CN1990489B

CN1990489B - 香豆草醚类化合物及其组合物的新用途

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Publication number: CN1990489B
Application number: CN2005101124356A
Authority: CN
Inventors: 俞强
Original assignee: Xiangbei Welman Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Xiangbei Welman Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2005-12-30
Filing date: 2005-12-30
Publication date: 2011-03-23
Anticipated expiration: 2025-12-30
Also published as: CN1990489A

Abstract

本发明公开了一种从菊科植物中提取的香豆草醚类化合物的用途。该化合物及以该化合物为主要成分的药物组合物，可以被用来治疗恶性肿瘤。细胞学试验和动物试验证明，这种香豆草醚类化合物可有效抑制并杀死肿瘤细胞，可被开发成新型的抗肿瘤一类新药。

Description

香豆草醚类化合物及其组合物的新用途

技术领域

本发明涉及一种从菊科植物中提取的香豆草醚类化合物和含有该化合物的药物组合物或者保健食品在治疗恶性肿瘤方面的应用。

背景技术

香豆草醚类化合物(如式I所示)可由植物中提取或化学合成、半合成、生物转化的方式获得，例如从菊科植物鳢肠(Eclipta prostrata Linn)、蟛蜞菊(Wedelia chinensis)、或旱莲草(Eclipta alba)等植物中提取。该化合物在菊科植物中的提取部位为植物的枝、叶或果实部位，尤其是叶部位。

式中，

R₁代表氢原子、羟基、甲氧基；

R₂代表氢原子、C₁-C₈烷基；

R₃和R₄各自独立地选自氢原子、卤素原子、羟基、甲氧基。

1956年，Govindachari等首次从Wedelia calendulacea中分离出香豆草醚类成分蟛蜞菊内酯(wedelolactone)，其结构为

(Govindachari et.al.″Chemical Examination of Wedelia Calendulacea，Part I，Structure of Wedelolactone″，Journal of the Chemical Society(1956)，pp.629-632.；Govindachari et.al.″Chemical Investigation of WedeliaCalendulacea，Part II，The Position of the Methoxyl Group in Wedelolactone″，Journal of the Chemical Society，(1957)，545-547；)。

其后Bhargava等从旱莲草(Eclipta alba)中分离出去甲蟛蜞菊内酯(demethylwedelolactone)，结构式为：

(Bhargava KK.et.al Isolation of desmethylwedelolactone and its glucoside fromEclipta alba.Indian J Chem，1970，8(7)：664-665)。

Li CC.等及美国专利6,552,071公开了该类化合物衍生物的结构及合成方法(Li CC.et.al Total synthesis of wedelolactone.J Org Chem.2003 Oct31；68(22)：8500-4.)(Yuan et al.Methods for treating cell death diseases andinflammation.United States Patent 6,552,071)。

该类化合物以往被认为有护肝、止血、抗蛇毒等作用(Wong et.al.Wedelolactone and coumestan derivatives as new antihepatotic and antiphlogisticprinciples.Arzneimittelforschung.1998 May 38(5)：661-5；Melo.et.al.Inhibitionof the myotoxic and hemorrhagic activities of crotalid venoms by Ecliptaprostrate extracts and constituents.Toxicon.1994 May；32(5)：595-603)。

众所周知，恶性肿瘤严重危胁着人类的身体健康，其治疗也成为人们关注的焦点，传统的化疗和放疗由于缺乏特异性，取得疗效的同时也往往给患者带来较大的毒副作用。因此，寻找靶向性的小分子抗肿瘤药物是新药研究领域的一个重点，而从天然植物中筛选具有崭新分子结构的新化合物或者已知天然化合物的新用途，也成为新药开发的主要途径之一。

发明内容

本发明提供了一种香豆草醚类化合物或其药学上可接受的盐，或者含该化合物或其药学上可接受的盐的提取物在抗恶性肿瘤方面的用途。

本发明人经研究发现：一种香豆草醚类化合物或其药学上可接受的盐，或者含该香豆草醚类化合物或其药学上可接受的盐的提取物可显著抑制实验动物的肿瘤生长，且基本无毒；细胞学试验也显示其对细胞NF-κB信号通路有显著的阻遏作用，提示能阻止肿瘤细胞转移，并能杀死肿瘤细胞。

本发明所提供的物质是一种式I的香豆草醚类化合物或其药学上可接受的盐，或者含式I的香豆草醚类化合物或其药学上可接受的盐的提取物：

式中，

R₁代表氢原子、羟基、甲氧基；

R₂代表氢原子、C₁-C₈烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、戊基、新戊基、己基、庚基、辛基等，优选具有1～4个碳原子的直链或支链的烷基，最优选甲基；

R₃和R₄各自独立地选自氢原子、卤素原子、羟基、甲氧基；

在另一优选例中，所述的药学上可接受的盐是式I化合物与选自下组的酸所形成的盐：盐酸、氢溴酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、琥珀酸、草酸、富马酸、马来酸、草酰乙酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、甲基苯磺酸或羟乙磺酸。

在另一优选例中，所述的式I化合物或其药学上可接受的盐是从菊科植物中提取的。

在另一优选例中，所述的菊科植物选自鳢肠(Eclipta prostrata Linn)、蟛蜞菊(Wedelia chinensis)或旱莲草(Eclipta alba)。

在另一优选例中，所述的式I化合物是如同式II的蟛蜞菊内酯：

在另一优选例中，式I化合物是通过化学全合成、化学半合成或用生物转换的方式获得的，如

化合物1：R₁＝R₂＝H，R₃＝R₄＝OH；

化合物2：R₁＝OH，R₂＝CH₃，R₃＝R₄＝OH；

化合物3：R₁＝OH，R₂＝CH₃，R₃＝Cl，R₄＝OH；

化合物4：R₁＝OCH₃，R₂＝H，R₃＝Cl，R₄＝H；

化合物5：R₁＝H，R₂＝(CH₂)₂CH₃，R₃＝OCH₃，R₄＝Cl；

化合物6：R₁＝OH，R₂＝CH₃，R₃＝H，R₄＝OH。

本发明还包括一种用于治疗恶性肿瘤的药物组合物，它含有(a)有效量的作为活性成分的式I化合物或其药学上可接受的盐，或者含式I的香豆草醚类化合物或其药学上可接受的盐的提取物，和(b)药学上可接受的载体。

其中，该药物组合物还可以包括选自下组的一种或多种辅助活性成分：紫杉醇、长春花碱、喜树碱、替尼泊苷、秋水仙碱、高三尖杉酯碱、依托泊苷、丙卡巴肼、门冬酰胺酶、顺铂、卡铂、米托蒽醌、他莫昔芬、环磷酰胺、盐酸氮芥、洛莫司汀、司莫司汀、塞替派、白消安、氮甲、苯丁酸氮芥、氟尿嘧啶、喃氟啶、优氟啶、卡莫氟、巯嘌呤、甲氨蝶呤、阿糖胞苷、环胞苷、硫鸟嘌呤、六甲蜜胺、羟基脲、丝裂霉素、阿霉素、表柔比星、博莱霉素、培莱霉素、放线菌素D和阿伐司汀、赫赛汀、格列卫、吉西他滨、托泊替康、多西他赛、泰索帝、亮丙瑞林等。

本发明还包括一种用于辅助治疗恶性肿瘤的保健食品，它含有(a)有效量的作为活性成分的式I化合物或其药学上可接受的盐，或者含式I的香豆草醚类化合物或其药学上可接受的盐的提取物，和(b)食品上可接受的载体。

如本文所用，烷基是指具有1～8个碳原子的直链或支链的烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、戊基、新戊基、己基、庚基、辛基等。优选具有1～4个碳原子的直链或支链的烷基。最优选甲基。

本发明的化合物可以以由药学上或生理学可接受的酸或碱衍生的盐形式使用。这些盐包括(但不限于)与如下酸形成的盐：盐酸、氢溴酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、琥珀酸、草酸、富马酸、马来酸、草酰乙酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、或羟乙磺酸。其他盐包括：与碱金属或碱土金属(如钠、钾、钙或镁)形成的盐，以及以酯、氨基甲酸酯或其他常规的“前体药物”的形式(当以这种形式给药时，在体内可转化成活性部分)。

含有式I化合物的提取物也可用于本发明。一种优选的提取方法如本发明人在其另一项专利《治疗关节炎的药物》(申请号：200310124512)中所述。通常，在提取物中式I化合物的纯度按重量计应在40％-99.9％，更佳地为50-98％。

本发明还包括其药物组合物以及治疗恶性肿瘤的方法，它包括给哺乳动物施用药物有效量的本发明化合物。

本发明的香豆草醚类化合物可用于治疗恶性肿瘤。

本发明涉及的药物组合物包含有效量的本发明涉及的化合物和药物上可接受的载体。“有效量”系指在普遍认同的医学判定范畴内，化合物的用量足以改善待治病情，且治疗时并未出现严重的副作用。某化合物的有效量应根据具体的待治病情、接受治疗的病人的年龄和生理状况、病情严重程度、疗程长短、药用载体及给药途径等因素而确定。此时本发明药物组合物中包含按重量计约0.1％至约99.9％，通常为0.05-90％(重量)的香豆草醚类化合物或其药学上可接受的盐，或含有它们的提取物。

通常，当本发明化合物用于上述用途时，它们可与一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂混合，如添加剂、稀释剂、载体或抛射剂等以混合物形式使用，制成粉雾剂、气雾剂或喷雾剂。粉雾剂中适合的稀释剂或载体的实例包括乳糖、葡聚糖、阿拉伯胶、甘露糖醇和葡萄糖。气雾剂和喷雾剂中适合的溶剂为乙醇或油酸，适合的潜溶剂为甘油、丙二醇或聚乙二醇。溶剂和潜溶剂可统称为稀释剂。适合的抛射剂为三氯一氟甲烷，二氯二氟甲烷，二氯四氟乙烷、丙烷、异丁烷、正丁烷、二氧化碳、一氧化二氮、氮气等。

或者可以用如下形式口服给药：片剂、胶囊、可分散的粉末、颗粒或悬浮液(含有如约0.05-5％悬浮剂)、糖浆(含有如约10-50％糖)、和酏剂(含有约20-50％乙醇)，或者以无菌可注射溶液或悬浮液形式(在等渗介质中含有约0.05-5％悬浮剂)进行非肠胃给药。例如，这些药物制剂可含有与载体混合的约2.5-90％，通常约为5％-60％(重量)的活性成分。

常见的药物剂型包括粉雾剂、气雾剂、喷雾剂、粒剂、粉剂、片剂、胶囊、糖浆、栓剂、注射剂、乳剂、酊剂、悬浮液、溶液的形式口服或非口服给药。

对于非口服给药，可使用粉雾剂、气雾剂、喷雾剂。

对于口服给药，可使用片剂、锭剂、胶囊、丸剂、粉末、颗粒、糊剂、混悬剂、乳剂或者溶液剂。

对于非胃肠道给药，可使用注射剂和输液剂。

对于肌肉内注射，可使用水溶液和油溶液或者混悬剂以及相应的贮存库制剂。

所用的活性成分的有效剂量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度而变化。然而，通常当本发明的化合物每天以约0.5-500mg/kg动物体重的剂量给予时，能得到令人满意的效果，较佳地每天以2-4次分开的剂量给予，或以缓释形式给药。对大部分大型哺乳动物而言，每天的总剂量约为1-100mg。适用于内服的剂量形式，包含与固态或液态药学上可接受的载体混合的约0.5-500mg的活性化合物。可调节此剂量方案以提供最佳治疗应答。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。通常，成年人的口服每日的合适临床剂量的选择范围为1-1000mg，优选为10-200mg，成人非口服的每日剂量为0.1-100mg，优选1-100mg。

在优选例中，本发明的化合物可通过口服以及静脉内、肌内或皮下途径给药。固态载体包括：淀粉、乳糖、磷酸氢钙、微晶纤维素、蔗糖和白陶土，而液态载体包括：无菌水、聚乙二醇、非离子型表面活性剂和食用油(如玉米油、花生油和芝麻油)，只要适合活性成分的特性和所需的特定给药方式。在制备药物组合物中通常使用的佐剂也可有利地被包括，例如调味剂、色素、防腐剂和抗氧化剂如维生素E、维生素C、BHT和BHA。

如本文所用，“非口服”包括皮下注射，静脉注射，腹膜内注射和滴注输液，使用合适的分散剂或润滑剂及悬浮剂，由本领域常规方法可制得注射制剂如无菌注射的水性或油性悬浮剂，无菌注射的制剂为在稀释剂中或溶液中的无毒、非口服施用的溶液或悬浮剂，例如水溶液，可用的载体或溶剂包括水、等渗盐水、无毒非挥发性油也可用作溶剂或悬浮介质。为此，可以使用任何非挥发油或脂肪酸，包括天然、合成或半合成的脂肪油和脂肪酸以及天然、合成或半合成的单、双或三甘油酯。

直肠用药的栓剂的制备可用药物与一种合适的无刺激性赋形剂混合而成，赋形剂在常温下为固体，而在肠内温度下为液体从而溶解、将药物释放到直肠中，如可可脂或聚乙二醇。

口服用药的固体药剂如上所述，包括粉剂、粒剂、片剂、丸剂、胶囊。这种剂型可用有效组分与至少一种添加剂混合而成，这些添加剂包括蔗糖、乳糖、纤维素糖、甘露醇、麦芽糖、葡聚糖、淀粉、琼脂、藻酸炎、壳质、壳聚糖、果胶、黄耆胶、阿拉伯胶、明胶、胶原、酪蛋白、白蛋白以及合成或半合成的聚合物和甘油酯，一般这些剂型可含有另外的添加剂，包括惰性稀释剂，润滑剂如硬脂酸镁，防腐剂如对羟苯甲酸酯类，山梨酸，抗氧剂如维生素C、α-维生素E和半胱氨酸，分解剂，粘结剂，增稠剂，缓冲液，甜味剂，调味剂和香料。片剂和丸剂也可覆以肠衣。口服的液体剂型包括可药用的乳剂、糖浆、酊剂、悬液和溶液，可以含有常用的惰性稀释剂，如水。

从易于制备和给药的立场看，优选的药物组合物是固态组合物，尤其是片剂和固体填充或液体填充的胶囊。口服给药是优选的。

本发明中所说的“保健食品”是指表明具有特定保健功能的食品，即适用于特定人群食用，具有调节机体功能的作用，不直接以治疗为目的的食品。其中通常含有0.05-50％(重量)的香豆草醚类化合物或其药学上可接受的盐，或含有它们的提取物。

本发明的主要优点在于：

1.本发明从天然植物中找到了-类香豆草醚类化合物，该化合物能被用于制备治疗恶性肿瘤的新药。细胞试验和动物试验显示：该化合物能显著抑制肿瘤细胞生长，且对人体无毒副作用。

2.本发明化合物可将其单独或与其它药物共同作为活性成分制成治疗恶性肿瘤的药品，也可将其单独或与其它活性成分及食品上可接受的载体制成辅助治疗恶性肿瘤的保健食品。

附图说明

图1为蟛蜞菊内酯对于脱壁悬浮引起的NF-κB因子转录活性的影响的示意图；

图2为蟛蜞菊内酯对S180细胞的细胞毒性的影响的示意图。

具体实施方式

以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1如结构式II所示的香豆草醚类化合物抑制NF-κB细胞因子的活力

NF-κB即核因子，在细胞信号转导途径中有重要作用。以往对NF-κB的认识只限制于其在炎症、应激、免疫方面的作用，Beg等[Beg A A，Sha W C，Bronson R T，et al.Nature，1995，376(6536)：167～170]最早发现NF-κB与细胞死亡有关，并发现缺乏NF-κB鼠的肝脏由于肝细胞凋亡而出现退行性变，认为NF-κB与抑制胚胎细胞凋亡有关，因而推想其可以抑制肿瘤细胞凋亡。接下来的研究表明：许多高表达NF-κB的肿瘤细胞表现出对射线、化疗、肿瘤坏死因子TNF介导的凋亡的抵抗作用，抑制NF-κB可以提高肿瘤细胞对TNF的敏感性[NF-κB与肿瘤发生及药物筛选.刘巍峰，于姗姗，李越中.生物工程学报，2005，21(1)：12-18.]。

实验目的：在脱壁悬浮状态下，被转化的人肾胚胎细胞HEK293细胞株以及其它肿瘤细胞株中的NF-κB转录因子的活性会随着悬浮时间的延长而逐渐增强；本试验在于观察天然化合物蟛蜞菊内酯(如式II所示)对于脱壁悬浮引起的NF-κB转录因子活性的影响。

实验材料：

1)细胞株：稳定转染了NF-κB-luciferase报告基因质粒的HEK293

2)质粒：NF-κB-luc+plasmid

3)荧光素酶检测试剂盒(promega E1500)

实验方法：

1)培养过夜的HEK293细胞，胰酶消化，以每孔2×10⁵个细胞分装于eppendorf管中；

2)用新鲜配制的含蟛蜞菊内酯(如式II所示)的DMEM(含10％小牛血清)补足上述培养基至1毫升，混匀，使其中的蟛蜞菊内酯(如式II所示)终浓度为80μM；

3)将上述细胞悬液滴入琼脂覆盖的24孔培养板中，于培养箱中分别培养3h、5h、15h；

4)2000rpm，4℃，离心5min，收集细胞；

5)用预冷PBS(磷酸盐缓冲液)漂洗一遍，2000rpm，4℃，离心5min，弃上清，收集细胞；

6)加100μl荧光素酶裂解液(CCLR)，涡旋振荡10s；

7)13200rpm，4℃，离心2min，收集上清；

8)取20μl上述上清液于96孔白板(Costar)中，加30μl荧光素酶底物，快速混匀，于luminometer(TECAN GENion)中检测。

实验结果：

实验结果见图1。

实验结论：如图1所示，蟛蜞菊内酯(如式II所示)能有效抑制HEK293细胞脱壁悬浮所引起的NF-κB因子转录的激活效应，提示蟛蜞菊内酯(如式II所示)可能通过抑制脱壁肿瘤细胞中的NF-κB的活力来诱导肿瘤细胞脱壁调亡，从而阻止肿瘤细胞的转移。

实施例2如结构式II所示的香豆草醚类化合物对小鼠S180肉瘤细胞的杀伤效果

实验目的：观察天然化合物蟛蜞菊内酯(如式II所示)对于小鼠S180肉瘤细胞的体外细胞毒性。

实验材料：S180肉瘤细胞，噻唑蓝(MTT)。

实验步骤：

1.收集细胞，调整细胞浓度，取90μl种于96孔板，使每孔细胞浓度为1×10⁴。

2.配10倍浓度各药，取10μl加入各孔，每种药物设三个复孔，同时设仅加药物(无细胞)的对照孔三个。

3.37℃5％CO2培养48小时，每孔加入5mg/ml的MTT 10μl，37℃4小时。每孔加入三联液(5％SDS，10mm HCl，5％异丙醇)，37℃过夜。

4.595nm和620nm测吸光度。

计算公式：

survival cell percent(％)＝(样品OD值/对照OD值)×100％

实验结果：

实验结果见图2：

实验结论：在5～100μM的浓度范围内，蟛蜞菊内酯对S180肉瘤细胞有显著杀伤作用。

实施例3 如结构式II所示的香豆草醚类化合物对实验动物的抗肿瘤效果

实验目的：观察蟛蜞菊内酯(如式II所示)对小鼠S180肉瘤生长有无抑制作用。

实验动物：雌性昆明小鼠20只，体重18-25g，由本公司实验动物室提供。随机均分为2组，每组10只，分别为阴性对照组、给药组。

实验方法：称取一定量纯度为98％蟛蜞菊内酯(如式II所示)，用0.5％CMC稀释配制成100mg/kg剂量。0.5％CMC设立为阴性对照组。给小鼠接种S180肉瘤细胞，7天后在无菌条件下抽取腹水，1200rpm离心5min，弃去上清。细胞沉淀用生理盐水稀释成1∶80的混悬液备用(细胞浓度为5×10⁶个/ml)。将稀释的S180悬液注射在小鼠右前肢腋部皮下，注射量每只0.2ml，制造荷瘤小鼠，进行抑瘤作用的检测。接种24小时后，将小鼠随机分组，进行腹腔注射给药，每日1次，连续给药10天后停药，放置4天后处死小鼠，剥取瘤块称重，计算每组平均值，进行t检验，并计算抑瘤率。

抑瘤率＝(对照组瘤重-给药组瘤重)/对照组瘤重×100％。

实验结果：

实验结果见下表：

“*”表示p＜0.01与阴性对照组(0.5％CMC)相比有非常显著性差异。

上表的结果表明：给药组体重与阴性对照组相比，蟛蜞菊内酯(如式II所示)具有显著的抑瘤活性(p＜0.01)。

实验结论：本次实验中，纯度为98％的蟛蜞菊内酯(如式II所示)在100mg/kg剂量时对小鼠S180肉瘤生长的有明显抑制作用。

实施例4 片剂的制备

利用常规技术，混合以下组分，然后直接压片，制备片剂形式的药物组合物，其配方如下：

成分	处方量(g/1000片)
		蟛蜞菊内酯(如式II所示)	100
乳糖	50
		微晶纤维素	40
玉米淀粉	6
		羧甲基淀粉钠	3
硬脂酸镁	1
		总量	200

实施例5 注射剂的制备

称取1.0g纯度为98％的蟛蜞菊内酯(如结构式II所示)，加入50g聚乙二醇PEG-400，使其完全溶解；配制50g pH5.5的磷酸盐缓冲液，称取0.02g亚硫酸氢钠加入到上述磷酸盐缓冲液中；将缓冲液加入到蟛蜞菊内酯(如式II所示)的PEG溶液中，混合均匀，加入0.01％针用活性碳100℃保温30分钟，G₃垂熔玻璃漏斗过滤、0.22μm微孔滤膜过滤，过滤后的药液分装成2ml/支的针剂50支，分装好的注射剂压塞、压铝盖成针剂。

Claims

1.一种式II的蟛蜞菊内酯的用途，其特征在于用于制备小鼠S180肉瘤细胞抑制剂或由脱壁悬浮引起的NF-κB因子转录活性的抑制剂；

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的式II的蟛蜞菊内酯是从菊科植物中提取的。

3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的菊科植物选自鳢肠(Eclipta prostrata Linn)、蟛蜞菊(Wedelia chinensis)或旱莲草(Eclipta alba)。