente antibiotico con o senza estratto di Echinacea alla concentrazione di 10 - 1 - 0.1 µg/ml. Quindi le cellule sono state incubate per 24 h a 37°C. Al termine dell’incubazione sono state raccolte mediante centrifugazione e sottoposte a colorazione con anti-CD11c (marcatore per cellule dendritiche) e CD80 o HLA-DR (marcatori di attivazione). Quindi le cellule sono state sottoposte ad analisi citofluorimetrica per determinare la percentuale di cellule CD11c positive per i due marcatori di attivazione e per l’intensità del segnale fluorescente (MFI) indicativo dell’espressione di ciascuna proteina. I dati ottenuti sono riportati nei successivi grafici delle figure 8-11.

Esempio 6-3 Conclusioni

Dai saggi condotti con i macrofagi umani si evince una buona attività anti-infiammatoria, evidenziata dalla capacità dell’estratto di Echinacea di inibire in maniera significativa la produzione di due potenti citochine pro-infiammatorie (IL-1β e TNFα). Gli effetti appaiono più consistenti alla dose di 1 μg/ml di estratto. Dosi più elevate sembrano causare, almeno in vitro, la attivazione aspecifica dei macrofagi, mentre la dose di 0.1 μg/ml da risultati ragionevoli: su macrofagi non attivati è in grado di ridurre la produzione basale di IL-1β e TNFα, mentre su cellule attivate dal LPS non ha effetto. Complessivamente l’attività “immuno-modulante”, valutata come capacità di influenzare il fenotipo e la risposta di cellule dendritiche umane ad un potente stimolo pro-infiammatorio, sembra meno energica di quella anti-infiammatoria, seppur presente. L’estratto riduce in maniera significativa e consistente alla dose di 1 μg/ml la produzione di citochine pro-infiammatorie da cellule dendritiche in condizioni basali e riduce la espressione di CD80 e dell’MHC II (in un caso riducendo la percentuale di cellule positive, nell’altro la quantità di molecole espresse per cellula).

In conclusione, i saggi preliminari condotti in vitro su macrofagi e cellule dendritiche umane hanno dimostrato un’ottima attività anti-infiammatoria ed una discreta azione immunomodulante dell’estratto di Echinacea testato.

Claims

Rivendicazioni 1. Estratto dalle radici di Echinacea pallida avente: • un contenuto in alchilammidi < 0,05% • un contenuto in echinacoside ≥2%, • un contenuto totale in polisaccaridi ≥ 30% • ed un contenuto in polisaccaridi con peso molecolare ponderale medio superiore a 12.000Da, ≥5%.
2. Estratto secondo la rivendicazione 1, in cui il contenuto in alchilammidi è compreso tra 0,001 e 0,05%.
3. Estratto secondo la rivendicazione 1 o 2 in cui il contenuto in echinacoside è compreso 2 e 5%, preferibilmente è compresa tra 2 e 3% in peso sul peso totale di estratto
4. Estratto secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-3, in cui il contenuto di polisaccaridi totali è compreso tra 30 e 80% in peso sul peso totale dell’estratto.
5. Estratto secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-4, in cui il contenuto in polisaccaridi con peso molecolare medio ponderale è compreso tra 5 e 12% in peso sul peso totale dell’estratto.
6. Processo di preparazione dell’estratto secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-5 comprendente i seguenti stadi: a) estrazione della frazione contenente echinacoside per miscelazione a caldo delle radici di Echinacea pallida, in solvente idroalcolico, b) concentrazione a piccolo volume del solvente della miscela proveniente dal precedente stadio sino ad ottenimento di un estratto molle con concentrazione in componente solida compresa tra 20 e 40°Bx c) estrazione della frazione contenente polisaccaridi per miscelazione in acqua a caldo di radice di Echinaea pallida. d) concentrazione a piccolo volume dell’acqua sino ad ottenimento di un estratto molle con concentrazione in componente solida compresa tra 20 e 40°Bx. e) unione dei due estratti molli ottenuti negli stadi b) e d) ed essiccazione in granulatore a letto fluido contenente maltodestrina e silice.
7. Processo secondo la rivendicazione 6 in cui la temperatura è compresa tra 20 e 40°C e detto solvente idroalcolico è preferibilmente etanolo ad una concentrazione compresa tra 40 e 80%, preferibilmente all’80%.
8. Processo secondo la rivendicazione 6 o 7, in cui nello stadio b) l’estratto ottenuto viene concentrato a piccolo volume sino ad ottenere un estratto molle con concentrazione di 31,5° Bx.
9. Processo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 6-8, in cui nello stadio b) l’estratto ottenuto viene concentrato a piccolo volume sino ad ottenere un estratto molle con concentrazione di 31,5° Bx.
10. Processo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 6-8 in cui lo stadio c) viene condotto a temperatura compresa tra 20e 80°C.
11. Processo secondo una qualsiasi 6-10, in cui nello stadio e) la maltodestrina è il 23% sul peso totale dell’estratto e la silice è il 5% sul peso totale dell’estratto.
12. Estratto secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 -5 per uso come nutraceutico, come cosmetico o come medicamento.
13. Estratto secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-5 per uso nel trattamento e prevenzione del comune raffreddore, influenza e ed altre infezioni del tratto superiore respiratorio (URTI).
14. Composizioni farmaceutiche, cosmetiche o nutraceutiche contenenti come principio attivo l’estratto secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-5 in combinazione con adatti eccipienti e/o diluenti.
15. Composizioni farmaceutiche secondo la rivendicazione 14, adatte per la somministrazione orale.