CN104825498A - 硒酵母在阿尔茨海默病防治中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了硒酵母在阿尔茨海默病防治中的应用及富硒酵母在治疗三转基因AD小鼠中的实验，富硒酵母的实验方法是每千克的小鼠饲料中加入4～6克的富硒酵母，每只小鼠每天喂食4克的含有富硒酵母的饲料。从多方面多通道深入研究了富硒酵母对三转基因AD小鼠的治疗效果，从而为治疗AD的药物研究提供有效数据；鉴于富硒酵母在降低tau蛋白的过度磷酸化、显著地降低不可溶性Tau蛋白、提高神经元的synaptophysin和PSD95蛋白水平，恢复神经元突触损伤中表现出的优良性能；以及提高神经元的synaptophysin和PSD95蛋白水平，恢复神经元突触损伤的优良性能；富富硒酵母中的硒具有吸收率高、生物活性强、环境污染小等特点，非常的安全，所以富硒酵母可以用于治疗阿尔茨海默病。

Description

硒酵母在阿尔茨海默病防治中的应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种硒酵母在阿尔茨海默病防治中的应用。

背景技术

三转基因AD小鼠发病机制、进程及AD治疗药物评估的研究一直是学者们研究的热点，现有技术中普遍采用喂食硒代蛋氨酸的方法研究硒对三转基因AD小鼠的治疗效果，但是硒代蛋氨酸对小鼠的治疗效果不甚理想，而且硒代蛋氨酸价格昂贵，导致实验成本上升。

硒酵母是硒含量富集的一类酵母，其硒元素主要以硒代蛋氨酸和硒半胱氨酸的形式存在；它与传统富硒药物一样具有良好的抗氧化性、抗衰老和抗肿瘤作用，而且相较于传统又有更好的生物利用率和安全性，也便于扩大生产，达到产效合一。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提出将富硒酵母用在治疗三转基因AD小鼠中，其中所述富硒酵母的应用方法是每千克的小鼠饲料中加入4～6克的富硒酵母，每只小鼠每天喂食4克的含有富硒酵母的饲料。在所述的富硒酵母中，硒代蛋氨酸形式的硒占总8有机硒的58～70％。

进一步的，从小鼠4月龄时开始喂食含有富硒酵母的饲料，持续90～110天，效果较佳。

本发明中，所述的三转基因AD小鼠为B6:129-Psen1tm1MpmTg(APPSwe,tauP301L)1Lfa/J三转基因AD小鼠，该模型含有三种公认的AD致病基因，能够很好的模拟AD病理特征，在小鼠大脑皮层及海马区等相关区域，可导致局限于中枢神经系统的行为学异常，3-4月时开始可见细胞内Aβ沉积，6个月时突触传导受损，非常适用于对AD的发病机制、进程及AD治疗药物评估的研究。

本发明采用以下方法对应用效果进行检测：

1)、采用morris水迷宫实验，根据小鼠从四个象限入水的游泳轨迹图以及小鼠找到平台的时间，检测三转基因AD小鼠的空间记忆及探索能力；

Morris水迷宫最早是由英国心理学家Morris设计并主要应用于学习记忆脑机制的研，是目前在AD研究中应用广泛的一种行为学检测方法；其通过检测动物的：1)定位航行逃避潜伏期、运动轨迹、平均速度、不同象限停留时间和路程；2)空间探索24小时、72小时记忆在原平台所在象限停留时间及跨越原平台的次数等，来实现对动物认知水平的客观反映，实现动物学习记忆障碍和感觉、运动缺陷等因素的分离。

2)、采用免疫荧光检测小鼠脑内海马区总Tau蛋白、脑内皮层区总Tau蛋白水平、脑内海马区Tau-ps404磷酸化蛋白水平、内皮层区Tau-ps404磷酸化蛋白水平；

3)、采用Western blot检测脑内总Tau蛋白及其磷酸化蛋白Tau-ps404、Tau-ps202

水平

4)、采用Western blot检测脑组织内突触蛋白水平。

本发明所达到的有益效果是：本发明研究了从行为学、生理病理学方面观察等多方面、多通道深入研究了富硒酵母对三转基因AD小鼠的治疗效果，从而为治疗AD的药物研究提供有效数据：

一、富硒酵母治疗三转基因AD小鼠后，在不改变AD小鼠运动能力的前提下，小鼠逃避潜伏期显著降低，且在其后的探索实验中，穿越原平台次数显著增高，因此硒酵母可以显著地改善AD小鼠的记忆和认知损伤；

二、富硒酵母既可以降低tau蛋白的过度磷酸化，又表现出显著地降低不可溶性Tau蛋白的作用，以防止结合微管的稳定作用下降，影响轴突轴浆运输，营养物质不能正常交替输送，神经纤维退化、功能丧失或细胞死亡，诱发AD的记忆功能衰退，行为能力下降等病理变化；

三、富硒酵母有助于提高神经元的synaptophysin和PSD 95蛋白水平，以恢复AD小鼠神经元突触损伤，从而改善其认知和记忆能力。

鉴于富硒酵母在降低tau蛋白的过度磷酸化、显著地降低不可溶性Tau蛋白、提高神经元的synaptophysin和PSD 95蛋白水平，恢复神经元突触损伤中表现出的优良性能；又由于富硒酵母蛋白质含量高达50％以上，还含有丰富的B族维生素和多种矿物质，所以富硒酵母可以为人体提供优质营养之源。富硒酵母中的硒主要是有机源的硒，不同于毒性高，吸收率低的无机硒，富硒酵母中的硒具有吸收率高、生物活性强、环境污染小等特点，非常的安全，所以富硒酵母可以用于治疗阿尔茨海默病。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1是Morris水迷宫定位航行检测结果

其中图1A为：实验小鼠逃避潜伏期，其中*p<0.05，**p<0.01，++p<0.05；n＝12；

图1B为实验小鼠游泳平均速度；

图2是Morris水迷宫空间探索实验，其中*p<0.05；n＝12；

图2A：实验小鼠24h原平台象限所停留时间；

图2B为实验小鼠24h跨越原平台次数；

图2C为实验小鼠72h原平台象限所停留时间；

图2D为实验小鼠72h跨越原平台次数；

图3是小鼠海马区Tau5免疫荧光检测20×)，*p<0.05；n＝3；

图4是小鼠皮层区Tau5免疫荧光检测(20×)，**p<0.01；n＝3；

图5是免疫荧光检测小鼠海马区Tau-ps404表达(20×)，*p<0.05；n＝3；

图6是小鼠皮层区Tau-ps404免疫荧光检测(20×)，*p<0.05；n＝3；

图7是小鼠脑组织海马区Tau蛋白及其磷酸化蛋白水平检测；其中图7A为Western-blot检测可溶性(TBS-soluble)Tau蛋白及其磷酸化蛋白；图7B为可溶性(TBS-soluble)Tau蛋白及其磷酸化蛋白灰度值定量分析，*p<0.05；n＝3；

图7C为Western-blot检测不可溶性(TBS-insoluble)Tau蛋白及其磷酸化蛋白；

图7D：不可溶性(TBS-insoluble)Tau蛋白及其磷酸化蛋白灰度值定量分析，*p<0.05；n＝3-4；

图8是小鼠脑组皮层区Tau蛋白及其磷酸化蛋白水平检测；其中图8A为Western-blot检测可溶性(TBS-soluble)Tau蛋白及其磷酸化蛋白；

图8B为可溶性(TBS-soluble)Tau蛋白及其磷酸化蛋白灰度值定量分析，*p<0.05；n＝3；

图8C为Western-blot检测不可溶性(TBS-insoluble)Tau蛋白及其磷酸化蛋白；

图8D为不可溶性(TBS-insoluble)Tau蛋白及其磷酸化蛋白灰度值定量分析结果，其中*p<0.05；n＝3-6；

图9为小鼠脑组织海马区突触前后蛋白水平检测图，其中*p<0.05，***p<0.001；n＝3；

图9A为Western-blot检测synaptophysin蛋白；

图9B为synaptophysin蛋白灰度值定量分析；

图9C为Western-blot检测PSD 95蛋白；

图9D为PSD 95蛋白灰度值定量分析；

图10小鼠脑组织皮层区突触前后蛋白水平检测图，其中*p<0.05；n＝3；

图10A为Western-blot检测synaptophysin蛋白；

图10B为synaptophysin蛋白灰度值定量分析；

图10C为Western-blot检测PSD 95蛋白；

图10D为PSD 95蛋白灰度值定量分析。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例

向4月龄的三转基因AD小鼠喂食含有富硒酵母的饲料，其中每千克的小鼠饲料中加入5.18克富硒酵母其中，持续100天，每只小鼠每天喂食4克的含有富硒酵母的饲料，所述的富硒酵母中，硒代蛋氨酸形式的硒占总8有机硒的58～70％。所述的三转基因AD小鼠为B6:129-Psen1tm1MpmTg(APPSwe,tauP301L)1Lfa/J三转基因AD小鼠。

采用以下方法对应用效果进行检测：

1)、采用morris水迷宫实验，根据小鼠从四个象限入水的游泳轨迹图以及小鼠找到平台的时间，检测三转基因AD小鼠的空间记忆及探索能力；

三转基因AD小鼠在富硒酵母给药治疗100天之后，morris水迷宫检测对照组和给药组发现：在定位航行试验中，给药组较对照组，其平均逃避潜伏期即小鼠在规定时间内找到平台的时间显著降低(++p<0.01；n＝12)，单独分析检测期第一天和最后一天的逃避潜伏期也显著降低(*p<0.05，**p<0.01；n＝12)如图1A)；但实验各组小鼠的平均游泳速度无明显差异(如图1B)；另外，检测时小鼠从四个象限入水的游泳轨迹图表明，给药组小鼠在找平台过程中运动轨迹较对照组的更短，且“绕圈”现象不明显，表明其找平台的目的性更强。

在空间探索试验中，检测硒酵母组和对照组小鼠的24小时(h)记忆时发现，两组小鼠60s内于目标平台所在象限停留的时间无明显差异(如图2A)；但是硒酵母组跨越目标平台的次数较对照组显著增加(*p<0.05；n＝12)(如图2B)。另外检测实验小鼠72h记忆时，两组小鼠于平台所在象限停留的时间无明显差异(如图2C)，跨越平台次数明显上升但无显著差异(如图2D)。

2)、采用免疫荧光检测小鼠脑内海马区总Tau蛋白、脑内皮层区总Tau蛋白水平、脑内海马区Tau-ps404磷酸化蛋白水平、内皮层区Tau-ps404磷酸化蛋白水平；

免疫荧光检测总Tau、Tau-ps404蛋白水平

①免疫荧光检测脑内海马区总Tau蛋白的水平发现，在海马CA3区、齿状回、CA1区中，硒酵母组总Tau蛋白表达量显著低于对照组(*p<0.05；n＝3，)图3；

②、免疫荧光检测脑内皮层区总Tau蛋白水平的发现，硒酵母组总Tau蛋白量显著低于对照组(**p<0.01；n＝3)(如图4)

③、免疫荧光检测脑内海马区Tau-ps404磷酸化蛋白水平，如图5所示，在海马CA3区中，硒酵母组较对照组的Tau-ps404蛋白水平较对照组水平明显降低(*p<0.05；n＝3)，主要表现在Tau-ps404阳性细胞数量和荧光强度上。

④、免疫荧光检测脑内皮层区Tau-ps404的表达发现，硒酵母组的Tau-ps404水平显著低于对照组(*p<0.05；n＝3)，主要表现在Tau-ps404阳性细胞数量和荧光强度上；而且硒酵母组细胞阳性细胞的分部较均匀和松散，而对照组分布较集中，如图6所示。

3)、采用Western blot检测脑内总Tau蛋白及其磷酸化蛋白Tau-ps404、Tau-ps202水平。

①、Western-blot检测小鼠脑内海马区可溶性(TBS-soluble)Tau蛋白及其磷酸化蛋白的表达水平发现，硒酵母组较对照组小鼠Tau5蛋白水平显著降低(*p<0.05；n＝3)；Tau-ps404、Tau-ps202蛋白水平有一定程度降低，但均无显著差异性。(如图7A、B)。Western-blot检测小鼠脑内海马区非可溶性(TBS-insoluble)Tau蛋白及其磷酸化水平发现，与对照组相比，硒酵母组Tau5、Tau-ps404和Tau-ps202蛋白水平均显著降低(*p<0.05；n＝3-4)(如图7C、D)。

②、Western-blot检测小鼠脑内皮层区可溶性(TBS-soluble)Tau蛋白及其磷酸化蛋白水平发现，硒酵母组较对照组的Tau5、Tau-ps202蛋白水平显著性降低(*p<0.05；n＝3)，Tau-ps404蛋白水平明显降低但无显著差异性(如图8A、B)。

Western-blot检测实验小鼠脑内皮层区非可溶性(TBS-insoluble)Tau蛋白及其磷酸化蛋白水平发现，硒酵母组较对照组的Tau5蛋白水平无明显变化，而Tau-ps404、Tau-ps202蛋白水平显著性降低(*p<0.05；n＝3-6)(如图8C、D)

4)、采用Western blot检测脑组织内突触蛋白水平：

①、Western-blot检测硒酵母治疗后小鼠脑内海马区突触蛋白的表达水平发现，硒酵母组较对照组的突触前蛋白synaptophysin、突触后蛋白PSD95表达水平均显著升高(***p<0.001，*p<0.05；n＝3)(如图9)。

②、Western-blot检测实验小鼠脑内皮层区突触蛋白水平发现，硒酵母组较对照组的突触前蛋白synaptophysin水平显著升高(*p<0.05；n＝3)，突触后蛋白PSD95水平明显升高，但无显著差异性(如图10)。

AD病理情况下Tau蛋白某些磷酸化位点高度磷酸化，被认为是形成NFT的主要原因。据研究材料显示，大脑中的Tau蛋白由于转录、剪切的差异可划分为易溶型非异常磷酸化的Tau、易溶型异常磷酸化的p-Tau和不溶性以双螺旋丝聚集的PHF-Tau三种蛋白形式，而非可溶性的PHF-Tau是形成神经纤维缠结的主要成分。有意思的是，我们结果显示富硒酵母既可以降低tau蛋白的过度磷酸化，又表现出显著地降低不可溶性Tau蛋白的作用，以防止结合微管的稳定作用下降，影响轴突轴浆运输，营养物质不能正常交替输送，神经纤维退化、功能丧失或细胞死亡，诱发AD的记忆功能衰退，行为能力下降等病理变化。

神经元突触损伤是AD一主要的早期病理学改变。有研究指出，AD早期记忆、认知等神经功能障碍与神经元突触的丢失、神经网络的破坏密切相关。突触的数量和功能发生改变可引起突触可塑性的改变，进而影响学习记忆能力，而这些突触可塑性改变与突触相关蛋白有密切联系。synaptophysin是突触囊泡钙结合蛋白之一，参与乙酰胆碱、谷氨酸等神经递质的释放过程。突触后致密区是突触后膜细胞骨架纤维特化区域，该区域可调节细胞黏附性、控件受体聚集和调节受体功能，是突触后信号转导和整合的结构基础。PSD 95位于突触后致密区，离突触后膜非常近，参与胞内信号转导、突触连接等相互作用。为了研究硒酵母对

延缓突触受损起到的重要作用，我们检测了synaptophysin和PSD 95蛋白水平。检测结果表明摄入硒酵母有助于提高神经元的这两种蛋白的水平，以恢复AD小鼠神经元突触损伤，从而改善其认知和记忆能力。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.富硒酵母在治疗三转基因AD小鼠中的应用，其中所述富硒酵母的应用方法是每千克的小鼠饲料中加入4～6克的富硒酵母，每只小鼠每天喂食4克的含有富硒酵母的饲料。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，从小鼠4月龄时开始喂食含有富硒酵母的饲料，持续90～110天。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的富硒酵母中，硒代蛋氨酸形式的硒占总8有机硒的58～70％。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的三转基因AD小鼠为B6:129-Psen1tm1MpmTg(APPSwe,tauP301L)1Lfa/J三转基因AD小鼠。

5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，采用以下方法对应用效果进行检测：

1)、采用morris水迷宫实验，根据小鼠从四个象限入水的游泳轨迹图以及小鼠找到平台的时间，检测三转基因AD小鼠的空间记忆及探索能力；

2)、采用免疫荧光检测小鼠脑内海马区总Tau蛋白、脑内皮层区总Tau蛋白水平、脑内海马区Tau-ps404磷酸化蛋白水平、内皮层区Tau-ps404磷酸化蛋白水平；

3)、采用Western blot检测脑内总Tau蛋白及其磷酸化蛋白Tau-ps404、Tau-ps202水平；

4)、采用Western blot检测脑组织内突触蛋白水平。

6.富硒酵母在制备防治阿尔茨海默病药物中的应用。