TWI533880B - 具抗發炎活性之黃酮類化合物，及5,3'-二羥基-7,4'-二甲氧基黃酮之用途 - Google Patents
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Description
本發明係關於一種抗發炎活性之黃酮類化合物；本發明另關一種5,3'-二羥基-7,4'-二甲氧基黃酮之用途。
白木香(Aquilaria sinensis)又名沉香，為瑞香科(Thymelaeaceae)沉香屬(Aquilaria)之常綠喬木。
一般而言，藥用沉香為白木香於樹幹損傷後，真菌侵入寄生所產生形成之香脂，具有降氣溫中、暖腎納氣等功效，可以治氣逆喘息、嘔吐呃逆，脘腹脹痛，腰膝虛冷，大腸虛秘，小便氣淋，男子精冷等。惟，白木香萃取物是否其他生物活性尚屬未知。
本發明之主要目的係提供一種黃酮類化合物，係具有抗發炎活性者。
本發明之另一目的係提供一種黃酮類化合物之用途，係藉由抑制血小板凝集現象之活性，以應用於製備抗血栓藥物者。
為達到前述發明目的，本發明所運用之技術手段及藉由該技術手段所能達到之功效包含有：本發明之具抗發炎活性之黃酮類化合物，該黃酮類化合物為5-羥基-4'-異戊烯基氧基-7-甲氧基黃酮。
本發明之5,3'-二羥基-7,4'-二甲氧基黃酮之用途，係應用於製備抗血栓之藥物，該5,3'-二羥基-7,4'-二甲氧基黃酮具有抑制凝血酵素(thrombin)誘導血小板凝集現象之活性。
本發明之5-羥基-4'-異戊烯基氧基-7-甲氧基黃酮係具有抑制NF-κB活化之活性，可以作為抗發炎之活性成分，為本發明之功效。
本發明之黃酮類化合物之用途，係藉由5,3'-二羥基-7,4'-二甲氧基黃酮抑制血小板凝集現象之活性，作為抗血栓之活性成分，為本發明之功效。
第1圖係本發明5-羥基-4'-異戊烯基氧基-7-甲氧基黃酮之ESI-MS圖譜。
第2圖係本發明5-羥基-4'-異戊烯基氧基-7-甲氧基黃酮之HR-ESI-MS圖譜。
第3圖係本發明5-羥基-4'-異戊烯基氧基-7-甲氧基黃酮之1H-NMR圖譜(CDCl3，500MHz)。
第4圖係本發明5-羥基-4'-異戊烯基氧基-7-甲氧基黃酮之13C-NMR圖譜(CDCl3，125MHz)。
第5圖係本發明5-羥基-4'-異戊烯基氧基-7-甲氧基黃酮之NOESY圖譜。
第6圖係本發明5-羥基-4'-異戊烯基氧基-7-甲氧基黃酮之COSY圖譜。
第7圖係本發明5-羥基-4'-異戊烯基氧基-7-甲氧基黃酮之HSQC圖譜。
第8圖係本發明5-羥基-4'-異戊烯基氧基-7-甲氧基黃酮之HMBC圖譜。
第9圖係本發明5-羥基-4'-異戊烯基氧基-7-甲氧基黃酮之DEPT圖譜。
第10圖係本發明5-羥基-4'-異戊烯基氧基-7-甲氧基黃酮之IR圖譜。
第11a圖係本發明5-羥基-4'-異戊烯基氧基-7-甲氧基黃酮之化學結構
式。
第11b圖係本發明豆甾-4-烯-3,6-二酮之化學結構式。
第11c圖係本發明豆甾-4-烯-3-酮之化學結構式。
第11d圖係本發明5,3'-二羥基-7,4'-二甲氧基黃酮之化學結構式。
第11e圖係本發明5,4'-二羥基-7,3'-二甲氧基黃酮之化學結構式。
為讓本發明之上述及其他目的、特徵及優點能更明顯易懂，下文特舉本發明之較佳實施例，並配合所附圖式，作詳細說明如下：
本實施例中，該白木香萃取物係藉由一包含下列步驟之方法所製得：提供一白木香樣本；於室溫下以甲醇萃取該白木香樣本，以獲得一甲醇萃取物；及以一正己烷、水之混合溶液對該甲醇萃取物進行分配，以獲得一正己烷層萃取物。
詳而言之，該白木香樣本係為取自白木香葉部之樣本(3.8公斤)，經甲醇(3.8公升)進行冷浸萃取，反覆三次(共使用11.4公升之甲醇)後，將獲得之甲醇萃取液經減壓濃縮獲得共320克之甲醇萃取物。
配製該正己烷、水之混合溶液(正己烷：水之體積比為1：1)，以3.2公升之正己烷、水之混合溶液對該甲醇萃取物進行分配，取得該正己烷層，經減壓濃縮後，獲得113克之正己烷層萃取物。
該正己烷層萃取物可以續經由管柱層析法進行分離，依序以由正己烷開始沖提，逐漸增加乙酸乙酯/甲醇以提高極性，以依序獲得一第1分劃(A1，2公升之正己烷、乙酸乙酯混合液，99：1)、一第2分劃(A2，3公升之正己烷、乙酸乙酯混合液，98：1)、一第3分劃(A3，3公升之正己烷、乙酸乙酯混合液，95：1)、一第4分劃(A4，3公升之正己烷、乙酸乙酯混合液，90：1)、一第5分劃(A5，2公升之正己烷、乙酸乙酯混合液，80：1)、一第6分劃(A6，3公升之正己烷、乙酸乙酯混合液，
70：1)、一第7分劃(A7，3公升之正己烷、乙酸乙酯混合液，60：1)、一第8分劃(A8，3公升之正己烷、乙酸乙酯混合液，50：1)、一第9分劃(A9，3公升之正己烷、乙酸乙酯混合液，40：1)、一第10分劃(A10，2公升之正己烷、乙酸乙酯混合液，30：1)、一第11分劃(A11，2公升之正己烷、乙酸乙酯混合液，20：1)、一第12分劃(A12，2公升之正己烷、乙酸乙酯混合液，10：1)、一第13分劃(A13，2.5公升之正己烷、乙酸乙酯混合液，5：1)、一第14分劃(A14，2公升之正己烷、乙酸乙酯混合液，1：1)，及一第15分劃(A15，3公升之甲醇)。
取8.4克之第4分劃(A4)，以正己烷、乙酸乙酯混合液(20：1~0：1)進行沖提，依序得到12個次分劃A4-1~A4-12(各1.3公升)，續取145毫克之次分劃A4-5以製備薄層層析法(preparative TLC，silica gel，n-hexane/acetone 10：1)進行純化，即可以獲得4.2毫克之化合物1(R f =0.37)。
取7.7克之第6分劃(A6)，以正己烷、丙酮混合液(14：1~0：1)進行沖提，依序得到9個次分劃A6-1~A6-9(各0.8公升)，續取165毫克之次分劃A6-5以製備薄層層析法(silica gel，n-hexane/acetone 9：1)進行純化，即可以獲得5.3毫克之化合物2(R f =0.56)。
取6.9克之第8分劃(A8)，以三氯甲烷、丙酮混合液(10：1~0：1)進行沖提，依序得到10個次分劃A8-1~A8-10(各0.9公升)，續取125毫克之次分劃A8-8以製備薄層層析法(silica gel，n-hexane/acetone 4：1)進行純化，即可以獲得3.1毫克之化合物3(R f =0.44)。
取6.5克之第13分劃(A13)，以二氯甲烷、甲醇混合液(20：1~0：1)進行沖提，依序得到8個次分劃A13-1~A13-8(各1.1公升)，續取125毫克之次分劃A13-5以製備薄層層析法(silica gel，CH2Cl2/MeOH，15：1)進行純化，即可以獲得5.2毫克之化合物4(R f =
0.68)；另取135毫克之次分劃A13-6以製備薄層層析法(silica gel，CH2Cl2/MeOH，20：1)進行純化，即可以獲得3.9毫克之化合物5(R f =0.63)。
請參照第1~10圖所示，分別以UV、IR、ESI-MS、HR-ESI-MS、NMR(1H-NMR、13C-NMR、DEPT、COSY、NOESY、HSQC、HMBC)光譜分析未知化合物3，其數據如下：黃色針狀物(CH2Cl2-MeOH)mp 173~175℃；UV(MeOH)λmax(log ε)268(4.15)，327(4.18)nm；IR(KBr)λmax3425(OH)，1662(C=O)cm-1；1H-NMR(CDCl3，500MHz)1.78(3H，s，H-5")，1.83(3H，s，H-4")，3.89(3H，s，OMe-7)，4.06(2H，d，J=6.5Hz，H-1")，5.51(1H，t，J=6.5Hz，H-2")，6.37(1H，d，J=2.5Hz，H-6)，6.49(1H，d，J=2.5Hz，H-8)，6.58(1H，s，H-3)，7.03(2H，d，J=9.0Hz，H-3'及H-5')，7.83(2H，d，J=9.0Hz，H-2'及H-6')，12.80(1H，s，D2O可交換，OH-5)；13C-NMR(CDCl3，125MHz)δ18.4(C-5")，26.0(C-4")，55.8(OMe-7)，65.3(C-1")，92.8(C-8)，98.2(C-6)，104.5(C-3)，105.7(C-10)，115.4(C-3')，115.4(C-5')，119.1(C-2")，123.6(C-1')，128.2(C-2')，128.2(C-6')，157.9(C-9)，162.1(C-4')，162.4(C-5)，164.3(C-2)，165.6(C-7)，182.6(C-4)；ESI-MS m/z 375[M+Na]+；HR-ESI-MS m/z 375.1205[M+Na]+(calcd for C21H20O5Na，375.1208)。藉此確認其化學結構式係為如第11a圖所示，其IUPAC名稱為5-羥基-4'-異戊烯基氧基-7-甲氧基黃酮(5-hydroxy-4'-isoprenyloxy-7-methoxyflavone)。
另將化合物1、2、4、5進行相同之光譜分析，並將結果與文獻資料比對確知化合物1為豆甾-4-烯-3,6-二酮(stigmast-4-en-3,6-dione，其化學結構式如第11b圖所示)、化合物2為豆甾-4-烯-3-酮(stigmast-4-en-3-one，又名β-sitostenone，其化學結構式如第11c圖所示)、
化合物4為5,3'-二羥基-7,4'-二甲氧基黃酮(5,3'-dihydroxy-7,4'-dimethoxyflavone，又名pillion，其化學結構式如第11d圖所示)，且化合物5為5,4'-二羥基-7,3'-二甲氧基黃酮(5,4'-dihydroxy-7,3'-dimethoxyflavone，又名velutin，其化學結構式如第11e圖所示)，上述化合物均屬於黃酮類或固醇類化合物，續分析上述黃酮類及固醇類化合物之生物活性。
(A)本發明黃酮類及固醇類化合物具有抑制NF-κB活化之活性
穩定表現NF-κB報導基因單一細胞株RAW264.7/Luc-P1細胞培養於二氧化碳培養箱(37℃，5%)，使用含有10% heat-inactivated BCS、2μM L-glutamine、100U/mL penicillin、100μg/mL streptomycin、1mM sodium pyruvate及3g/mL puromycin之DMEM。
將RAW264.7/Luc-P1細胞種於MP-24細胞培養盤(4x105 cells/well)。隔日加入10ng/mL活化小鼠巨噬細胞RAW264.7，培養一小時過後分別加入溶劑(0.1%DMSO)及分劃(或第1表所示之黃酮類及固醇類化合物)，在5% CO2培養箱及37℃條件下作用6小時。接著將培養液移除，以PBS清洗細胞後加入100μL passive lysis buffer，置於室溫作用15分鐘。在進行偵測螢光酵素活性步驟前取20μL cell lysate與100μL luciferin(螢光酵素基質)混合，立即以多功能微量盤式分析儀(Infinite® 200 PRO)偵測所釋放出的冷光。
前述試驗結果顯示，針對LPS(lipopolysaccharide)所誘導之NF-κB活化現象，濃度為10μg/mL之分劃A13具有顯著之抑制活性，其抑制百分比為48.71±6.23%。
續取如第1表所示之黃酮類及固醇類化合物進行試驗，以IC50數值呈現NF-κB之抑制活性。
請參照第1表所示，針對LPS(lipopolysaccharide)所誘導之NF-κB活化現象，豆甾-4-烯-3-酮、豆甾-4-烯-3,6-二酮、5,3'-二羥基-7,4'-二甲氧基黃酮，及5,4'-二羥基-7,3'-二甲氧基黃酮均具有顯著之抑制活性。
(B)本發明黃酮類化合物具有抑制超氧陰離子生成之活性
抑制fMIP(N-formyl-L-methionyl-L-leucyl-L-phenylalanine)誘導嗜中性白血球(neutrophil)產生超氧陰離子(superoxide anion)實驗方法：PMN(polymorphous nucleous)白血球懸浮液先與DMSO或待測化合物在37℃下培養5分鐘；再將superoxide dismutase和HBSS(Hank's buffered saline solution)分別加入空白試管和測試管；加入ferryicytochrome C(0.5mg/mL)後，以fMIP(1然)/CB(5mg/mL)或PMA(0.16然)為引發劑，30分鐘後藉著離心(double-gradient Ficoll-Hypaqur centrifugation)結束反應；將上清液以UV分光光度計(Hitachi；UV-3010)在550nm偵測，以評估對超氧陰離子產生之抑制效果)；及分劃(或第2表所示之黃酮類化合物)對於超氧陰離子產生的抑制百分比係依【式1】進行計算：{(control-resting)-(compound-resting)}÷(control-resting)×100 【式1】。
根據前述試驗結果，濃度為10μg/mL之分劃A13對於fMLP/CB所誘發生成之超氧陰離子(O2 ·-)具有顯著之抑制活性，其抑制百分比為53.42±5.36%。
又，續取如第2表所示之黃酮類化合物進行試驗，以IC50數值呈現超氧陰離子之抑制活性。
請參照第2表所示，針對fMLP/CB誘發產生之超氧陰離子，5-羥基-4'-異戊烯基氧基-7-甲氧基黃酮，及5,4'-二羥基-7,3'-二甲氧基黃酮均具有顯著之抑制活性。
(C)本發明黃酮類化合物具有抑制血小板凝集之活性
血小板懸浮液的之製備(platelet suspension，PS)係用100mM EDTA與兔子(New Zealand White)耳靜脈抽出血以1：14(v/v)的比例混合，在室溫下立即以90×g離心10分鐘，取出上層富含血小板血漿後，再於500×g離心10分鐘。除去血漿後，將下層血小板以含有EDTA(2mM)及bovine serum albumin(BSA，3.5mg/ml)的Tyrode溶液懸浮之，並於相同轉速下離心10分鐘，所得血小板以不含EDTA的Tyrode溶液懸浮並離心後，再以Tyrode溶液使其懸浮，並以Coulter Counter(Model ZM)計算血小板數目，調整其計數為4.5×108 platelets/mL，最後加入1mM Ca2+，靜置30分鐘後，進行實驗。Tyrode溶液除了含有BSA外，其它組成如下(mM)：NaCl(136.9)、KCl(2.7)、MgCl2(2.1)、NaH2PO4(0.4)、NaHCO3(11.9)、glucose(11.1)。
血小板凝集的測定係以Lumi-aggregometer(Chrono-Log Co.U.S.A.)測之。將製備好的血小板加入經silicon包衣的小玻璃管中，並以小磁棒做每分鐘1200轉的攪拌。若未特別說明，均在加入凝集引發劑前3分鐘添加5,3'-二羥基-7,4'-二甲氧基黃酮，全部過程皆在37℃下進行。凝集程度的計算，係以PRP或PS的吸光度作為0%的血小板凝集，以不含血小板的血漿
(platelet-poor plasma，PPP)或Tyrode溶液的吸光度作為100%的血小板凝集，係依【式2】進行計算：凝集(%)=(加凝集引發劑前的吸光度-加凝集引發劑後的吸光度)÷(加凝集引發劑前的吸光度-Tyrode溶液(或ppp)的吸光度) 【式2】。
根據上述試驗結果，5,3'-二羥基-7,4'-二甲氧基黃酮對於凝血酵素(thrombin)所誘導之血小板凝集現象的IC50數值為32.71±0.56μM，顯示其具有顯著之抑制活性。
綜上所述，本發明之5-羥基-4'-異戊烯基氧基-7-甲氧基黃酮係具有抑制NF-κB活化之活性，可以作為抗發炎之活性成分，為本發明之功效。
另外，本發明之黃酮類化合物之用途，係藉由5,3'-二羥基-7,4'-二甲氧基黃酮抑制血小板凝集現象之活性，作為抗血栓之活性成分，為本發明之功效。
雖然本發明已利用上述較佳實施例揭示，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者在不脫離本發明之精神和範圍之內，相對上述實施例進行各種更動與修改仍屬本發明所保護之技術範疇，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
Claims (2)
- 一種具抗發炎活性之黃酮類化合物，該黃酮類化合物為5-羥基-4'-異戊烯基氧基-7-甲氧基黃酮。
- 一種5,3'-二羥基-7,4'-二甲氧基黃酮之用途，係應用於製備抗血栓之藥物，該5,3'-二羥基-7,4'-二甲氧基黃酮具有抑制凝血酵素(thrombin)誘導血小板凝集現象之活性。
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