CN108714148A - Arteannuin B抑制EMT介导肝癌转移及其作用机制研究 - Google Patents

Abstract

本发明中Arteannuin B是从传统中草药黄花蒿中分离的青蒿素衍生物。本发明公开了Arteannuin B在制备抗肝癌细胞转移候选药物中的应用。本发明重要之处是发现Arteannuin B能抑制EMT介导肝癌转移的作用。具体包括Arteannuin B对人肝癌HepG2细胞具有明显增殖抑制作用，在非毒性剂量40μM(IC₅₀＝55.84±4.69μM)下可阻滞TGF‑β1诱导HepG2细胞发生上皮间质转化(epithelial‑mesenchymal transition，EMT)；划痕实验和Transwell迁移实验结果表明：Arteannuin B明显抑制TGF‑β1诱导HepG2细胞迁移作用，并具有良好浓度依赖性；作用机制研究表明：Arteannuin B可能通过抑制Smad通路的p‑Smad2、p‑Smad3以及p‑STAT3、Twist1的表达阻滞TGF‑β1诱导HepG2细胞发生EMT。体内实验发现Arteannuin B对小鼠肺转移模型具有良好的治疗作用。因此，Arteannuin B可作为抑制人肝癌细胞转移候选药物进行研究和开发。

Description

Arteannuin B抑制EMT介导肝癌转移及其作用机制研究

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及Arteannuin B抑制EMT介导肝癌转移及其作用机制。

背景技术

根据GLOBOCAN调查显示，2012年肝癌为782451例，占同期世界癌症发病总数的5.6％，占当年中国癌症发病总数的12.9％。世界标化发病率(ASR-W)为10.1/10万，约83％的肝癌发生于欠发达地区，其中50％发生于中国。我国2000年至2011年的癌症统计数据显示，肝癌的发病率在所有癌症中居于第五或第六位，男性高于女性。此外，肝癌在男性癌症致死率排第二位仅次子肺癌，女性中居第二或第三。

多种致病因素可导致肝癌，感染慢性乙肝或丙肝病毒、酗酒、非酒精性脂肪肝以及一些代谢病如糖尿病等都是罹患肝癌的风险因素。另外，尚有研究提示肝癌的发病率与慢性炎症和肝硬化高度相关。肝癌的高发病率和高死亡率极大地影响了我国居民的身体健康和生活水平。

临床上对肝癌患者的治疗方法有多种，以手术切除、肝移植、局部消融等直接消灭肿瘤为主要方法，其中最常用的是手术治疗。尽管消灭肿瘤是最快捷的治疗肝癌的手段，但其仍具有一定局限性，如大多数患者伴有肝硬化和或肝功能低下，肿瘤的大小等实际情况并非所有肝癌患者均可接受手术治疗；另外，即使接受了手术治疗的患者，术后的五年生存率仍然很低。肝癌的复发与患者的肝功能情况密切相关，恶性肝癌侵袭性的肝内蔓延和肝外转移也是影响患者术后状况的主要原因。因此，开发高效低毒的新型抗肝癌转移药物显得至关重要。

肿瘤从原发部位向远处转移的过程很复杂，在原位肿瘤开始向远处转移的初始阶段，上皮间质转化(epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)扮演了一个至关重要的角色。多种细胞外信号的相互作用能够导致肝癌细胞EMT的发生，从而增强其迁移能力。

菊科蒿属植物黄花蒿(Artemisia annua L.)，又称青蒿、臭蒿，它作为一种传统中药有清热解毒、除蒸抗疟的功效。性寒，味苦、辛，用于夜热早凉、阴虚发热、暑邪发热、疟疾寒热、湿热黄疸等症，外用可治疗蚊虫咬伤、烫伤、疮肿等。屠呦呦等中国学者受东晋葛洪所著《肘后备急方》启发从黄花蒿中分离得到的青蒿素是最主要的抗疟活性成分。原植物中的化学成分包括青蒿酸、青蒿醚类、青蒿醇等。现代药理研究发现在黄花蒿的多种青蒿素衍生物中主要是倍半萜类化合物具有抗肿瘤、抗病毒和免疫调节等药理活性。

Arteannuin B具有毒性较低的特点并显示出良好的抗肿瘤活性。经文献调研未见Arteannuin B的抗肿瘤迁移作用的研究报道，故本发明首次发现其具有作为抗肿瘤候选药物开发的潜在价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种青蒿素衍生物治疗肿瘤候选药物Arteannuin B在制备抗肿瘤转移中的应用。

本发明是通过如下技术方案实现的：通过形态学观察、Western blotting法构建HepG2细胞的EMT模型；采用MTT、划痕实验、Transwell迁移实验、克隆形成实验等研究Arteannuin B对EMT介导HepG2细胞迁移的抑制作用；采用Western blotting法研究Arteannuin B对HepG2细胞Smad信号通路以及P-STAT3、Twist1的影响，探究其作用机制。构建鼠源H₂₂细胞模型考察Arteannuin B的体内抗肝癌转移的作用。

本发明的突出贡献在于：

(1)首次发现了Arteannuin B对TGF-β1诱导的肝癌HepG2细胞上皮间质转化具有抑制作用，且呈良好的浓度依赖性。

(2)Arteannuin B可能通过抑制p-Smad2、p-Smad3的表达抑制Smad通路以及抑制p-STAT3和Twist1的表达发挥，从而对TGF-β1诱导的HepG2上皮间质转化的抑制作用。

(3)首次通过H₂₂小鼠转移模型，发现Arteannuin B具有体内抗鼠源肝癌H₂₂转移的作用；体外检测Arteannuin B对TGF-β1诱导的H₂₂细胞的EMT相关蛋白表达的影响。结果表明Arteannuin B可能通过抑制H₂₂发生EMT作用来抑制其肺部转移。

本发明为研制新的抗肿瘤转移候选药物提供了科学依据，对开发中药新药具有重要意义。

附图说明

图1为实施例1中TGF-β1诱导HepG2细胞从上皮形态转化成间质细胞形态。

图2为实施例1中TGF-β1作用48h对HepG2细胞内的EMT相关表型蛋白的影响。

图3为实施例2中检测Arteannuin B对HepG2细胞的增殖抑制作用。

图4为实施例3中Arteannuin B阻滞TGF-β1诱导HepG2细胞从上皮形态转化成间质形态。

图5为实施例3中Arteannuin B阻滞TGF-β1诱导HepG2细胞发生EMT作用对表型蛋白的影响。

图6为实施例3中划痕实验检测Arteannuin B对EMT作用介导HepG2细胞迁移的抑制作用。

图7为实施例3中Transwell小室实验检测Arteannuin B对EMT作用介导HepG2细胞迁移的抑制作用。

图8为实施例4中Western blot检测Arteannuin B对Smad信号通路蛋白的影响。

图9为实施例4Western blot检测Arteannuin B对p-STAT3、Twist1的影响。

图10为实施例5中各组小鼠肺部转移灶数目平均值统计。

图11为实施例5中各组小鼠肺转移灶的HE染色病理形态学观察。

图12为实施例5中各体重的组小鼠变化。

图13为实施例5中各组小鼠的肝脏指数。

图14为实施例5中各组小鼠的脾脏指数。

图15为实施例5中各组小鼠的胸腺指数。

图16为实施例5中HE染色研究Arteannuin B对昆明小鼠肝、脑的影响。

图17为实施例5中Arteannuin B阻滞TGF-β1诱导H₂₂细胞发生EMT对表型蛋白的影响。

具体实施方式：

下面结合技术方案和图表详细说明本发明的具体实施例。

以下实验所用的Arteannuin B是由暨南大学中药生物技术研究所提供。

实施例1：TGF-β1诱导HepG2细胞发生上皮-间质转化

①TGF-β1诱导HepG2细胞从上皮形态转化成间质细胞形态：

1)HepG2细胞用高糖DMEM培养基(含100U/mL青霉素、0.1mg/mL链霉素和10％胎牛血清)置于细胞培养箱中(37℃、5％CO₂)静置培养。六孔板每孔铺上约占孔底面积20％的HepG2细胞。过夜贴壁后在实验前6h更换新鲜的无血清培养基，使细胞获得同步化生长。然后，六孔板每孔依次设置为NC、0.625ng/mL TGF-β1、1.25ng/mL TGF-β1、2.5ng/mL TGF-β1、5ng/mL TGF-β1。将板置于细胞培养箱中(37℃、5％CO₂)培养。

2)在倒置相差显微镜下每隔24h观察细胞的形态变化并拍照。

②Western blotting法检测TGF-β1作用48h后HepG2细胞内EMT相关蛋白表达：

1)HepG2细胞用高糖DMEM培养基(含100U/mL青霉素、0.1mg/mL链霉素和10％胎牛血清)置于细胞培养箱中(37℃、5％CO₂)静置培养。六孔板的每孔铺上50％的HepG2细胞。过夜贴壁后在实验前6h更换新鲜的无血清培养基，使细胞获得同步化生长。然后，六孔板每孔依次设置为NC、0.625ng/mL TGF-β1、1.25ng/mL TGF-β1、2.5ng/mL TGF-β1、5ng/mLTGF-β1。将板置于细胞培养箱中(37℃、5％CO₂)培养。

2)各组总蛋白的提取：弃去上清液，PBS清洗细胞一次。每孔加100μL配制好的SDS细胞裂解液，冰浴条件裂解10min。裂解完毕后，超声3次，每次5s，于4℃环境中14000rpm离心10min，取上清，得总蛋白。

3)蛋白浓度测定：使用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，根据标准曲线计算各样品中总蛋白含量，用SDS细胞裂解液将各样蛋白浓度调成一致，加入5×buffer后混匀，于100℃水中煮沸变性10min，-20℃环境保存备用。

4)SDS-PAGE电泳：

a.SDS-PAGE凝胶配制：按表1.1配方配制分离胶(10-15％)，按表1.2配方配制浓缩胶：

表1.1 SDS-PAGE分离胶配方(10mL)

表1.2 SDS-PAGE浓缩胶配方(4mL)

b.上样、电泳：每个上样孔道中加入10μL蛋白样品，最右端孔道加入5μL Marker。上样后，打开电源，将电压调为60V进行恒压电泳，30min后蛋白样品跑至浓缩胶到分离胶的分界线，此时调整电压到110V恒压继续电泳。待电泳完毕，关闭电源，取出凝胶。

5)转膜：根据待检测目的蛋白的分子量，切下相应位置的胶条，将其泡于转膜液中暂存。剪下与胶条大小一致的PVDF膜，泡在甲醇中活化3s。以阴极-海绵-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-海绵-阳极的顺序制备“三明治”，将其置于转膜仪中，在冰浴环境下恒流200mA进行转膜。根据所需检测目的蛋白的分子量调整转膜时间。

6)封闭：结束转膜，取出PVDF膜，将其置于封闭液中，室温水平摇床缓慢封闭2h。

7)孵育一抗：封闭后，按各目的蛋白的一抗∶5％的BSA＝1∶1000稀释一抗。将转上目的蛋白的PVDF膜泡在稀释好的一抗中封入封膜袋中，封口后4℃孵育过夜。

8)孵育二抗：一抗孵育完毕后，回收一抗，将PVDF膜取出用1×TBST溶液于摇床上迅速摇晃洗涤3次，每次9min。洗膜完毕后，将PVDF膜泡于稀释好的二抗(用5％BSA稀释2000倍)封入封膜袋中并封口，室温条件下于水平摇床上缓慢孵育2h。孵育完毕，回收二抗，将PVDF膜取出用1×TBST溶液于摇床上迅速摇晃洗涤3次，每次9min。

9)显影：避光条件下，将PVDF膜置于暗盒中，ECL发光液中的A液和B液按1∶1混合均匀滴加在PVDF膜上，避光反应2min，进入暗房显影。

上述实验重复三次。

形态观察结果：作用48h后，随着TGF-β1浓度的增高，细胞的形态较NC组差异变大，细胞与细胞间的间隙也变大。当TGF-β1的浓度为5ng/mL时，作用48h的HepG2细胞随着TGF-β1浓度的增高，与NC组的相比差异越来越大，尤其是TGF-β1高浓度组的细胞。具体表现在细胞间隙明显变大且获得了纺锤状的成纤维细胞样的间质表型(红色箭头所指的部分)。说明TGF-β1能够诱导人肝癌HepG2细胞从形态上发生EMT(图1)。

Western blotting结果：诱导48h后与NC组比较发现：随着TGF-β1浓度的升高E-Cadherin的表达呈下调趋势，在5ng/mL TGF-β1组的HepG2细胞E-Cadherin蛋白表达水平最低；而N-Cadherin表达呈上调趋势，5ng/mL TGF-β1组的HepG2细胞N-Cadherin蛋白表达水平最高，说明在该浓度和作用时间下的HepG2发生EMT作用最为明显，此与形态学观察结果一致(图2)。

实施例2：Arteannuin B对HepG2细胞的增殖抑制作用

MTT实验：

1)制备细胞悬液：弃旧培养基，PBS洗一遍后加1mL 0.25％的胰酶消化3min，显微镜下观察大部分细胞变圆时，弃胰酶，加2倍所加胰酶量的完全培养基终止消化，将瓶内细胞轻轻吹下并转移到15mL离心管中，1000rpm离心5min。

2)弃上清，加入新鲜培养基，1/3的细胞悬液留种，其余备用。

3)细胞计数和铺板：细胞悬液吹打混匀后，吸取10μL加入血球计数板在显微镜下计数，调整细胞悬液浓度为3×10⁴cells/mL。向96孔板的每孔加入100μL浓度调整过的细胞悬液，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养，使其过夜贴壁。

4)加药：弃去旧培养基，加入用DMEM完全培养基稀释过的200μL YA-2样品溶液。浓度依次为100、50、25、12.5、6.25、0μM，每个浓度设置4个复孔。阴性对照组加等量的完全培养基，调零孔加200μL PBS。放入培养箱分别培养24、48和72h。

5)测定吸光度：待药物作用到相应时间点后，从细胞培养箱中取出，96孔板每孔加入20μL MTT(5mg/mL)溶液，再放入细胞培养箱中继续培养4h。然后，轻轻除去上清，再加入200μL DMSO/孔，于室温避光震荡10min，置多功能酶标仪中，在570nm处检测吸光度值A。

6)数据统计：按照下列公式求取细胞存活率

细胞存活率(Viability％)＝(加药组A570nm-调零孔A570nm)/(阴性对照组A570nm-调零孔A570nm)×100％

实验重复三次，并分别计算Arteannuin B对HepG2细胞作用24、48和72h的半数抑制浓度IC₅₀。

结果显示：分别作用24、48、72h后，Arteannuin B能够剂量依赖和时间依赖性抑制HepG2细胞的增殖。表3.1给出了不同作用时间的IC₅₀值。由表可见：Arteannuin B作用48h时间内，给予Arteannuin B样品浓度50μM时，HepG2细胞的存活率仍保持在60％以上；作用48h的IC₅₀值为55.84±4.69μM。根据MTT结果确定Arteannuin B对HepG2细胞的非毒性剂量来进行后续的实验即Arteannuin B对HepG2的最大给药浓度为40μM。顺铂(Cis)作为阳性对照药(图3)。

实施例3：Arteannuin B对EMT介导HepG2细胞的迁移的抑制作用

1、Arteannuin B阻滞TGF-β1诱导HepG2细胞从上皮形态转化成间质细胞的形态学观察：

1)HepG2细胞用高糖DMEM培养基(含100U/mL青霉素、60U/mL链霉素和10％胎牛血清)置于细胞培养箱中(37℃、5％CO₂)静置培养。六孔板每孔铺上约占孔底面积50％的HepG2细胞。过夜贴壁后在实验前6h更换新鲜的无血清培养基。

2)在细胞获得同步化生长后，将六孔板的六孔细胞分别加入2mL终浓度为5ng/mLTGF-β1的DMEM培养基(T组)、2mL Arteannuin B为10μM的含TGF-β1 5ng/mL的DMEM培养基、2mL Arteannuin B为20μM的含TGF-β1 5ng/mL的DMEM培养基、2mL Arteannuin B为40μM的含TGF-β1 5ng/mL的DMEM培养基、2mL不加因素的DMEM培养基(NC组)。在倒置相差显微镜下定时观察细胞的形态变化且每隔24h进行一次拍照。

2、Western blotting法检测TGF-β1作用48h后HepG2细胞内EMT相关蛋白的表达：

1)HepG2细胞用高糖DMEM培养基(含100U/mL青霉素、0.1mg/mL链霉素和10％胎牛血清)置于细胞培养箱中(37℃、5％CO₂)静置培养。六孔板每孔铺上约占孔底面积1/5的HepG2细胞。过夜贴壁后在实验前6h更换新鲜的无血清培养基。

2)在细胞获得同步化生长后，将六孔板的六孔细胞分别加入2mL终浓度为5ng/mLTGF-β1的DMEM培养基(T组)、2mL Arteannuin B为10μM的含TGF-β1 5ng/mL的DMEM培养基、2mL Arteannuin B为20μM的含TGF-β1 5ng/mL的DMEM培养基、2mL Arteannuin B为40μM的含TGF-β1 5ng/mL的DMEM培养基、2mL不加因素的DMEM培养基(NC组)。将板置于细胞培养箱中(37℃、5％CO₂)培养。

3)48h后提取各组总蛋白：弃去上清液，PBS清洗细胞两次。六孔板的每孔加100μL配制好的SDS细胞裂解液，于冰上裂解5min。裂解时缓慢摇晃六孔板使裂解液与细胞充分接触，裂解完毕后，超声3次，每次5s，4℃环境14000rpm离心10min，取上清，即得总蛋白。

4)蛋白浓度测定：按BCA蛋白定量试剂盒所示操作步骤测定各样品蛋白浓度，并用细胞裂解液将其浓度调成一致，加入相应量的5×buffer混匀后于100℃水浴变性10min，室温冷却后，于-20℃环境保存。

5)SDS-PAGE凝胶电泳：

a.SDS-PAGE凝胶配制：按表2.1配方制备分离胶(10-15％)，表2.2配方制备浓缩胶。

b.上样、电泳：每个上样孔道中加入10μL蛋白样品，最右端孔道加入5μL Marker。上样后，打开电源，将电压调为60V进行恒压电泳，30min后蛋白样品跑至浓缩胶到分离胶的分界线，此时调整电压到110V恒压继续电泳。待电泳完毕，关闭电源，取出凝胶。

6)转膜：根据待检测目的蛋白的分子量，切下相应位置的胶条，将其泡于转膜液中暂存。剪下与胶条大小一致的PVDF膜，泡在甲醇中活化3s以上。以阴极-海绵-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-海绵-阳极的顺序制备“三明治”，将其置于转膜仪中，在冰浴环境下恒流200mA进行转膜。根据所需检测目的蛋白的分子量调整转膜时间。

7)封闭：结束转膜，取出PVDF膜，将其置于封闭液中，室温水平摇床缓慢封闭2h。

8)孵育一抗：封闭完，按各目的蛋白的一抗∶5％的BSA＝1∶1000稀释一抗。将转上目的蛋白的PVDF膜泡在稀释好的一抗中封入封膜袋中，封口后4℃孵育过夜。

9)孵育二抗：一抗孵育完毕后，回收一抗，将PVDF膜取出用1×TBST溶液于摇床上迅速摇晃洗涤3次，每次9min。洗膜完毕后，将PVDF膜泡于稀释好的二抗(二抗用5％BSA稀释2000倍)封入封膜袋中并封口，室温条件下于水平摇床上缓慢孵育2h。孵育完毕，回收二抗，将PVDF膜取出用1×TBST溶液于摇床上迅速摇晃洗涤3次，每次9min。

10)显影：避光条件下，将PVDF膜置于暗盒中，ECL发光液中的A液和B液按1∶1混合均匀滴加在PVDF膜上，避光反应2min，进入暗房显影。

上述实验重复三次。

3、细胞划痕实验：

1)用Marker笔和直尺在6孔板底部每孔垂直画3条线，将其平均分成4个部分。

2)制备细胞悬液，调整HepG2细胞密度为1×10⁵cells/mL，每孔接种2mL，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养。

3)划痕：待其愈合度达到80-90％时，弃去上清，用10μL无菌枪头轻轻划痕，每孔划出3条横线和两条竖线。用PBS轻轻清洗两遍除去划下的细胞，并于显微镜下拍照。

4)加药：使用无血清DMEM高糖培养基配制2mL终浓度为5ng/mL的TGF-β1培养基(T组)、2mL Arteannuin B为10μM的含TGF-β1 5ng/mL、2mL Arteannuin B为20μM的含TGF-β15ng/mL的培养基、2mL Arteannuin B为40μM的含TGF-β1 5ng/mL的培养基、2mL不加因素的培养基(NC组)。将板置于细胞培养箱中(37℃、5％CO₂)培养。

5)放入二氧化碳培养箱中培养48h后，观察并在每孔相同部位拍照。

6)数据统计：用ImageJ统计十字划痕部分面积，Graphpad Prism统计数据并做显著性差异分析。

上述实验重复三次。

4、Transwell迁移实验：

1)HepG2细胞胰酶消化下来，离心后弃上清，加新鲜培养基重悬计数调整细胞悬液浓度为8×10⁴cells/200μL，用细胞悬液分别配制5ng/mL TGF-β1(T组)、5ng/mL的TGF-β1以及10μM YA-2(T+10组)、5ng/mL的TGF-β1以及20μM YA-2(T+20组)、5ng/mL的TGF-β1以及40μM YA-2(T+40组)和NC组。各组细胞悬液加入到上室内，孔板内的下室加入800μL/孔含20％FBS培养基，共培养48h。

2)弃旧培养基，甲醇固定30min后用棉棒轻轻除去位于上室内层的贴壁细胞。再用PBS清洗2遍。用0.25％的结晶紫染色30min。清水冲去多余染料。

3)在显微镜下观察并拍照。

4)数据统计。

上述实验重复三次。

形态学观察结果显示：TGF-β1的浓度设定为5ng/mL诱导HepG2细胞发生EMT，同时加入10μM、20μM和40μM三个不同浓度的Arteannuin B给药组观察Arteannuin B是否具有抑制TGF-β1诱导HepG2细胞发生EMT的作用。作用48h后，形态学实验结果显示：模型组(只加TGF-β1组)的HepG2细胞与NC组相比在形态上明显发生了EMT。与模型组相比，加入不同浓度Arteannuin B后能够抑制HepG2这种形态上的变化，且随着Arteannuin B浓度的升高抑制越明显，尤其是40μM Arteannuin B组的细胞间连接紧密，与NC组的HepG2细胞一样呈原本的四边形。上述结果说明：Arteannuin B能够阻滞TGF-β1诱导的HepG2细胞发生EMT(图4)。

Western blotting结果显示：当同时加入不同浓度的Arteannuin B之后可以抑制TGF-β1引起的HepG2细胞内N-Cadherin表达上调和E-Cadherin的表达下调，且具有一定的浓度依赖性(图5)。

细胞划痕实验结果显示：在细胞饥饿48h后，只加TGF-β1组的划痕区的面积与NC组相比明显缩小，而随着Arteannuin B给药浓度的增加，划痕区的面积越来越大，经过计算NC组的迁移率为(12.87±0.66)％，模型组(只加TGF-β1)的迁移率为(24.84±1.64)％，10μMArteannuin B组的迁移率为(25.70±1.87)％，20μM Arteannuin B组的迁移率为(23.71±0.85)％，40μM Arteannuin B组的迁移率为(10.13±1.66)％。上述结果显示：ArteannuinB能够抑制TGF-β1增强HepG2细胞迁移作用，且呈现浓度依赖性(图6)。

Transwell迁移实验显示：只加TGF-β1组的细胞迁移数与NC组相比明显增多，而随着Arteannuin B给药浓度的增加，迁移过来的细胞越来越少，经过细胞计数分析比较可以发现，YA-2能够抑制TGF-β1增强HepG2细胞迁移作用，且呈现一定的浓度依赖性(图7)。

实施例4：Western blotting检测HepG2细胞内Smad通路蛋白表达的变化

考察的相关蛋白有：Smad2、p-Smad2、Smad3、p-Smad3、P-STAT3和Twist1。

1)HepG2细胞用高糖DMEM培养基(含100U/mL青霉素、0.1mg/mL链霉素和10％胎牛血清)置于细胞培养箱中(37℃、5％CO₂)静置培养。六孔板每孔铺上约占孔底面积1/5的HepG2细胞。过夜贴壁后在实验前6h更换新鲜的无血清培养基。

2)在细胞获得同步化生长后，将六孔板的六孔细胞分为加入2mL终浓度为5ng/mLTGF-β1的DMEM培养基(T组)、2mL Arteannuin B为10μM的含TGF-β1 5ng/mL的DMEM培养基、2mL Arteannuin B为20μM的含TGF-β1 5ng/mL的DMEM培养基、2mL Arteannuin B为40μM的含TGF-β1 5ng/mL的DMEM培养基、2mL不加因素的DMEM培养基(NC组)。将板置于细胞培养箱中(37℃、5％CO₂)培养。

3)6h后提取各组总蛋白：弃去上清液，PBS清洗细胞两次。六孔板的每孔加100μL配制好的SDS细胞裂解液，于冰上裂解5min。裂解时缓慢摇晃六孔板使裂解液与细胞充分接触，裂解完毕后，超声3次，每次5s，4℃环境14000rpm离心10min，取上清，即得总蛋白。

4)蛋白浓度测定：按BCA蛋白定量试剂盒所示操作步骤测定各样品蛋白浓度，并用细胞裂解液将其浓度调成一致，加入相应量的5×buffer混匀后于100℃水浴变性10min，室温冷却后，于-20℃环境保存。

5)SDS-PAGE凝胶电泳：

a.SDS-PAGE凝胶配制：按表2.1配方制备分离胶(10-15％)，表2.2配方制备浓缩胶。

b.上样、电泳：每个上样孔道中加入10μL蛋白样品，最右端孔道加入5μL Marker。上样后，打开电源，将电压调为60V进行恒压电泳，30min后蛋白样品跑至浓缩胶到分离胶的分界线，此时调整电压到110V恒压继续电泳。待电泳完毕，关闭电源，取出凝胶。

6)转膜：根据待检测目的蛋白的分子量，切下相应位置的胶条，将其泡于转膜液中暂存。剪下与胶条大小一致的PVDF膜，泡在甲醇中活化3s以上。以阴极-海绵-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-海绵-阳极的顺序制备“三明治”，将其置于转膜仪中，在冰浴环境下恒流200mA进行转膜。根据所需检测目的蛋白的分子量调整转膜时间。

7)封闭：结束转膜，取出PVDF膜，将其置于封闭液中，室温水平摇床缓慢封闭2h。

8)孵育一抗：封闭完，按各目的蛋白的一抗∶5％的BSA＝1∶1000稀释一抗。将转上目的蛋白的PVDF膜泡在稀释好的一抗中封入封膜袋中，封口后4℃孵育过夜。

9)孵育二抗：一抗孵育完毕后，回收一抗，将PVDF膜取出用1×TBST溶液于摇床上迅速摇晃洗涤3次，每次9min。洗膜完毕后，将PVDF膜泡于稀释好的二抗(用5％BSA稀释2000倍)封入封膜袋中并封口，室温条件下于水平摇床上缓慢孵育2h。孵育完毕，回收二抗，将PVDF膜取出用1×TBST溶液于摇床上迅速摇晃洗涤3次，每次9min。

10)显影：避光条件下，将PVDF膜置于暗盒中，ECL发光液中的A液和B液按1∶1混合均匀滴加在PVDF膜上，避光反应2min，进入暗房显影。

上述实验重复三次。

结果显示：TGF-β1诱导HepG2细胞6h能够明显上调p-Smad2和p-Smad3的表达，而随着Arteannuin B给药浓度的增加TGF-β1诱导所增强的p-Smad2和p-Smad3的表达被下调；Arteannuin B浓度为40μM时，p-Smad2和p-Smad3的表达最低，但对Smad和Smad3的表达无影响。说明Arteannuin B有可能通过抑制p-Smad2和p-Smad3的表达抑制TGF-β1诱导的HepG2细胞发生EMT作用(图8)。

TGF-β1诱导HepG2细胞6h能够明显上调p-STAT3和Twist1的表达，而随着Arteannuin B给药浓度的增加TGF-β1诱导所增强的p-STAT3和Twist1的表达被下调，Arteannuin B浓度为40μM时，p-STAT3和Twist1的表达最低。说明抑制p-STAT3和Twist1的表达也有可能是Arteannuin B抑制TGF-β1诱导的HepG2细胞发生EMT的机制之一(图9)。

实施例5：Arteannuin B抗H₂₂肝癌肺转移的作用

1、Arteannuin B抗H₂₂肝癌肺转移体内实验：

1)H₂₂腹水瘤细胞复苏后腹腔注射入四只KM小鼠体内，一星期左右腹水形成后再传一代，抽取最后一代的澄清腹水，离心，用生理盐水洗一次，并用生理盐水稀释调节细胞悬液浓度为2×10⁷cells/mL备用。

2)制备小鼠肝癌H₂₂细胞肺转移模型：抽取最后一代的澄清腹水，离心，生理盐水洗一次，并用生理盐水稀释调节细胞悬液浓度为2×10⁷cells/mL，按0.2mL/只尾静脉注射入18-20g雄性昆明小鼠的体内。

3)分组与给药：24h后将实验小鼠随机分为4组，每组6只。并按各组要求给药或生理盐水10天：

(1)高剂量组：尾静脉注射30mg/kg Arteannuin B，每日同一时间给药一次；

(2)低剂量组：尾静脉注射10mg/kg Arteannuin B，每日同一时间给药一次；

(4)模型对照组：尾静脉注射0.1mL/10g生理盐水，每日同一时间给予一次。

4)观察指标：

①体质量变化情况：整个实验过程中隔日同一时间记录各组小鼠体质量的变化情况。

②免疫器官变化情况：取小鼠脾脏和胸腺称重，计算脾脏指数和胸腺指数。

器官质量指数＝10×器官重量平均值(mg)/体重平均值(g)

③肺转移灶生长情况：剥离肺脏称重，Bouin液(饱和苦味酸∶甲醛∶乙酸＝15∶5∶1)固定24h观察，单盲法计数肺转移瘤结节数。

肺结节抑制率(％)＝(1-给药组肺瘤结节数/造模组肺瘤结节数)×100％

④组织病理学检验：取各组小鼠的肺、脑、肾组织4％甲醛固定24h，切片，HE染色观察变化。

⑤统计学处理：用Graphpad prism 6软件进行显著性检验，计量资料数据用表示，组间比较采用方差分析(One-Way ANOVA)。

2、Western blotting法检测TGF-β1作用48h后H₂₂细胞内EMT相关蛋白的表达

1)H₂₂细胞用1640培养基(含100U/mL青霉素、0.1mg/mL链霉素和10％胎牛血清)置于细胞培养箱中(37℃、5％CO₂)静置培养。六孔板每孔铺上约占孔底面积1/5的H₂₂细胞。过夜贴壁后在实验前6h更换新鲜的无血清培养基。

2)在细胞获得同步化生长后，将六孔板的六孔细胞分为加入2mL终浓度为5ng/mLTGF-β1的1培养基1640(T组)、2mL Arteannuin B为10μM的含TGF-β1 5ng/mL的1640培养基、2mL Arteannuin B为20μM的含TGF-β1 5ng/mL的1640培养基、2mL Arteannuin B为40μM的含TGF-β1 5ng/mL的1640培养基、2mL DMEM培养基(NC组)。将板置于细胞培养箱中(37℃、5％CO₂)培养。

3)48h后提取各组总蛋白：弃去上清液，PBS清洗细胞两次。六孔板的每孔加100μL配制好的SDS细胞裂解液，于冰上裂解5min。裂解时缓慢摇晃六孔板使裂解液与细胞充分接触，裂解完毕后，超声3次，每次5s，4℃环境14000rpm离心10min，取上清，即得总蛋白。

4)蛋白浓度测定：按BCA蛋白定量试剂盒所示操作步骤测定各样品蛋白浓度，并用细胞裂解液将其浓度调成一致，加入相应量的5×buffer混匀后于100℃水浴变性10min，室温冷却后，于-20℃环境保存。

5)SDS-PAGE凝胶电泳：

a.SDS-PAGE凝胶配制：按表1.1配方制备分离胶(10-15％)，表1.2配方制备浓缩胶

b.上样、电泳：每个上样孔道中加入10μL蛋白样品，最右端孔道加入5μL Marker。上样后，打开电源，将电压调为60V进行恒压电泳，30min后蛋白样品跑至浓缩胶到分离胶的分界线，此时调整电压到110V恒压继续电泳。待电泳完毕，关闭电源，取出凝胶。

6)转膜：根据待检测目的蛋白的分子量，切下相应位置的胶条，将其泡于转膜液中暂存。剪下与胶条大小一致的PVDF膜，泡在甲醇中活化3s以上。以阴极-海绵-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-海绵-阳极的顺序制备“三明治”，将其置于转膜仪中，在冰浴环境下恒流200mA进行转膜。根据所需检测目的蛋白的分子量调整转膜时间。

7)封闭：结束转膜，取出PVDF膜，将其置于封闭液中，室温水平摇床缓慢封闭2h。

8)孵育一抗：封闭完，按各目的蛋白的一抗∶5％的BSA＝1∶1000稀释一抗。将转上目的蛋白的PVDF膜泡在稀释好的一抗中封入封膜袋中，封口后4℃孵育过夜。

9)孵育二抗：一抗孵育完毕后，回收一抗，将PVDF膜取出用1×TBST溶液于摇床上迅速摇晃洗涤3次，每次9min。洗膜完毕后，将PVDF膜泡于稀释好的二抗(用5％BSA稀释2000倍)封入封膜袋中并封口，室温条件下于水平摇床上缓慢孵育2h。孵育完毕，回收二抗，将PVDF膜取出用1×TBST溶液于摇床上迅速摇晃洗涤3次，每次9min。

10)显影：避光条件下，将PVDF膜置于暗盒中，ECL发光液中的A液和B液按1∶1混合均匀滴加在PVDF膜上，避光反应2min，进入暗房显影。

上述实验重复三次。

体内实验结果显示：通过对解剖后各组小鼠肺部转移灶数目的统计分析可以发现，与模型组相比Arteannuin B给药组能够明显减少肺部转移灶数量(图10)。通过HE染色分析可以看到，模型组小鼠的肺部的转移灶多而大，与之相比阳性药组小鼠的肺部的转移灶明显少而小。Arteannuin B给药组的小鼠肺部的转移灶明显少而小(图11)。说明Arteannuin B能够抑制鼠源肝癌H₂₂细胞的肺转移。此外，根据数据统计结果，Arteannuin B给药组及阳性药组与模型组相比，体重与肝脏指数无明显差异。且Arteannuin B给药组的胸腺指数和脾脏指数与模型组相比都无显著性差异，而阳性药组表现出明显的免疫抑制作用(图12-16)。由此可见，在所给剂量范围内，Arteannuin B对小鼠无明显毒性。

Westernblotting结果显示：当同时加入不同浓度的ArteannuinB之后可以抑制TGF-β1引起的H₂₂细胞内N-Cadherin的表达上调和E-Cadherin的表达下调，且具有一定的浓度依赖性(图17)。

Claims (4)

1.Arteannuin B抑制EMT介导肝癌转移及其作用机制研究。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的体外实验所用的细胞株为人源肝癌细胞(HepG2)，体内实验采用了鼠源肝癌细胞(H₂₂)在昆明小鼠上的肺转移模型。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述Arteannuin B为传统中草药黄花蒿中提取的青蒿类似物，来源于暨南大学中药生物技术研究所。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述Arteannuin B在制备抑制EMT介导的肿瘤转移候选药物中的应用。