CN102408431A - 青蒿素b的制备方法及其新用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开青蒿素B的制备方法及其新用途。青蒿素B的提取分离方法为：青蒿叶干燥，粉碎，用有机溶剂渗漉/浸泡提取，60℃以下减压回收溶剂后，与柱层析硅胶混合，晾干，进行硅胶柱层析分离，用石油醚-乙酸乙酯或石油醚-丙酮混合溶剂梯度洗脱，以薄层层析法检测洗脱液成分，收集含青蒿素B的流份，回收溶剂至小体积，放置析出粗结晶，再经有机溶剂如丙酮、乙醇等反复重结晶纯化，即得到青蒿素B。本发明青蒿素B(artemisinin B)用于制备免疫抑制的药物，具有显著的免疫抑制活性，可在制备预防和治疗自身免疫性疾病、炎症性疾病的药物和临床上应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种青蒿素B(artemisinin B)的制备方法及其新用途，特别涉及一种青蒿素B(artemisinin B)在制备预防和治疗自身免疫性疾病、炎症性疾病的药物中的应用。
背景技术
近年来，随着社会工业化程度的逐步提高，自身免疫性疾病、超敏反应性疾病等由免疫反应过度而引起的疾病也在不断增加，寻找高效低毒的免疫抑制剂已成为当前一个世界性的研究热点。有证据表明，中药免疫抑制剂具有高效低毒的特殊疗效，但由于制剂质量难以控制、作用机制难以明确，限制了其在临床中的广泛应用。采用现代提取分离技术，从中药中获得具有免疫抑制活性的单体化合物，将克服这些不足，并有望创制免疫抑制新药。
青蒿为菊科植物黄花蒿Artemisia annua L的干燥地上部分，主要含有青蒿素、青蒿甲素、青蒿乙素、青蒿丙素、青蒿酸、青蒿内酯、黄酮、香豆素和挥发油等成分，具有清热解暑、除蒸、截疟等功效。其中，化学单体青蒿素(artemisinin，Art)由我国药学家首先于20世纪70年代提取分离得到，分子式C15H22O5，是我国第一个被WHO认可按化药研究标准开发的高效抗疟药。通过近十年的实验及临床研究证实，青蒿中多种有效成分具有免疫抑制活性，对类风湿性关节炎、红斑狼疮等自身免疫性疾病都显示出不同程度的治疗或保护作用，具有抗炎和较为复杂的免疫抑制作用，但青蒿素B未见相关报道。青蒿乙素(Arteannuin B；CAS No 50906-56-4)为从中药青蒿(Artemisia annua L.)中提取分离得到的倍半萜内酯类化合物，被认为是抗疟活性成分青蒿素的生物合成前体，其化学结构和绝对构型经光谱[D.JeremiC，A.JokiC，A.Behbud，and M.Stefanovic.Tetrahedron lett.，3039(1973).]和X光衍射[D.G.Leppard，M.Rey，and A.S.Dreiding，Helw.Chim.Acta.，57，
602(1974)]方法确定。近代药理学研究表明，其不具有抗疟活性，但具有一定程度的抗细菌、抗真菌、解热活性。
发明内容
本发明目的在于提供一种青蒿素B的制备方法，本发明另一目的在于提供在制备预防和治疗自身免疫性疾病、炎症性疾病的药物中的应用。本发明目的是通过如下技术方案实现
本发明青蒿素B的制备方法为：青蒿叶干燥后，粉碎，用有机溶剂渗漉/浸泡提取，60℃以下减压回收溶剂后，与柱层析硅胶混合，晾干，进行硅胶柱层析分离，用石油醚-乙酸乙酯或石油醚-丙酮混合溶剂，梯度洗脱，以薄层层析法检测洗脱液成分，收集含青蒿素B的流份，回收溶剂至小体积，放置析出粗结晶，再经有机溶剂反复重结晶纯化，即得。
本发明青蒿素B的优选制备方法为：青蒿叶1重量份干燥后，粉碎，用4～8体积份有机溶剂浸泡24～76小时，用40～80体积份的有机溶剂渗漉，收集渗漉液，50～60℃以下减压回收溶剂得浸膏，用有机溶剂溶解后，与2～4倍浸膏重量的柱层析硅胶混合，晾干，加入装有25～50倍浸膏重量柱层析硅胶的层析柱顶部进行硅胶柱层析分离，用石油醚-乙酸乙酯＝1∶0至5∶5或石油醚-丙酮＝1∶0至6∶4混合溶剂梯度洗脱，以薄层层析法检测洗脱液成分，收集含青蒿素B的流份，回收溶剂至小体积，放置析出粗结晶，再经有机溶剂反复重结晶纯化，即得。
本发明青蒿素B的优选制备方法为：青蒿叶1重量份干燥后，粉碎，用5体积份量95％乙醇浸泡24小时，用50体积份95％乙醇渗漉，收集渗漉液，50℃以下减压回收溶剂得浸膏，用乙酸乙酯溶解后，与2倍浸膏重量的柱层析硅胶混合，晾干，加入装有30倍浸膏重量柱层析硅胶的层析柱顶部进行硅胶柱层析分离，用石油醚∶乙酸乙酯＝1∶0至5∶5混合溶剂梯度洗脱，以薄层层析法检测洗脱液成分，收集含青蒿素B的流份，回收溶剂至小体积，放置析出粗结晶，再经丙酮反复重结晶纯化，即得。
本发明青蒿素B的优选制备方法为：青蒿叶1重量份干燥后，粉碎，用4体积份乙酸乙酯浸泡50小时，用45体积份的乙酸乙酯渗漉，收集渗漉液，55℃以下减压回收溶剂得浸膏，用乙酸乙酯溶解后，与3倍浸膏重量的柱层析硅胶混合，晾干，加入装有25倍浸膏重量柱层析硅胶的层析柱顶部进行硅胶柱层析分离，用石油醚∶乙酸乙酯＝1∶0至5∶5混合溶剂梯度洗脱，以薄层层析法检测洗脱液成分，收集含青蒿素B的流份，回收溶剂至小体积，放置析出粗结晶，再经乙酸乙酯反复重结晶纯化，即得。
本发明青蒿素B的优选制备方法为：青蒿叶1重量份干燥后，粉碎，用7体积份石油醚浸泡70小时，用75体积份的石油醚渗漉，收集渗漉液，60℃以下减压回收溶剂得浸膏，用乙酸乙酯溶解后，与4倍浸膏重量的柱层析硅胶混合，晾干，加入装有45倍浸膏重量柱层析硅胶的层析柱顶部进行硅胶柱层析分离，用石油醚∶乙酸乙酯＝1∶0至5∶5混合溶剂梯度洗脱，以薄层层析法检测洗脱液成分，收集含青蒿素B的流份，回收溶剂至小体积，放置析出粗结晶，再经乙醇反复重结晶纯化，即得。
本发明青蒿素B的优选制备方法为：青蒿叶1重量份干燥后，粉碎，用8体积份丙酮浸泡48小时，用60体积份丙酮渗漉，收集渗漉液，50℃以下减压回收溶剂得浸膏，用乙酸乙酯溶解后，与2倍浸膏重量的柱层析硅胶混合，晾干，加入装有30倍浸膏重量柱层析硅胶的层析柱顶部进行硅胶柱层析分离，用石油醚∶丙酮＝1∶0至6∶4混合溶剂梯度洗脱，以薄层层析法检测洗脱液成分，收集含青蒿素B的流份，回收溶剂至小体积，放置析出粗结晶，再经乙醇反复重结晶纯化，即得。
本发明青蒿素B的优选制备方法为：青蒿叶1重量份干燥后，粉碎，用5体积份乙醚浸泡50小时，用45体积份的乙醚渗漉，收集渗漉液，55℃以下减压回收溶剂得浸膏，用乙酸乙酯溶解后，与3倍浸膏重量的柱层析硅胶混合，晾干，加入装有25倍浸膏重量柱层析硅胶的层析柱顶部进行硅胶柱层析分离，用石油醚∶丙酮＝1∶0至6∶4混合溶剂梯度洗脱，以薄层层析法检测洗脱液成分，收集含青蒿素B的流份，回收溶剂至小体积，放置析出粗结晶，再经丙酮反复重结晶纯化，即得。
本发明所述的青蒿素B的制备方法中有机溶剂可以是乙醇、丙酮、乙酸乙酯、乙醚、石油醚或汽油中的一种或几种。
所述重量份和体积份的关系为千克和升的关系。
本发明所述的青蒿素B的制备方法中，所得青蒿素B的理化性质和波谱数据为：无色方形结晶，熔点151-153℃，[α]-73.5℃(C＝1.01，MeOH)，EI-MSm/e 248(M+)，分子式为C15H20O3(元素分析：计算值％C72.6，H8.06；实测值％C72.09，H8.14)；1H-NMR(CDCl3 300Hz)614(1H，d，J＝3Hz，13-CH＝)，5.42(1H，dJ＝3Hz，13-CH＝)，2.70(1H，s，5-CH)，1.34(3H，，15-CH3)，0.99(3H，d，J＝6Hz，14-CH3)；13C-NMR(CDCl3 75Hz)：43.9(C-1)，16.4(C-2)，24.5(C-3)，58.2(C-4)，58.7(C-5)，81.0(C-6)，52.8(C-7)，21.8(C-8)，34.0(C-9)，30.7(C-10)，138.7(C-11)，169.5(C-12)，117.2(C-13)，18.6(C-14)，22.7(C-15)。
本发明青蒿素B的一种新用途，用于制备免疫抑制的药物，具有显著的免疫抑制活性，可在制备预防和治疗自身免疫性疾病、炎症性疾病的药物和临床上应用。通过实验首次发现，青蒿素B可剂量依赖性地抑制LPS诱导大鼠腹腔细胞NO、PGE2生成，抑制LPS/IFN诱导细胞因子的产生释放。对人外周血单个核细胞也体现出同样的作用。
附图说明：
图1：本发明青蒿素B对大鼠腹腔细胞NO生成的影响
图2：本发明青蒿素B对大鼠腹腔细胞PGE2生成的影响
图3：本发明青蒿素B对大鼠腹腔细胞细胞因子分泌的影响
图4：本发明青蒿素B对人外周血单个核细胞(PBMC)PGE2和细胞因子分泌的影响
下述实验例和实施例用于进一步说明但不限于本发明。
实验例1
1.实验材料
1.1动物：8-10周龄雌性Wistar大鼠。
1.2主要试剂：Ficoll-Paque(Amersham Biosciences)，LPS(E.coli 0111：B4；Sigma；1ng/mL)，ELISA试剂盒(R&D Systems，Minneapolis，MN)。培养基：RPMI-1640培养基(Sigma-Aldrich)，含10％小牛血清，2m ML-谷氨酰胺，50μg/ml庆大霉素和5大霉素-5M 2-巯基乙醇(购自Sigma)，培养基在细胞培养前新鲜配制，细胞37培，5％CO2培养。
1.3受试药为从Artemisia annua L.中提取的系列化合物AA1-AA7，其中AA2为青蒿素B(artemisinin B)。
2.实验方法
2.1大鼠腹腔细胞获取：大鼠5-10只一笼(透明塑料鼠笼)，在标准动物房喂养。灯光：6点-18点；温度：22-24℃。断椎处死后向腹腔中注射16ml生理盐水洗腹腔细胞，以2×106cells/mL每孔100μl接种于Costar 96孔板，37℃，5％CO2孵育。培养基为含10％胎牛血清的RPMI-1640(Sigma-Aldrich，含2mM L-glutamine，50μg/ml gentamicin，5×10-5M 2-mercaptoethanol，allSigma)。
2.2正常人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)获取：从患者前臂静脉抽取血液，Ficoll-Paque(Amersham Biosciences)分离上层淡黄色上层细胞，用10％胎牛血清的RPMI-1640重悬，终浓度为1.5x106cells/ml，每孔100μl。与受试样品孵育24h后检测。
2.3检测指标：
大鼠腹腔细胞用LPS(1ng/mL)刺激后取细胞上清，比色法检测NO含量，ELISA法检测IL-1β、IL-6和TNF-α，LPS(10ng/mL)与IFN-γ(5ng/mL)共同刺激后检测VEGF。
人PBMC用1μg/mL LPS刺激18h后检测PGE2及IL-1β，IL-6和TNF-α。
3.实验结果
3.1对大鼠腹腔细胞NO生成的影响
以大鼠腹腔细胞NO的基础表达为0，LPS 1ng/mL诱导24h后，细胞上清中NO含量明显增高，达70μM。AA2，AA5和AA6可剂量依赖性地抑制NO浓度。其中AA2作用最强，IC50约为7.04μM(95％可信限区间为4.18-11.87μM)(见图1)。(n＝4，数据均以mean±SEM表示，实验重复2次。下同)
3.2对大鼠腹腔细胞PGE2生成的影响
对照组大鼠腹腔细胞仅分泌微量的PGE2，LPS 5μg/mL刺激24h后PGE2含量明显增高。各受试样品均可剂量依赖性地抑制PGE2高表达，其中AA2的作用最强，IC50约为2.70μM(95％可信限区间为1.12-6.48μM)(见图2)。
3.3对大鼠腹腔细胞细胞因子分泌的影响
LPS 1ng/mL诱导24h可诱导细胞上清中IL-1β，IL-6，TNF-α高表达，达70μM。AA2，AA5和AA6可剂量依赖性地抑制细胞因子的浓度。其中AA2作用最为明显，IL-1的IC50约为1.06μM(95％可信限区间为0.61-1.85μM)，IL-6的IC50约为1.53μM(95％可信限区间为0.77-3.04μM)，TNF-的IC50约为4.41μM(95％可信限区间为2.89-6.73μM)，VEGF的IC50约为1.21μM(95％可信限区间为0.69-2.12μM)(见图3)。
3.4对人外周血单个核细胞(PBMC)PGE2和细胞因子分泌的影响
取志愿者血液密度梯度离心法获取PBMC，以LPS 1ng/mL诱导18h后PGE2的生成量作为100％，受试样品的抑制作用以如下公式计算：
抑制率＝[(X-control)-(LPS-control)]/(LPS-control)×100
结果见图4、表1。
表1对人外周血单个核细胞(PBMC)PGE2和细胞因子分泌的影响
4.实验结论
受试样品AA2可抑制大鼠腹腔细胞NO、PGE2的表达及细胞因子表达，具有显著的免疫抑制活性。可开发为治疗自身免疫性疾病、炎症性疾病的新型药物。
下述实施例均能实现上述实验例所述的效果。
实施例1
青蒿叶1kg干燥后，粉碎，加5L95％乙醇浸泡24小时，用50L95％乙醇渗漉，收集渗漉液，50℃以下减压回收溶剂得浸膏，用乙酸乙酯溶解后，与2倍浸膏重量的柱层析硅胶混合，晾干后，将其加入装有30倍浸膏重量柱层析硅胶的层析柱顶部，用石油醚-乙酸乙酯(1∶0→5∶5)梯度洗脱，以薄层层析法检测洗脱液成分，收集含青蒿素B的流份，回收溶剂至小体积，放置析出粗结晶，再经丙酮重结晶纯化，即得到青蒿素B。
实施例2
青蒿叶1kg干燥后，粉碎，用4L乙酸乙酯浸泡50小时，用45L的乙酸乙酯渗漉，收集渗漉液，55℃以下减压回收溶剂得浸膏，用乙酸乙酯溶解后，与3倍浸膏重量的柱层析硅胶混合，晾干，加入装有25倍浸膏重量柱层析硅胶的层析柱顶部进行硅胶柱层析分离，用石油醚-乙酸乙酯(1∶0→5∶5)混合溶剂梯度洗脱，以薄层层析法检测洗脱液成分，收集含青蒿素B的流份，回收溶剂至小体积，放置析出粗结晶，再经乙酸乙酯反复重结晶纯化，即得。
实施例3
青蒿叶1kg干燥后，粉碎，用7L石油醚浸泡70小时，用75L的石油醚渗漉，收集渗漉液，60℃以下减压回收溶剂得浸膏，用乙酸乙酯溶解后，与4倍浸膏重量的柱层析硅胶混合，晾干，加入装有45倍浸膏重量柱层析硅胶的层析柱顶部进行硅胶柱层析分离，用石油醚-乙酸乙酯(1∶0→5∶5)混合溶剂梯度洗脱，以薄层层析法检测洗脱液成分，收集含青蒿素B的流份，回收溶剂至小体积，放置析出粗结晶，再经乙醇反复重结晶纯化，即得。
实施例4
青蒿叶1kg干燥后，粉碎，用8L丙酮浸泡48小时，用60L丙酮渗漉，收集渗漉液，50℃以下减压回收溶剂得浸膏，用乙酸乙酯溶解后，与2倍浸膏重量的柱层析硅胶混合，晾干，加入装有30倍浸膏重量柱层析硅胶的层析柱顶部进行硅胶柱层析分离，用石油醚-丙酮＝(1∶0→6∶4)混合溶剂梯度洗脱，以薄层层析法检测洗脱液成分，收集含青蒿素B的流份，回收溶剂至小体积，放置析出粗结晶，再经乙醇反复重结晶纯化，即得。
实施例5
青蒿叶1kg干燥后，粉碎，用5L乙醚浸泡50小时，用45L的乙醚渗漉，收集渗漉液，55℃以下减压回收溶剂得浸膏，用乙酸乙酯溶解后，与3倍浸膏重量的柱层析硅胶混合，晾干，加入装有25倍浸膏重量柱层析硅胶的层析柱顶部进行硅胶柱层析分离，用石油醚-丙酮＝(1∶0→6∶4)混合溶剂梯度洗脱，以薄层层析法检测洗脱液成分，收集含青蒿素B的流份，回收溶剂至小体积，放置析出粗结晶，再经丙酮反复重结晶纯化，即得。
Claims (11)
1.一种青蒿素B的制备方法，其特征在于该方法为：
青蒿叶干燥后，粉碎，用有机溶剂渗漉/浸泡提取，60℃以下减压回收溶剂后，与柱层析硅胶混合，晾干，进行硅胶柱层析分离，用石油醚-乙酸乙酯或石油醚-丙酮混合溶剂梯度洗脱，以薄层层析法检测洗脱液成分，收集含青蒿素B的流份，回收溶剂至小体积，放置析出粗结晶，再经有机溶剂反复重结晶纯化，即得。
2.如权利要求1所述的青蒿素B的制备方法，其特征在于该方法为：
青蒿叶1重量份干燥后，粉碎，用4～8体积份有机溶剂浸泡24～76小时，用40～80体积份的有机溶剂渗漉，收集渗漉液，50～60℃以下减压回收溶剂得浸膏，用有机溶剂溶解后，与2～4倍浸膏重量的柱层析硅胶混合，晾干，加入装有25～50倍浸膏重量柱层析硅胶的层析柱顶部进行硅胶柱层析分离，用石油醚-乙酸乙酯＝1∶0至5∶5或石油醚-丙酮＝1∶0至6∶4混合溶剂梯度洗脱，以薄层层析法检测洗脱液成分，收集含青蒿素B的流份，回收溶剂至小体积，放置析出粗结晶，再经有机溶剂反复重结晶纯化，即得。
3.如权利要求2所述的青蒿素B的制备方法，其特征在于该方法为：
青蒿叶1重量份干燥后，粉碎，用5体积份95％乙醇浸泡24小时，用50体积份95％乙醇渗漉，收集渗漉液，50℃以下减压回收溶剂得浸膏，用乙酸乙酯溶解后，与2倍浸膏重量的柱层析硅胶混合，晾干，加入装有30倍浸膏重量柱层析硅胶的层析柱顶部进行硅胶柱层析分离，用石油醚∶乙酸乙酯＝1∶0至5∶5混合溶剂梯度洗脱，以薄层层析法检测洗脱液成分，收集含青蒿素B的流份，回收溶剂至小体积，放置析出粗结晶，再经丙酮反复重结晶纯化，即得。
4.如权利要求2所述的青蒿素B的制备方法，其特征在于该方法为：
青蒿叶1重量份干燥后，粉碎，用4体积份乙酸乙酯浸泡50小时，用45体积份的乙酸乙酯渗漉，收集渗漉液，55℃以下减压回收溶剂得浸膏，用乙酸乙酯溶解后，与3倍浸膏重量的柱层析硅胶混合，晾干，加入装有25倍浸膏重量柱层析硅胶的层析柱顶部进行硅胶柱层析分离，用石油醚∶乙酸乙酯＝1∶0至5∶5混合溶剂梯度洗脱，以薄层层析法检测洗脱液成分，收集含青蒿素B的流份，回收溶剂至小体积，放置析出粗结晶，再经乙酸乙酯反复重结晶纯化，即得。
5.如权利要求2所述的青蒿素B的制备方法，其特征在于该方法为：
青蒿叶1重量份干燥后，粉碎，用7体积份石油醚浸泡70小时，用75体积份的石油醚渗漉，收集渗漉液，60℃以下减压回收溶剂得浸膏，用乙酸乙酯溶解后，与4倍浸膏重量的柱层析硅胶混合，晾干，加入装有45倍浸膏重量柱层析硅胶的层析柱顶部进行硅胶柱层析分离，用石油醚∶乙酸乙酯＝1∶0至5∶5混合溶剂梯度洗脱，以薄层层析法检测洗脱液成分，收集含青蒿素B的流份，回收溶剂至小体积，放置析出粗结晶，再经乙醇反复重结晶纯化，即得。
6.如权利要求2所述的青蒿素B的制备方法，其特征在于该方法为：
青蒿叶1重量份干燥后，粉碎，用8体积份丙酮浸泡48小时，用60体积份丙酮渗漉，收集渗漉液，50℃以下减压回收溶剂得浸膏，用乙酸乙酯溶解后，与2倍浸膏重量的柱层析硅胶混合，晾干，加入装有30倍浸膏重量柱层析硅胶的层析柱顶部进行硅胶柱层析分离，用石油醚∶丙酮＝1∶0至6∶4混合溶剂梯度洗脱，以薄层层析法检测洗脱液成分，收集含青蒿素B的流份，回收溶剂至小体积，放置析出粗结晶，再经乙醇反复重结晶纯化，即得。
7.如权利要求2所述的青蒿素B的制备方法，其特征在于该方法为：
青蒿叶1重量份干燥后，粉碎，用5体积份乙醚浸泡50小时，用40体积份的乙醚渗漉，收集渗漉液，55℃以下减压回收溶剂得浸膏，用乙酸乙酯溶解后，与3倍浸膏重量的柱层析硅胶混合，晾干，加入装有25倍浸膏重量柱层析硅胶的层析柱顶部进行硅胶柱层析分离，用石油醚∶丙酮＝1∶0至6∶4混合溶剂梯度洗脱，以薄层层析法检测洗脱液成分，收集含青蒿素B的流份，回收溶剂至小体积，放置析出粗结晶，再经丙酮反复重结晶纯化，即得。
8.如权利要求1或2所述的青蒿素B的制备方法，其特征在于该方法中有机溶剂是指乙醇、丙酮、乙酸乙酯、乙醚、石油醚或汽油中的一种或几种。
9.如权利要求1-7任一所述的青蒿素B的制备方法，其特征在于该方法所得青蒿素B的理化性质和波谱数据为无色方形结晶，熔点151-153℃，[α]-73.5℃(C＝1.01，MeOH)，EI-MS m/e 248(M+)，分子式为C15H20O3；1H-NMR(CDCl3 300Hz)6.14(1H，d，J＝3Hz，13-CH＝)，5.42(1H，d J＝3Hz，13-CH＝)，2.70(1H，s，5-CH)，1.34(3H，s，15-CH3)，0.99(3H，d，J＝6Hz，14-CH3)；13C-NMR(CDCl3 75Hz)：43.9(C-1)，16.4(C-2)，24.5(C-3)，58.2(C-4)，58.7(C-5)，81.0(C-6)，52.8(C-7)，21.8(C-8)，34.0(C-9)，30.7(C-10)，138.7(C-11)，169.5(C-12)，117.2(C-13)，18.6(C-14)，22.7(C-15)。
10.青蒿素B在制备免疫抑制的药物中的应用。
11.青蒿素B在制备预防和治疗自身免疫性疾病的药物中的应用。
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Granted publication date: 20140716 |