WO2018066954A1 - 올레아놀린산 아세테이트를 유효성분으로 포함하는 약제에 의해 유발되는 신장독성의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 - Google Patents

올레아놀린산 아세테이트를 유효성분으로 포함하는 약제에 의해 유발되는 신장독성의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 Download PDF

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acceptable salt
pharmaceutically acceptable
acid acetate
anticancer
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노문철
이승웅
이소영
김상현
박권무
이우송
정경숙
박찬선
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한국생명공학연구원
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    • A23V2200/30—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health

Definitions

  • the present invention relates to a composition for preventing, ameliorating or treating nephrotoxicity induced by a medicament, comprising oleanolic acid acetate as an active ingredient.
  • the present invention is a pharmaceutical composition for preventing or treating nephrotoxicity caused by a medicament comprising oleanolinic acid acetate or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient, a kidney induced by a medicament comprising the active ingredient. It relates to a health functional food for preventing or improving toxicity, and an anticancer adjuvant comprising the active ingredient.
  • a method for treating nephrotoxicity caused by a medicament using an oleanoline acetate or a pharmaceutically acceptable salt thereof a method for treating a cancer using an oleanoline acetate or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and a platinum-based anticancer agent , And oleanolinic acid acetate or pharmaceutically acceptable salts thereof.
  • Cisplatin cis-platin, cis-diammine-dichloroplatinum II
  • a representative anticancer agent is one of the platinum-based anticancer agents and is widely used in clinic as a chemotherapeutic agent for the treatment of ovarian cancer, bladder cancer, lung cancer, head and neck cancer and testicular cancer.
  • Cisplatin produces free radicals to attack cancer cells, induces DNA inter-intrastrand cross-linking, and DNA adduct formation, thereby inhibiting DNA replication in cancer cells that have active cell division. Although it is known to have an effect (Boulikas T., Oncology Rep, 10: 1663-1682, 2003), side effects such as bone marrow suppression, gastrointestinal toxicity, neurotoxicity, nephrotoxicity, and hepatotoxicity have been reported. It is recognized as a big problem. Cisplatin is known to be seriously toxic because it is concentrated in the kidney and increases in proportion to the dose (Safirstein R., Am J Kidney Dis 8: 356-367, 1986).
  • the present inventors have made diligent efforts to find a prophylactic or therapeutic agent for nephrotoxicity caused by drugs, especially platinum-based anticancer drugs.
  • oleanolinate acetate is used in animal models in which acute renal failure has been induced by platinum-based anticancer drugs.
  • the invention for the prevention, improvement and treatment of the renal toxicity caused by the drug and the anticancer adjuvant using the same was completed.
  • An object of the present invention is to provide a composition for preventing, improving or treating nephrotoxicity comprising oleanolinic acid acetate.
  • one object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating nephrotoxicity caused by a medicament, comprising oleanolinic acid acetate or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a dietary supplement for preventing or improving nephrotoxicity caused by a medicament, including oleanolinic acid acetate or a food acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • Still another object of the present invention is to provide an anticancer adjuvant for preventing or treating nephrotoxicity caused by an anticancer agent, including oleanolinic acid acetate or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide the use of oleanolinic acid acetate or a pharmaceutically acceptable salt thereof in the manufacture of a medicament for the treatment of nephrotoxicity induced by the medicament.
  • Another object of the present invention also provides the use of said oleanoline acetate or a pharmaceutically acceptable salt thereof for the treatment of nephrotoxicity induced by a medicament.
  • Another object of the present invention is to provide the use of oleanoline acetate or a pharmaceutically acceptable salt thereof in the manufacture of an anticancer adjuvant.
  • Another object of the present invention is to provide the use of oleanolinic acid acetate or a pharmaceutically acceptable salt thereof for an anticancer adjuvant.
  • the present invention comprises as an embodiment an oleanolinic acid acetate or a pharmaceutically acceptable salt thereof as a compound represented by the following formula (1) as an active ingredient, for renal toxicity caused by a drug
  • a prophylactic or therapeutic pharmaceutical composition for renal toxicity caused by a drug
  • oleanolinic acid acetate has an effect of improving nephrotoxicity induced by a drug
  • oleanolinic acid acetate is cisplatin, which is one of platinum-based anticancer agents.
  • BUN levels (FIG. 2D)
  • inflammatory factors (TNF- ⁇ ) in kidney tissues in animal models of acute renal failure , IL-6, COX-2, MCP-1) was confirmed to effectively reduce the amount of expression (Fig. 4a, 4b, 4c, 4d).
  • the oleanolinic acid acetate of the present invention is not only cisplatin but also other platinum-based anticancer agents known to have similar mechanisms of inducing nephrotoxicity such as carboplatin, oxaliplatin, nedaplatin, and also nephrotoxicity. It is believed that the triggering mechanism will have the same effect on similar antibiotics such as aminoglycoside, tetratracycline, sulfa drug, gentamicin and the like.
  • oleanolinic acid acetate has a significantly lower cytotoxicity than oleanolinic acid has no side effects when applied to animals or the human body can be used in a variety of uses for prevention, improvement and treatment for renal toxicity It was.
  • the oleanolic acid acetate of the present invention can be obtained by a commercialized compound or a known method.
  • the present inventors used to separate and purify the oleanolinic acid acetate of the present invention from red soybean. Specifically, the ethanol extract of red beans is fractionated with hexane to obtain a hexane soluble fraction, which is separated by silica gel column chromatography using a mixed solvent of hexane and ethyl acetate, and then recrystallized with methanol, Pure oleanolic acid acetate compound was isolated.
  • the term "renal toxicity induced by a drug” means damage to the kidneys caused by the use of a drug used for the purpose of diagnosis or treatment. Drugs administered can reduce kidney blood flow or inhibit the function of glomeruli and tubules, which can lead to kidney damage, necrosis of the proximal tubules, and severe renal failure.
  • the medicament is included in the scope of the present invention as long as it causes nephrotoxicity, for example, a platinum-based anticancer agent such as cisplatin, carboplatin, oxaliplatin and nedaplatin.
  • antibiotics having similar mechanisms for inducing nephrotoxicity, for example, aminoglycoside, tetracycline, sulfa drug, and gentamicin. Any one or more selected from these may be mentioned.
  • compositions comprising a compound of Formula 1 of the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof may further comprise suitable carriers, excipients or diluents commonly used in the manufacture of pharmaceutical compositions.
  • suitable carriers excipients or diluents commonly used in the manufacture of pharmaceutical compositions.
  • the content of the oleanolinic acid acetate, salts, extracts or fractions thereof contained in the composition is not particularly limited, but is 0.0001 to 10% by weight, preferably 0.001 to 1% by weight based on the total weight of the composition. It can manufacture.
  • the term pharmaceutically acceptable salt means a salt in a form that can be used pharmaceutically among salts in which a cation and an anion are bound by an electrostatic attraction, and generally a metal salt and a salt with an organic base.
  • the metal salt may be an alkali metal salt (sodium salt, potassium salt, etc.), alkaline earth metal salt (calcium salt, magnesium salt, barium salt, etc.), aluminum salt, or the like;
  • Salts with organic bases include triethylamine, pyridine, picoline, 2,6-lutidine, ethanolamine, diethanolamine, triethanolamine, cyclohexylamine, dicyclohexylamine, N, N-dibenzylethylenediamine Salts and the like;
  • Salts with inorganic acids can be salts with hydrochloric acid, hydrobromic acid, nitric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, and the like;
  • Salts with organic acids can be salts with formic acid, acetic acid, trifluoroacetic acid, phthalic acid, fumaric acid, oxalic acid, tartaric acid, maleic acid, citric acid, succinic acid, methanesulfonic acid, benzenesulf
  • compositions comprising a compound of formula (1) of the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof are oral formulations, external preparations, such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, etc. It can be formulated in the form of suppositories and sterile injectable solutions.
  • carriers, excipients and diluents which may be included in the composition comprising red soybean extract and fractions include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, Gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, and such solid preparations include at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose or lactose in the red bean extract and fractions thereof. Mixed with gelatin.
  • excipients such as starch, calcium carbonate, sucrose or lactose in the red bean extract and fractions thereof.
  • lubricants such as magnesium styrate and talc are also used.
  • Liquid preparations for oral use may include various excipients, such as wetting agents, sweeteners, fragrances, preservatives, etc., in addition to water and liquid paraffin, which are commonly used to include suspensions, solutions, emulsions, and syrups. have.
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories.
  • non-aqueous solvent and suspending agent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate and the like can be used.
  • As the base of the suppository witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.
  • the preferred dosage of the pharmaceutical composition of the present invention depends on the condition and weight of the patient, the extent of the disease, the form of the drug, the route of administration and the duration, and may be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the oleanolinic acid acetate, salts, extracts or fractions thereof of the present invention is preferably administered at 0.0001 to 100 mg / kg, preferably 0.001 to 100 mg / kg per day. , May be administered once a day or may be divided several times.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered to mammals such as mice, mice, livestock, humans, etc. by various routes. All modes of administration can be expected, for example, by oral, rectal or intravenous, intramuscular, subcutaneous, intrauterine dural or intracerebroventricular injection.
  • tumor necrosis factor refers to a type of inflammatory cytokine as an abbreviation for tumor necrosis factor.
  • IL-6 refers to a type of inflammatory cytokine as an abbreviation for interleukin-6.
  • COX-2 is the cyclooxygenase-2 refers to the prostaglandin E 2 (prostaglandin E 2, PGE 2) synthesis enzyme as an abbreviation of (Cyclooxygenase-2).
  • MCP-1 refers to a type of inflammatory chemokine as an abbreviation for monocyte chemoattractant protein-1.
  • red cow of the present invention means a seed of the legume (Phaseolus angularis Wight) of the legume, in the form of a columnar shape is a little flat, and the seedling is reddish brown smooth and glossy, pharmacologically active In terms of diuresis, anti-inflammatory, drainage, antipyretic, systemic edema, cirrhosis, jaundice, boils, purulent diseases, edema, keratin, sogal, dysentery and diarrhea.
  • the red beans are used to mean seeds of red beans (Phaseoli angularis Wight) or red beans (or vine red beans, Phaseolus calcaratus Roxburgh), but are not limited thereto.
  • red bean extract refers to an extract obtained by extracting red soybean
  • red soybean extract refers to a ground product of red soybean, water, alcohol having 1 to 6 carbon atoms (methanol, ethanol, butanol, etc.).
  • red soybean extract may be a result obtained by extraction with a mixed solvent thereof, but is not limited thereto, and the result is an extract, a dilution or concentrate of the extract, a dried product obtained by drying the extract, or these modifiers or purified products It includes everything.
  • jeoksodu pulverized dry about 2 to 20 times the weight of water, preferably to a carbon number of 1 (C 1), such as about 3 to 5 times the volume of water up to, methanol, ethanol and butanol
  • C 1 carbon number of 1
  • a polar solvent of 6 (C 6 ) alcohol or a mixed solvent having a mixing ratio of about 1: 0.1 to 1:10 thereof is used as the elution solvent, and the extraction temperature is from 20 to 100 ° C., preferably at room temperature, during the extraction period.
  • the silver may be extracted using extraction methods such as hot water extraction, cold needle extraction, reflux cooling extraction, or ultrasonic extraction for about 12 hours to 4 days, preferably 3 days.
  • the mixture is extracted once or five times by cold extraction and filtered under reduced pressure, and the filtrate is concentrated under reduced pressure at 20 to 100 ° C., preferably at room temperature using a vacuum rotary concentrator, and soluble in water, lower alcohols, or a mixed solvent thereof.
  • One red bean (red bean and red bean) crude extract can be obtained.
  • fraction of the present invention means the result obtained by the fractionation method of separating a specific component or a specific group from a mixture comprising various components.
  • the extract of red soybean may be the result of fractionation by a solvent fractionation method using a solvent such as n-hexane, ethyl acetate, and includes both a polar solvent fraction and a nonpolar solvent fraction, specifically, a hexane fraction, Ethyl acetate fraction and water fraction can all be used.
  • the red soybean crude extract obtained above is suspended in distilled water, and then added with a nonpolar solvent such as hexane and ethyl acetate in a volume of about 1 to 100 times, preferably about 1 to 5 times, the suspension. It can be obtained by extracting and separating the nonpolar solvent soluble layer from 1 to 10 times, preferably 2 to 5 times. It is also possible to further carry out conventional fractionation processes (Harborne J. B. Phytochemical methods: A guide to modern techniques of plant analysis, 3rd Ed. P6-7, 1998).
  • a nonpolar solvent such as hexane and ethyl acetate
  • the soluble extract of each of the small soybean sauce can be obtained by continuous extraction using an equivalent amount of n-hexane and ethyl acetate solvent, more specifically, the red soybean crude extract in water
  • the same amount of n-hexane is mixed and fractioned to obtain n-hexane soluble fraction and water soluble fraction, and ethyl acetate is added to the water soluble fraction to obtain ethyl acetate soluble fraction and water soluble fraction.
  • n-hexane is mixed and fractioned to obtain n-hexane soluble fraction and water soluble fraction
  • ethyl acetate is added to the water soluble fraction to obtain ethyl acetate soluble fraction and water soluble fraction.
  • the present invention comprises a oleanolinic acid acetate or a food-acceptable salt thereof as a compound represented by the formula (1) as an active ingredient, preventing or improving kidney toxicity caused by a medicament Provide dietary supplements for health.
  • the compound of formula 1 of the present invention can be used as a food composition because it is derived from natural products and its safety has been demonstrated.
  • the oleanolic acid acetate or a food acceptable salt thereof may be included in an amount of 0.01 to 100% by weight, more preferably 1 to 80% by weight, based on the total weight of the food composition.
  • the food is a beverage, it may be included in a ratio of 1 to 30 g, preferably 3 to 20 g based on 100 ml.
  • the composition may include additional ingredients that are commonly used in food compositions to improve the smell, taste, time and the like.
  • it may include vitamins A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, niacin, biotin, folate, panthotenic acid, and the like.
  • it may include minerals such as zinc (Zn), iron (Fe), calcium (Ca), chromium (Cr), magnesium (Mg), manganese (Mn), copper (Cu). It may also contain amino acids such as lysine, tryptophan, cysteine, valine and the like.
  • preservatives include potassium sorbate, sodium benzoate, salicylic acid, sodium dihydroacetate, etc.
  • fungicides bleaching powder and highly bleaching powder, sodium hypochlorite, etc.
  • antioxidants butylhydroxyanisol (BHA), butylhydroxytoluene (BHT)
  • Colorants such as tar colors), colorants (such as sodium nitrite, sodium nitrite), bleach (sodium sulfite), seasonings (such as MSG glutamate), sweeteners (ducin, cyclate, saccharin, sodium, etc.),
  • Food additives such as fragrances (vanillin, lactones, etc.), swelling agents (alum, potassium D-tartrate, etc.), reinforcing agents, emulsifiers, thickeners (pigments), coatings, gum herbicides, foam inhibitors, solvents, and improving agents. Can be added.
  • the additive is selected according to the type of food and used in an appropriate amount.
  • the term food-acceptable salt means a salt in a form that can be used in foodstuffs, among salts in which cations and anions are bonded by an electrostatic attraction, and specific examples thereof are described above. Examples of one “pharmaceutically acceptable salt” are included.
  • health food means a food having an active health maintenance or promotion effect compared to the general food
  • health supplement food means a food for health supplement purposes.
  • functional foods, health foods, and health supplements is used in.
  • the foods may be prepared in various forms such as tablets, capsules, powders, granules, liquids, and pills to obtain useful effects.
  • the term "functional food” is the same term as a food for special health use (FOSHU), and in addition to the nutritional supply, the processed food and the medical effect is high so that the bioregulatory function appears efficiently Means food.
  • the dietary supplement comprising the composition is not particularly limited, but preferably margarine, fat continuous or water continuous or bicontinuous spreads, fat reduced spreads, chocolate, or chocolate.
  • Confectionery such as coatings or fillings or bakery, ice cream, ice cream coatings, ice cream ingredients, dressings, mayonnaise, cheese, cream substitutes, dry soups, drinks, cereal bars, sauces, snack bars, dairy products, clinical nutrition, Those manufactured in the form of pediatric foods and the like can be used.
  • an anticancer adjuvant for preventing or treating nephrotoxicity induced by an anticancer agent to provide.
  • the anticancer adjuvant is nephrotoxic by co-administration with existing anticancer agents such as cisplatin, carboplatin, oxaliplatin, nedaplatin, doxorubicin, taxol, tamoxyphene, camptobel, addressyl, gleevec, etoposide, zometa, and silver corbin. It can reduce anticancer efficacy.
  • existing anticancer agents such as cisplatin, carboplatin, oxaliplatin, nedaplatin, doxorubicin, taxol, tamoxyphene, camptobel, addressyl, gleevec, etoposide, zometa, and silver corbin. It can reduce anticancer efficacy.
  • mice exposed to cisplatin body weight and renal organs were reduced to cause kidney toxicity and mortality was 100%, but in the group of cisplatin and oleanolinic acid acetate, mortality was reduced to 44%. It could be confirmed (FIGS. 2A, 2B and 2C).
  • blood BUN levels a blood biochemical indicator of blood content of urea nitrogen, a metabolite of proteolysis, increased significantly due to renal toxicity in the cisplatin group, but decreased in the cisplatin and oleanolinate acetate groups. It was found that oleanolinic acid acetate reduced the increased BUN by cisplatin (FIG. 2D).
  • the cisplatin-administered group significantly increased inflammatory cytokines TNF- ⁇ and IL-6 in blood and renal tissue and significantly increased COX-2 and MCP-1 in renal tissue. It was shown that both the cisplatin and oleanolinate acetate groups decreased, indicating that the oleanolinate acetate effectively suppressed the inflammatory response induced by cisplatin (FIGS. 3A, 3B and 4A, 4B, 4C, and 4D). .
  • the present invention also provides a method of treating nephrotoxicity induced by a medicament by administering to a patient a pharmaceutically effective amount of said oleanolinic acid acetate or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the treatment of renal toxicity refers to a therapeutic action such as reduction and amelioration of damage occurring to the kidneys.
  • the term "effective amount" refers to the amount of oleanolinic acid acetate or a pharmaceutically acceptable salt thereof that exhibits a therapeutically effective effect on nephrotoxicity induced by a medicament.
  • the present invention also provides the use of said oleanoline acetate or a pharmaceutically acceptable salt thereof in the manufacture of a medicament for the treatment of nephrotoxicity induced by the medicament.
  • the present invention also provides a composition comprising said oleanoline acetate or a pharmaceutically acceptable salt thereof for use in the treatment of nephrotoxicity induced by a medicament.
  • the present invention also provides the use of said oleanoline acetate or a pharmaceutically acceptable salt thereof for the treatment of nephrotoxicity induced by a medicament.
  • the present invention also provides a method for treating cancer by administering to the patient a pharmaceutically effective amount of oleanolinic acid acetate or a pharmaceutically acceptable salt thereof as the anticancer adjuvant, and a pharmaceutically effective amount of a platinum-based anticancer agent.
  • oleanolic acid acetate or a pharmaceutically acceptable salt thereof allows to achieve effective treatment of cancer by reducing and improving nephrotoxicity caused by anticancer agents.
  • the present invention also provides the use of said oleanolinic acid acetate or a pharmaceutically acceptable salt thereof in the manufacture of an anticancer adjuvant.
  • the present invention also provides a composition comprising said oleanolinic acid acetate or a pharmaceutically acceptable salt thereof for use as an anticancer adjuvant.
  • the present invention also provides the use of said oleanolinic acid acetate or a pharmaceutically acceptable salt thereof for anticancer adjuvant.
  • the oleanolinic acid acetate of the present invention is derived from natural products, has no side effects and is not cytotoxic, and has an excellent effect of preventing, improving and treating renal toxicity caused by drugs, in particular, platinum-based anticancer agents, and thus the pharmaceutical composition and health functional food thereof. And it can be used in various ways as an anticancer adjuvant.
  • oleanolic acid acetate of the present invention remarkably inhibits BUN levels, blood inflammatory cytokines, and inflammatory cytokine expression in kidney tissues, which are indicators of renal function in animal models in which acute renal failure is induced by platinum-based anticancer drugs. Excellent efficacy in inhibiting the effects of effectively preventing, improving and treating kidney toxicity.
  • FIG. 1 is a comparative evaluation of the cytotoxicity of oleanolinic acid or oleanolinic acid acetate in HEK-293T cells (Figure 1a), celiac macrophages (Figure 1b), spleen cells (Figure 1c) human human kidney cells (Human embryonic kidney cells) It is a graph shown by performing the MTT assay (*: p ⁇ 0.05 significance with the control).
  • FIG. 2A shows the body weight (FIG. 2A), kidney tissue weight (FIG. 2B), mortality rate (FIG. 2C), and blood BUN levels (FIG. 2D) after administration of oleanolinic acid acetate at a concentration of 50 mg / Kg in cisplatin-induced nephrotoxicity animal experiments.
  • * P ⁇ 0.05 significance with control
  • # p ⁇ 0.05 significance with cisplatin only group.
  • Figure 3 is a graph showing the changes in the levels of inflammatory cytokines TNF- ⁇ (Fig. 3a), IL-6 (Fig. 3b) in the blood after administration of oleanoline acetate at a concentration of 50 mg / kg in a cisplatin-induced nephrotoxicity animal experiment (* : p ⁇ 0.05 significance with control, #: p ⁇ 0.05 significance with cisplatin only group).
  • FIG. 4 shows the inflammatory factors TNF- ⁇ (FIG. 4A), IL-6 (FIG. 4B), COX-2 (FIG. 4C) in renal tissue after administration of oleanolinic acid acetate at a concentration of 50 mg / Kg in a cisplatin-induced nephrotoxicity animal experiment.
  • MCP-1 (Fig. 4d) is a graph showing the expression level (*: p ⁇ 0.05 significance with the control, #: p ⁇ 0.05 significance with cisplatin only group).
  • Red bean red bean or red bean
  • Red bean was washed with water, dried in the shade, and then powdered by Waring brand. 20 kg of powdered red beans were put in 100 l of methanol and extracted by cold extraction at room temperature for 3 days, filtered under reduced pressure with a filter paper (Watman, USA), and then the filtrate was extracted by removing the methanol solvent at room temperature with a vacuum rotary concentrator. As a red bean extract 450g was prepared.
  • the red soybean extract was suspended in 1 L of water and mixed by the addition of the same amount of n-hexane, and this process was repeated four times to repeat the process four times. 1 L of water-soluble fraction and n-hexane-soluble fraction. 4 liters were obtained. The n-hexane soluble fraction was then concentrated under reduced pressure to obtain 50 g of n-hexane soluble extract.
  • the obtained ethyl acetate soluble fraction was concentrated under reduced pressure to obtain 35 g of ethyl acetate soluble extract, and the remaining water soluble fraction was concentrated under reduced pressure to obtain 35 g, which was used as a water fraction.
  • HPLC HPLC was used for the Agilent Technologies 1200 series, and the analytical column was used for the Y 'J'sphere ODS-H80 (YMC, 4 ⁇ m, 4.6mm ID x 150mm) column.
  • the analytical solvent was analyzed at 210nm while flowing 1% / min 5% ⁇ 90% CH 3 CN, the sample was injected 10 ⁇ L (Table 1).
  • catechin-7-glucopyranoside catechin-7-glu
  • rutin rutin
  • oleanolic acid acetate AAA
  • stigmasterol stigmasterol
  • Example 1-2 80 g of the n-hexane fraction obtained in Example 1-2 was subjected to silica gel column chromatography using a step gradient solvent system composed of hexane: ethyl acetate (100: 1 to 1: 1).
  • Five active fractions (Fr.1-5) were obtained by the application of chromatography.
  • By re-crystallization by adding methanol to fractions 3 and 4 in the active fraction two compounds showing white powdery phase were purified.
  • HEK-293T cells human embryonic kidney cells, were cultured in Gibco's Dulbecco's modified eagle medium (Cat No. 12800-017) to which 10% FBS inactivated by heat was added.
  • mice 5-6 week old ICR male mice (Oriental Bio, Seoul, Korea) were sacrificed with CO 2 for mouse spleen cell isolation, and then spleens were removed aseptically.
  • the spleen is ground with a filter to separate single splenocytes, and then centrifuged to centrifuge and lyse red blood cells using Ficoll.
  • the cells depleted of red blood cells are stabilized with RPMI (10% FBS, 1% antibiotics) at 37 ° C. for 2 hours.
  • MTT solution can form the formazan (formazan) by mitochondrial dehydrogenases in living cells to determine whether the cells survive.
  • the cells were incubated at 37 ° C. in 96 ⁇ well plates at 5 ⁇ 10 4 cells / well, treated with oleanolinic acid and oleanolinic acid acetate by concentration, and incubated for 24 hours. After 24 hours, 20 ⁇ l of MTT solution was added to each well, followed by further incubation for 2 hours, the culture solution was removed, and 100 ⁇ l of dimethylsulfoxide was added, followed by measurement of absorbance at 570 nm.
  • oleanolinic acid showed cytotoxicity in a concentration-dependent manner, while oleanolinic acid acetate showed cell viability of 81% at the highest concentration of 1000 ⁇ g / ml and showed little cytotoxicity.
  • cell survival rate of 81% at 1000 ⁇ g / ml of oleanolinic acid acetate is about twice the difference of 41% oleanolinic acid cell viability (Fig. 1b).
  • oleanolinic acid acetate caused higher cytotoxicity than oleanolinic acid at all concentrations (100, 300, 600 ⁇ g / ml) to induce less cytotoxicity (FIG. 1C).
  • mice 8-week-old C57BL / 6 male mice (Oriental Bio, Seoul, Korea) weighing 20-25 g were randomly treated with saline solution (Control, CON), oleanolinate acetate (OAA), cisplatin alone (CP), cisplatin And oleanolinic acid acetate combination group (CP + OAA).
  • OAA oleanolinate acetate
  • CP cisplatin alone
  • CP + OAA oleanolinic acid acetate combination group
  • these mice were bred under constant temperature (23 ⁇ 3 ° C.), humidity (55 ⁇ 15%), and dose (7:00 to 19:00). After purchase, the mice were stabilized for 1 week in the SPF zoo, and then used for the experiment.
  • Cisplatin Sigma, St.
  • Body weights were measured after mouse sacrifice, kidneys were isolated, and blood was drawn from the heart to measure blood urea nitrogen (BUN), a biochemical marker related to kidney toxicity.
  • BUN blood urea nitrogen
  • the collected mouse blood was centrifuged at 4 ° C., 3000 rpm for 15 minutes using a centrifuge to separate serum only, and BUN was measured using an automatic analyzer (Fuji Dry-Chem NX500i, Tokyo, Japan). .
  • mice exposed to cisplatin reduced kidney weight and organs, causing kidney toxicity.
  • the cisplatin-administered group had a 100% mortality but cisplatin and oleanolinate acetate.
  • the mortality rate was reduced to 44%.
  • Mortality was expressed as a percentage divided by the number of mice killed in each group.
  • the BUN level is a blood biochemical indicator indicating the blood content of urea nitrogen, a metabolite of proteolysis, and elevated BUN in blood generally indicates the presence of kidney disease. Therefore, the BUN level was significantly increased due to renal toxicity in the cisplatin-administered group, but the increased BUN was decreased in the cisplatin and oleanolic acid acetate combination group.
  • Example 3-3 Inflammatory cytokines in the blood ( TNF - ⁇ , IL-6) measurements
  • Serum was separated from blood to measure inflammatory cytokines (TNF- ⁇ , IL-6) in the blood, and TNF- ⁇ and IL-6 were used in a mouse ELISA kit (R & D system, Minneapolis, MN, USA). And analyzed. ELISA colorimetry was measured using a Varioskan TM LUX multimode microplate reader (Thermofisher, Sunnyvale, CA, USA) at 450 nm wavelength.
  • TNF- ⁇ and IL-6 which are inflammatory cytokines in the blood, were significantly increased in the cisplatin-administered group, but the increased TNF- ⁇ and IL-6 were increased in the cisplatin and oleanoline acetate combination groups. Reducing has the effect of inhibiting the inflammatory response in the blood due to kidney toxicity.
  • Kidneys were isolated after mouse sacrifice and homogenized by addition of Trizol reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Chloroform was added thereto to extract RNA, and isopropanol was added to precipitate. After washing the RNA precipitate with 75% ethanol, the concentration and purity of the RNA were measured by a 2100 Bioanalyzer system (Agilent Technologies, Santa Clara, Calif., USA), and the Taqman reverse transcription reagents kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). CDNA was synthesized using. The expression level of inflammatory factors was measured by real-time PCR using SYBR Green PCR master mix kit (Applied Biosystem, Foster City, CA, USA).
  • oleanolinic acid acetate suppresses the renal toxicity induced by cisplatin and effectively inhibits the expression and secretion of inflammatory factors. Furthermore, oleanolinic acid acetate is significantly lower in cytotoxicity than oleanolinic acid and excellent in inhibiting renal toxicity, and thus has no side effects when applied to animals or humans. It can be confirmed that it can be used in various ways such as nutraceuticals and anticancer drugs.
  • a powder was prepared by mixing 0.1 g of oleanolinic acid acetate, red soybean extract containing the same or a fraction of the extract, 1.5 g of lactose and 0.5 g of talc and filling into an airtight bag.
  • oleanolinic acid acetate 0.1 g of oleanolinic acid acetate, red soybean extract containing the same or a fraction of the extract, 7.9 g of lactose, 1.5 g of crystalline cellulose and 0.5 g of magnesium stearate are mixed, and 50 mg of the active ingredient is obtained by direct tableting method. 500 mg tablets were prepared.
  • Oleanolinic acid acetate, red soybean extract containing the same or fractions of the extract 0.1g, corn starch 5g and 4.9g carboxy cellulose was mixed well to prepare a powder, 500mg of the powder was put in a hard capsule to prepare a capsule.
  • an injection ampoule which contained 0.1 g of oleanolinic acid acetate, red soybean extract or fraction thereof, and an appropriate amount of sterile distilled water for injection and a pH adjuster.
  • oleanolinic acid acetate 0.1 g of oleanolinic acid acetate, red soybean extract containing the same or fractions of the extract, 10 g of isomerized sugar and 5 g of mannitol are dissolved in purified water, and a suitable amount of lemon flavor is added, followed by mixing the above components.
  • purified water was added thereto to adjust the total volume to 100 ml, and the solution was prepared by sterilization by filling in a brown bottle.

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Abstract

본 발명은 올레아놀린산 아세테이트(oleanolic acid acetate)를 유효성분으로 포함하는, 약제에 의해 유발되는 신장독성에 대한 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 올레아놀린산 아세테이트 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 약제에 의해 유발되는 신장독성의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 상기 유효성분을 포함하는 약제에 의해 유발되는 신장독성의 예방 또는 개선용 건강기능식품, 그리고 상기 유효성분을 포함하는 항암 보조제에 관한 것이다. 본 발명의 올레아놀린산 아세테이트는 천연물에서 유래되어 부작용이 없고 세포독성이 없으며, 약제, 특히 백금계 항암제에 의해 유발되는 신장독성을 예방, 개선 및 치료하는 효과가 뛰어나 이에 대한 약학적 조성물, 건강기능식품 및 항암 보조제로 활용될 수 있다.

Description

올레아놀린산 아세테이트를 유효성분으로 포함하는 약제에 의해 유발되는 신장독성의 예방, 개선 또는 치료용 조성물
본 발명은 올레아놀린산 아세테이트(oleanolic acid acetate)를 유효성분으로 포함하는, 약제에 의해 유발되는 신장독성에 대한 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
구체적으로 본 발명은 올레아놀린산 아세테이트 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 약제에 의해 유발되는 신장독성의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 상기 유효성분을 포함하는 약제에 의해 유발되는 신장독성의 예방 또는 개선용 건강기능식품, 그리고 상기 유효성분을 포함하는 항암 보조제에 관한 것이다. 또한, 올레아놀린산 아세테이트 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 이용한 약제에 의해 유발되는 신장독성을 치료하는 방법, 올레아놀린산 아세테이트 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 및 백금계 항암제를 이용한 암을 치료하는 방법, 및 올레아놀린산 아세테이트 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 다양한 용도를 제공한다.
전 세계적으로 암 발생자는 약 1,400만 명이 있으며, 암으로 인한 사망은 약 820만 명에 달하는 것으로 추정된다. 우리나라에서 암은 1983년 이후 사망원인 1위의 질환으로 2013년 전체 사망자 중 28.3%가 암으로 인한 사망인 것으로 나타났다(국립암센터, 우리나라 암발생 현황 2012).
현재 암을 치료하는 방법으로는 수술, 방사선 치료, 유전자 치료 등 여러 방법이 사용되고 있으나, 가장 많이 사용되고 있는 치료방법 중의 하나는 항암제를 투여하는 화학요법이다. 대표적인 항암제인 시스플라틴(Cisplatin, cis-diammine-dichloroplatinum II)은 백금계 항암제의 하나로서 난소암, 방광암, 폐암, 두경부암, 고환암 등의 치료를 위한 화학요법제로 임상에서 널리 사용되고 있다.
시스플라틴은 활성산소종을 생성하여 암세포를 공격하고, 암세포에서 DNA 인터-인트라스트랜드 교차결합(inter-intrastrand cross-linking), DNA 부가체 형성을 유도하여 세포분열이 왕성한 암세포의 DNA 복제를 억제함으로써 항암효과를 나타내는 것으로 알려져 있으나(Boulikas T., Oncology Rep, 10:1663-1682, 2003), 골수억제, 위장관계 독성, 신경독성, 신장독성, 간독성 등의 부작용이 보고되고 있으며, 이중 신장독성이 가장 큰 문제점으로 인식되고 있다. 시스플라틴은 집중적으로 신장에 축적되고, 투여용량에 비례해서 축적량도 증가하기 때문에 독성이 심각해지는 것으로 알려져 있다(Safirstein R., Am J Kidney Dis 8:356-367, 1986).
임상에서 시스플라틴을 투여한 환자의 25-35%에서 신장독성이 유발되는 것으로 나타났기 때문에(Merouani A., Am J Nephrol 17:53-58, 1997) 이러한 독성을 감소시키려는 약리학적 방안들이 연구되고 있다. 또한, 시스플라틴에 의한 신장독성의 병태생리학적 기전을 염증반응의 변화로 해석할 수 있는 실험적 증거가 보고됨으로써, 신장독성 조절과 관련하여 염증관련 인자들에 대한 연구들이 진행되고 있다(Ramesh G., J Clin Invest 110: 835-842, 2002). 뿐만 아니라 항암제에 의한 급성 신부전 독성은 신장세포독소(nephrotoxin)에 의한 독성으로 항생제 사용 시에도 같은 독성이 나타날 수 있다. 따라서 시스플라틴에 의한 신장독성 억제 물질은 항생제에 의한 신장독성에도 효과가 있을 것으로 여겨진다.
이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 약제, 특히 백금계 항암제에 의해 유발되는 신장독성에 대한 예방 또는 치료용 물질을 찾기 위해 예의 노력한 결과, 올레아놀린산 아세테이트가 백금계 항암제에 의해 급성신부전이 유발된 동물모델에서 신장독성을 억제하는 효능이 있음을 확인하고 이를 규명함으로써, 약제에 의해 유발되는 신장독성에 대한 예방, 개선 및 치료용 조성물과 이를 이용한 항암 보조제 발명을 완성하였다.
본 발명은 올레아놀린산 아세테이트를 포함하는 신장독성의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
구체적으로, 본 발명의 하나의 목적은 올레아놀린산 아세테이트 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는, 약제에 의해 유발되는 신장독성에 대한 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 올레아놀린산 아세테이트 또는 이의 식품학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는, 약제에 의해 유발되는 신장독성에 대한 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 올레아놀린산 아세테이트 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는, 항암제에 의해 유발되는 신장독성의 예방 또는 치료용 항암 보조제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 올레아놀린산 아세테이트 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 약제학적으로 유효한 양을 환자에게 투여하여 약제에 의해 유발되는 신장독성을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 약제에 의해 유발되는 신장독성의 치료를 위한 약제의 제조에서 올레아놀린산 아세테이트 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 약제에 의해 유발되는 신장독성의 치료에 사용하기 위한 올레아놀린산 아세테이트 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 또한 약제에 의해 유발되는 신장독성의 치료를 위한 상기 올레아놀린산 아세테이트 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적은 항암보조제로써 올레아놀린산 아세테이트 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 약제학적으로 유효한 양, 및 백금계 항암제의 약제학적으로 유효한 양을 환자에게 투여하여 암을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 항암 보조제의 제조에서 올레아놀린산 아세테이트 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 항암보조제로 사용하기 위한 올레아놀린산 아세테이트 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명은 또 다른 목적은 항암보조제를 위한 올레아놀린산 아세테이트 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 용도를 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 하나의 구현예로서 하기 화학식 1로 표시되는 화합물인 올레아놀린산 아세테이트 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는, 약제에 의해 유발되는 신장독성에 대한 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2017011044-appb-I000001
본 발명자들은 올레아놀린산 아세테이트가 약제에 의해 유발되는 신장독성을 개선시키는 효과가 있음을 최초로 규명하였으며, 특히 구체적으로 본 발명의 일 실시예에 의하면, 올레아놀린산 아세테이트가 백금계 항암제의 하나인 시스플라틴에 의해 급성신부전이 유발된 동물모델에서 신장기능 지표가 되는 BUN 수치(도 2d)와 혈중 염증성 사이토카인 (TNF-α, IL-6) 수치(도 3a, 3b), 신장 조직 내 염증 인자(TNF-α, IL-6, COX-2, MCP-1) 발현량(도 4a, 4b, 4c, 4d)을 효과적으로 감소시키는 것을 확인하였다. 이로써 본 발명의 올레아놀린산 아세테이트가 시스플라틴뿐만 아니라 신장독성을 유발하는 작용 기작이 유사한 것으로 알려진 다른 백금계 항암제, 예컨대 보플라틴(carboplatin), 옥살리플라틴(oxaliplatin), 네다플라틴(nedaplatin), 그리고 역시 신장독성 유발 기작이 유사한 항생제, 예컨대 아미노글리코사이드(aminoglycoside), 테트라사이클린(tetracycline), 설파제(sulfa drug), 젠타마이신(gentamicin) 등에도 모두 동일한 효과를 나타낼 것으로 여겨진다.
또한 본 발명의 일 실시예에서, 올레아놀린산 아세테이트는 올레아놀린산에 비해 세포독성이 현저히 낮아 동물이나 인체에 적용 시 부작용이 없어 신장독성에 대한 예방, 개선 및 치료 용도로 다양하게 활용될 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 올레아놀린산 아세테이트는 상용화된 화합물 또는 공지의 방법에 의해 수득할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 의하면, 본 발명자들은 적소두로부터 본 발명의 올레아놀린산 아세테이트를 분리 정제하여 이용하였다. 구체적으로 적소두의 에탄올 추출물을 헥산으로 분획하여 헥산 가용성 분획물을 수득하고, 이를 헥산과 에틸아세테이트의 혼합용매를 사용하여 실리카겔 칼럼 크로마토그래피로 분리한 다음, 메탄올을 이용하여 재결정을 실시하여, 화학식 1의 순수한 올레아놀린산 아세테이트 화합물을 분리하였다.
화학식 1
Figure PCTKR2017011044-appb-I000002
본 발명의 용어, “약제에 의해 유발되는 신장독성”이란, 진단이나 치료의 목적으로 사용된 약제 사용으로 인해 신장에 발생하는 손상을 의미한다. 투여한 약물들이 신장으로의 혈액 흐름을 감소시키거나 사구체와 세뇨관의 기능을 억제하여 신장의 손상을 발생시킬 수 있으며, 근위세뇨관에 괴사를 유발할 수 있고, 심한 경우 신부전을 유발할 가능성이 있다. 상기 약제는 신장독성을 유발하는 것이라면 어떠한 것이라도 본원 발명의 범주에 포함되며, 예를 들어 백금계 항암제, 예컨대 시스플라틴, 카보플라틴(carboplatin), 옥살리플라틴(oxaliplatin) 및 네다플라틴(nedaplatin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 들 수 있으며, 신장독성 유발 기작이 유사한 항생제, 예를 들어 아미노글리코사이드(aminoglycoside), 테트라사이클린(tetracycline), 설파제(sulfa drug) 및 젠타마이신(gentamicin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 들 수 있다.
본 발명의 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 이때, 상기 조성물에 포함되는 상기 올레아놀린산 아세테이트, 이의 염, 추출물 또는 분획물의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 내지 10 중량%로, 바람직하게는 0.001 내지 1 중량%를 포함하도록 제조할 수 있다.
본 발명의 용어 약학적으로 허용되는 염이란, 양이온과 음이온이 정전기적 인력에 의해 결합하고 있는 물질인 염 중에서도 약제학적으로 사용될 수 있는 형태의 염을 의미하는데, 통상적으로 금속염, 유기 염기와의 염, 무기산과의 염, 유기산과의 염, 염기성 또는 산성 아미노산과의 염 등이 될 수 있다. 예를 들어, 금속염으로는 알칼리 금속염(나트륨염, 칼륨염 등), 알칼리 토금속염(칼슘염, 마그네슘염, 바륨염 등), 알루미늄염 등이 될 수 있고; 유기 염기와의 염으로는 트리에틸아민, 피리딘, 피콜린, 2,6-루티딘, 에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, 시클로헥실아민, 디시클로헥실아민, N,N-디벤질에틸렌디아민 등과의 염이 될 수 있으며; 무기산과의 염으로는 염산, 브롬화수소산, 질산, 황산, 인산 등과의 염이 될 수 있고; 유기산과의 염으로는 포름산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 프탈산, 푸마르산, 옥살산, 타르타르산, 말레인산, 시트르산, 숙신산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산, p-톨루엔술폰산 등과의 염이 될 수 있으며; 염기성 아미노산과의 염으로는 아르기닌, 라이신, 오르니틴 등과의 염이 될 수 있고; 산성 아미노산과의 염으로는 아스파르트산, 글루탐산 등과의 염이 될 수 있다.
본 발명의 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명에서, 적소두 추출물과 분획물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 적소두 추출물과 이의 분획물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 상기 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 보다 효과적인 예방 또는 치료를 위하여, 본 발명의 상기 올레아놀린산 아세테이트, 이의 염, 추출물 또는 분획물은 1일 0.0001 내지 100 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 100 mg/kg으로 투여함이 바람직하고, 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 쥐, 마우스, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 용어, “TNF-α”란 종양괴사인자(tumor necrosis factor)의 약어로서 염증성 사이토카인의 일종을 말한다.
본 발명의 용어, “IL-6”이란 인터루킨-6 (interleukin-6)의 약어로서 염증성 사이토카인의 일종을 말한다.
본 발명의 용어, “COX-2”이란 사이클로옥시게나아제-2 (Cyclooxygenase-2)의 약어로서 프로스타글란딘 E2 (prostaglandin E2, PGE2) 합성 효소를 말한다.
본 발명의 용어, “MCP-1”이란 단구주화성단백질-1 (monocyte chemoattractant protein-1)의 약어로서 염증성 케모카인의 일종을 말한다.
본 발명의 용어 "적소두(赤小豆)"란 콩과의 팥(Phaseolus angularis Wight)의 종자를 의미하는데, 형태적으로는 원주모양으로 조금 납작하고 종피는 적갈색으로 매끈매끈하며 광택이 있으며, 약리활성의 측면에서는 이뇨, 소염, 배농, 해열, 전신부종, 간경화, 황달, 종기, 화농성 질환, 수종, 각기병, 소갈, 이질설사 등의 치료를 위한 민간요법에 사용되어 왔다. 본 발명의 목적상, 상기 적소두는 팥(Phaseoli angularis Wight) 또는 이팥(또는 덩굴팥, Phaseolus calcaratus Roxburgh)의 종자를 의미하는 것으로 사용되지만, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 용어 "적소두 추출물"이란 적소두를 추출하여 수득한 추출물을 의미하는데, 본 발명의 목적상, 적소두 추출물은 적소두의 분쇄물을 물, 탄소수 1 내지 6의 알코올(메탄올, 에탄올, 부탄올 등), 이들의 혼합 용매 등으로 추출하여 수득한 결과물이 될 수 있으나, 이에 제한되지는 않고, 상기 결과물은 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 또는 이들 조정제물 또는 정제물 등을 모두 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 적소두 분쇄물을 건조 중량의 약 2 내지 20배, 바람직하게는 약 3 내지 5배에 달하는 부피의 물, 메탄올, 에탄올 및 부탄올 등과 같은 탄소수 1(C1) 내지 6(C6)의 알콜의 극성 용매 또는 이들의 약 1:0.1 내지 1:10의 혼합비를 갖는 혼합용매를 용출 용매로써 사용하고, 추출 온도는 20 내지 100℃, 바람직하게는 실온에서, 추출 기간은 약 12시간 내지 4일, 바람직하게는 3일 동안 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출 또는 초음파 추출 등의 추출방법을 사용하여 추출할 수 있다. 바람직하게는 냉침추출로 1회 내지 5회 연속 추출하여 감압여과하고, 그 여과추출물을 진공회전농축기로 20 내지 100℃, 바람직하게는 실온에서 감압농축하여 물, 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매에 가용한 적소두(팥 및 이팥) 조추출물을 수득할 수 있다.
본 발명의 용어 "분획물"은 다양한 구성성분을 포함하는 혼합물로부터 특정성분 또는 특정 그룹을 분리하는 분획방법에 의하여 얻어진 결과물을 의미한다. 본 발명에서는 바람직하게는 적소두의 추출물을 n-헥산, 에틸아세테이트 등의 용매를 이용한 용매분획방법으로 분획한 결과물일 수 있으며, 극성 용매 분획물과 비극성 용매 분획물을 모두 포함하며, 구체적으로는 헥산 분획물, 에틸아세테이트 분획물 및 물 분획물 등이 모두 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 수득한 적소두 조추출물을 증류수에 현탁한 후, 현탁액의 약 1 내지 100배, 바람직하게는 약 1 내지 5배 부피의 헥산, 에틸아세테이트와 같은 비극성 용매를 가하여 1회 내지 10회, 바람직하게는 2회 내지 5회에 걸쳐 비극성 용매 가용층을 추출, 분리하여 수득할 수 있다. 또한 추가로 통상의 분획 공정을 수행할 수도 있다(Harborne J.B. Phytochemical methods: A guide to modern techniques of plant analysis, 3rd Ed. p6-7, 1998). 구체적으로, 상기 적소두 조추출물을 물에 현탁한 후, 등량의 n-헥산 및 에틸아세테이트 용매를 이용하여 연속 추출로 적소두 각 용매 가용 추출물을 수득할 수 있고, 더욱 구체적으로는 적소두 조추출물을 물에 현탁한 후, 동량의 n-헥산을 혼합한 후 분획하여 n-헥산 가용성 분획물 및 수가용성 분획물을 수득할 수 있으며, 이 수가용성 분획물에 에틸아세테이트를 가하여 에틸아세테이트 가용성 분획물 및 수가용성 분획물을 수득할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물인 올레아놀린산 아세테이트 또는 이의 식품학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는, 약제에 의해 유발되는 신장독성에 대한 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 화학식 1의 화합물은 천연물로부터 유래되어 그의 안전성이 입증되었으므로 식품 조성물로 사용할 수 있다. 상기 올레아놀린산 아세테이트 또는 이의 식품학적으로 허용되는 염은 식품 조성물의 총 중량에 대하여 0.01 내지 100 중량%, 보다 바람직하게는 1 내지 80 중량%로 포함될 수 있다. 식품이 음료인 경우에는 100㎖를 기준으로 1 내지 30g, 바람직하게는 3 내지 20g의 비율로 포함될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 식품 조성물에 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 추가 성분을 포함할 수 있다. 예들 들어, 비타민 A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, 니아신(niacin), 비오틴(biotin), 폴레이트(folate), 판토텐산(panthotenic acid) 등을 포함할 수 있다. 또한, 아연(Zn), 철(Fe), 칼슘(Ca), 크롬(Cr), 마그네슘(Mg), 망간(Mn), 구리(Cu) 등의 미네랄을 포함할 수 있다. 또한, 라이신, 트립토판, 시스테인, 발린 등의 아미노산을 포함할 수 있다. 또한, 방부제(소르빈산 칼륨, 벤조산나트륨, 살리실산, 디히드로초산나트륨 등), 살균제(표백분과 고도 표백분, 차아염소산나트륨 등), 산화방지제(부틸히드록시아니졸(BHA), 부틸히드록시톨루엔(BHT) 등), 착색제(타르색소 등), 발색제(아질산 나트륨, 아초산 나트륨 등), 표백제(아황산나트륨), 조미료(MSG 글루타민산나트륨 등), 감미료(둘신, 사이클레메이트, 사카린, 나트륨 등), 향료(바닐린, 락톤류 등), 팽창제(명반, D-주석산수소칼륨 등), 강화제, 유화제, 증점제(호료), 피막제, 검기초제, 거품억제제, 용제, 개량제 등의 식품 첨가물(food additives)을 첨가할 수 있다. 상기 첨가물은 식품의 종류에 따라 선별되고 적절한 양으로 사용된다.
본 발명의 용어, 식품학적으로 허용되는 염이란, 양이온과 음이온이 정전기적 인력에 의해 결합하고 있는 물질인 염 중에서도 식품학적으로 사용될 수 있는 형태의 염을 의미하며, 그 종류에 대한 구체적인 예는 상술한 “약학적으로 허용되는 염”의 예를 포함한다.
본 발명에서 용어, 건강식품(health food)"은 일반식품에 비해 적극적인 건강유지나 증진 효과를 가지는 식품을 의미하고, 건강보조식품(health supplement food)는 건강 보조 목적의 식품을 의미한다. 경우에 따라, 기능성식품, 건강식품, 건강보조식품의 용어는 호용된다. 상기 식품은 유용한 효과를 얻기 위하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 다양한 형태로 제조될 수 있다.
본 발명에서 용어, 기능식품(functional food)"은 특정보건용 식품(food for special health use, FoSHU)와 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미한다.
이러한 건강기능식품의 구체적인 예로, 상기 조성물을 이용하여 농산물, 축산물 또는 수산물의 특성을 살려 변형시키는 동시에 저장성을 좋게 한 가공식품을 제조할 수 있다. 상기 조성물을 포함하는 건강기능성 식품은 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 마아가린, 지방 지속성(fat continuous) 또는 물 지속성(water continuous) 또는 양쪽 지속성(bicontinuous) 스프레드, 지방 감소된 스프레드, 초콜렛, 또는 초콜렛 코팅 또는 초콜렛 속(fillings) 또는 베이커리 속과 같은 과자류, 아이스크림, 아이스크림 코팅, 아이스크림 함유물, 드레싱, 마요네즈, 치즈, 크림 대체물, 건조 스프, 드링크, 시리얼 바, 소스, 스낵바, 유제품, 임상 영양식품, 소아용식품 등의 형태로 제조된 것을 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물인 올레아놀린산 아세테이트 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는, 항암제에 의해 유발되는 신장독성의 예방 또는 치료용 항암 보조제를 제공한다.
상기 항암 보조제는 시스플라틴, 카보플라틴, 옥살리플라틴, 네다플라틴, 독소루비신, 탁솔, 탐옥시펜, 캄토벨, 아드루실, 글리벡, 에토포사이드, 조메타, 은코빈 등의 기존 항암제와 병용 투여함으로써 신장독성을 감소시켜 항암 효능을 증진시킬 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 시스플라틴에 노출된 마우스의 경우 체중과 신장 장기가 감소하여 신장독성이 유발되어 사망률이 100%였으나 시스플라틴과 올레아놀린산 아세테이트 병용투여한 군에는 사망률이 44%로 줄어드는 것을 확인할 수 있었다(도 2a, 2b, 2c). 또한, 단백질 분해의 대사산물인 요소질소의 혈중 함량을 나타내는 혈액생화학적 지표인 혈중 BUN 수치가 시스플라틴을 투여한 군에서는 신장 독성으로 인해 크게 증가하였으나 시스플라틴과 올레아놀린산 아세테이트 병용투여한 군에서는 감소하는 것으로 나타나, 올레아놀린산 아세테이트가 시스플라틴에 의해 증가된 BUN을 감소시키는 것을 확인할 수 있었다(도 2d).
또 다른 실시예에서, 시스플라틴을 투여한 군에서는 혈액 내 및 신장 조직 내에서 염증성 사이토카인인 TNF-α 및 IL-6가 크게 증가하였고 신장 조직 내에서 COX-2 및 MCP-1이 크게 증가하였으나, 시스플라틴과 올레아놀린산 아세테이트를 병용 투여한 군에서는 모두 감소하는 것으로 나타나 올레아놀린산 아세테이트가 시스플라틴에 의해 유발된 염증 반응을 효과적으로 억제시키는 것을 확인할 수 있었다(도 3a, 3b 및 도 4a, 4b, 4c, 4d).
본 발명은 또한 상기 올레아놀린산 아세테이트 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 약제학적으로 유효한 양을 환자에게 투여하여 약제에 의해 유발되는 신장독성을 치료하는 방법을 제공한다. 상기 신장 독성의 치료는 신장에 발생하는 손상의 감소, 개선과 같은 치료 작용을 의미한다. 본 발명에서 사용되는 “유효한 양”이라는 용어는 약제에 의해 유발되는 신장독성에 유효한 치료 작용 효과를 나타내는 올레아놀린산 아세테이트 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 양을 나타낸다.
본 발명은 또한 약제에 의해 유발되는 신장독성의 치료를 위한 약제의 제조에서 상기 올레아놀린산 아세테이트 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 약제에 의해 유발되는 신장독성의 치료에 사용하기 위한 상기 올레아놀린산 아세테이트 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 약제에 의해 유발되는 신장독성의 치료를 위한 상기 올레아놀린산 아세테이트 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 항암보조제로써 올레아놀린산 아세테이트 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 약제학적으로 유효한 양, 및 백금계 항암제의 약제학적으로 유효한 양을 환자에게 투여하여 암을 치료하는 방법을 제공한다. 항암보조제로써 올레아놀린산 아세테이트 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 항암제에 의해 유발되는 신장독성을 감소, 개선함으로써 암의 효과적 치료를 달성하게 한다.
본 발명은 또한 항암 보조제의 제조에서 상기 올레아놀린산 아세테이트 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 항암보조제로 사용하기 위한 상기 올레아놀린산 아세테이트 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 항암보조제를 위한 상기 올레아놀린산 아세테이트 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 용도를 제공한다.
본 발명의 용도, 조성물, 치료 방법에서 언급된 사항은 서로 모순되지 않는 한 동일하게 적용된다.
본 발명의 올레아놀린산 아세테이트는 천연물에서 유래되어 부작용이 없고 세포독성이 없으며, 약제, 특히 백금계 항암제에 의해 유발되는 신장독성을 예방, 개선 및 치료하는 효과가 뛰어나 이에 대한 약학적 조성물, 건강기능식품 및 항암 보조제로 다양하게 활용될 수 있다.
보다 구체적으로 본 발명의 올레아놀린산 아세테이트는 백금계 항암제에 의해 급성신부전이 유발된 동물모델에서 신장기능 지표가 되는 BUN 수치와 혈중 염증성 사이토카인 수치, 신장 조직 내 염증 인자 발현량을 현저히 저해시켜 신장독성을 억제하는 효능이 뛰어나 신장독성을 효과적으로 예방, 개선 및 치료하는 효과가 있다.
도 1은 올레아놀린산 또는 올레아놀린산 아세테이트의 세포독성 비교 평가를 인간배아신장세포(Human embryonic kidney cell)인 HEK-293T 세포(도 1a), 복강 대식세포(도 1b), 비장 세포(도 1c)에서 MTT assay를 실시하여 나타낸 그래프이다(*: p<0.05 대조군과의 유의성).
도 2는 시스플라틴 유발 신장독성 동물 실험 시, 올레아놀린산 아세테이트를 50mg/Kg 농도로 투여 후 체중(도 2a), 신장 조직 무게(도 2b), 사망률(도 2c), 혈중 BUN 수치 변화(도 2d)를 나타낸 그래프이다(*: p<0.05 대조군과의 유의성, #: p<0.05 시스플라틴만 처리한 군과의 유의성).
도 3은 시스플라틴 유발 신장독성 동물 실험 시, 올레아놀린산 아세테이트를 50mg/kg 농도로 투여 후 혈중 염증성 사이토카인 TNF-α(도 3a), IL-6(도 3b)의 수치 변화를 나타낸 그래프이다(*: p<0.05 대조군과의 유의성, #: p<0.05 시스플라틴만 처리한 군과의 유의성).
도 4는 시스플라틴 유발 신장독성 동물 실험 시, 올레아놀린산 아세테이트를 50mg/Kg 농도로 투여 후 신장 조직 내 염증 인자 TNF-α(도 4a), IL-6(도 4b), COX-2(도 4c), MCP-1(도 4d)의 발현량을 나타낸 그래프이다(*: p<0.05 대조군과의 유의성, #: p<0.05 시스플라틴만 처리한 군과의 유의성).
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 적소두 에탄올 추출물의 제조 및 화학식 1의 화합물의 분리정제
실시예 1-1: 적소두 추출물의 제조
적소두(팥 또는 이팥)를 물로 깨끗이 세척하여 그늘에서 건조한 후, 와링 브랜드로 분말화시켰다. 분말화된 적소두 20 ㎏을 메탄올 100 ℓ에 넣고 실온에서 3일간 냉침 추출한 후, 여지(와트만사, 미국)로 감압 여과한 다음, 여과 추출물은 진공회전농축기로 실온에서 메탄올 용매를 제거한 후 추출된 잔사로서 적소두 추출물 450g을 제조하였다.
실시예 1-2: 분획물의 제조
상기 제조된 적소두 추출물에서 활성 분획물을 분리하기 위하여, 적소두 추출물을 물 1ℓ에 현탁시키고 동량의 n-헥산을 가하여 혼합하여 분획하고, 이 과정을 4회 반복하여 수가용성 분획물 1ℓ와 n-헥산 가용성 분획물 4ℓ를 수득하였다. 이어, 상기 n-헥산 가용성 분획물을 감압 농축하여 n-헥산 가용 추출물 50g을 수득하였다.
또한, 상기 수가용성 분획물 1ℓ에 동량의 에틸아세테이트를 가하여 혼합하여 분획하고, 이 과정을 3회 반복하여 수가용성 분획물 1ℓ와 에틸아세테이트 가용성 분획물 3ℓ를 다시 수득하였다.
상기 수득한 에틸아세테이트 가용성 분획물을 감압농축하여 에틸아세테이트 가용 추출물 35g을 수득하고, 남은 수가용성 분획물을 감압농축하여 35g을 수득하였으며, 이를 물 분획물로 사용하였다.
실시예 1-3: 적소두 추출물 및 분획물의 HPLC 분석
상기 실시예 1-1 및 1-2에서 수득한 각각의 적소두 추출물 및 분획물을 대상으로 하여 HPLC 분석을 수행하였다.
이때, HPLC는 Agilent Technologies 1200 series를 사용하였고, 분석용 컬럼은 YMC 사의 J'sphere ODS-H80(YMC, 4μm, 4.6mm I.D. x 150mm) 컬럼을 사용하였다. 이때, 분석용매는 5%~90% CH3CN을 1㎖/min 흘려주면서 210nm에서 분석하였고, 시료는 10㎕를 주입하였다(표 1).
[표 1]
Figure PCTKR2017011044-appb-I000003
카테킨-7-글루코피라노시드(catechin-7- glucopyranoside, catechin-7-glu), 루틴(rutin), 올레아놀린산 아세테이트(oleanolic acid acetate, OAA) 및 스티그마스테롤(stigmasterol)의 피크는 각각 5.5, 24.5, 35.5, 35.5 분대에 관찰되었으며, 팥 및 이팥의 HPLC 크로마토그램은 상호 유사한 패턴을 나타냄을 확인할 수 있었다.
실시예 1-4: 유효성분의 정제
상기 실시예 1-2에서 수득한 n-헥산 분획물 80g을 헥산:에틸아세테이트(100:1 → 1:1)로 구성된 단계농도 구배(step gradient) 용매 시스템을 이용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography)에 적용하여 5개의 활성분획(Fr.1-5)을 수득하였다. 상기 활성분획 중에서 3번 및 4번 분획에 메탄올을 가하여 재결정과정을 수행함으로써, 흰색분말상을 나타내는 2종의 화합물을 정제하였다.
상기 정제한 2종의 화합물을 기기분석(1H-, 13C-NMR, MS) 및 문헌 값(Voutquenne L. et al. Phytochemistry 2003, 64, 781-789; Kongduang D. et al. Tetrahedron letters 2008, 49, 4067-4072)에 적용하여, 각각 올레아놀린산 아세테이트(oleanolic acid acetate, 화학식 1) 임을 확인할 수 있었다.
화학식 1: 올레아놀린산 아세테이트
Figure PCTKR2017011044-appb-I000004
4aS,6aR,6aS,6bR,8aR,10S,12aR,14bS-10-hydroxy-2,2,6a,6b,9,9,12a-heptamethyl-1,3,4,5,6,6a,7,8,8a,10,11,12,13,14b-tetradecahydropicene-4a-carboxylic acid acetate
실시예 2: 올레아놀린산과 올레아놀린산 아세테이트의 세포독성 비교평가
올레아놀린산과 올레아놀린산 아세테이트의 세포독성 비교를 위해 인간 신장 세포주와 마우스 복강 대식 세포, 비장 primary 세포를 이용하여 확인하였다.
실시예 2-1: 세포주 배양 및 Primary cell 분리
인간배아신장세포(Human embryonic kidney cell)인 HEK-293T 세포는 열에 의해 불활성화한 10% FBS가 첨가된 Gibco사(미국)의 Dulbecco’s modified eagle medium(Cat No. 12800-017)에서 배양하였다.
마우스 복강 대식세포 분리를 위해 5-6주령 ICR 수컷 마우스(오리엔탈바이오, 서울, 한국)에 3% 티오글리콜산염 배지(thioglycollate medium)를 3 ml 복강 투여하여 3일 후 6~7ml PBS를 복강에 투여하여 복강을 마사지 한 뒤 복강액을 채취한다. 수집한 복강액을 원심분리한 후 RPMI(10% FBS, 1% antibiotics)에 부유시켜 플레이트에 옮긴 뒤 37℃에서 2시간 동안 안정화시킨다.
마우스 비장 세포 분리를 위해 5-6주령 ICR 수컷 마우스(오리엔탈바이오, 서울, 한국)를 CO2로 희생시킨 후, 비장(spleen)을 무균적으로 적출한다. 비장을 여과기로 갈아서 단일 비장세포를 분리한 후 원심분리를 이용하여 원침 시키고 피콜(Ficoll)을 이용하여 적혈구를 용해시킨다. 적혈구가 제거된 세포를 RPMI(10% FBS, 1% antibiotics)로 37℃에서 2시간 동안 안정화시킨다.
실시예 2-2: 세포독성 평가
배양이 끝난 세포의 생존률은 MTT 환원 방법을 이용하여 측정하였다. MTT 용액은 살아있는 세포에서 미토콘드리아의 디하이드로게나아제(dehydrogenases)에 의해서 포르마잔(formazan)을 형성하여 세포의 생존 여부를 확인할 수 있다. 세포독성 확인을 위해 cell을 96 웰 플레이트에 5×104세포/웰로 37℃에서 배양한 후 올레아놀린산과 올레아놀린산 아세테이트를 농도별로 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후 각 웰에 20μl의 MTT 용액을 첨가하고 2시간 동안 추가로 배양한 후 배양액을 제거하고 100μl의 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide)를 첨가한 후 570nm에서 흡광도를 측정하였다.
실시예 2-3: 세포독성 비교 분석
올레아놀린산과 올레아놀린산 아세테이트의 세포독성 비교 평가를 위해 인간 신장 세포주와 복강 대식세포, 비장 세포를 이용하여 MTT assay를 확인하였다. 그 결과, 인간 신장 세포주에서는 농도의존적으로 올레아놀린산보다 올레아놀린산 아세테이트의 세포독성이 적게 나타났고, 최고 농도 1000 μg/ml에서 올레아놀린산은 27% 올레아놀린산 아세테이트는 43% 세포 생존율을 보여 올레아놀린산 아세테이트가 세포독성이 적게 유발하는 것을 확인하였다(도 1a).
마우스 복강에서 채취한 복강 대식세포에서는 올레아놀린산은 농도의존적으로 세포독성을 나타내는 반면, 올레아놀린산 아세테이트는 최고 농도 1000 μg/ml에서도 81%의 세포생존율을 보이며 세포독성을 거의 나타내지 않았다. 또한, 올레아놀린산 아세테이트의 1000 μg/ml에서 81%의 세포생존율은 올레아놀린산 세포생존율이 41%인 것의 두배 정도 차이가 나는 것을 확인하였다(도 1b).
마우스 비장을 적출하여 분리한 비장 세포에서는 모든 농도 (100, 300, 600 μg/ml) 에서 올레아놀린산 보다 올레아놀린산 아세테이트가 세포생존율을 높아 세포독성을 적게 유발하는 것을 확인하였다(도 1c).
실시예 3: 시스플라틴 유발 신장독성 동물모델을 이용한 올레아놀린산 아세테이트의 신장독성 억제 효과
올레아놀린산 아세테이트의 시스플라틴 유발 신장독성의 억제효과를 확인하기 위하여 동물실험을 실시하였다.
실시예 3-1: 시스플라틴으로 신장 독성 유발
체중 20-25g의 8주령 C57BL/6 수컷 마우스(오리엔탈바이오, 서울, 한국)을 구입하여 무작위로 생리식염수 투여군(Control, CON), 올레아놀린산 아세테이트 투여군(OAA), 시스플라틴 단독 투여군(CP), 시스플라틴과 올레아놀린산 아세테이트 병용 투여군(CP+OAA)으로 나누었다. 실험을 위하여 이들 마우스를 일정한 온도(23±3℃), 습도(55±15%) 및 조사량(7:00시부터 19:00시까지) 하에서 사육하였다. 구입 후 마우스를 SPF 동물사육실에서 1주일 동안 안정시킨 후 실험에 사용하였다. 시스플라틴(Sigma, St. Louis, MO, USA)은 생리식염수에 2mg/ml의 농도로 녹인 후 20mg/kg의 용량으로 복강 투여하였고, 올레아놀린산 아세테이트는 증류수에 녹여 50mg/ml의 용량으로 시스플라틴 투여 1시간 전, 투여 후 1일, 3일, 5일에 경구 투여하였다. 모든 군의 마우스는 시스플라틴 투여 후 5일째에 마우스를 희생시켰다.
실시예 3-2: 체중, 신장 장기무게, 사망률 모니터링 및 BUN 분석
마우스 희생 후 체중을 측정하고, 신장을 분리하였으며 심장에서는 혈액을 채취하여 신장 독성과 관련된 생화학적 지표인 혈중 요소 농도(blood urea nitrogen, BUN)를 측정하였다. 채취한 마우스 혈액은 원심분리기를 이용하여 4℃, 3000rpm, 15분간 원심분리하여 혈청만을 분리한 후 자동분석장치(automatic analyzer)(Fuji Dry-Chem NX500i, Tokyo, Japan)를 이용하여 BUN을 측정하였다.
도 2a 및 도 2b에서 나타난 바와 같이 시스플라틴에 노출된 마우스의 경우 체중과 신장 장기가 감소하여 신장독성이 유발됨을 확인하였고, 도 2c에서 보듯이 시스플라틴 투여 군은 사망률이 100%였으나 시스플라틴과 올레아놀린산 아세테이트 병용투여 군에는 사망률이 44%로 줄어드는 것을 확인할 수 있었다. 사망률은 각 군에서 사망한 마우스 마리수를 전체 마우스의 마리수로 나누어 백분율로 나타내었다.
도 2d에서 나타난 바와 같이 BUN 수치는 단백질 분해의 대사산물인 요소질소의 혈중 함량을 나타내는 혈액생화학적 지표로, 혈중 BUN 상승은 일반적으로 신장 질환의 존재를 의미한다. 따라서, 시스플라틴을 투여한 군에서는 신장 독성으로 인해 BUN 수치가 크게 증가하였으나, 시스플라틴과 올레아놀린산 아세테이트 병용투여한 군에서는 증가된 BUN을 감소시키는 것을 확인하였다.
실시예 3-3: 혈액 내 염증성 사이토카인( TNF -α, IL-6) 측정
혈액 내 염증성 사이토카인(TNF-α, IL-6)을 측정하기 위해 혈액에서 혈청을 분리하여 사용하였고, TNF-α, IL-6는 마우스 ELISA 키트(R&D system, Minneapolis, MN, USA)를 이용하여 분석하였다. ELISA 발색정도는 450nm 파장에서 VarioskanTM LUX 멀티모드 마이크로플레이트 리더(Thermofisher, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 측정하였다.
도 3a 및 도 3b에서 나타난 바와 같이 혈액 내 염증성 사이토카인인 TNF-α과 IL-6는 시스플라틴 투여군에서 크게 증가하였으나, 시스플라틴과 올레아놀린산 아세테이트 병용투여한 군에서는 증가된 TNF-α과 IL-6을 감소시키는 것은 신장 독성에 의한 혈액 내 염증반응을 억제시키는 효과를 나타내는 것이다.
실시예 3-4: 신장 조직 내 염증 인자(TNF-α, IL-6, COX-2, MCP-1)의 발현량 분석
마우스 희생 후 신장을 분리하여 Trizol reagent(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 첨가하여 균질화하였다. 여기에 클로로폼을 첨가하여 RNA를 추출하고, 이소프로판올을 첨가하여 침전시켰다. RNA 침전물을 75% 에탄올로 세척한 후 RNA의 농도와 순도는 2100 Bioanalyzer system(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)으로 측정하였고, Taqman reverse transcription reagents kit(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 염증성인자의 발현 정도는 SYBR Green PCR master mix kit(Applied Biosystem, Foster City, CA, USA)를 사용해 Real-time PCR을 통해 측정하였다.
염증성 사이토카인인 TNF-α과 IL-6, 염증 반응의 혈관투과성 증가에 관여하는 프로스타글란딘 E2(PGE2) 합성 효소인 COX-2, 염증성 케모카인인 MCP-1의 발현량을 확인하기 위해 각 유전자의 Real-time PCR 실시하여 도 4a 도 4d에 그래프로 나타내었다. 도 4a 도 4d에서 보듯이, 시스플라틴 투여군에서 TNF-α, IL-6, COX-2, MCP-1 mRNA 발현량이 크게 증가하였으나, 시스플라틴과 올레아놀린산 아세테이트 병용투여한 군에서는 증가된 mRNA 발현량을 감소시키는 것은 신장 독성에 의한 염증반응을 억제시키는 효과를 나타내는 것이다.
이상의 결과들을 종합해보면, 올레아놀린산 아세테이트는 시스플라틴에 의해 유발된 신장 독성을 억제시키고, 염증성 인자들의 발현 및 분비를 효과적으로 억제 한다는 사실을 확인할 수 있다. 나아가, 올레아놀린산 아세테이트는 올레아놀린산 보다 세포독성은 현저히 낮으면서도 신장독성을 억제하는 효과가 뛰어나, 동물이나 인체에 적용 시 부작용이 없으면서 신장독성에 대한 예방, 개선 및 치료 효과가 우수한 약학적 조성물, 건강기능식품, 항암제 등으로 다양하게 활용될 수 있음을 확인할 수 있다.
제제예 1: 산제의 제조
올레아놀린산 아세테이트, 이를 포함하는 적소두 추출물 또는 상기 추출물의 분획물 0.1g, 유당 1.5g 및 탈크 0.5g를 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
제제예 2: 정제의 제조
올레아놀린산 아세테이트, 이를 포함하는 적소두 추출물 또는 상기 추출물의 분획물 0.1g, 락토스 7.9g, 결정성 셀룰로오스 1.5g 및 마그네슘 스테아레이트 0.5g을 혼합하고, 직타법(direct tableting method)에 의해 유효성분을 50 ㎎으로 포함하는 500 ㎎짜리 정제를 제조하였다.
제제예 3: 분말제의 제조
올레아놀린산 아세테이트, 이를 포함하는 적소두 추출물 또는 상기 추출물의 분획물 0.1g, 옥수수전분 5g 및 카르복시 셀룰로오스 4.9g을 잘 혼합하여 분말을 제조하고, 경질 캡슐에 상기 분말 500 ㎎을 넣어 캡슐제를 제조하였다.
제제예 4: 주사제의 제조
통상적인 주사제의 제조방법에 따라, 올레아놀린산 아세테이트, 이를 포함하는 적소두 추출물 또는 상기 추출물의 분획물 0.1g과 적량의 주사용 멸균 증류수 및 pH 조절제를 포함하는 2㎖ 용량의 주사용 앰플을 제조하였다.
제제예 5: 액제의 제조
통상적인 액제의 제조방법에 따라, 정제수에 올레아놀린산 아세테이트, 이를 포함하는 적소두 추출물 또는 상기 추출물의 분획물 0.1g, 이성화당 10g 및 만니톨 5g을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조하였다.

Claims (18)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는, 약제에 의해 유발되는 신장독성에 대한 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2017011044-appb-I000005
  2. 제1항에 있어서,
    상기 신장독성을 유발하는 약제는 시스플라틴(cisplatin), 카보플라틴(carboplatin), 옥살리플라틴(oxaliplatin) 및 네다플라틴(nedaplatin)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 백금계 항암제; 또는 항생제인 것인 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 것인 약학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은 신장조직 내의 염증인자 발현 저해활성을 갖는 것인 약학적 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 염증인자는 TNF-α, IL-6, COX-2 및 MCP-1로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상인 것인 약학적 조성물.
  6. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 식품학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는, 약제에 의해 유발되는 신장독성에 대한 예방 또는 개선용 건강기능식품.
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2017011044-appb-I000006
  7. 제6항에 있어서,
    상기 신장독성을 유발하는 약제는 시스플라틴(cisplatin), 카보플라틴(carboplatin), 옥살리플라틴(oxaliplatin) 및 네다플라틴(nedaplatin)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 백금계 항암제; 또는 항생제인 것인 건강기능식품.
  8. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는, 항암제에 의해 유발되는 신장독성의 예방 또는 치료용 항암 보조제.
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2017011044-appb-I000007
  9. 제8항에 있어서,
    상기 항암 보조제는 시스플라틴(cisplatin), 카보플라틴(carboplatin), 옥살리플라틴(oxaliplatin) 및 네다플라틴(nedaplatin)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 백금계 항암제와 병용 투여되는 것인 항암 보조제.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 항암 보조제는 신장조직 내의 염증인자 발현 저해활성을 갖는 것인 항암 보조제.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 염증인자는 TNF-α, IL-6, COX-2 및 MCP-1로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상인 것인 항암 보조제.
  12. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 약제학적으로 유효한 양을 환자에게 투여하여 약제에 의해 유발되는 신장독성을 치료하는 방법.
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2017011044-appb-I000008
  13. 약제에 의해 유발되는 신장독성의 치료를 위한 약제의 제조에서 하기 화학식 1로 표시되는 올레아놀린산 아세테이트 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 용도.
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2017011044-appb-I000009
  14. 약제에 의해 유발되는 신장독성의 치료에 사용하기 위한 하기 화학식 1로 표시되는 올레아놀린산 아세테이트 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 조성물.
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2017011044-appb-I000010
  15. 항암보조제로써 하기 화학식 1로 표시되는 올레아놀린산 아세테이트 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 약제학적으로 유효한 양, 및 백금계 항암제의 약제학적으로 유효한 양을 환자에게 투여하여 암을 치료하는 방법.
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2017011044-appb-I000011
  16. 제15항에 있어서, 상기 백금계 항암제는 시스플라틴(cisplatin), 카보플라틴(carboplatin), 옥살리플라틴(oxaliplatin) 및 네다플라틴(nedaplatin)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 백금계 항암제인 암을 치료하는 방법.
  17. 항암 보조제의 제조에서 하기 화학식 1로 표시되는 올레아놀린산 아세테이트 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 용도.
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2017011044-appb-I000012
  18. 항암보조제로 사용하기 위한 하기 화학식 1로 표시되는 올레아놀린산 아세테이트 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 조성물.
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2017011044-appb-I000013
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