JP2013006821A

JP2013006821A - 抗腫瘍剤及びその製造方法

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Publication number: JP2013006821A
Application number: JP2011258221A
Authority: JP
Inventors: Naomichi Arima; 直道有馬; Yohann White; ホワイトヨハン; Sueyuki Hamada; 季之濱田; Mitsuyoshi Nakashima; 充賀中島
Original assignee: Kagoshima University NUC
Current assignee: Kagoshima University NUC
Priority date: 2011-05-23
Filing date: 2011-11-25
Publication date: 2013-01-10
Anticipated expiration: 2031-11-25
Also published as: JP5892508B2

Abstract

【課題】難治性のＡＴＬ、リンパ腫及び固形癌に対する新規抗腫瘍剤の提供。
【解決手段】一般式（Ｉ）：

[式中、Ｒ_１は、ヒドロキシル基、メトキシ基等であり；Ｒ_２は、水素原子、ヒドロキシル基等、及び、以下：

から選択され；Ｒ_３は、水素原子、ヒドロキシル基等から選択され;Ｒ_４は、水素原子、ヒドロキシル基等から選択される]
【選択図】なし

Description

本発明は、抗腫瘍剤及びその製造方法に関する。特に、本発明は、シソ科植物ヒプティス・ヴェルチシラータ（Ｈｙｐｔｉｓｖｅｒｔｉｃｉｌｌａｔａ）由来の抗腫瘍剤及びその製造方法に関する。具体的には、ヒプティス・ヴェルチシラータ由来の化合物及び組成物を有効成分として含有する抗腫瘍剤及びその製造方法に関する。

シソ科植物であるヒプティス・ヴェルチシラータは熱帯アメリカ原産で、南北アメリカの熱帯から亜熱帯地方に生息している。メキシコでは、一般に「ｈｉｅｒｂａｍａｌｔｉｎａ」と呼ばれているこの植物の葉は、経口的に頭痛、胃痛及び消化器疾患等の薬として用いられている。また、この植物全体を煮詰めたものは、虫刺され、リウマチ及び皮膚感染症等の塗り薬として用いられており、さらに、駆虫剤や下剤としても広く用いられている。

ヒプティス・ヴェルチシラータからは、過去の研究により、多くのリグナン骨格を有する化合物が単離されている（非特許文献１及び２）。非特許文献２には、図１に示すようなリグナン骨格を有する化合物が記載されている。

成人Ｔ細胞白血病（ＡｄｕｌｔＴ−ｃｅｌｌＬｅｕｋｅｍｉａ：以下、ＡＴＬという）は、細胞性免疫担当細胞であるＴ細胞がＨＴＬＶ−１というウイルスに侵されてガン化する白血病のことであり、Ｔ細胞がガン化したＡＴＬ細胞の一部は花びらのような形状をした核を有し、「花細胞」と呼ばれている。感染経路としては、母乳、胎盤、産道を介した垂直感染、及び、性交、輸血、臓器移植を介した水平感染等が挙げられる。ＡＴＬの発症までの潜伏期間は４０〜６０年であり、成人期以降に水平感染した人からは、ＡＴＬの発症はほとんど見られない。ＨＴＬＶ−１ウイルスのキャリアは日本で１２０万人、世界では１０００万〜２０００万人とされており、日本では九州・沖縄地方に多いという特徴をもつ。発症すると、白血球数の増加、リンパ節腫脹、肝臓や脾臓の腫大、皮膚紅斑や皮下腫瘤等の皮膚病変、下痢や腹痛等の消化器症状がしばしばみられる。また病勢の悪化によって血液中のカルシウム値が上昇（高カルシウム血症）すると、全身の倦怠感、意識障害等の症状を引き起こす。さらに免疫能の低下により感染症にかかりやすくなり、真菌、原虫、寄生虫及びウイルス等による日和見感染症を高頻度に合併する。ＡＴＬ細胞は抗ガン剤が効きにくく、また寛解が得られたとしても、再発率が高い。このため、従来の治療法ではきわめて難治性であるため有効な治療薬の探索が求められている。

非特許文献３には、リグナン類に属する化合物であるエトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）（ＶＰ−１６）：

が記載されている。エトポシドはメギ科の植物ポドフィルム（Ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｕｍｐｅｌｔａｔｕｍ）から単離されたポドフィロトキシン（ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｏｔｏｘｉｎ）を原料に合成された。エトポシドはトポイソメラーゼ阻害作用を有し、肺小細胞ガン、悪性リンパ腫、子宮頚ガン、急性白血病、精巣腫瘍、膀胱ガン及び絨毛性疾患等に対する薬として用いられている。また、エトポシドはＡＴＬの治療にも用いられているが、エトポシド以外のリグナン類に属する化合物についてはＡＴＬ細胞に対して抗腫瘍活性があるという報告は現在までにない。

また特許文献１には、キク科植物ベニバナボロギクからの抽出物がＡＴＬ細胞に対して抗腫瘍活性を有することが記載されている。

しかしながら、シソ科植物ヒプティス・ヴェルチシラータ由来の化合物又は抽出物がＡＴＬ細胞に対して抗腫瘍活性を有することはこれまで報告されていない。

特開２００８−１０５９６０号公報

秋久俊博ほか;「資源天然物化学」、共立出版、１２８−１３２頁 M. Novelo et al. J.Nat.Prod., 1993, 56, 1728−1736 B. Konuklugil, Chem. Nat. Compd., 2005, 41, 306-307

本発明は、極めて効果の高い抗腫瘍剤、特に難治性のＡＴＬをはじめとする多種の白血病、リンパ腫及び固形癌に対して極めて高い効果を有する抗腫瘍剤並びにその製造方法を提供することを目的とする。

本発明者は、シソ科植物ヒプティス・ヴェルチシラータ由来の化合物及び組成物が高い抗腫瘍活性を有することを見出した。

本発明は以下の発明を包含する。
（１）一般式（Ｉ）：

[式中、
Ｒ_１は、ヒドロキシル基、メトキシ基、メチレンジオキシ基及びリン酸基から選ばれる少なくとも１個の基により置換されているフェニル基であり；
Ｒ_２は、水素原子、ヒドロキシル基、メトキシ基、アセチル基、アニリノ基、及び、以下：

から選択され；
Ｒ_３は、水素原子、ヒドロキシル基、メトキシ基及びアセチル基から選択され;
Ｒ_４は、水素原子、ヒドロキシル基、メトキシ基及びアセチル基から選択される]
で示される化合物（ただし、式（Ｄ）：

で示される化合物を除く）。
（２）Ｒ_３が、ヒドロキシル基、メトキシ基及びアセチル基から選択される、上記（１）に記載の化合物。
（３）式（Ａ）：

で示される、上記（１）又は（２）に記載の化合物。
（４）上記（３）に記載の化合物を含有するヒプティス・ヴェルチシラータ（Ｈｙｐｔｉｓｖｅｒｔｉｃｉｌｌａｔａ）由来の組成物。
（５）前記組成物が式（Ｂ）：

で示される化合物；
式（Ｃ）：

で示される化合物；
式（Ｄ）：

で示される化合物；及び
式（Ｅ）：

で示される化合物から選ばれる少なくとも１種を含有する、上記（４）に記載の組成物。
（６）前記組成物がヒプティス・ヴェルチシラータの抽出物又はその処理物である、上記（４）又は（５）に記載の組成物。
（７）ヒプティス・ヴェルチシラータのメタノール抽出物をエーテルと水で分配して得られたエーテル層を８５〜９５％メタノール水溶液とヘキサンで分配した場合の前記メタノール水溶液抽出物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより処理して得られる組成物。
（８）シリカゲルカラムクロマトグラフィーの移動相として酢酸エチル／ヘキサン−酢酸エチルを用いた場合の６０％酢酸エチル／ヘキサン溶出画分である、上記（７）に記載の組成物。
（９）シリカゲルカラムクロマトグラフィーの移動相として酢酸エチル／ヘキサン−酢酸エチルを用いた場合の４０％〜５０％酢酸エチル／ヘキサン溶出画分である、上記（７）に記載の組成物。
（１０）上記（１）〜（３）のいずれかに記載の化合物、又は上記（４）〜（９）のいずれかに記載の組成物を有効成分として含有する抗腫瘍剤。
（１１）成人Ｔ細胞白血病治療剤である、上記（１０）に記載の抗腫瘍剤。
（１２）薬剤耐性を有する患者に投与するための、上記（１０）又は（１１）に記載の抗腫瘍剤。
（１３）医薬品である、上記（１０）〜（１２）いずれかに記載の抗腫瘍剤。
（１４）食品に添加するための、上記（１０）〜（１２）のいずれかに記載の抗腫瘍剤。
（１５）ヒプティス・ヴェルチシラータを抽出し、得られた抽出物を精製することを特徴とする、式（Ａ）：

で示される化合物の製造方法。

本発明によれば、極めて効果の高い抗腫瘍剤、特に難治性のＡＴＬをはじめとする多種の白血病、リンパ腫及び固形癌に対して極めて高い効果を有する抗腫瘍剤並びにその製造方法を提供することができる。

図１は、過去にヒプティス・ヴェルチシラータから単離された化合物を示す図である。図２は、ヒプティス・ヴェルチシラータからの抽出スキームを示す図である。図３は、ヒプティス・ヴェルチシラータの抽出物の精製スキーム及び当該抽出物からの化合物（Ａ）−（Ｅ）の単離スキームを示す図である。図４は、化合物（Ａ）の構造及びＨＭＢＣ相関と^１ＨＮＭＲケミカルシフト値及び^１３ＣＮＭＲケミカルシフト値を示す図である。図５は、化合物（Ａ）の^１ＨＮＭＲスペクトルを示す図である。図６は、化合物（Ａ）の^１３ＣＮＭＲスペクトルを示す図である。図７は、化合物（Ｂ）の構造及び^１ＨＮＭＲケミカルシフト値（ｐｐｍ）を示す図である。図８は、化合物（Ｃ）の構造及び^１ＨＮＭＲケミカルシフト値（ｐｐｍ）を示す図である。図９は、化合物（Ｄ）の構造及び^１ＨＮＭＲケミカルシフト値（ｐｐｍ）を示す図である。図１０は、化合物（Ｅ）の構造及びＨＭＢＣ相関と^１ＨＮＭＲケミカルシフト値及び^１３ＣＮＭＲケミカルシフト値を示す図である。図１１は、化合物（Ａ）の癌細胞株に対する細胞障害活性を示す図である。

本発明の化合物は、一般式（Ｉ）：

から選択され；
Ｒ_３は、水素原子、ヒドロキシル基、メトキシ基及びアセチル基から選択され;
Ｒ_４は、水素原子、ヒドロキシル基、メトキシ基及びアセチル基から選択される]
で示される構造を有する（ただし、式（Ｄ）：

で示される化合物を除く）。

本発明の式（Ｉ）の化合物は、１位における絶対配置はＲ体及びＳ体のいずれであってもよく、またラセミ体であってもよい。好ましい絶対配置はＲ体である。また、式（Ｉ）の化合物は、２〜３位に二重結合があるという点でエトポシドと異なる。さらに、式（Ｉ）の化合物は、５位の置換基、ラクトン環の向きが上記エトポシドと異なる。

Ｒ_１は、好ましくは、以下：

から選択される。

Ｒ_２は、水素原子、ヒドロキシル基又はメトキシ基であることが好ましい。
Ｒ_３は、水素原子、メトキシ基又はヒドロキシル基であることが好ましく、メトキシ基又はヒドロキシル基であることが特に好ましい。
Ｒ_４は、水素原子であることが好ましい。

本発明の式（Ｉ）の化合物は、極めて効果の高い抗腫瘍活性を有し、特に難治性のＡＴＬをはじめとする多種の白血病、リンパ腫及び固形癌に対して極めて高い効果を有する。

本発明の組成物は、式（Ｉ）の化合物を有効成分として含有する。

本発明の化合物は、特に好ましくは、式（Ａ）：

で示される構造を有する。化合物（Ａ）の１位における絶対配置はＲ体及びＳ体のいずれであってもよく、またラセミ体であってもよい。好ましい化合物（Ａ）の絶対配置はＲ体である。また、化合物（Ａ）は、２〜３位に二重結合があるという点、配糖体でないという点でＡＴＬ細胞に対する抗腫瘍活性が報告されているエトポシドと異なる。さらに、化合物（Ａ）は、４’位及び５位の置換基、ラクトン環の向きが上記エトポシドと異なる。

本発明の組成物は、シソ科イガニガクサ属のヒプティス・ヴェルチシラータに由来する。用いるヒプティス・ヴェルチシラータの部分は、特に限定されず、全ての植物体を使用できるが、葉及び茎等を用いることが好ましい。

本発明の組成物は化合物（Ａ）を含有することが好ましい。
本発明の組成物は化合物（Ｂ）−（Ｅ）から選ばれる少なくとも１種を含有することが好ましい。

本発明の組成物は、化合物（Ａ）と化合物（Ｂ）−（Ｅ）から選ばれる少なくとも１種を含有することが好ましい。

本発明の組成物は、ヒプティス・ヴェルチシラータの抽出物（以下、抽出物という）又はその処理物（以下、処理物という）であることが好ましい。処理物とは、抽出物に分離、精製、単離等の各種処理の少なくとも１つを施したものである。

抽出溶媒としては、水；脂肪族炭化水素類、例えばヘキサン；アルコール類、例えばメタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール；エステル類、例えば酢酸エチル等の酢酸エステル；エーテル類、例えばエチルエーテル、ジオキサン；ケトン類、例えばアセトン等が挙げられる。抽出物を一旦溶媒除去して乾燥物として用いる場合には、前述した任意の溶媒を単独で又は混合して用いることができる。一方、抽出物を溶媒に溶解した状態で用いる場合には、人体に対して有害な作用を示さない溶媒を用いる必要があり、この場合には、水、エタノール又はこれらの混合物を用いることが好ましい。抽出に際して、ヒプティス・ヴェルチシラータは、そのまま用いることができ、また乾燥後に破砕又は粉砕して溶媒との接触を高めることもできる。

本発明の抽出物は、ヒプティス・ヴェルチシラータ１ｋｇ当たり、好ましくは５〜３０Ｌ、特に好ましくは１０〜１５Ｌの抽出溶媒で抽出することができる。抽出温度は、好ましくは室温ないし加圧下での沸点の範囲内であり、抽出時間は、抽出温度等により異なるが、好ましくは２４〜６０時間であり、特に好ましくは３６〜４８時間である。

このようにして得られた抽出液は、必要に応じて、布、ステンレスフィルター、濾紙、濾過滅菌用フィルター等で濾過して不溶物、不純物等を除去してもよい。また、濾過後の抽出液に、スプレードライ処理、フリーズドライ処理、超臨界処理等の処理を施してもよい。

このようにして得られた抽出物又はその処理物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、吸着・逆相分配クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、透析等の各種精製手段により処理し、さらに活性を高めた処理物としてもよい。

本発明の抽出物としては、例えば、ヒプティス・ヴェルチシラータのメタノール抽出物、これをエーテルと水で分配して得られたエーテル層を８５〜９５％、好ましくは９０％メタノール水溶液とヘキサンで分配した場合のメタノール水溶液抽出物等が挙げられる。

本発明の処理物としては、例えば、上記抽出物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（例えば移動相として酢酸エチル／ヘキサン−酢酸エチル、塩化メチレン／メタノール／水及びメタノールを順次用いる）を用いて分取した溶出画分、好ましくは６０％酢酸エチル／ヘキサン溶出画分が挙げられる。

本発明の処理物としては、上記溶出画分をさらに、例えばＨＰＬＣ（例えばＣｏｓｍｏｓｉｌ５Ｃ１８−ＭＳ−ＩＩ、φ４．６×２５０ｍｍ、φ１０×２５０ｍｍ、例えば移動相として５１％メタノール／水、５０％メタノール／水を用いる）を用いて分取した溶出画分が挙げられる。

本発明の処理物としては、上記６０％酢酸エチル／ヘキサン溶出画分をさらに、例えばＨＰＬＣ（例えばＣｏｓｍｏｓｉｌ５Ｃ１８−ＡＲ、φ１０×２５０ｍｍ、例えば移動相として５０％メタノール／水を用いる）を用いて分取した溶出画分が挙げられる。本発明の化合物（Ａ）及び（Ｃ）は、これらの溶出画分から得られる。本発明の化合物（Ｂ）、（Ｄ）及び（Ｅ）は、これらの溶出画分を例えばＨＰＬＣ（例えばＣｏｓｍｏｓｉｌ５Ｃ１８−ＭＳ−ＩＩ、φ４．６×２５０ｍｍ、φ１０×２５０ｍｍ、例えば移動相として３０％アセトニトリル／水、４３％メタノール／水）を用いて精製した場合に得られる。

本発明の式（Ｉ）の化合物又は化合物（Ｂ）〜（Ｅ）は、合成により製造してもよい。本発明の化合物は、リグナン類の合成法についての総説Eur. J. Org. Chem., 2007, 3815-3828の記載に基づき合成することができる。

本発明の組成物は、本発明の式（Ｉ）の化合物を、組成物全量を１００質量部として、好ましくは０．０１〜０．０２質量部、特に好ましくは０．０１５〜０．０１７質量部含有する。

本発明の組成物は、そのまま本発明の抗腫瘍剤の有効成分として使用することができる。本発明の抗腫瘍剤は医薬品であってもよく、食品に添加されてもよい。

本発明において、「腫瘍」には固形腫瘍及び造血器腫瘍が含まれる。ここで、固形腫瘍は、例えば、脳腫瘍、頭頸部癌、食道癌、甲状腺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、乳癌、胃癌、胆のう・胆管癌、肝癌、膵癌、結腸癌、直腸癌、卵巣癌、絨毛上皮癌、子宮体癌、子宮頸癌、腎盂・尿管癌、膀胱癌、前立腺癌、陰茎癌、睾丸癌、胎児性癌、ウイルス腫瘍、皮膚癌、悪性黒色腫、神経芽細胞腫、骨肉腫、ユーイング腫、軟部肉腫等であり、好ましくは非小細胞肺癌、結腸癌である。一方、造血器腫瘍は、例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、有毛細胞白血病（ＨＣＬ）、成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）等の白血病、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫（例えばＢ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫等）等のリンパ腫、多発性骨髄腫等であり、好ましくは急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）、成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）であり、特に好ましくは成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）である。

さらに、本発明の抗腫瘍剤は、薬剤耐性を有する腫瘍細胞に対しても抗腫瘍活性を有する。上記薬剤耐性に関与する遺伝子としては、ＭＲＰ−１、Ｐ−糖蛋白質遺伝子、ＢＣＲＰ等が挙げられる。このように、本発明の抗腫瘍剤は、従来の抗癌剤に対して耐性を獲得した癌患者に対しても治療効果が期待できる。

本発明の抗腫瘍剤は、公知の食品用担体又は医薬用担体と組合せて製剤化することができる。投与形態としては、特に制限はなく、必要に応じ適宜選択されるが、一般には錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、液剤、シロップ剤、懸濁剤、乳剤、エリキシル剤等の経口剤として使用される。また、本発明の抗腫瘍剤は、注射剤、点滴剤、坐剤、吸入剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤、貼付剤、軟膏剤等の非経口剤として使用してもよい。また、本発明の抗腫瘍剤は、食品、チューインガム、飲料等に添加して、いわゆる特定保健用食品（例えば、癌予防食品）等とすることもできる。

本発明の抗腫瘍剤の投与量は、患者の年令、体重、疾患の程度、投与経路により異なるが、経口投与では、本発明の式（Ｉ）の化合物の乾燥粉末として、通常１日１〜１０ｍｇであり、投与回数は、通常、経口投与では１日１〜３回である。

経口剤は、例えばデンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等の賦形剤を用いて常法に従って製造される。

この種の製剤には、適宜前記賦形剤の他に、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料等を使用することができる。

結合剤の具体例としては、結晶セルロース、結晶セルロース・カルメロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートサクシネート、カルメロースナトリウム、エチルセルロース、カルボキシメチルエチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、コムギデンプン、コメデンプン、トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、デキストリン、アルファー化デンプン、部分アルファー化デンプン、ヒドロキシプロピルスターチ、プルラン、ポリビニルピロリドン、アミノアルキルメタクリレートコポリマーＥ、アミノアルキルメタクリレートコポリマーＲＳ、メタクリル酸コポリマーＬ、メタクリル酸コポリマー、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルアルコール、アラビアゴム、アラビアゴム末、寒天、ゼラチン、白色セラック、トラガント、精製白糖、マクロゴールが挙げられる。

崩壊剤の具体例としては、結晶セルロース、メチルセルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルメロース、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、クロスカルメロースナトリウム、コムギデンプン、コメデンプン、トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、部分アルファー化デンプン、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルスターチナトリウム、トラガントが挙げられる。

界面活性剤の具体例としては、大豆レシチン、ショ糖脂肪酸エステル、ステアリン酸ポリオキシル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、セスキオレイン酸ソルビタン、トリオレイン酸ソルビタン、モノステアリン酸ソルビタン、モノパルミチン酸ソルビタン、モノラウリン酸ソルビタン、ポリソルベート、モノステアリン酸グリセリン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウロマクロゴールが挙げられる。

滑沢剤の具体例としては、コムギデンプン、コメデンプン、トウモロコシデンプン、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、含水二酸化ケイ素、軽質無水ケイ酸、合成ケイ酸アルミニウム、乾燥水酸化アルミニウムゲル、タルク、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、リン酸水素カルシウム、無水リン酸水素カルシウム、ショ糖脂肪酸エステル、ロウ類、水素添加植物油、ポリエチレングリコールが挙げられる。

流動性促進剤の具体例としては、含水二酸化ケイ素、軽質無水ケイ酸、乾燥水酸化アルミニウムゲル、合成ケイ酸アルミニウム、ケイ酸マグネシウムが挙げられる。

また、本発明の抗腫瘍剤は、液剤、シロップ剤、懸濁剤、乳剤、エリキシル剤として投与する場合には、矯味矯臭剤、着色剤を含有してもよい。

以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

（実施例１）
１．ヒプティス・ヴェルチシラータの抽出物、その処理物の調製及び化合物（Ａ）−（Ｅ）の単離
ＡＴＬ患者由来の白血病細胞株Ｓ１Ｔ細胞に対する抗腫瘍活性を指標として行った。抗腫瘍活性は、下記３に示す方法で測定した。

ヒプティス・ヴェルチシラータ（被子植物門双子葉植物網キク亜綱シソ目シソ科イガニガクサ属）はジャマイカで採取された。

ヒプティス・ヴェルチシラータのメタノール抽出物（Ｓ１Ｔ細胞に対するＩＣ_５０値０．１μｇ／ｍＬ）をエーテルと水で二層分配した。エーテル可溶部（ＩＣ_５０値０．１２５μｇ／ｍＬ）をさらに９０％メタノール水溶液とヘキサンで分配し、得られた９０％メタノール水溶液可溶部（ＩＣ_５０値０．０３μｇ／ｍＬ）を減圧濃縮した。この抽出スキームを図２に示す。

９０％メタノール水溶液可溶部（１．０７ｇ）をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（移動相：５％酢酸エチル／ヘキサン−１００％酢酸エチル（画分１〜１８）、塩化メチレン：メタノール：水=７：３：０．５（画分１９）、１００％メタノール（画分２０）を用いて分取した。

６０％酢酸エチル／ヘキサンで溶出した９番目の画分５３．２ｍｇ（ＩＣ_５０値３ｎｇ／ｍＬ）をさらにＨＰＬＣ（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ５Ｃ１８−ＡＲ、φ１０×２５０ｍｍ、移動相：５０％メタノール／水、１８画分）を用いて分取した。得られた６番目の画分からさらにＨＰＬＣ（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ５Ｃ１８−ＭＳ−ＩＩ、φ４．６×２５０ｍｍ、移動相：３０％アセトニトリル／水）を用いて化合物（Ｂ）１．６ｍｇ（ＩＣ_５０値２．５ｎｇ／ｍＬ）を、１０番目の画分から化合物（Ｃ）２．２ｍｇ（ＩＣ_５０値２２ｎｇ／ｍＬ）を単離した。また、１２番目の画分からＨＰＬＣ（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ５Ｃ１８−ＭＳ−ＩＩ、φ１０×２５０ｍｍ、移動相：４３％メタノール／水）を用いて化合物（Ｄ）０．５ｍｇ（ＩＣ_５０値０．１５ｎｇ／ｍＬ）と、化合物（Ｅ）１．３ｍｇ（ＩＣ_５０値１５．０ｎｇ／ｍＬ）をそれぞれ単離した。さらに１７番目の画分から化合物（Ａ）１．７ｍｇ（ＩＣ_５０値３．０ｎｇ／ｍＬ）を単離した。

４０％〜５０％酢酸エチル／ヘキサンで溶出した５番目の画分６６．１ｍｇ（ＩＣ_５０値０．３５μｇ／ｍＬ；シリカゲルＴＬＣ（５０％酢酸エチル／ヘキサン）のＲｆ値約０．４）をさらにＨＰＬＣ（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ５Ｃ１８−ＡＲ、φ１０×２５０ｍｍ、移動相：５１％メタノール／水、９画分）を用いて分取した。４番目の画分（ＩＣ_５０値０．２５ｎｇ／ｍＬ；保持時間約８０分）及び７番目の画分（ＩＣ_５０値０．２５ｎｇ／ｍＬ；保持時間約１４０分）を得た。
上記精製、単離スキームを図３に示す。

２．構造決定
化合物（Ａ）は、不定形で黄色がかった固体として得られた。ＦＡＢマススペクトルによる解析から、分子量４２６であり、分子式Ｃ_２３Ｈ_２２Ｏ_８であった。また、^１ＨＮＭＲスペクトルによる解析から、リグナン骨格を示していることが分かった。さらに、^１３ＣＮＭＲ、^１３ＣＤＥＰＴ、ＨＭＢＣ、ＨＭＱＣスペクトルを含めた解析により、化合物（Ａ）が、４−メトキシ−９−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−８，９−ジヒドロフロ［３’，４’：６，７］ナフト［２，３−ｄ］［１，３］ジオキソール−６（５Ｈ）−オンであると同定した。化合物（Ａ）の構造及びＨＭＢＣ相関と^１ＨＮＭＲケミカルシフト値及び^１３ＣＮＭＲケミカルシフト値を図４に示す。また、化合物（Ａ）の^１ＨＮＭＲスペクトル及び^１３ＣＮＭＲスペクトルを、それぞれ図５及び６に示す。化合物（Ａ）は、現在までに単離された報告はなく、今回初めて単離された化合物であった。

化合物（Ｂ）は、不定形無色の固体として得られた。ＦＡＢマススペクトルによる解析から、分子量４１４であり、分子式Ｃ_２２Ｈ_２２Ｏ_８であった。さらに、^１ＨＮＭＲ、^１３ＣＮＭＲ、^１３ＣＤＥＰＴ、ＨＭＢＣ、ＨＭＱＣスペクトルによる構造解析、及び、B.Konuklugil,Chem.Nat.Compd.,2005,41,306−307及びD. E. Jackson and P. M. Dewick, Phytochemistry, 1984, 23, 1147−1152との比較により、化合物（Ｂ）がβ−ペルタチン（β−ｐｅｌｔａｔｉｎ）（（５Ｒ）−５，８，８ａβ，β−テトラヒドロ−１０−ヒドロキシ−５−（３，４，５−トリメトキシフェニル）フロ［３’，４’：６，７］ナフト［２，３−ｄ］−［１，３］−ジオキソール−６（５ａαＨ）−オン）であると同定した。化合物（Ｂ）の構造及び^１ＨＮＭＲケミカルシフト値（ｐｐｍ）を図７に示す。

化合物（Ｃ）は、不定形で黄色がかった固体として得られた。ＦＡＢマススペクトルによる解析から、分子量３８４であり、分子式Ｃ_２１Ｈ_２０Ｏ_７であった。さらに、^１ＨＮＭＲ、^１３ＣＮＭＲ、^１３ＣＤＥＰＴ、ＨＭＢＣ、ＨＭＱＣスペクトルによる構造解析、及び、D. E. Jackson and P. M. Dewick, Phytochemistry, 1984, 23, 1147−1152との比較により、化合物（Ｃ）が４’−デメチルデスオキシポドフィロトキシン（４’−ｄｅｍｅｔｈｙｌｄｅｓｏｘｙｐｏｄｐｐｈｙｌｌｏｔｏｘｉｎ）（（５Ｒ）−５β−［３，４，５−トリメトキシフェニル］−５ａα-ヒドロキシ-５，８，８ａβ，９−テトラヒドロフロ［３’，４’:６，７］ナフト［２，３−ｄ］−１，３−ジオキソール-６（５ａＨ）-オン））であると同定した。化合物（Ｃ）の構造及び^１ＨＮＭＲケミカルシフト値（ｐｐｍ）を図８に示す。

化合物（Ｄ）は、不定形無色の固体として得られた。ＦＡＢマススペクトルによる解析から、分子量３９６であり、分子式Ｃ_２２Ｈ_２０Ｏ_７であった。さらに、^１ＨＮＭＲ、^１３ＣＮＭＲ、^１３ＣＤＥＰＴ、ＨＭＢＣ、ＨＭＱＣスペクトルによる構造解析、及び、M. Kuhnt et al, Phytochemistry, 1994,36,485−489との比較により、化合物（Ｄ）がヒプチニン（ｈｙｐｔｉｎｉｎ）（９α−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−５，９−ジヒドロフロ［３’，４’：６，７］ナフト［２，３−ｄ］−［１，３］−ジオキソール−６（８Ｈ）−オン）であると同定した。化合物（Ｄ）の構造及び^１ＨＮＭＲケミカルシフト値（ｐｐｍ）を図９に示す。

化合物（Ｅ）は、不定形無色の固体として得られた。ＦＡＢマススペクトルによる解析から、分子量３９８であり、分子式Ｃ_２２Ｈ_２２Ｏ_７であった。さらに、^１ＨＮＭＲ、^１３ＣＮＭＲ、^１３ＣＤＥＰＴ、ＨＭＢＣ、ＨＭＱＣスペクトルによる構造解析、及び、Y. Inamori et al. Chem. Pharm. Bull., 1985, 33, 704−709との比較により、化合物（Ｅ）がデオキシピクロポドフィリン（Ｄｅｏｘｙｐｉｃｒｏｐｏｄｏｐｈｙｌｌｉｎ）（（５Ｒ）−５，８，８ａβ，９−テトラヒドロ−５β−（３，４，５−トリメトキシフェニル）フロ［３’，４’：６，７］ナフト［２，３−ｄ］−［１，３］−ジオキソール−６（５ａβＨ）−オン）であると同定した。化合物（Ｅ）の構造及びＨＭＢＣ相関と^１ＨＮＭＲケミカルシフト値及び^１３ＣＮＭＲケミカルシフト値を図１０に示す。

３．抗腫瘍活性の測定
抗腫瘍活性は、ＡＴＬ細胞株であるＳ１Ｔ細胞に対する細胞障害性をＷＳＴ法で測定することにより行った。

ＲＰＭＩ−１６４０１０％ＦＣＳ培養液を用いて、９６穴平底マルチプレートにＳ１Ｔ細胞１×１０^４／１００μＬ／ウェルと１０倍希釈系列の分画液（１００μＬ／ウェル）を入れ、７２時間３７℃、５％ＣＯ_２存在下で培養した。

最後の４時間、テトラゾリウム塩ＷＳＴ−８試薬を２０μＬ／ウェル添加し、培養を継続した。次いで４５０ｎｍの吸光度を測定した。細胞生存率はコントロール群を１００％として、各濃度分画液のコントロールに対する割合で評価した。抗腫瘍活性の表現として、５０％の細胞障害作用を引き起こす化合物の濃度をＩＣ_５０とした。ＩＣ_５０はμg／ｍＬ及びｎＭで表した。

化合物（Ａ）について、上記抗腫瘍活性試験を行った結果を表１及び図１１に示す。白血病細胞株であるＫ３Ｔ（ＡＴＬ細胞）、Ｊｕｒｋａｔ（急性リンパ性白血病細胞）、ＨＬ６０及びＫ５６２（骨髄性白血病細胞）、並びにＡ５４９（肺癌細胞）及びＳＷ４８０（結腸癌細胞）に対する細胞障害性についてもＳ１Ｔ細胞と同様に測定した。

さらに、化合物（Ａ）について、Ｓ１Ｔ（ＡＴＬ細胞）及びＡｃｔＴ（活性化Ｔ細胞）に対して抗腫瘍活性試験を行った結果を表２に示す。抗腫瘍活性試験は細胞障害性をＷＳＴ法で測定することにより行った。９６穴マルチプレートを用いて化合物（Ａ）を最終濃度１０μg／ｍＬから１０倍希釈系列で希釈し、それにＳ１Ｔ細胞又はＡｃｔＴ細胞１×１０^５/ウェルを添加し、３７℃、５％ＣＯ_２の条件で７２時間培養し、上記と同様にＷＳＴ法で発色させ細胞障害活性を測定した。５０％細胞障害作用を引き起こす濃度をＩＣ_５０とした。

表２より、化合物（Ａ）は、ＡＴＬ細胞であるＳ１Ｔに対し、ＡｃｔＴの１２倍の抗腫瘍活性を有することがわかる。

以上より、本発明の化合物（Ａ）は、癌細胞、特に白血病細胞であるＡＴＬ細胞に対して非常に高い抗腫瘍活性を有することがわかった。

４．薬剤耐性細胞株に対する抗腫瘍活性の測定
薬剤耐性細胞株に対して化合物（Ａ）、エトポシド及びミトキサントロンの抗腫瘍活性試験を行った結果を表３に示す。薬剤耐性細胞としては、類上皮癌ＫＢ３−１とそれに薬剤耐性遺伝子ＭＲＰ−１を移入した細胞ＫＢ／ＭＲＰ、同様に薬剤耐性遺伝子Ｐ−糖蛋白質遺伝子を移入したＫＢ−Ｇ２、骨髄性白血病細胞株Ｋ５６２とそれに薬剤耐性遺伝子ＢＣＲＰを移入したＫ５６２/ＢＣＲＰを用いた。ＭＲＰ−１、Ｐ−糖蛋白質遺伝子及びＢＣＲＰはいずれも、多種類の抗癌剤耐性に関与している。ＭＲＰ−１とＰ−糖蛋白質の遺伝子移入株についてはエトポシドをコントロール薬剤として用い、ＢＣＲＰ移入株においてはミトキサントロンをコントロール薬剤として用いた。抗腫瘍活性試験は細胞障害性をＷＳＴ法で測定することにより行った。

ＲＰＭＩ−１６４０１０％ＦＣＳ培養液を用いて、９６穴平底マルチプレートに各細胞１×１０^４／１００μＬ／ウェルと１０倍希釈系列の分画液（１００μＬ／ウェル）を入れ、７２時間３７℃、５％ＣＯ_２存在下で培養した。

テトラゾリウム塩ＷＳＴ−８試薬を２０μＬ／ウェル添加し、同条件で４時間培養した後、４５０ｎｍの吸光度を測定した。細胞生存率はコントロール群を１００％として、各濃度分画液のコントロールに対する割合で評価した。５０％細胞障害作用を引き起こす濃度をＩＣ_５０とした。

ＫＢ／ＭＲＰ細胞はＫＢ３−１に比べて、エトポシドに対し２８．６倍の薬剤耐性を示すが、化合物（Ａ）に対しては１．１７倍の薬剤耐性を示すに過ぎない。ＫＢ−Ｇ２細胞はＫＢ３−１に比べて、エトポシドに対して２０．８倍の薬剤耐性を示すが、化合物（Ａ）に対しては耐性を全く示さない。Ｋ５６２/ＢＣＲＰ細胞はＫ５６２に比べて、ミトキサントロンに対して約１５倍の薬剤耐性を示すが、化合物（Ａ）に対しては約１．９倍という極めて低い薬剤耐性を示すに過ぎない。

以上より、化合物（Ａ）は、多剤耐性遺伝子である、ＭＲＰ−１、Ｐ−糖蛋白質遺伝子及びＢＣＲＰの関与する薬剤耐性を超えて、癌細胞株に作用することが明らかとなった。

Claims

一般式（Ｉ）：

[式中、
Ｒ_１は、ヒドロキシル基、メトキシ基、メチレンジオキシ基及びリン酸基から選ばれる少なくとも１個の基により置換されているフェニル基であり；
Ｒ_２は、水素原子、ヒドロキシル基、メトキシ基、アセチル基、アニリノ基、及び、以下：

から選択され；
Ｒ_３は、水素原子、ヒドロキシル基、メトキシ基及びアセチル基から選択され;
Ｒ_４は、水素原子、ヒドロキシル基、メトキシ基及びアセチル基から選択される]
で示される化合物（ただし、式（Ｄ）：

で示される化合物を除く）。
Ｒ_３が、ヒドロキシル基、メトキシ基及びアセチル基から選択される、請求項１に記載の化合物。
式（Ａ）：

で示される、請求項１又は２に記載の化合物。
請求項３に記載の化合物を含有するヒプティス・ヴェルチシラータ（Ｈｙｐｔｉｓｖｅｒｔｉｃｉｌｌａｔａ）由来の組成物。
前記組成物が式（Ｂ）：

で示される化合物；
式（Ｃ）：

で示される化合物；
式（Ｄ）：

で示される化合物；及び
式（Ｅ）：

で示される化合物から選ばれる少なくとも１種を含有する、請求項４に記載の組成物。
前記組成物がヒプティス・ヴェルチシラータの抽出物又はその処理物である、請求項４又は５に記載の組成物。
ヒプティス・ヴェルチシラータのメタノール抽出物をエーテルと水で分配して得られたエーテル層を８５〜９５％メタノール水溶液とヘキサンで分配した場合の前記メタノール水溶液抽出物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより処理して得られる組成物。
シリカゲルカラムクロマトグラフィーの移動相として酢酸エチル／ヘキサン−酢酸エチルを用いた場合の６０％酢酸エチル／ヘキサン溶出画分である、請求項７に記載の組成物。
シリカゲルカラムクロマトグラフィーの移動相として酢酸エチル／ヘキサン−酢酸エチルを用いた場合の４０％〜５０％酢酸エチル／ヘキサン溶出画分である、請求項７に記載の組成物。
請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物、又は請求項４〜９のいずれか１項に記載の組成物を有効成分として含有する抗腫瘍剤。
成人Ｔ細胞白血病治療剤である、請求項１０に記載の抗腫瘍剤。
薬剤耐性を有する患者に投与するための、請求項１０又は１１に記載の抗腫瘍剤。
医薬品である、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の抗腫瘍剤。
食品に添加するための、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の抗腫瘍剤。
ヒプティス・ヴェルチシラータを抽出し、得られた抽出物を精製することを特徴とする、式（Ａ）：

で示される化合物の製造方法。