CN112837822B - 预测covid-19患者发生轻至重度进展的标志物及试剂盒和建立方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了快速预测COVID‑19患者是否发生轻至重度进展的标志物及其试剂盒以及建立方法。本发明通过将蛋白质组学数据预测早期COVID‑19患者病情的严重程度，进而筛查潜在的重症患者，当患者入院时只需获得其OAF，MB和DDT共3个特征数据即可进行特定的分析。本发明标志物和所述检测试剂盒能够及时、快速、客观和准确地预测COVID‑19患者病情的严重程度，是否发生轻至重度进展，辅助医护人员及时发现潜在的重症患者以分配足够的医疗资源和注意力，是传统评估方式所不具备的优势。因此，本发明对COVID‑19潜在重症患者的早期快速预测和筛查具有极大的临床应用价值。

Description

预测COVID-19患者发生轻至重度进展的标志物及试剂盒和建 立方法
技术领域
本发明属于医药生物技术领域，具体是涉及一种快速预测COVID-19患者是否发生轻至重度进展的标志物及其试剂盒和建立方法。
背景技术
由严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2(SARS-CoV-2)引起的2019年冠状病毒疾病病例(COVID-19)在世界范围内急剧增加。根据约翰霍普金斯大学冠状病毒资源中心网站的数据，截至2020年6月8日，已有188个国家/地区报告了700多万病例，约40万人死亡。研究表明，大约80％实验室确诊的患者为轻度病例，该类患者无论是否接受常规治疗均可康复。20％则为严重病例，需要重症监护，这些严重病例中，有70％至80％的患者在几天之内死亡。因此，在COVID-19患者确诊入院时，防止患者发生中度至重度进展至关重要。此外，对COVID-19患者进行精准的早期临床评估，继而选择合适的临床治疗方式以及分配合理的医疗资源，对防止疾病进展和缓解医疗资源紧张，都具有非常重大的意义。这意味着非常有必要建立一套有效的COVID-19患者早期临床评估的方法。
然而，目前COVID-19患者的临床评估主要取决于他们的临床表现和症状。当轻度至重度进展迅速发生时，其预测准确性非常有限，无法及时判断患者病情的严重程度和预测是否发生病情恶化。而那些没有严重临床表现和症状的COVID-19患者，在入院时往往未能被正确分类以至于失去医护人员足够的注意力，特别是医疗资源紧张的情况下，医护人员无法在其迅速进展至重度阶段做好充分的救治准备。因此，当前缺少但迫切需要有效的方法来筛查没有严重症状表现的严重COVID-19患者。
综上，确定一组标志物及提供试剂盒以快速预测COVID-19患者入院时的病情的严重程度，准确区分轻重症患者；此外，快速筛查可能发生重症进展的患者，帮助医护人员及时发现预后不良的患者，具有极其重要的意义，这对于降低总体死亡率和优化医疗资源配置至关重要。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种快速预测COVID-19患者是否发生轻至重度进展的标志物。
本发明的另一目的在于提供一种筛查重症COVID-19患者的试剂盒。
本发明所采取的技术方案是：
快速预测COVID-19患者是否发生轻至重度进展的标志物，包括OAF，MB和DDT。
OAF，MB和DDT在快速预测COVID-19患者是否发生轻至重度进展中的应用。
一种快速筛查重症COVID-19患者的试剂盒，包括有检测样本中OAF，MB和DDT的含量的试剂。
一种快速预测COVID-19患者是否发生轻至重度进展的试剂盒，包括有检测样本中OAF，MB和DDT的含量的试剂。
本发明还提供了一种预测COVID-19患者是否发生轻至重度进展的方法。
一种预测COVID-19患者是否发生轻至重度进展的方法，包括检测OAF，MB和DDT为COVID-19的蛋白表达水平。
本发明的另一目的是提供一种筛查COVID-19患者是否发生轻至重度进展的标志物的建立方法。
一种筛查COVID-19患者是否发生轻至重度进展的标志物建立方法，包括如下步骤：
招募两个队列的COVID-19患者，一个队列用于寻找COVID-19患者发生轻至重度进展的标志物，另一个队列用于验证标志物对于疾病由轻度至重度进展的预测能力；
将COVID-19患者的血清，分成两组；
处理其中一组血清样品进行蛋白质提取并进行高效液相分离；
使用纳升LC-MS/MS进行数据依赖采集(DDA)和非数据依赖采集(DIA)分析，并通过DDA和DIA数据搜索实现蛋白质的定性和定量；
对定量蛋白质组学数据进行统计分析，找出差异表达的蛋白；
对差异表达的蛋白进行平行反应监测验证，确定初步筛选的标志物；
测试初步筛选出的标志物对潜在严重患者的早期筛查能力；
使用随机森林算法设计迭代模型，详尽测试初步筛选出的标志物的各个组合，进而确定COVID-19患者发生轻至重度进展的最佳标志物组。
基于另一组患者血清样本，使用ELISA分析进一步验证最佳标志物组合对COVID-19患者是否发生轻至重度进展的预测性能，确定所述OAF，MB和DDT的组合有早期预测COVID-19患者是否发生轻至重度进展的能力。
在其中一个实施例中，从血清样品中产生的蛋白质组学数据共同表征了33个样品中988个蛋白质的丰度，并显示出高重现性。
在其中一个实施例中，对定量蛋白质组学数据进行统计分析，所有患者和健康对照之间鉴定出43个显著上调的蛋白和47个显著下调的蛋白。
比较重症患者和非重症患者的蛋白质组学数据，在重症患者中显著上调蛋白质与健康者的数据进行比较，寻找初步仅适用于重症患者的蛋白；
在其中一个实施例中，对初步仅适用于重症患者的蛋白进行平行反应监测验证，进一步得到初步筛选出的蛋白标志物。
对筛选出的蛋白标志物测试其对潜在严重患者的早期筛查的能力。
设计了一个迭代模型构建方法用于寻找最佳的蛋白标志物组合：使用随机森林算法对初步筛选出的蛋白标志物形成的组合进行了详尽的测试和建模，确定OAF，MB和DDT作为预测COVID-19患者是否发生轻至重度进展的一组最佳筛查标志物。
在其中一个实施例中，基于另一独立队列的患者的血清样本，使用ELISA技术进行分析，重症患者的最佳筛查标志物进行分析。
在其中一个实施例中，随机森林算法使用了5折交叉验证方法避免模型构建时发生的潜在过度拟合，同时，为了减少随机森林模型的潜在变异性，对于每个模型，都重复随机抽取训练集和测试集100次并分别用于模型构建，取平均值作为最终结果。
本发明的有益效果是：
1)本发明所述试剂盒和标志物能够及时、快速、客观和准确地预测COVID-19患者病情的严重程度，是否发生轻至重度进展，辅助医护人员及时发现潜在的重症患者以分配足够的医疗资源和注意力，本发明对于COVID-19患者是否发生轻至重度进展的早期快速预测和潜在重症患者的筛查具有极大的临床应用价值。
2)本发明利用COVID-19患者的蛋白质组学数据信息，相较于当前基于临床表现和症状的传统评估方式，在对COVID-19潜在重症患者的早期快速预测和筛查中，AUC较高，结果稳定；而当前的评估方式预测早期迅速发生轻度至重度进展的准确性较低，无法及时判断患者病情的严重程度和预测是否发生病情恶化。
3)本发明所述快速COVID-19重症患者的试剂盒和检测方法还具有取材方便、操作简单、快速准确和结果稳定等优点。
附图说明
图1：鉴定用于严重COVID-19患者筛查的蛋白质组预测因子。收集了两个独立队列的血清样本。通过LC-MS/MS和PRM对队列I的样品进行了蛋白质组分析。基于蛋白质组学数据用机器学习方法确定了筛选严重COVID-19患者的3个预警因素。通过ELISA测定分析来自队列II的样品以验证蛋白质组预警因子。
图2：COVID-19患者特异性蛋白的鉴定和功能注释。a：蛋白质组学数据(988种定量蛋白质)的PCA结果，红色，绿色和蓝色数据点分别为健康对照，轻度和重度COVID-19患者。b：显示所有患者和健康对照之间的差异蛋白鉴定的火山图。c：患者和健康对照之间90个差异蛋白的热图。上调和下调是针对患者和健康对照组而言。红色三角形表示唯一在住院时被分类为严重的患者。d：对COVID-19患者中上调的蛋白质的生物过程分析，点的大小与注释到相应的GO term的蛋白质数量成正比。e：火山图显示所有严重和非严重患者之间差异蛋白的鉴定结果。f：严重和非严重患者之间的24个显著差异蛋白的热图。上调和下调是针对严重和非严重而言。红色三角形表示唯一在住院时被分类为严重的患者。g：对严重患者中上调蛋白质的生物过程分析，点的大小与注释到相应的GO term的蛋白质的数量成正比。
图3：在严重COVID-19患者中筛选的上调蛋白的PRM验证结果。a:通过PRM验证DDT，OAF和MB蛋白。b：重度和轻度患者保留曲线峰面积的累积条形图。颜色代码与a相同，虚线竖线分隔严重和轻度患者。c：重症和轻度患者的DDT，OAF和MB的PRM检测浓度的箱线图。
图4：为严重和非严重COVID-19患者之间选定差异蛋白的特征进行随机森林建模的结果。a：用于随机森林建模的8个验证蛋白的重要性排名。b：基于8个验证蛋白特征对所有患者进行严重患者筛查的随机森林模型的ROC结果，括号内为AUC的95％置信区间值。
图5：基于蛋白质组学数据的迭代随机森林机器学习建模的流程和结果。a：迭代随机森林机器学习方法的工作流程。b：根据蛋白质组学数据的不同组合构建的随机森林模型，然后通过模型的筛查能力(AUC)对模型进行排序；水平虚线表示AUC趋势的拟合线；颜色代码表示用于每个随机森林模型构建的特征数量。c：用d中显示的3个特征构建的随机森林模型的ROC，括号内为AUC的95％置信区间值。d:3个蛋白组学特征(OAF，MB和DDT)在随机森林模型中的重要性排名。
图6：基于另一组独立队列的50名COVID-19患者进行DDT，MB和OAF的ELISA验证。a-c分别表示轻度(21例)和重度(29例)COVID-19患者中DDT,MB和OAF的ELISA检测值的箱线图，其中P值为Wilcoxon秩和检验结果。d为利用DDT，MB和OAF的ELISA数据建立随机森林模型的ROC图，其括号内表示95％的置信区间。e为基于随机森林和五折交叉验证对ELISA数据构建模型的混淆矩阵，其中大多数的轻度(18例)和重度(25例)样本能够被准确分类，说明DDT，MB和OAF的ELISA检测结果对于筛查重度COVID-19患者是可靠的。
具体实施方式
本发明为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。
本申请实施例的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。
在本文中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
在本发明中，严重COVID-19患者的临床特征(淋巴细胞计数，AST，D-二聚体和LDH)与非严重病例中相应的检验指标之间的差异很小，仅能为早期识别严重进展提供相对较低的预测价值。然而，COVID-19严重患者的蛋白组特征(OAF，MB和DDT)与非严重病例和健康成年人相比，表达均为上调，而非严重患者和健康对照组中该蛋白组的表达没有显著差异。同时，DDT和OAF在肝脏中特异性表达，提示严重COVID-19患者在入院时表现出肝损害的早期迹象，该蛋白质组学水平的细微异常可作为早期识别重症COVID-19患者的预警指标，这对COVID-19患者是否发生轻至重度进展的快速预测和潜在严重患者的筛查具有显著的意义。
1.实验中轻症重症的医学定义：
轻症包含临床上的轻型和普通型：(一)轻型：临床症状轻微，影像学未见肺炎表现；(二)普通型：具有发热、呼吸道等症状，影像学可见肺炎表现。
重症包含临床上的重型和危重型(成人)：(一)重型：符合下列任何一条：1.出现气促，RR≥30次/分；2.静息状态下，指氧饱和度≤93％；3.动脉血氧分压(PaO2)/吸氧浓度(FiO2)≤300mmHg(lmmHg＝O.133kPa)。高海拔(海拔超过1000米)地区应根据以下公式对Pa02/Fi02进行校正：PaO2/FiO2×[大气压(mmHg)/760]。肺部影像学显示24-48小时内病灶明显进展>50％者按重型管理。(四)危重型：符合以下情况之一者：1.出现呼吸衰竭，且需要机械通气；2.出现休克；3.合并其他器官功能衰竭需ICU监护治疗。
ACTB：肌动蛋白
CAPNS1：小亚基钙蛋白酶1
COL6A3：VI型胶原蛋白链α-3
F8：凝血因子VIII重组蛋白
GSTO1：谷胱甘肽S-转移酶omega-1
MB(myoglobin，MYO)：肌红蛋白
DDT(D-dopachrome decarboxylase):D-多巴色素变位酶
OAF：初始蛋白同源物(out at first protein homolog)
SOD2：锰超氧化物歧化酶
TMSB4X：胸腺素β4
TNFRSF17：肿瘤坏死因子受体超家族成员17
S100A8：S100-A8蛋白质
S100A9：S100-A9蛋白质
SAA1：血清淀粉状蛋白A1
SAA2：血清淀粉状蛋白A2
SERPINA3：丝氨酸蛋白酶抑制因子
一组筛查COVID-19患者是否发生轻至重度进展的标志物建立方法，包括如下步骤：
招募两个队列的COVID-19患者，一个队列用于寻找COVID-19患者发生轻至重度进展的标志物，另一个队列用于验证标志物对于疾病由轻度至重度进展的预测能力；
在COVID-19患者入院当天收集患者的血液样本，进行血清样品制备；
处理血清样品进行蛋白质提取并进行高效液相分离；
使用纳升LC-MS/MS进行数据依赖采集(DDA)和非数据依赖采集(DIA)分析，并通过DDA和DIA数据搜索实现蛋白质的定性和定量；
对定量蛋白质组学数据进行统计分析，找出差异表达的蛋白；
对差异表达的蛋白进行平行反应监测验证，确定初步筛选的标志物；
测试初步筛选出的标志物对潜在严重患者的早期筛查能力；
使用随机森林算法设计迭代模型，详尽测试初步筛选出的标志物的各个组合，进而确定COVID-19患者发生轻至重度进展的最佳标志物组。
基于另一个独立队列患者的血清样本，使用ELISA分析进一步验证最佳标志物组合对COVID-19患者是否发生轻至重度进展的预测性能。
在其中一个实施例中，从血清样品中产生的蛋白质组学数据共同表征了33个样品中988个蛋白质的丰度，并显示出高重现性。
在其中一个实施例中，对定量蛋白质组学数据进行统计分析，所有患者和健康对照之间鉴定出43个显著上调的蛋白和47个显著下调的蛋白。
在其中一个实施例中，比较重症患者和非重症患者的蛋白质组学数据，在重症患者中有20个蛋白质显著上调，而将所有患者(包括8位非严重患者)与健康对照进行比较，上述20个蛋白中有10种被鉴定为上调；其他10个上调的蛋白(ACTB，CAPNS1，COL6A3，F8，GSTO1，MB，OAF，SOD2，TMSB4X和TNFRSF17)仅适用于重症患者，即在非严重患者和健康对照组中这10个蛋白的表达没有显著差异。
在其中一个实施例中，对10个上调蛋白(ACTB，CAPNS1，COL6A3，F8，GSTO1，MB，OAF，SOD2，TMSB4X和TNFRSF17)进行平行反应监测验证，有8个蛋白在严重患者中表达量显著高于非严重患者(P<0.05，Wilcoxon秩和检验)，分别是S100A8，OAF，RPS28，SOD2，MB，GSTO1，DDT和CAPNS1。
在其中一个实施例中，使用初步筛选出的8个蛋白标志物(S100A8，OAF，RPS28，SOD2，MB，GSTO1，DDT和CAPNS1)测试其对潜在严重患者的早期筛查的能力，其AUC约为0.80。
在其中一个实施例中，设计了一个迭代模型构建方法用于寻找最佳的蛋白标志物组合：使用随机森林算法对8个蛋白标志物形成的255个组合进行了详尽的测试和建模，确定OAF，MB和DDT作为预测COVID-19患者是否发生轻至重度进展的一组最佳筛查标志物，其模型的AUC为0.907(CI：0.87-0.93)。
在其中一个实施例中，基于另一独立队列的50个患者的血清样本，使用ELISA技术进行分析，重症患者的DDT，MB和OAF的浓度均显着高于轻度患者(P<0.05)，而且这三个蛋白组的随机森林模型显示其对筛选重症患者具有强大的预测能力(AUC＝0.904，CI：0.89-0.91)。
在其中一个实施例中，随机森林算法使用了5折交叉验证方法避免模型构建时发生的潜在过度拟合，同时，为了减少随机森林模型的潜在变异性，对于每个模型，都重复随机抽取训练集和测试集100次并分别用于模型构建，取平均值作为最终结果。
在其中一个实施例中，涉及一种快速筛查重症COVID-19患者的试剂盒，针对该试剂盒建立基于COVID-19患者的OAF，MB和DDT定量数据进行潜在严重患者筛查的预测模型，其采用上述任一实施例所述方法建立。
实施例1：快速预测COVID-19患者是否发生轻至重度进展的标志物筛选一、COVID-19患者入院时的蛋白组特征初筛
如图1所示，本发明提供了一种COVID-19患者入院时的蛋白组特征初筛方法，其具体包括如下内容：
(1)血清样品制备
在COVID-19患者入院当天收集患者的血液样本，此外收集健康成年人对照组的血液样本，通过在4℃以1,000g离心10分钟来分离血样，收集等份的血清并存储在-80℃冰箱以待后续研究。共分为两个队列，一个队列用于寻找COVID-19患者发生轻至重度进展的标志物，另一个队列用于验证标志物对于疾病由轻度至重度进展的预测能力。
其中，用于寻找COVID-19患者发生轻至重度进展的标志物的共33份样品，包括23份COVID-19患者(其中8例临床轻症，15份重症)，10份健康成年人。
2.23名病例的详细临床症状
Table 1.Characteristics of patients infected with COVID-19 atadmission according to diseases severity(根据疾病严重程度入院时感染COVID-19的患者的特征)
Figure BDA0002758874340000121
Figure BDA0002758874340000131
Data are presented in median(IQR),or n(％)；
(数据以中位数或百分数来呈现)
P values are derived from Rank sum test,χ2test,or Fisher’s exacttest；
(P数值从秩和检验，χ2测试或费希尔精准检验中提取)
*including Hypertension,Diabetes,and Hyperlipemia；
(包含高血压，糖尿病，高血脂病)
Abbreviations:NR＝Normal Range,HGB＝Haemoglobin,APTT＝activatedpartial thromboplastin time,PT＝prothrombin time,
缩写注释：NR＝正常范围 HGB＝血红蛋白，APTT＝活化部分凝血酶原时间 PT＝凝血酶原时间
ALT＝alanine aminotransferase,AST＝aspartate aminotransferase,TB＝Total bilirubin,BUN＝blood urea nitrogen,Scr＝serum
ALT＝谷氨酸氨基转移酶 AST＝天冬氨酸转氨酶 TB＝总胆红素 BUN＝血尿素Scr＝血肌酐
creatinine,CK＝creatine kinase,LDH＝lact ate dehydrogenase,CRP＝Creactive protein.
CK＝肌酸激酶 LDH＝乳酸脱氨酶 CRP＝C-反应蛋白
(2)蛋白质提取
使用Cleanert PEP96孔板(Agela，中国)处理血清样品，根据制造商的说明去除高丰度蛋白质。继而使用Bradford蛋白质测定试剂盒(Bio-Rad，美国)确定最终蛋白质浓度，并通过补充8M尿素漩涡振荡5分钟提取蛋白质。然后将10mM二硫苏糖醇(DTT)添加到样品混合物中，37℃下静置1小时后添加55mM碘乙酰胺(IAM)，并置于暗室中静置45分钟。最后，将混合物在25,000g，4℃离心20分钟，上清液通过C18 SPE(Waters，Sep-Pak)并用75％乙腈(ACN)洗脱。将样品在真空中脱水，样本在50mM碳酸氢铵中重新溶解，用FASP(Sartorius，UK)以50：1(蛋白质/酶)的比例消化，随后用70％ACN洗脱，并在真空离心机中脱水。
(3)高pH反相液相分离
将所有样本(包括健康组与疾病组)均等混合(10μg/样品)，然后将200μg混合物重新溶解于2ml流动相A(5％ACN pH 9.8)中，通过LC-20AB HPLC系统(岛津公司，日本)结合Gemini高pH C18色谱柱(4.6×250mm，5μm)进行分离。将样品上样到柱上，然后以1ml/min的流速洗脱，梯度如下：5％的流动相B(95％ACN，pH 9.8)持续10分钟，5％到35％的流动相B持续40分钟，35％至95％的流动相B持续1分钟，流动相B持续3分钟，5％流动相B平衡10分钟。在214nm波长处监测洗脱峰，每1分钟收集一次样品组分。然后将这些组分合并为总共10个组分并冷冻干燥。
(4)纳升LC-MS/MS进行数据依赖采集(DDA)和非数据依赖采集(DIA)分析
DDA的样本为第三步10个组分的样本，DDA的数据只为建库，帮助提高鉴定的蛋白数目，DIA的数据是每个样本独立的蛋白组组鉴定数据，DDA和DIA样品分析均在OrbitrapFusion Lumos Tribrid质谱仪(Thermo Fisher Scientific Bremen,Germany)和Ultimate3000 RPLC纳升流速液相系统(Thermo Fisher Scientific Bremen,Germany)上进行。其内部采用了纳升LC色谱柱(150μm×30cm，1.8μm，
Figure BDA0002758874340000141
)，用于以500nl/min的流速分离肽段，肽段的上样量均为1ug。对于DDA分析，将肽段用流动相A(2％ACN，0.1％甲酸)重新溶解，并以120分钟的梯度洗脱。加载到C18捕集柱(300μm×5mm，5μm，Thermo Scientific)中5分钟，5％至25％流动相B(98％ACN，0.1％甲酸)持续90分钟，25％至30％流动相B持续10分钟，以及30％至80％的流动相B持续10分钟。质谱参数设置如下：MS扫描范围350-1500m/z；30个循环计数；NCE 30；MS1分辨率120,000，最大进样时间(MIT)50毫秒；MS/MS HCD扫描分辨率为30,000，MIT 100毫秒；动态排除时间30s；离析窗口2.0m/z；强度阈值2×104；电荷排除1，7，8，>8。对于DIA分析，将相同的纳升LC系统和梯度用于DDA分析。DIA MS参数设置如下：1)MS1：400-1250m/z扫描范围；120,000分辨率；50毫秒最大进样时间(MIT)。4×105的自动增益控制(AGC)。(2)DIA：17m/z隔离窗口；50个循环计数；自动MIT 30,000分辨率；步进NCE：22.5、25、27.5；AGC目标为5×104。
(5)DDA和DIA数据搜索进行蛋白质定性和定量分析
通过Maxquant(15.3.30版)搜索DDA数据，参数设置如下：胰蛋白酶；最小肽段长度7；PSM水平和蛋白质(FDR<0.01)；固定修饰，氨基甲酰甲基(C)；可变修饰，氧化(M)；乙酰基(蛋白质N端)；Gln->pyro-Glu(N-term Q)；脱酰胺(NQ)；数据库包含uniport release(01-2019)的canonical and isoform的蛋白序列。使用Spectronaut(12.0.20491.14.21367)分析DIA数据，该产品使用iRT肽进行保留时间校准。
(6)对定量蛋白质组学数据进行统计分析
所有数据均使用R 3.5进行分析，并使用MSstats R软件包对Spectronaut和skyline定量数据进行差异表达蛋白质分析，完成了log2转换，归一化和P值计算。主成分分析(PCA)则使用pcaMethods R软件包进行。
从血清样品中产生的蛋白质组学数据共同表征了33个样品中988种蛋白质的丰度，并显示出高再现性。使用这些蛋白质组学数据进行的PCA分析，尽管大多数非重症患者在蛋白质组学上与健康对照相似，但重度患者明显与其他患者分离开(图2a)，反映了一些严重病例特有的蛋白质组学特征。
然后进行差异表达分析，并在所有患者和对照之间鉴定出43个显着上调的蛋白和47个显著下调的蛋白(图2b和2c)。这些上调蛋白质包括经典的炎症反应蛋白质，例如S100A8，S100A9，SAA1，SAA2和SERPINA3。系统基因本体论(GO)富集分析表明，在与急性炎症反应，中性粒细胞活化和先天免疫应答活化相关的生物过程中，上调的蛋白质显著富集(FDR<0.05)(图2d)。此外，一些上调的蛋白质明显参与了对缺氧和细胞因子分泌的反应(图2d)。这些结果为23例确诊的COVID-19患者提供了蛋白质组学证据。
Table S2.24 differentially expressed proteins between COVID-19severe(n＝15)and mild(n＝8)group quantified by DIA-MS.
表S2。通过DIA-MS定量分析COVID-19严重(n＝15)和轻度(n＝8)组之间的24种差异表达蛋白
Figure BDA0002758874340000161
Figure BDA0002758874340000171
进而比较重症患者和非重症患者的蛋白质组学数据，在重症患者中有20个蛋白质显著上调(图2e和2f)。将所有患者(包括8位非严重患者)与健康对照进行比较，上述20种蛋白中有10种(包括S100A8，S100A9和SAA2)被鉴定为上调。鉴定到的这些上调蛋白表明，严重的患者比其他患者具有更强的炎症反应。另外，其他10个上调的蛋白(ACTB，CAPNS1，COL6A3，F8，GSTO1，MB，OAF，SOD2，TMSB4X和TNFRSF17)仅在重症患者高表达，在非严重患者和健康对照组中这10种蛋白的表达没有显著差异，因此在将所有患者与对照组进行比较时，这10种蛋白的平均变化和P值变得不显著。
(7)对差异表达的(DE)蛋白质进行平行反应监测(PRM)验证
为了确定重症患者中上调蛋白质的特异性，使用PRM验证筛选的差异蛋白，基于Q-Exactive质谱仪(Thermo Fisher Scientific，不来梅港市，德国)，结合相同的Ultimate3000 RPLC纳升系统和相同的120分钟梯度进行分析。使用采集方法对所有样品进行分析，该方法结合了一个完整的扫描选择离子监测(SIM)事件，然后由包含目标前体离子的预定包含列表触发PRM扫描，以及基于DIA数据的相对rt(扫描窗口为±8分钟)。SIM扫描的参数设置如下：350–1,500m/z质量选择；60,000分辨率(200m/z)；目标AGC值为3×106；MIT为50毫秒。PRM：15,000分辨率；AGC值为1×105；MIT为140毫秒；1.4m/z离析宽度；离析偏移0.2m/z。分裂以28的归一化碰撞能量，MS/MS扫描的起始质量为100m/z。使用Skyline软件分析了PRM数据。
结果表明，在上述10种上调蛋白(ACTB，CAPNS1，COL6A3，F8，GSTO1，MB，OAF，SOD2，TMSB4X和TNFRSF17)中，PRM验证结果显示有8个蛋白在严重患者中的表达显著高于非严重患者(P<0.05，Wilcoxon秩和检验)(图3)，分别是S100A8，OAF，RPS28，SOD2，MB，GSTO1，DDT和CAPNS1。
二、用COVID-19患者入院时初筛的蛋白质特征进行潜在严重患者的早期筛查
使用随机森林机器学习算法基于23位COVID-19患者入院时初筛的8种经过PRM验证的重症患者特异性蛋白特征(S100A8，OAF，RPS28，SOD2，MB，GSTO1，DDT和CAPNS1)构建随机森林模型，结果表明，尽管其中一些蛋白质具有参考意义，但ROC分析表明使用这8个蛋白质建立的总体模型达到约0.80的AUC(图4a和4b)，不足以用于筛查重症COVID-19患者。
三、基于随机森林设计迭代模型寻找COVID-19患者发生轻至重度进展预测的最佳标志物组合
针对8个蛋白质组学数据，发明人设计了一种迭代模型构建方法(图5a和5b)。然后8个蛋白组学特征的255种组合都进行了详尽的测试和筛选，最终结果表明，OAF，MB和DDT的表达水平是筛查重症患者的最佳预测指标(AUC＝0.907，CI：0.87-0.93)(图5c和5d)。因此，OAF，MB和DDT可作为入院时COVID-19患者是否发生轻至重度进展的一组筛查标志物。
四、验证最佳标志物组合的对COVID-19患者是否发生轻至重度进展的预测性能
基于另一独立的50个COVID-19患者队列，收集其血清样本并且使用ELISA分析技术验证OAF，MB和DDT蛋白组的预测能力。其中，OAF，MB和DDT的ELISA试剂盒购自于Andygene Co.，Ltd。首先根据厂家说明测定三个蛋白浓度，并使用HydroFlex微孔板清洗器在450nm处测量吸光度，所有样本都进行了三次平行分析，取平均值作为最终结果。然后，基于ELISA数据作进一步分析，结果表明重症患者的DDT，MB和OAF的浓度均显着高于轻度患者(P<0.05)，而且这三个蛋白组的随机森林模型显示其对筛选重症患者具有强大的预测能力(AUC＝0.904，CI：0.89-0.91)。表明了OAF，MB和DDT用于预测COVID-19患者是否发生轻至重度进展是可靠的。
实施例2：快速筛查COVID-19重症患者的试剂盒及其临床应用
1)当有确诊COVID-19患者入院时，24小时内获取患者的血液样本，获取OAF，MB和DDT的蛋白组学特征信息，具体操作同实施例1所述；
2)将获得患者的OAF，MB和DDT数据信息作为输入变量，输入到随机森林模型中(AUC＝0.907，CI：0.87-0.93)，(图5b和5c)，模型将输出筛查结果：1表示潜在重症患者，0表示非重症患者；其中没有作限定；
3)当筛选模型输出结果后，医护人员可根据模型分析结果结合患者的临床表现和症状了解患者病情的严重程度，进而分配相应需要的医疗资源和施以适宜的注意力。此外OAF和DDT都是直接或间接地从肝脏释放出来，而且DDT和OAF在肝脏中特异性表达，提示患者的肝脏状况与COVID-19的严重进展呈正相关，OAF，MB和DDT可作为临床过程中的一组预后因素进一步辅助医护人员评估COVID-19患者的预后结局。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (7)

1.OAF，MB和DDT，或检测OAF，MB和DDT蛋白含量试剂在制备快速预测COVID-19患者是否发生轻症至重症进展中的试剂盒中的应用，所述轻症包含临床上的轻型和普通型：（一）轻型：临床症状轻微，影像学未见肺炎表现；（二）普通型：具有发热、呼吸道症状，影像学可见肺炎表现；
所述重症包含临床上的重型和成人危重型：（三）重型：符合下列任何一条：1）.出现气促，RR≥30次/分；2）.静息状态下，指氧饱和度≤93%; 3）.动脉血氧分压/吸氧浓度≤300mmHg；4）.肺部影像学显示24-48小时内病灶明显进展>50%；（四）危重型：符合以下情况之一：1）.出现呼吸衰竭，且需要机械通气；2）.出现休克；3）.合并其他器官功能衰竭需ICU监护治疗。
2.一种非诊断目的的筛查COVID-19患者是否发生轻症至重症进展的标志物建立方法，其特征在于，包括如下步骤：
将COVID-19患者的血清，分成两个队列，一个队列用于寻找COVID-19患者发生轻症至重症进展的标志物，另一个队列用于验证标志物对于疾病由轻症至重症进展的预测能力；
处理血清样品进行蛋白质提取并进行高效液相分离；
使用纳升LC- MS/MS进行数据依赖采集和非数据依赖采集分析,并通过DDA和DIA数据搜索实现蛋白质的定性和定量；
对定量蛋白质组学数据进行统计分析，找出差异表达的蛋白；
对差异表达的蛋白进行平行反应监测验证，确定初步筛选的标志物；
测试初步筛选出的标志物对潜在严重患者的早期筛查能力；
使用随机森林算法设计迭代模型，详尽测试初步筛选出的标志物的各个组合，进而确定COVID-19患者发生轻症至重症进展的最佳标志物组；
基于所述另一个队列的患者血清样本，分析进一步验证最佳标志物组合对COVID-19患者是否发生轻症至重症进展的预测性能，确定所述OAF，MB和DDT的组合有早期预测COVID-19患者是否发生轻症至重症进展的能力；
所述轻症包含临床上的轻型和普通型：（一）轻型：临床症状轻微，影像学未见肺炎表现；（二）普通型：具有发热、呼吸道症状，影像学可见肺炎表现；
所述重症包含临床上的重型和成人危重型：（三）重型：符合下列任何一条：1）.出现气促，RR≥30次/分；2）静息状态下，指氧饱和度≤93%; 3）.动脉血氧分压/吸氧浓度≤300mmHg；4）.肺部影像学显示24-48小时内病灶明显进展>50%；（四）危重型：符合以下情况之一者：1）.出现呼吸衰竭，且需要机械通气；2）.出现休克；3）.合并其他器官功能衰竭需ICU监护治疗。
3.根据权利要求2所述的建立方法，其特征在于，
从血清样品中产生的蛋白质组学数据共同表征了33个样品中988个蛋白质的丰度，并显示出高重现性；
对定量蛋白质组学数据进行统计分析，所有患者和健康对照之间鉴定出43个显著上调的蛋白和47个显著下调的蛋白。
4.根据权利要求3所述的建立方法，其特征在于，比较重症患者和非重症患者的蛋白质组学数据，在重症患者中显著上调蛋白质与健康者的数据进行比较，寻找初步仅适用于重症患者的蛋白；
对初步仅适用于重症患者的蛋白进行平行反应监测验证，进一步得到初步筛选出的蛋白标志物。
5.根据权利要求4所述的建立方法，其特征在于，对筛选出的蛋白标志物测试其对潜在严重患者的早期筛查的能力；
设计了一个迭代模型构建方法用于寻找最佳的蛋白标志物组合：使用随机森林算法对初步筛选出的蛋白标志物形成的组合进行了详尽的测试和建模，确定OAF，MB和DDT作为预测COVID-19患者是否发生轻症至重症进展的一组最佳筛查标志物。
6.根据权利要求2-5任一项所述的建立方法，其特征在于，基于另一独立队列的患者的血清样本，使用ELISA技术进行分析，重症患者的最佳筛查标志物进行分析。
7.根据权利要求3所述的建立方法，其特征在于，随机森林算法使用了5折交叉验证方法避免模型构建时发生的潜在过度拟合，同时，为了减少随机森林模型的潜在变异性，对于每个模型，都重复随机抽取训练集和测试集100次并分别用于模型构建，取平均值作为最终结果。
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