CN110101718A - 一种基于蚕蛹混合制剂的制作和功能的研究方法 - Google Patents
一种基于蚕蛹混合制剂的制作和功能的研究方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种基于蚕蛹混合制剂的制作和功能的研究方法，包括以下步骤：S1：蚕蛹蛋白粉的制备方法：将鲜蚕蛹用匀浆器匀浆备用，所得匀浆液用五层医用纱布过滤以除去蚕蛹壳等残渣，用PBS(15mmol/l NaCO3，35mmol/l NaHCO3,pH 9.6)缓冲液将滤过液稀释一倍，离心后用医用注射器将油脂层下的清液吸取出来，提取蛋白质，再用稀硫酸调节PH值，本发明涉及蚕蛹技术领域。该基于蚕蛹混合制剂的制作和功能的研究方法，其实验结果表明，使用蚕蛹蛋白和蚕蛹油的混合制剂喂养转基因小鼠，能够使转基因小鼠的认知和记忆能力具有明显改善，并能显著改善阿尔茨海默病模型小鼠的主要病理特征‑β淀粉样蛋白沉积斑(老年斑)，板块面积显著减少，对阿尔茨海默病具有防治作用。
Description
技术领域
本发明涉及蚕蛹技术领域，具体为一种基于蚕蛹混合制剂的制作和功能的研究方法。
背景技术
蚕蛹是一种高营养的美食，同时具有药用价值，在我国的《太平御览》、《日华子本草》及《本草纲目》等古籍均有记载，具有滋补强身、和脾胃、长肌肉、去风湿、长阳气之功效。中国健康部门将蚕蛹归入“传统食品的新型食用性原料”，是“作为普通食品管理的新资源名单”中唯一上榜的昆虫类，1998年卫生部下发《关于1998年全国保健食品市场整顿工作安排的通知》，将新资源食品蚕蛹列为普通食品管理，蚕蛹是一种极富经济价值和开发价值的自然资源，蚕蛹的药理作用也相当广泛，有保护肝脏、促进生长、提高免疫力、降低血压和血糖、抗癌治癌等功效，是一种很好的药用材料，干蚕蛹的油脂含量为20％-30％，而其中的75％为不饱和脂肪酸，主要由油酸、亚油酸和亚麻酸组成。其中亚油酸对神经细胞具有保护作用。蚕蛹蛋白是一种优质纯天然全价蛋白质，干蚕蛹的粗蛋白质含量高达45％-50％，蚕蛹蛋白质经测定含有18种人体所需的氨基酸，含有的8种人体必须氨基酸含量大约是猪肉的2倍，牛奶的4倍，且比例适当，是一种优质的蛋白源。还富含核黄素、尼克酸、锌、铁、铜等营养素，具有补充机体营养、促进生长发育的作用，可广泛用于婴幼儿、孕妇、老人、久病体弱者及运动员的营养食品添加剂和滋补剂。浙江省福来康保健品公司研制推出的蚕蛹蛋白丸，经临床使用，有健脾开胃、抗疲劳、抗衰老、提高人体免疫功能的作用，蚕蛹中还含有多种维生素(维生素A、维生素B、维生素D等)，微量元素(铁、锌、硒等)以及少量粗纤维、几丁质、甲壳素、抗菌肤、激素、溶菌酶、多糖等,对人体代谢平衡能起到调节作用和保健作用。因此，蚕蛹是一种极富经济价值和开发价值的自然资源。
蚕蛹是在养蚕生产中成为缫丝产业的副产品，中国作为约世界年产量的80％蚕业大国，每年的蚕蛹资源可达300000t，但是这样一种药食同源的优质资源，它的加工利用率非常低，除少数经烘干粉碎作为营养添加剂外，一些用作饲料和肥料，大量被废弃，造成资源的巨大浪费，但目前缺乏对研究蚕蛹成分和营养作用的研究方法，使人们无法准确认知蚕蛹药用价值。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种基于蚕蛹混合制剂的制作和功能的研究方法，解决了目前缺乏对研究蚕蛹成分和营养作用的研究方法，使人们无法准确认知蚕蛹药用价值的问题。
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种基于蚕蛹混合制剂的制作和功能的研究方法，包括以下步骤：
S1：蚕蛹蛋白粉的制备方法：将鲜蚕蛹用匀浆器匀浆备用，所得匀浆液用五层医用纱布过滤以除去蚕蛹壳等残渣，用PBS(15mmol/l NaCO3，35mmol/l NaHCO3,pH 9.6)缓冲液将滤过液稀释一倍，离心后用医用注射器将油脂层下的清液吸取出来，提取蛋白质，再用稀硫酸调节PH值，将PH值调节至4.0，沉淀后低速离心分离蚕蛹粗蛋白，氧化剂脱色用纯净水反复洗涤并低速离心，最后进行喷雾干燥获得蚕蛹蛋白粉；
S2：蚕蛹油的制备方法：将一部分蚕蛹匀浆装入多功能提取罐装料桶中，加石油醚浸提，浓缩后加入4％的氢氧化钠-95％乙醇溶液皂化，盐酸酸化后再用石油醚萃取制得蚕蛹油；
S3：混合：将S1中制备的蚕蛹蛋白粉和S2中制备的蚕蛹油按照重量以2:8的比例进行混合；
S4：用S3中蚕蛹蛋白和蚕蛹油的混合制剂饲喂阿尔茨海默病模型小鼠(B6C3-Tg)，测试小鼠的认知和记忆能力：将5周龄的阿尔茨海默病小鼠分成实验组和对照组(每组八只，雌雄各半)，实验组每只小鼠每周饲喂4g全蚕蛹蛋白粉和蚕蛹油的混合物；对照组不服用任何蚕蛹粉，每日只饲喂鼠粮，阿尔茨海默病模型小鼠从5周龄开始饲喂，直至13 月龄，应用水迷宫测试学习和记忆的获取能力，然后分别进行定位航行试验和空间搜索试验。
进一步地，所述定位航行实验：使小鼠接触平台，停留2秒，分析软件认为小鼠找到了平台，然后将小鼠移动至水迷宫入口处，直至小鼠找到平台，随即停止跟踪并记录下游泳轨迹和找到平台所需的时间(即潜伏期)等指标，小鼠寻找平台时间设置为90秒，小鼠未及时找到平台，将小鼠放置平台30秒，使其学习记忆，若小鼠顺利找到平台，也将其放置平台30秒。
进一步地，所述空间搜索试验：在第6天撤除平台，在水池的池壁上设置四个图形标识，依次将小鼠轻轻从池壁的四个图形标识处放入水池，跟踪90秒内小鼠在水迷宫中的运动轨迹，从而分析小鼠平台区的穿越次数，在各象限的运动情况。
进一步地，所述S1中的离心温度为4℃，离心转速为12000rpm，离心时间为30min。
进一步地，所述S1中蛋白质的提取利用8倍1.0％NaOH在80℃下进行提取。
进一步地，所述定位航行实验用于测量动物在水迷宫中的学习和记忆能力，所述定位航行实验总时间为五天，所述空间搜索实验用于测量动物对平台空间位置准确记忆，即记忆保持能力。
进一步地，所述定位航行实验中平台的位置保持不变。
进一步地，观察和记录小鼠在所述定位航行实验和所述空间搜索实验中，寻找并爬上平台的路线图及所需时间，即记录其潜伏期和游泳速度，主要分析指标有总路程(单位时间内运动距离)，潜伏期(找到平台的时间间隔)，游泳速度(总路程/运动总时间)等，采用SPSS16.0，进行方差分析，组间采用多重比较。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
该基于蚕蛹混合制剂的制作和功能的研究方法，通过用蚕蛹蛋白和蚕蛹油的混合制剂饲喂阿尔茨海默病模型小鼠，测试小鼠的认知和记忆能力：将5周龄的阿尔茨海默病小鼠分成实验组和对照组，实验组每只小鼠每周饲喂4g全蚕蛹蛋白粉和蚕蛹油的混合物；对照组不服用任何蚕蛹粉，每日只饲喂鼠粮，阿尔茨海默病模型小鼠从5周龄开始饲喂，直至13月龄，应用水迷宫测试学习和记忆的获取能力，然后分别进行定位航行试验和空间搜索试验，实验结果表明，使用蚕蛹蛋白和蚕蛹油的混合制剂喂养转基因小鼠，能够使转基因小鼠的认知和记忆能力具有明显改善，并能显著改善阿尔茨海默病模型小鼠的主要病理特征-β淀粉样蛋白沉积斑(老年斑)，板块面积显著减少，对阿尔茨海默病具有防治作用。
附图说明
图1为本发明实验组和对照组小鼠在定航试验中潜伏期(平均数±标准误)的分析图；
图2为本发明实验组和对照组小鼠空间搜索实验中穿越平台区的次数分析图；
图3为本发明小鼠脑的老年斑免疫组化分析图；
图4为本发明小鼠大脑组织MDA和GSH的含量分析图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1-4，本发明提供一种技术方案：一种基于蚕蛹混合制剂的制作和功能的研究方法包括以下步骤：
S1：蚕蛹蛋白粉的制备方法：将鲜蚕蛹用匀浆器匀浆备用，所得匀浆液用五层医用纱布过滤以除去蚕蛹壳等残渣，用PBS(15mmol/l NaCO3，35mmol/l NaHCO3,pH 9.6)缓冲液将滤过液稀释一倍，离心后用医用注射器将油脂层下的清液吸取出来，提取蛋白质，再用稀硫酸调节PH值，将PH值调节至4.0，沉淀后低速离心分离蚕蛹粗蛋白，氧化剂脱色用纯净水反复洗涤并低速离心，最后进行喷雾干燥获得蚕蛹蛋白粉；
S2：蚕蛹油的制备方法：将一部分蚕蛹匀浆装入多功能提取罐装料桶中，加石油醚浸提，浓缩后加入4％的氢氧化钠-95％乙醇溶液皂化，盐酸酸化后再用石油醚萃取制得蚕蛹油；
S3：混合：将S1中制备的蚕蛹蛋白粉和S2中制备的蚕蛹油按照重量以2:8的比例进行混合；
S4：用S3中蚕蛹蛋白和蚕蛹油的混合制剂饲喂阿尔茨海默病模型小鼠(B6C3-Tg)，测试小鼠的认知和记忆能力：将5周龄的阿尔茨海默病小鼠分成实验组和对照组(每组八只，雌雄各半)，实验组每只小鼠每周饲喂4g全蚕蛹蛋白粉和蚕蛹油的混合物；对照组不服用任何蚕蛹粉，每日只饲喂鼠粮，阿尔茨海默病模型小鼠从5周龄开始饲喂，直至13 月龄，应用水迷宫测试学习和记忆的获取能力，然后分别进行定位航行试验和空间搜索试验。
所述定位航行实验：使小鼠接触平台，停留2秒，分析软件认为小鼠找到了平台，然后将小鼠移动至水迷宫入口处，直至小鼠找到平台，随即停止跟踪并记录下游泳轨迹和找到平台所需的时间(即潜伏期)等指标，小鼠寻找平台时间设置为90秒，小鼠未及时找到平台，将小鼠放置平台30秒，使其学习记忆，若小鼠顺利找到平台，也将其放置平台30 秒。
所述空间搜索试验：在第6天撤除平台，在水池的池壁上设置四个图形标识，依次将小鼠轻轻从池壁的四个图形标识处放入水池，跟踪90秒内小鼠在水迷宫中的运动轨迹，从而分析小鼠平台区的穿越次数，在各象限的运动情况。
所述S1中的离心温度为4℃，离心转速为12000rpm，离心时间为30min。
所述S1中蛋白质的提取利用8倍1.0％NaOH在80℃下进行提取。
所述定位航行实验用于测量动物在水迷宫中的学习和记忆能力，所述定位航行实验总时间为五天，所述空间搜索实验用于测量动物对平台空间位置准确记忆，即记忆保持能力。
所述定位航行实验中平台的位置保持不变，提高实验准确率。
观察和记录小鼠在所述定位航行实验和所述空间搜索实验中，寻找并爬上平台的路线图及所需时间，即记录其潜伏期和游泳速度，主要分析指标有总路程(单位时间内运动距离)，潜伏期(找到平台的时间间隔)，游泳速度(总路程/运动总时间)等，采用SPSS16.0，进行方差分析，组间采用多重比较。
定位航行实验：我们用水迷宫测试来调查蚕蛹蛋白和蚕蛹油混合制剂对转基因模型鼠学习，处理和回忆空间信息的能力，并以此评价蚕蛹疫苗对改善小鼠记忆和认知能力的效果。定位航行实验中以小鼠找到平台所需的时间(即潜伏期)作为主要评价指标，与对照组相比，实验组小鼠经过五天的学习训练，表现优异，潜伏期缩短，并在训练的第五天形成显著性差异；
空间搜索实验：第六天撤掉平台，分别在每个象限中分别投放小鼠如池，记录小鼠90 s内的运动轨迹。实验组的小鼠与对照组小鼠相比，虽然没有形成显著性的差异，但是在曾放置平台的目标象限停留的时间更长，穿越平台区的次数也更多。
第二实施例
检测模型小鼠脑内β淀粉样蛋白(Aβ)的清除情况：
水迷宫测试后，所有小鼠被处死。一半脑半球被制成石蜡冰冻切片，检测Aβ蛋白的沉积，切片染色后用Image Analyzer软件分析各处理之间老年斑的差异。
实验结果：
与对照组小鼠相比，实验组小鼠脑内老年斑的减少而且板块明显小得多(染色的红色部分为淀粉样蛋白板块沉积)；对小鼠脑内老年斑的面积进行定量分析显示，实验组的小鼠与对照组小鼠形成了显著性差异；表明蚕蛹蛋白和蚕蛹油混合制剂在预防β淀粉样蛋白的沉积上有成效；
B6C3-Tg小鼠脑内发生免疫组化反应的老年斑的定量分析表格：
mean±SE,*P<0.05，对照组与实验组行程显著性差异
第三实施例
氧化应激相关酶及产物的测定：
丙二醛(MDA)是脂质过氧化反应的主要终产物，是产生细胞毒作用的重要活性氧成分，在阿尔茨海默病患者脑内MDA显著升高，如附图所示，与对照组相比，实验组小鼠在MDA含量上有着非常显著的降低(P<0.01)。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种基于蚕蛹混合制剂的制作和功能的研究方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1：蚕蛹蛋白粉的制备方法：将鲜蚕蛹用匀浆器匀浆备用，所得匀浆液用五层医用纱布过滤以除去蚕蛹壳等残渣，用PBS(15mmol/l NaCO3，35mmol/l NaHCO3,pH 9.6)缓冲液将滤过液稀释一倍，离心后用医用注射器将油脂层下的清液吸取出来，提取蛋白质，再用稀硫酸调节PH值，将PH值调节至4.0，沉淀后低速离心分离蚕蛹粗蛋白，氧化剂脱色用纯净水反复洗涤并低速离心，最后进行喷雾干燥获得蚕蛹蛋白粉；
S2：蚕蛹油的制备方法：将一部分蚕蛹匀浆装入多功能提取罐装料桶中，加石油醚浸提，浓缩后加入4％的氢氧化钠-95％乙醇溶液皂化，盐酸酸化后再用石油醚萃取制得蚕蛹油；
S3：混合：将S1中制备的蚕蛹蛋白粉和S2中制备的蚕蛹油按照重量以2:8的比例进行混合；
S4：用S3中蚕蛹蛋白和蚕蛹油的混合制剂饲喂阿尔茨海默病模型小鼠(B6C3-Tg)，测试小鼠的认知和记忆能力：将5周龄的阿尔茨海默病小鼠分成实验组和对照组(每组八只，雌雄各半)，实验组每只小鼠每周饲喂4g全蚕蛹蛋白粉和蚕蛹油的混合物；对照组不服用任何蚕蛹粉，每日只饲喂鼠粮，阿尔茨海默病模型小鼠从5周龄开始饲喂，直至13月龄，应用水迷宫测试学习和记忆的获取能力，然后分别进行定位航行试验和空间搜索试验。
2.根据权利要求1所述的一种基于蚕蛹混合制剂的制作和功能的研究方法，其特征在于：所述定位航行实验：使小鼠接触平台，停留2秒，分析软件认为小鼠找到了平台，然后将小鼠移动至水迷宫入口处，直至小鼠找到平台，随即停止跟踪并记录下游泳轨迹和找到平台所需的时间(即潜伏期)等指标，小鼠寻找平台时间设置为90秒，小鼠未及时找到平台，将小鼠放置平台30秒，使其学习记忆，若小鼠顺利找到平台，也将其放置平台30秒。
3.根据权利要求1所述的一种基于蚕蛹混合制剂的制作和功能的研究方法，其特征在于：所述空间搜索试验：在第6天撤除平台，在水池的池壁上设置四个图形标识，依次将小鼠轻轻从池壁的四个图形标识处放入水池，跟踪90秒内小鼠在水迷宫中的运动轨迹，从而分析小鼠平台区的穿越次数，在各象限的运动情况。
4.根据权利要求1所述的一种基于蚕蛹混合制剂的制作和功能的研究方法，其特征在于：所述S1中的离心温度为4℃，离心转速为12000rpm，离心时间为30min。
5.根据权利要求1所述的一种基于蚕蛹混合制剂的制作和功能的研究方法，其特征在于：所述S1中蛋白质的提取利用8倍1.0％NaOH在80℃下进行提取。
6.根据权利要求1所述的一种基于蚕蛹混合制剂的制作和功能的研究方法，其特征在于：所述定位航行实验用于测量动物在水迷宫中的学习和记忆能力，所述定位航行实验总时间为五天，所述空间搜索实验用于测量动物对平台空间位置准确记忆，即记忆保持能力。
7.根据权利要求2所述的一种基于蚕蛹混合制剂的制作和功能的研究方法，其特征在于：所述定位航行实验中平台的位置保持不变。
8.根据权利要求1所述的一种基于蚕蛹混合制剂的制作和功能的研究方法，其特征在于：观察和记录小鼠在所述定位航行实验和所述空间搜索实验中，寻找并爬上平台的路线图及所需时间，即记录其潜伏期和游泳速度，主要分析指标有总路程(单位时间内运动距离)，潜伏期(找到平台的时间间隔)，游泳速度(总路程/运动总时间)等，采用SPSS16.0，进行方差分析，组间采用多重比较。
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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