KR20010077956A - 하수오에서 항산화 성분을 추출하는 방법, 하수오 추출물및 하수오 추출물 또는 하수오 분말을 포함하는 건강식품 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 하수오에서 항산화 성분을 추출하는 방법, 하수오 추출물 및 하수오 추출물 또는 하수오 분말을 포함하는 건강식품에 관한 것이다. 본 발명의 하수오 추출방법은 하수오를 메탄올, 에탄올 및 물로 구성된 군으로부터 선택된 1종의 용매로 추출하는 단계 및 상기 추출된 용액을 농축 및/또는 건조하는 단계를 포함한다. 본 발명에 의한 하수오 추출물은 항산화제로 잘 알려진 아스코베이트와 유사하게 농도가 높아짐에 따라 유사한 항산화 활성을 보이며, 종래의 생약추출물의 항산화 활성에 비하여 효과가 우수하고, 냄새 등의 문제가 없어 건강식품 등에 광범위하게 사용할 수 있다.
Description
하수오에서 항산화 성분을 추출하는 방법, 하수오 추출물 및 하수오 추출물 또는 하수오 분말을 포함하는 건강식품에 관한 발명으로, 상세하게는 하수오에서 천연 항산화성 성분을 용매 추출하고, 분리하는 방법과 이에 의하여 분리된 추출물질 그리고 상기 추출물질 또는 하수오 분말을 함유한 건강식품에 관한 발명이다.
최근 천연식물체를 중심으로 한 연구가 발전하면서 이들이 가지는 생리활성 물질에 대한 관심이 증대되고 있다. 생리활성 물질은 적은 양으로 현저한 활성을 나타내는 고부가치 물질이기에 새로운 물질들의 연구, 개발이 활발히 이루어지고 있다. 특히 인공합성물질 중 일부에 대한 안전성 문제들이 제기되고, 사람들의 건강에 대한 관심과 욕구 증대에 따라 천연 생리활성 물질에 대한 관심은 더욱 증가할 것으로 보인다. 따라서 식품학, 영양학, 약학 등의 연구분야에서는 다양한 천연 식물체 내에 존재하는 여러 화합물들의 생물학적 활성 평가가 이루어지고 있으며, 그 중 항산화 활성에 관한 연구에 관심이 집중되고 있다.
생물체의 산화스트레스로 인한 산화물이 노화를 비롯한 암, 동맥경화 등의 각종 만성 퇴행성 질환의 발생원인으로 밝혀지면서 이를 조절하는데 관여하는 천연 항산화 물질의 가치가 부각되고 있다.
일반적으로 항산화제는 인체에서 세포막의 산화 등을 저해하여, 노화 등의 예방에 유익한 성분으로 알려졌으나, 기존의 합성 항산화제는 천연물에 비해서 인체독성이 있는 관계로 식품 등 인간의 섭취물에 인공적으로 첨가되는 첨가제로 사용하기에는 문제가 있어, 최근 천연 항산화제의 추출, 분리를 위한 연구가 활발히 진행되고 있다.
그 예로서, 탈지미강을 물과 에탄올 혼합액으로 추출하여 얻은 추출액을 여과, 농축한 다음 항산화제를 제조하는 방법(국내특허공고 제 95-10536호) 등이 있다. 그러나 많은 경우에 그 원료의 공급이나 추출공정에 많은 비용이 소요되어 그 응용에 문제가 있었다.
하수오는 비교적 쉽게 재배가 가능하여 실제로 이러한 측면에서 유리하게 이용될 수 있는 소재이기 때문에 본 발명의 발명자들은 하수오를 이용하여 항산화 성분을 얻는 발명을 할 필요성이 있었다.
상기한 문제점을 해결하기 위하여,
본 발명은 식품이나 약품에 응용할 수 있는 항산화 활성을 가지는 하수오 추출물을 대량으로 저렴하게 추출, 분리하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 상기의 방법에 의해 추출된 항산화 추출물 및 그 추출물 또는 하수오 분말을 포함하는 건강식품을 제공하는 것을 목적으로 한다.
도 1은 하수오에서 천연 항산화 성분을 추출하는 과정을 대략적으로 도시한 공정도이고,
도 2는 하수오에서 천연 항산화 성분을 물로 추출하는 과정을 대략적으로 도시한 공정도이고,
도 3은 하수오에서 천연 항산화 성분을 알코올로 추출하는 과정을 대략적으로 도시한 공정도이다.
상기한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 하수오를 메탄올, 에탄올 및 물로 구성된 군으로부터 선택된 1종의 용매로 추출하는 단계와 상기 추출된 용액을 농축 및/또는 건조하는 단계를 포함하는 하수오에서 항산화 성분을 추출하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 추출한 단계 후에, 상기 추출된 용액을 농축하는 단계와 상기 농축된 용액을 에틸아세테이트, 부탄올, 부탄올 및 물의 혼합액, 클로로포름, 및 클로로포름 및 물의 혼합액으로 구성된 용매 중에서 선택된 1종 이상의 용매를 이용하여 추출하는 단계를 더욱 포함하는 하수오에서 항산화 성분을 추출하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기의 추출방법에 의한 항산화 효과를 갖는 하수오에서 추출된 항산화 추출물과 상기의 하수오에서 추출된 항산화 추출물 또는 하수오 분말을 포함하는 건강식품을 제공한다.
하기에 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
하수오는 마디풀목 마디풀과의 여러해살이풀로, 길이는 약 1∼3 m 이다. 줄기가 땅바닥으로 길게 뻗거나 다른 것을 감아 오르는 덩굴성 식물이다. 뿌리는 옆으로 길게 뻗으며, 군데군데에 고구마와 같은 굵은 덩이뿌리가 생긴다. 원줄기는 가지가 갈라지면서 길게 뻗어간다. 잎은 어긋나며 자라는데, 길이는 약 3∼6 ㎝이고, 나비는 약 2. 5∼4. 5 ㎝이다. 잎의 모양은 달걀모양 심장꼴이며, 가장자리는 밋밋하고 끝은 뾰족하다. 잎자루의 아랫부분에는 짧은 잎집이 있다. 꽃은 8∼9월에 원추꽃차례로 핀다. 원추꽃차례는 긴 꽃대에 여러 개의 꽃이 어긋나게 붙으면서 밑에서부터 피기 시작하여 끝까지 피는 것으로, 전체가 원뿔모양이 되는 것을 말한다. 꽃의 빛깔은 흰색이다. 꽃받침은 5장이고 꽃잎은 없다. 수술은 8개로 꽃받침보다 길이가 짧다. 씨방은 달걀모양이고 암술대는 3개이다. 열매는 넓은 달걀모양의 수과이다. '수과'는 껍질이 얇아서 씨와 껍질이 하나로 딱 붙어있어 전체가 한 개의 열매로 보이는 것을 말한다. 열매의 크기는 2.5 ㎝정도이고, 윤기가 나며, 꽃받침으로 싸여있다. 열매는 익으면 터져서 흰 솜털이 달린 씨가 나온다. 한방에서는 붉은색을 띤 갈색 덩이뿌리를 하수오라고 하며, 강장제·강정제 및 완화제로 쓰고, 감기·신경쇠약·관절염을 치료하는데도 쓴다. 잎은 나물로 하여 먹으며, 생잎은 곪은 데 붙여서 고름을 빨아들이는데 쓴다. 하수오와 비슷한 것으로 나도하수오가 있는데, 이것은 잎이 크고 열매가 날개없이 세모난 달걀모양을 하고 있고 꽃덮이에 싸여 있어서 하수오와는 다르다. 하수오는 한국을 비롯하여 중국·일본 등지에 널리 분포한다.
하수오는 크게 적하수오(Polygonum multiflorum Thunberg)와 백하수오(Cynan chum wilfordii Hemsley)의 두 가지로 구분되는데 우리나라에서 주로 재배되는 하수오는 백하수오이다. 한방에서 하수오는 간과 신장을 재생시키고, 혈액을 재보충하여 검은 머리를 나게 하는 약효를 가진 것으로 알려져 왔고, 최근에는 하수오의 혈중 콜레스테롤 농도 저하 효과가 입증되었다. 하수오의 생리적 활성은 하수오 중에 함유된 안트라퀴논에 의한 것으로 알려졌으나, 하수오에는 그 외에도 식물성 스테롤, 각종 배당체화합물을 함유하고 있다.
최근 암을 비롯한 각종 만성 퇴행성 질환의 발생과 관련하여 체내에서 생성되는 산화물의 일종인 각종 자유 라디칼 틀에 의한 체내조직 손상이 연구되고 있다. 이들은 체내대사과정 중에 생성되어 조직내의 단백질 및 지질과 결합한 후 조직장해를 일으키고 세포노화를 촉진시킨다. 즉 세포의 노화는 이들 산화물의 생성과 밀접한 관련을 가지는 것으로 보이고 식품 내의 항산화 성분은 이를 억제하게 된다. 이러한 맥락에서 볼 때 예로부터 알려진 하수오의 항노화 효과는 하수오가 소유한 항산화 성분에 의할 것으로 추측되나 구체적인 연구가 시도된 바 없었으므로, 본 발명의 발명자들은 하수오에서 항산화 성분을 추출하는 방법과 그에 의해 추출된 항산화 추출물을 얻는 발명을 완성하게 된 것이다.
본 발명의 하수오에서 항산화물 추출방법은 (a) 하수오를 메탄올, 에탄올 및 물로 구성된 군으로부터 선택된 1종의 용매로 추출하는 및 (b) 상기 추출된 용액을농축 및/또는 건조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명의 하수오에서 항산화물 추출방법은 상기 (b)의 추출방법으로 하수오 추출물을 추출한 다음 에틸아세테이트, 부탄올, 부탄올/물 혼합액, 클로로포름 및 클로로포름/물 혼합액으로 이루어진 군으로부터 선택되어지는 용매로 추출하는 것을 더욱 포함한다. 상기의 부탄올/물의 혼합비는 부탄올 : 물이 부피비로 50 : 50에서 80 : 20인 것이 바람직하며, 가장 바람직하게는 60 : 40이 가장 바람직하며, 부탄올 수화시 약 20 %의 물이 필요하여 실제 비율은 80 : 20이 가장 바람직하게 된다. 수층을 분리시키기 위한 물의 비율은 최소한 40이 요구되며, 단 부탄올 용매 분획의 추출을 보다 완전히 하기 위해 부탄올 : 물의 부피비는 80 : 20이 적당하다.
상기의 클로로포름/물의 혼합비는 클로로포름: 물이 부피비로 60 : 40에서 90 : 10인 것이 바람직하며, 클로로포름 용해 분획의 추출을 보다 완전히 하기 위해 클로로포름 : 물의 부피비를 80 : 20으로 하는 것이 가장 바람직하다.
본 발명의 하수오 추출물은 항산화효과를 가지며 지질 과산화물 생성을 억제시킨다. 또한 동물실험으로 하수오 추출물의 생체내에서 지질 과산화물 생성 억제능을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 하수오 추출물은 약제, 식품, 식품첨가제 등으로 활용하여 건강증진의 목적으로 사용할 수 있으며, 하수오 분말 역시 동일한 효과를 가지며 활용할 수 있음은 당연한 것이다.
본 발명의 하수오 추출물 또는 하수오 분말은 환, 정제, 캔디, 젤리, 선식, 과립, 죽, 음료, 과자, 빵 등의 원료로 사용할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1]
(1) 하수오 물 추출물 제조
증류수 400 ㎖ 에 하수오 40 g을 혼합하여 70 ℃에서 4시간 동안 교반하였다. 그 후 3000 rpm에서 15분 동안 원심분리하여 그 상층액을 동결건조하였다.
(2) 하수오 에탄올 추출물 제조
원통여과지 하나에 하수오를 10 g씩 넣어 헥산 150 ㎖로 조지방을 제거한 후 에탄올 150 ㎖로 속실렛을 이용하여 추출한 후 추출액을 증류하여 동결 건조하였다.
(3) 하수오 메탄올 추출물 제조
원통여과지 하나에 하수오를 10 g씩 넣어 헥산 150 ㎖로 조지방을 제거한 후 메탄올 150 ㎖로 속실렛을 이용하여 추출한 후 추출액을 증류하여 동결건조하였다.
(4) 하수오 에틸아세테이트 추출물 제조
하수오 건조 분말 36 ｇ을 헥산 540 ㎖로 70 ℃ 이하에서 속실렛을 이용하여 추출하고, 추출 후 탈지된 시료를 메탄올 540 ㎖로 65 ℃ 이하에서 속실렛 추출을 거쳐 메탄올 추출액을 진공 증류한 다음, 진공 증류된 시료를 에틸아세테이트 108 ㎖과 물 72 ㎖로 실온에서 분별깔대기를 이용하여 추출하였다.
(5) 하수오 부탄올 추출물 제조
하수오 건조 분말 36ｇ을 헥산 540 ㎖로 70 ℃ 이하에서 속실렛을 이용하여 추출하고, 추출 후 탈지된 시료를 메탄올 540 ㎖로 65 ℃ 이하에서 속실렛 추출을 거쳐 메탄올 추출액을 진공 증류한 다음, 진공 증류된 시료를 부탄올 108 ㎖과 물 72 ㎖로 실온에서 분별깔대기를 이용하여 추출하고 그중 부탄올층에서 조 추출물 3.47 ｇ을 수득하였다.
(6) 하수오 부탄올/물 추출물 제조
하수오 건조 분말 36 ｇ을 헥산 540 ㎖로 70 ℃ 이하에서 속실렛을 이용하여 추출하고, 추출 후 탈지된 시료를 메탄올 540 ㎖로 65 ℃ 이하에서 속실렛 추출을 거쳐 메탄올 추출액을 진공 증류한 다음, 진공 증류된 시료를 부탄올 108 ㎖과 물 72 ㎖로 실온에서 분별깔대기를 이용하여 추출하고 그중 물층에서 조 추출물 6.94 ｇ을 수득하였다.
(7) 하수오 클로로포름 추출물 제조
하수오 건조 분말 24 ｇ을 헥산 360 ㎖로 70 ℃ 이하에서 속실렛을 이용하여 추출하고, 추출후 탈지된 시료를 메탄올 360 ㎖로 65 ℃ 이하에서 속실렛 추출을 거쳐 메탄올 추출액을 진공 증류한 다음, 진공 증류된 시료를 클로로포름 96 ㎖과 물 24 ㎖로 실온에서 분별깔대기를 이용하여 추출하고 그중 클로로포름층에서 조 추출물 338 ㎎을 수득하였다.
(8) 하수오 클로로포름/물 추출물 제조
하수오 건조 분말 24 ｇ을 헥산 360 ㎖로 70 ℃ 이하에서 속실렛을 이용하여 추출하고, 추출 후 탈지된 시료를 메탄올 360 ㎖로 65 ℃ 이하에서 속실렛 추출을거쳐 메탄올 추출액을 진공 증류한 다음, 진공 증류된 시료를 클로로포름 96 ㎖과 물 24 ㎖로 실온에서 분별깔대기를 이용하여 추출하고 그중 물층에서 조 추출물 7.06 ｇ을 수득하였다.
[비교예]
항산화 효과를 갖는 것으로 알려진 아스코베이트(ascorbate)를 비교예로 하였다.
[실험예 1]
실험 1. 전자 공여능 측정
전자 공여능 측정은 하수오에서 추출된 시료의 항산화 효과를 검증하기 위하여 브리오스(Blios)의 방법을 토대로 DPPH(1,1-디페닐-2-피크릴히드라진)에 대한 전자공여능(EDA: Electron donating ability)을 측정하여 그 환원력을 계산하였다.
DPPH 20 mg을 에탄올 150 ml에 녹여 DPPH 용액을 준비하고, 상기 실시예 1에서 제조한 물 추출물제조, 에탄올 추출물, 메탄올 추출물, 에틸아세테이트 추출물, 부탄올 추출물, 부탄올/물 추출물, 클로로포름 추출물 및 클로로포름/물 추출물을 각각 0.1, 0.5, 1.0 mg/ml의 농도로 시료용액으로 제조하여 시료 용액 0.5 ml에 DPPH 용액 0.5 ml를 혼합한 다음 5초 동안 진탕시키고 실온에서 30분 동안 반응시켰다.
또한 상기 비교예의 아스코베이트도 .1, 0.5, 1.0 mg/ml의 농도로 제조하고, DPPH 20 mg을 에탄올 150 ml에 녹여 DPPH 용액을 제조하였다. 상기 아스코베이트 용액 0.5 ml에 DPPH 용액 0.5 ml를 혼합하여 5초 동안 진탕시키고 실온에서 30분동안 반응시켰다.
상기에 준비한 시료는 517 nm에서 흡광도 변화를 측정하여 대조군(시료를 첨가하지 않은 DPPH 용액) 대한 흡광도 차이로 전자공여능(EDA%)을 환산하였고 계산식은 식 1과 같다.
[식 1]
EDA(%) = (1-시료의 흡광도/ 대조군의 흡광도) x 100
하기 표 1에 각 시료의 전자공여능을 나타내었고, ED50일 때 시료의 농도를 하기 표 2에 나타내었다. ED50은 전자공여능이 50 %일 때를 의미하며, 이는 일정 범위의 시료 농도를 이용해 회귀곡선을 그린 후 구하였다.
[표 1]
| 농도(mg/ml) | 1.0 | 0.5 | 0.1 | |
| 전자공여능(EDA(%)) | 비교예 | 94.36±0.07 | 94.27±0.09 | 94.17±0.15 |
| 물 추출물 | 12.95±1.62 | 6.40±1.52 | 1.15±1.07 | |
| 에탄올 추출물 | 73.13±2.43 | 58.79±4.61 | 31.84±0.69 | |
| 메탄올추출물 | 58.31±1.67 | 37.34±3.66 | 24.23±1.02 | |
| 에틸아세테이트 추출물 | 90.13±3.08 | 74.86±3.55 | 45.82±3.44 | |
| 부탄올 추출물 | 68.07±1.55 | 44.88±3.39 | 11.51±2.80 | |
| 부탄올/물 추출물 | 12.70±1.67 | 7.96±1.98 | 4.02±1.79 | |
| 클로로포름 추출물 | 98.39±1.09 | 83.29±1.23 | 66.81±2.16 | |
| 클로로포름/물 추출물 | 29.85±2.66 | 19.17±2.44 | 7.33±1.37 |
[표 2]
| 시료 | ED50(㎍/㎖) |
| 비교예 | 24 |
| 물 추출물 | 3586 |
| 에탄올 추출물 | 82 |
| 메탄올추출물 | 336 |
| 에틸아세테이트 추출물 | 56 |
| 부탄올 추출물 | 680 |
| 부탄올/물 추출물 | 4169 |
| 클로로포름 추출물 | 28 |
| 클로로포름/물 추출물 | 1653 |
실험 2. 과산화 지질 형성 억제능
과산화 지질 형성 억제 효과는 하수오에서 추출된 시료의 과산화 지질 형성에 대한 방어능력을 검증하기 위하여 리놀레익산을 기질로 사용하여 티오바비튤릭산 반응성 물질(thiobarbituric acid reactive substance)의 생성 저해효과를 측정하였다.
소디움 라우릴 설페이트 용액(0.8 w/v% )에 리놀레익산을 0.1 %(w/v)가 되게 분산시켜 기질용액을 준비하였다. 상기 기질용액 0.8 ml에 50 mM 트리스 버퍼 1.0 ml, 0.1 mM EDTA 0.1 ml을 혼합하고 상기 실시예 1의 추출물(물 추출물제조, 에탄올 추출물, 메탄올 추출물, 에틸아세테이트 추출물, 부탄올 추출물, 부탄올/물 추출물, 클로로포름 추출물 및 클로로포름/물 추출물)과 비교예 1을 각각 0.1, 0.5, 1.0 mg/ml로 농도별로 제조하여 0.1 ml 씩 상기 혼합물에 더욱 혼합하고 진탕시켰다. 과산화지질 형성 유도는 40 W의 자외선 램프를 30 cm 거리에서 90 분 동안 조사하여 일으켰다. 과산화 지질 형성 유도가 끝나면 여기에 0.44 M의 트리클로로아세테이드 0.5 ml와 0.8 %(w/v) 2-티오바비튤릭산 0.5 ml를 혼합하여 100 ℃에서 15분간 발색시키고, 바로 냉각하여 525 nm에서 흡광도를 측정하였다. 상기 측정된 흡광도는 하기 식 2로 저해속도(%)를 환산하였다.
[식 2]
저해속도(%) = (1-시료의 흡광도/대조군의 흡광도) x 100
하기 표 3은 과산화지질 형성 저해속도를 나타낸 것이고, 하기 표 4는 과산화지질 형성저해속도가 50 %일 때(ED50)의 각 시료의 농도 즉, 과산화 지질 형성 억제능을 나타낸 것이다.
[표 3]
| 농도(mg/ml) | 1.0 | 0.5 | 0.1 | |
| 저해속도(%) | 비교예 | 62.77±0.87 | 62.06±0.60 | 54.89±3.42 |
| 물 추출물 | 12.86±5.27 | 9.21±2.24 | 3.04±1.63 | |
| 에탄올 추출물 | 59.49±3.96 | 44.95±2.91 | 27.84±2.23 | |
| 메탄올추출물 | 45.23±2.81 | 31.81±3.71 | 17.97±2.24 | |
| 에틸아세테이트 추출물 | 58.72±0.72 | 57.02±4.39 | 35.57±1.52 | |
| 부탄올 추출물 | 59.70±0.89 | 53.83±2.12 | 23.40±3.76 | |
| 부탄올/물 추출물 | 12.68±1.7 | 9.56±1.34 | 9.83±2.31 | |
| 클로로포름 추출물 | 64.65±0.60 | 59.85±0.96 | 41.03±1.08 | |
| 클로로포름/물 추출물 | 19.75±3.47 | 15.30±1.45 | 7.07±3.55 |
[표 4]
| 농도(mg/ml) | ED50(㎍/㎖) |
| 비교예 | 316 |
| 물 추출물 | 3689 |
| 에탄올 추출물 | 562 |
| 메탄올추출물 | 1053 |
| 에틸아세테이트 추출물 | 446 |
| 부탄올 추출물 | 686 |
| 부탄올/물 추출물 | 5036 |
| 클로로포름 추출물 | 304 |
| 클로로포름/물 추출물 | 2573 |
실험 3. 동물독성시험
하수오의 랫에 대한 경구투여에 의한 독성시험의 정보를 얻기 위해서, 식품의약품 안전청 고시 제1998-116호(1998년 12월 8일)의 의약품 등의 독성시험기준에 준하여 한국화학연구소 안전성연구센터에서, 1999년 4월 13일부터 6월 4일까지 시험번호: G99056으로 실시하였다.
시험물질의 하수오의 단회투여에 의한 독성을 조사하기 위하여 SD 계통의 랫에 암수 각각 0, 2000 및 5000 mg/kg의 용량으로 암수 각각 5마리씩 단회(2000 mg/kg 투여군) 및 2회 분할(0 및 5000 mg/kg 투여군)로 경구 투여하고 14일간 사망률, 일반증상, 체중변화 및 부검 소견을 관찰하였다.
이와 같이 시험한 결과는 다음과 같다.
(1) 시험기간 중 사망동물은 암수 모든 투여군에서 관찰되지 않았다.
(2) 일반증상에 있어서 암수 모든 투여군에서 어떠한 독성증상도 관찰되지 않았다.
(3) 체중변화에서도 암수 모든 투여군에서 이상은 관찰되지 않았다.
(4) 부검소견에서도 암수 모든 투여군에서 시험물질 투여에 기인하는 어떠한 소견도 관찰되지 않았다.
이상의 결과에서 암수 랫에 대한 하수오의 단회 경구투여는 암수 모두에서 경구 투여가능한 최대용량과 한계용량에 근거한 모든 투여군에서 어떠한 이상증상도 관찰되지 않았다. 따라서 본 시험물질의 급성 경구 투여에 의한 LD50값은 암수 모두 5000 mg/kg을 상회할 것으로 사료되었다.
[실시예 2]
하수오 건조 분말 100ｇ을 석실렛을 이용하여 헥산추출로 조지방을 제거하고 에틸아세테이트로 추출하여, 에틸아세테이트 추출액을 감압농축하고 동결건조하여 1.6 g의 추출물을 수득하였다.
[실험예 2]
상기 실시예 2의 에틸아세테이트 추출액에 대한 전자공여능, 항산화능등을 확인하였다. 하기 실험의 모든 결과는 평균과 표준편차(Mean±Standard deviation)를 구하였고, ANOVA test 후 Duncan`s mutiple range test에 의하여 각 실험군 간의 유의차를 검증하였다.
(1) DPPH 라디칼에 의한 전자공여능
전자공여능 측정은 하수오 추출물의 항산화 효과를 검증하기 위하여 Blios의(1958)의 방법을 토대로 DPPH에 대한 전자공여능(EDA : Electron donating ability)을 측정하여 그 환원력을 계산하였다. 실험방법은 실험예 1과 동일하다.
[표 5]
| EDA(%) | ||
| 농도(mg/ml) | 실시예 2의 에틸아세테이트 | 아스코베이트 |
| 1.0 | 86.79 ±1.51ay | 94.16±0.92ax |
| 0.5 | 56.75 ±4.47by | 94.17±0.82ax |
| 0.1 | 23.91 ±3.32cy | 93.93±1.10ax |
상기 표 5는 실시예 2의 에틸아세테이트 추출물에 대한 전자공여능 결과로, 하수오 추출물은 농도가 증가함에 따라 전자공여 효과가 증가함을 볼 수 있었다. 0.5 mg/ml의 농도에서부터 50 % 이상의 효과가 나타났으며 1.0 mg/ml의 농도에서는 86.79 ±1.51 %로 전자공여능을, 1.0 ㎎/㎖의 농도에서는 90 %에 가까운 전자공여능을 나타내었다.
(2) 지질과산화 억제능
실시예 2의 에틸아세테이트 추출물에 대한 지질 과산화물 억제능을 실험예 1과 동일하게 실시하였다.
하기 표 6에 나타난 바와 같이, 지질 과산화물 억제능 실험에서 하수오 에틸아세테이트 추출물은 농도의존적으로 지질 과산화물 억제능이 증가하였다. 또한 0.1 mg/ml의 농도에서는 아스코베이트와 많은 차이를 볼 수 있으나 1.0 mg/ml의 농도에서는 아스코베이트와 비슷한 수준의 효과를 나타내었다.
[표 6]
| 지질 과산화물 억제능(%) | ||
| 농도(mg/ml) | 실시예 2의 에틸아세테이트 | 아스코베이트 |
| 1.0 | 55.17±2.74ay | 64.23±5.08ax |
| 0.5 | 43.79±4.45by | 62.62±1.49ax |
| 0.1 | 16.38±3.21cy | 55.66±4.23bx |
(3) 실험동물의 처리와 식이조성
실험동물은 4주령의 수컷 Sprague-dawley 랫을 대상으로 10일간의 일반사료로 적응기간을 거쳐 6주간 실험식이를 실시하였다. 각 실험군의 동물 수는 10마리로 하며 체중에 따라 무작위로 4그룹으로 나누었다.
(1) 1 그룹 : 일반식이군(control)
(2) 2 그룹 : 일반식이에 하수오 추출물 경구투여군(control + extract)
(3) 3 그룹 : 고지방 식이군(high fat)
(4) 4 그룹 : 고지방식이에 하수오 추출물 경구투여군(high fat + extract)
일반식이군(control)은 AIN76 식이요법(diet)를 기초로 하며, 고지방 식이군은 20 %의 고지방식이로 생체내 지질과산화를 유도하였고, 식이조성물은 하기 표 7과 같다. 1 그룹과 2 그룹은 일반식이를 공급하였으며, 3그룹과 4그룹은 고지방 식이를 공급하였다.
하수오 추출물은 실험동물의 체중 100 g 당 추출물10 mg으로 생리식염수1.5 ㎖에 현탁시켜 2 그룹과 4 그룹에 경구투여 하였고, 1 그룹과 3 그룹은 생리식염수만을 1.5 ㎖로 경구투여 하였다.
[표 7]
| 성분 | 일반식이(%) | 고지방식이(%) |
| 카세인(Casein) | 20.0 | 24.0 |
| 옥수수 전분(Corn starch) | 15.0 | 10.0 |
| 자당(Sucrose) | 50.0 | 34.0 |
| 옥수수 오일(Corn oil) | 5.0 | 20.0 |
| 섬유소(Cellulose) | 5.0 | 6.0 |
| 메티오닌(DL-methionine) | 0.3 | 0.36 |
| 무기물(Mineral mix) | 3.5 | 4.2 |
| 비타민(Vitamin mix) | 1.0 | 1.2 |
| 콜린 염화물(Cholin chloride) | 0.2 | 0.24 |
| 합 | 100.0 | 100.0 |
각 군 간의 일일 평균 식이섭취량은 하기 표 8과 같이 각 그룹간의 일일 평균 식이섭취량의 통계적 유의차는 없었다.(p<0.05)
[표 8]
| 그룹 | g/day |
| 1 그룹 | 18.50 ±1.89a |
| 2 그룹 | 18.63 ±3.57a |
| 3 그룹 | 19.11 ±2.38a |
| 4 그룹 | 17.72 ±3.17a |
상기의 식이요법을 실시한 총 4그룹들의 랫의 체중증가량을 측정하였다. 그 결과는 하기 표 9에 나타내었다.
[표 9]
| 그룹 | 체중증가량 (g) |
| 1 그룹 | 181.30±16.34ab |
| 2 그룹 | 160.27±21.2b |
| 3 그룹 | 205.24±24.73a |
| 4 그룹 | 185.27±33.61ab |
일반식이군(control)군에 비해 고지방 식이군의 체중 증가량이 더 컸으며, 2 그룹(일반식이+하수오 추출물 경구투여군)은 1 그룹(일반식이군)에 비해 체중증가량이 적었으며, 4 그룹(고지방 식이군+하수오 추출물 경구투여군) 역시 3 그룹(고지방 식이군)에 비해 체중증가량은 적었으나 통계적인 유의차는 없었다.(p<0.05)
(4) 지질 과산화물(malondialdehyde) 수준 측정
실험식이 최종 급여 후 12시간 이상 절식시킨 다음 마취시켜 해부하였다. 혈액을 채취하여 헤파린이 처리된 시험관에 넣어 3000 rpm에서 15분동안 원심분리하여 혈장과 혈구를 분리하고, 간 조직은 적출한 뒤 0.9 % 생리식염수로 세척하여 혈액을 제거한 다음 각각 -80 ℃에 보관하였다.
간
간 조직 중의 지질 과산화물은 Uchiyama와 Mihara(1978)의 방법에 따라 측정하였다. 혈액을 제거한 간 절편을 인산완충용액(pH7.4)와 함께 표모게나이저로 충분히 마쇄하여 10 % 호모게나이트(homogenate)를 만들었다. 이중 500 ㎕를 취하여 튜브에 넣고 1 % 포스포릭산 3 ㎖과 0.6 % TBA 용액 1 ㎖을 첨가한 다음 혼합하고 100 ℃에서 45분 동안 진탕하여 반응시켜 바로 냉각시켰다. 냉각한 튜브에 n-부탄올 4 ㎖을 가하여 잘 섞고, 1500 ×g에서 10분간 원심분리한 뒤 상층액을 취하여 532 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로 TEP(1,1,3,3-tetrae thoxypropane)를 사용하고, 지질 과산화물 수준은 nmol MDA/㎎ protein으로 나타내었고, 그 결과는 표 10에 도시하였다.
[표 10]
| 그룹 | nmol/mg |
| 1 그룹 | 76.10±15.02b |
| 2 그룹 | 76.93± 6.41b |
| 3 그룹 | 136.53±14.13a |
| 4 그룹 | 86.92±6.55b |
간의 지질 과산화물 함량은 산화스트레스 인자로 고지방 식이를 공급한 3 그룹(고지방 식이군)이 1 그룹(일반식이군)에 비해 유의적으로 증가하였다. 4 그룹(고지방 식이+하수오 추출물을 경구투여)의 지질 과산화물 양은 3 그룹보다 유의적으로 감소(36 % 감소)하여 1 그룹의 지질 과산화물 수준과 비슷하게 나타났다. 그러나 2 그룹(일반식이군+하수오 추출물 경구투여군)은 1 그룹과 차이를 보이지 않았다.
혈장
혈장 중의 지질 과산화물은 Yagi법(1976)에 따라 혈장 100 ㎕을 튜브에 넣고 1/12 N H2SO44 ㎖과 10 % 포스포텅스틱 산 0.5 ㎖을 혼합하여 잘 섞고, 실온에서 5분간 방치한 후 3000 rpm에서 10분간 원심분리시켜 침전물을 수득하였다. 여기에 다시 1/12 N H2SO42 ㎖과 10 % 포스포텅스틱 산 0.3 ㎖을 가하여 혼합하고, 실온에서 5분간 방치한 후 3000 rpm에서 10분간 원심분리하였다. 침전물에 증류수 2 ㎖과 0.67 % TBA용액 1 ㎖을 가하여 현탁시킨 후 95 ℃에서 1시간동안 진탕하여 바로 냉각시켰다. 냉각한 튜브에 n-부탄올 2 ㎖을 가하여 1분간 혼합하고 3000 rpm에서 15분간 원심분리 한 뒤 그 상층액을 형광검출기로 Ex 515 nm, Em 553 nm에서 측정하였다. 표준물질로는 TEP(1,1,3,3-tetraethoxypropane)를 사용하고, 지질 퍼록사이드 수준은 nmol MDA/㎖ 혈장으로 나타내었다.(표 11)
[표 11]
| 그룹 | 지질 퍼록사이드 nmol/㎖ |
| 1 그룹 | 73.61 ±7.06b |
| 2 그룹 | 74.76 ±3.30b |
| 3 그룹 | 108.88 ±5.53a |
| 4 그룹 | 76.49 ±4.76b |
혈장의 지질 과산화물은 산화 스트레스 인자로 고지방 식이를 공급한 3 그룹(고지방식이군)에서 1 그룹(일반식이군)보다 유의적으로 증가하였으며, 4 그룹(고지방 식이+하수오 추출물 경구투여군)의 지질 과산화물양은 2 그룹(고지방 식이군)보다 30 % 감소하여 1 그룹(일반식이)과 비슷한 수준을 나타냈다. 그러나 2 그룹(일반식이군+하수오 추출물 경구투여군)은 1 그룹에 비해 유의적인 차이가 없었다.
(5) SOD 활성 측정
SOD 활성 측정은 Flohe의 방법(1988)에 따라 크산틴 산화시스템(xanthine-xanthine oxidase system)에서 사이토크롬 c의 환원정도에 의해 측정하였다. 50 mM 인산완충용액에 5 ㎛ol의 크산틴을 함유한 사이토크롬 c 용액을 준비하였다. 샘플 50 ㎕에 사이토크롬 c 용액 2 ㎖과 0.2 U의 크산틴 산화효소 50 ㎕를 혼합하여 550 ㎚에서 1분 동안의 흡광도 변화를 측정하였다. SOD의 활성은 사이토크롬 c의 환원을 50 % 저해할 때 1 unit으로 하였다.
간
간의 SOD 활성측정결과는 하기 표 12에 나타내었다.
[표 12]
| 그룹 | unit/mg |
| 1 그룹 | 1.26±0.23a |
| 2 그룹 | 1.29±0.21a |
| 3 그룹 | 0.85±0.16b |
| 4 그룹 | 1.28±0.17a |
3 그룹(고지방 식이)의 SOD활성은 1 그룹(일반식이군) 보다 감소하였으며, 4 그룹(고지방 식이군+하수오 추출물 경구투여)은 3 그룹(고지방식이)에 비해 SOD 활성이 50 % 증가하였다. 그러나 2 그룹(일반식이+하수오 추출물 경구투여)은 1 그룹과의 SOD 활성에 있어서 차이를 보이지 않았다
혈장
하기 표 13은 혈장에서의 SOD 활성을 나타낸 것으로, 3 그룹(고지방 식이군)의 SOD활성이 1 그룹(일반식이군)보다 감소하였으며, 4 그룹(고지방 식이+하수오 추출물 경구투여)의 SOD 활성은 3 그룹에 비해 9 % 증가하였다. 2 그룹(일반식이군+하수오 추출물 경구투여)의 SOD 활성은 1 그룹에 비해 약간 증가하였으나 유의적인 차이는 없었다.
[표 13]
| 그룹 | unit/㎖ |
| 1 그룹 | 40.24±3.01ab |
| 2 그룹 | 42.47±2.32a |
| 3 그룹 | 38.16±2.34b |
| 4 그룹 | 41.78±2.33a |
[실시예 3] 하수오를 이용한 환 제조공정
하수오를 수분함량이 5 % 이하가 될 때까지 건조시키는데 일반 열풍건조기를 사용하는 경우에 80 ℃의 온도에서 10-12시간 동안 건조시켰다. 건조된 하수오를 분쇄기를 이용하여 1차 조분쇄 한 다음 200 메쉬 이하의 체로 2차 비세분쇄 하였다. 분쇄된 하수오분말 45-55 %, 국산산약(마) 10-15 %, 구기자 5-10 %, 영지 5-10 %, 건강 1-5 %, 감초 5-10 %, 기타 1-25 %를 첨가하여 혼합하였다. 상기공정에서 수득한 혼합물에 환제조시의 용이성과 유효성분의 추출을 돕기 위해 발효주정을 일정비율로 가한다음 롤반죽기를 이용하여 여러 차례 반죽하였다. 이 반죽물을 유압식 성형기에서 지름이 5 mm가 되도록 성형하는데 이때 반죽물의 가공성을 위해 하수오 분말을 약간 뿌려준다. 그 후 절환기에서 6 mm의 지름이 되는 환 형태로 절환하였다. 상기의 공정은 실내온도가 18-22 ℃가 되도록 유지하는 것이 바람직하다.
상기공정에서 수득한 하수오 환은 수분을 그대로 유지하고 있어 이것을 장환기에서 약 20분간 굴려 제품의 모양이 완성되고 조직이 단단해지도록 하였다. 그런 다음 제품의 수분함량이 5 % 이하가 되도록 일반 열풍건조기를 이용하여 50 ℃에서 8시간 건조하였다.
본 발명에서 제조된 하수오 환에 대한 관능 검사를 실시하여 하기 표 14에 나타내었다. 관능검사는 전문관능 시험요원 20명을 대상으로 5점 만점으로 실시하였다.
[표 14]
| 환의 모양 | 색 상 | 향 | 가공특성 | 붕해성 | 종합적인 평가 |
| 4.8 | 4.0 | 3.9 | 4.3 | 4.6 | 4.5 |
[실시예 4] 하수오를 이용한 정제 제품 제조공정
하수오를 수분함량이 5 % 이하가 될 때까지 건조시킨 후 분쇄기를 이용하여 1차 조분쇄한 다음 200 메쉬이하의 체로 2차 미분쇄하였다. 상기공정에서 수득한 하수오분말 25-35 %, 마분말 30-40 %, 포도당 5-15 %, 솔비톨 1-5 %, 비타민 C 1-2 %, 구연산 1-5 %, 기타(향신료 등) 5-25 %를 첨가하여 잘 혼합한 후 정제기에 넣어 정제하였다.
[실시예 5] 하수오를 이용한 캔디제품 제조공정
하수오를 물과의 혼합비율이 1:5가 되도록 하여 5-10시간 동안 추출한 후 60 ℃에서 진공농축하였다. 설탕과 물엿의 비율이 1:1이 되도록 하고 여기에 설탕량의 30 % 정도의 물을 혼합하여 110 ℃까지 끓인 후 145 ℃에서 약 5초 동안 스팀을 통과하도록 한 후 하수오 농축액과 혼합반죽하여 성형하였다. 이때 반죽시의 온도는 90 ℃가 적합하다.
[실시예 6] 하수오를 이용한 젤리제품 제조공정
하수오를 물과의 혼합비율이 1:5가 되도록 하여 100 ℃에서 5-10시간 동안 추출하였다. 한천에 물을 넣고 100 ℃에서 가열한 후 설탕과 물엿의 비율이 6:4 정도로 하여 첨가한 후 78브릭스가 되도록 끓인 다음 하수오추출물, 향, 색소 등을 첨가하여 80-90 ℃에서 몰딩을 한 후 굳혀서 떼어내어 텀블링하여 슈가샌딩을 하고 50-60 ℃에서 건조하여 제조하였다.
[실시예 7] 하수오를 이용한 과립제조
하수오를 수분함량이 5 % 이하가 될 때까지 건조시킨 후 분쇄기를 이용하여 1차 조분쇄하고, 200 메쉬 이하의 체로 2차 미세분쇄 하였다. 분쇄된 하수오 분말에 포도당, 하수오추출물을 넣고 반죽한 후 과립화하여 세미기에 체로 친 후 유동층 건조기에서 건조하여 과립화하였다.
[실시예 8] 하수오를 이용한 선식류 제품 제조
하수오를 수분함량이 5 % 이하가 될 때까지 건조시킨 후 분쇄기를 이용하여 1차 조분쇄하고, 200 메쉬 이하의 체로 2차 미세분쇄 하였다. 분쇄된 하수오 분말15-25 , 쌀보리 5-15 %, 통밀 5-10 %, 검은콩 10-20 %, 메밀가루 1-10 %, 검은깨 0.1-1 %, 소금 0.2-1 %, 땅콩가루 10-20 %, 설탕 20-30 %, 다시마 1-5 %를 혼합하여 제조하였다. 상기 기재된 원료는 볶아서 가루를 내었다.
[실시예 9] 하수오를 이용한 죽류 제품 제조
하수오를 물과의 혼합비율이 1:5가 되도록 하여 100 ℃에서 5-10시간 동안 추출한 후 여과하여 대추, 쌀을 넣어 죽제품을 제조하였다.
[실시예 10] 하수오를 이용한 음료 제품 제조
하수오를 물과 함께 1:5의 혼합 비율로 100 ℃에서 5-10시간 동안 추출한 후 하수오추출물에 농축사과과즙, 백설탕, 천연유자과즙, 과일향, 정제수등을 3000 rpm에서 20분 이상 혼합 한 후 95 ℃, 30초 이상 가열처리하여 살균하고 충진, 밀봉하여 냉각하였다. 상기공정에서 충진, 밀봉시 온도는 90 ℃ 이상으로 하고 냉각공정에서는 45 ℃ ±5 ℃로 한다.
[실시예 11] 하수오를 이용한 제과, 제빵류 제조
하수오를 수분함량이 5 % 이하가 될 때까지 건조시킨 후 분쇄기를 이용하여 1차 조분쇄하고, 200 메쉬 이하의 체로 2차 미세분쇄 한다. 분쇄된 하수오 분말 10-30 %, 강력분 45-60 %, 설탕 5-10 %, 분유 0.1-1 %, 소금 0.5-1.5 %, 이스트 1-5 %, 계란 10-15 %, 물 15-25 %를 혼합하여 반죽하고 180 ℃에서 20-25분간 구워내었다.
분쇄된 하수오 분말 1-10 , 박력분 40-50 %, 버터 25-35 %, 설탕 15-25 %, 소금 0.1-0.3 %를 혼합하여 반죽하여 160 ℃에서 20-30분간 구워내었다.
본 발명은 하수오에서 항산화 활성을 가지는 추출물을 분리하였으며, 하수오 추출물은 상기의 실험예 및 비교예에서 알 수 있는 바와 같이 항산화제로 잘 알려진 아스코베이트와 유사한 정도의 항산화 효과를 가지고, 또한 농도가 높아짐에 따라 그 활성이 증가한다. 본 발명의 하수오 추출물은 종래의 생약추출물의 항산화 활성에 비하여 효과가 우수하고, 냄새 등의 문제가 없으며, 첨가 농도가 증가함에 따라 항산화 효과가 비례적으로 상승하여 나타나므로, 저렴하고 간단하게 항산화 성분을 하수오에서 대량으로 분리하여 이를 건강식품 등에 광범위하게 사용할 수 있는 효과가 있다.
Claims (7)
- a) 하수오를 메탄올, 에탄올 및 물로 구성된 군으로부터 선택된 1종의 용매로 추출하는 단계와b) 상기 추출된 용액을 농축 및/또는 건조하는 단계를 포함하는 하수오에서 항산화 성분을 추출하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 a) 단계 후에, 상기 추출된 용액을 농축하는 단계와 상기 농축된 용액을 에틸아세테이트, 부탄올, 부탄올 및 물의 혼합액, 클로로포름, 및 클로로포름 및 물의 혼합액으로 구성된 용매 중에서 선택된 1종 이상의 용매를 이용하여 추출하는 단계를 더욱 포함하는 하수오에서 항산화 성분을 추출하는 방법.
- 제 1 또는 제 2항에 있어서, 상기의 부탄올 및 물의 혼합비는 부탄올 : 물이 부피비로 50 : 50에서 80: 20인 것을 특징으로 하는 하수오에서 항산화 성분을 추출하는 방법.
- 제 1 또는 제 2항에 있어서, 상기의 클로로포름 및 물의 혼합비는 클로로포름 : 물이 부피비로 60 : 40에서 90 : 10인 것을 특징으로 하는 하수오에서 항산화 성분을 추출하는 방법.
- 제1항 또는 제2항의 추출방법에 의한 항산화 효과를 갖는 하수오에서 추출된 항산화 추출물.
- 제 5항의 하수오에서 추출된 항산화 추출물 또는 하수오 분말을 포함하는 건강식품.
- 제 6항에 있어서, 상기의 식품은 환, 정제, 캔디, 젤리, 선식, 과립, 죽, 음료, 과자 및 빵으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 건강식품.
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