JPH05148156A - 血管内皮細胞増殖剤 - Google Patents
血管内皮細胞増殖剤Info
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- JPH05148156A JPH05148156A JP3314927A JP31492791A JPH05148156A JP H05148156 A JPH05148156 A JP H05148156A JP 3314927 A JP3314927 A JP 3314927A JP 31492791 A JP31492791 A JP 31492791A JP H05148156 A JPH05148156 A JP H05148156A
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- JP
- Japan
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- vascular endothelial
- endothelial cell
- agent
- interleukins
- cells
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 インターロイキン６またはインターロイキン
８を有効成分とする血管内皮細胞増殖剤。 【効果】 インターロイキン６またはインターロイキン
８は優れた血管内皮細胞増殖促進作用があるため、特に
火傷や創傷などの治癒促進剤、炎症時の組織修復剤およ
び血管障害の治療剤として有用である。
８を有効成分とする血管内皮細胞増殖剤。 【効果】 インターロイキン６またはインターロイキン
８は優れた血管内皮細胞増殖促進作用があるため、特に
火傷や創傷などの治癒促進剤、炎症時の組織修復剤およ
び血管障害の治療剤として有用である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、医薬あるいは診断薬と
して、さらには血管内皮研究上有用である新規な血管内
皮細胞増殖剤に関する。
して、さらには血管内皮研究上有用である新規な血管内
皮細胞増殖剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】近年、日本人の死亡率の上位を占める、
脳卒中、心臓病の主原因は血管の老化、損傷、機能低下
と考えられている。血管内皮細胞は血管の内腔を覆う単
層を形成する細胞であり、血管の老化や損傷を引き起こ
す動脈硬化の原因である脂質代謝にも関与していること
が推察されている。また、悪性腫瘍の増殖は血管新生と
密接に関連しており、血管内皮細胞の増殖が必須条件で
ある。さらには、やけどや創傷の治療にも血管新生が必
要であり、血管内皮細胞増殖因子の関与が明らかであ
る。
脳卒中、心臓病の主原因は血管の老化、損傷、機能低下
と考えられている。血管内皮細胞は血管の内腔を覆う単
層を形成する細胞であり、血管の老化や損傷を引き起こ
す動脈硬化の原因である脂質代謝にも関与していること
が推察されている。また、悪性腫瘍の増殖は血管新生と
密接に関連しており、血管内皮細胞の増殖が必須条件で
ある。さらには、やけどや創傷の治療にも血管新生が必
要であり、血管内皮細胞増殖因子の関与が明らかであ
る。
【０００３】以上のことから、血管内皮細胞増殖活性を
有する血管内皮細胞増殖剤（Endothlial cell growth a
gent、以下、ＥＣＧＡと略す）を調製してその利用がで
きれば、動脈硬化に伴う血管内皮損傷の保護薬および治
療薬、またやけどや創傷などの治療促進薬となり得るこ
とが期待できる。またＥＣＧＡは、血管内皮を被覆した
生体適合性の良い人口血管を作成する際の血管内皮形成
剤としても利用できる。さらに、ＥＣＧＡの拮抗薬は血
管新生を阻害すると考えられることから、ＥＣＧＡは、
抗悪性腫瘍および慢性関節リウマチや網膜症や治療開発
のための極めて有用な材料の一つとなり得ることが期待
できる。
有する血管内皮細胞増殖剤（Endothlial cell growth a
gent、以下、ＥＣＧＡと略す）を調製してその利用がで
きれば、動脈硬化に伴う血管内皮損傷の保護薬および治
療薬、またやけどや創傷などの治療促進薬となり得るこ
とが期待できる。またＥＣＧＡは、血管内皮を被覆した
生体適合性の良い人口血管を作成する際の血管内皮形成
剤としても利用できる。さらに、ＥＣＧＡの拮抗薬は血
管新生を阻害すると考えられることから、ＥＣＧＡは、
抗悪性腫瘍および慢性関節リウマチや網膜症や治療開発
のための極めて有用な材料の一つとなり得ることが期待
できる。
【０００４】このように、ＥＣＧＡの医療上における存
在価値は極めて高く、ちなみに、悪性腫瘍、脳卒中、心
臓病が、日本人の死亡率の上位３位までを占めているこ
と（昭和６１年度）から考えても、ＥＣＧＡの医療への
利用、応用の有用性は明らかである。
在価値は極めて高く、ちなみに、悪性腫瘍、脳卒中、心
臓病が、日本人の死亡率の上位３位までを占めているこ
と（昭和６１年度）から考えても、ＥＣＧＡの医療への
利用、応用の有用性は明らかである。
【０００５】今まで述べてきた背景と期待から、ＥＣＧ
Ａの研究は近年、精力的に行なわれており、たとえば、
ポリペプチド系では現在までに、ＦＧＦ(fibroblastgro
wthfactor）、ＰＤ−ＥＣＧＦ（platelet-derived endo
thelial cell growth factor 、ＶＰＦ／ＶＥＧＦ（vas
cular permeability factor/vascular endotherialgrow
th factor ）、ｆ−ＥＣＧＦ（fibroblast-derived end
othelial cell growth factor ）などが血管内皮に増殖
促進活性を有する因子として見つかっている（総説とし
て：内海潤、ＢＩＯｍｅｄｉｃａ，５，1484-1488, 199
0 ）。
Ａの研究は近年、精力的に行なわれており、たとえば、
ポリペプチド系では現在までに、ＦＧＦ(fibroblastgro
wthfactor）、ＰＤ−ＥＣＧＦ（platelet-derived endo
thelial cell growth factor 、ＶＰＦ／ＶＥＧＦ（vas
cular permeability factor/vascular endotherialgrow
th factor ）、ｆ−ＥＣＧＦ（fibroblast-derived end
othelial cell growth factor ）などが血管内皮に増殖
促進活性を有する因子として見つかっている（総説とし
て：内海潤、ＢＩＯｍｅｄｉｃａ，５，1484-1488, 199
0 ）。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】ＥＣＧＡの有用性の高
さから、すでに述べてきたように種々のＥＣＧＡのため
の因子が探索され、発見されてきている。しかしその応
用展開と実用化のための研究はまだ続けられており、そ
の一方でさらに新規で有用なＥＣＧＡ候補となる因子を
探す努力も続けられている。作用メカニズムが異なる複
数のＥＣＧＡの併用により、単独因子よりもさらに高い
効果も期待できることから、いろいろなタイプのＥＣＧ
Ａが開発され、それらの活性や作用点、特性などを吟味
しながら使いわけていくことが望まれている。しかしな
がら現状は数種のＥＣＧＡ候補因子が見出だされつつあ
るところであり、さらなるＥＣＧＡ候補因子の探索と実
用化のための研究が課題として残されている。
さから、すでに述べてきたように種々のＥＣＧＡのため
の因子が探索され、発見されてきている。しかしその応
用展開と実用化のための研究はまだ続けられており、そ
の一方でさらに新規で有用なＥＣＧＡ候補となる因子を
探す努力も続けられている。作用メカニズムが異なる複
数のＥＣＧＡの併用により、単独因子よりもさらに高い
効果も期待できることから、いろいろなタイプのＥＣＧ
Ａが開発され、それらの活性や作用点、特性などを吟味
しながら使いわけていくことが望まれている。しかしな
がら現状は数種のＥＣＧＡ候補因子が見出だされつつあ
るところであり、さらなるＥＣＧＡ候補因子の探索と実
用化のための研究が課題として残されている。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明は、インターロイ
キン類を有効成分とするＥＣＧＡであり、インターロイ
キン類としては特に限定されないが、好ましくはインタ
ーロイキン６（以下、ＩＬ−６略す）および／またはイ
ンターロイキン８（以下、ＩＬ−８略す）を有効成分と
するポリペプチド系のＥＣＧＡであり、さらにグルココ
ルチコイドを含有する場合も含まれる。
キン類を有効成分とするＥＣＧＡであり、インターロイ
キン類としては特に限定されないが、好ましくはインタ
ーロイキン６（以下、ＩＬ−６略す）および／またはイ
ンターロイキン８（以下、ＩＬ−８略す）を有効成分と
するポリペプチド系のＥＣＧＡであり、さらにグルココ
ルチコイドを含有する場合も含まれる。
【０００８】ＩＬ−６は１８４残基のアミノ酸からなる
糖タンパク質であり、Ｂリンパ球の抗体産生細胞への分
化を誘導する因子として発見され、現在までに肝細胞刺
激作用や骨髄種細胞の増殖作用、血小板産生の促進作
用、腎メサンギウム細胞の増殖促進、急性期タンパク質
の誘導など多彩な生理活性が知られている（総説とし
て：中嶋弘一と平野俊夫、癌と化学療法、１８，５０５
−５１４，１９９１）。
糖タンパク質であり、Ｂリンパ球の抗体産生細胞への分
化を誘導する因子として発見され、現在までに肝細胞刺
激作用や骨髄種細胞の増殖作用、血小板産生の促進作
用、腎メサンギウム細胞の増殖促進、急性期タンパク質
の誘導など多彩な生理活性が知られている（総説とし
て：中嶋弘一と平野俊夫、癌と化学療法、１８，５０５
−５１４，１９９１）。
【０００９】また、ＩＬ−８は好中球走化性因子として
発見されたアミノ酸７２残基からなるポリペプチドであ
り、好中球の活性化も行なうほか、Ｔリンパ球の走化性
誘導、好塩基球のヒスタミン放出促進、単球の血管内細
胞への付着促進などの作用を有する（久野耕嗣と松島綱
治、免疫薬理、９、１９７−２０５，１９９１）。
発見されたアミノ酸７２残基からなるポリペプチドであ
り、好中球の活性化も行なうほか、Ｔリンパ球の走化性
誘導、好塩基球のヒスタミン放出促進、単球の血管内細
胞への付着促進などの作用を有する（久野耕嗣と松島綱
治、免疫薬理、９、１９７−２０５，１９９１）。
【００１０】これらサイトカインの血管内皮細胞増殖促
進活性についてはまだ報告がなく、本発明によって明ら
かにされた。しかるに、ＩＬ−６についてはＭａｙら
（Biochem. Biophys. Commun., 159, 991-998, 1989 ）
によってヒト臍帯静脈由来血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）
に対して増殖阻害作用をもつことが示唆されているが、
実験に用いたサンプル中に混入する恐れのあるエンドト
キシンによるＨＵＶＥＣ増殖阻害作用を否定できない。
本発明で発見されたＩＬ−６のＨＵＶＥＣ増殖促進作用
はエンドドキシンが生物的作用を誘導しないレベルにま
で除去されたサンプルを用いて得られた結果であり、Ｉ
Ｌ−６の本質的な作用と考えられる。
進活性についてはまだ報告がなく、本発明によって明ら
かにされた。しかるに、ＩＬ−６についてはＭａｙら
（Biochem. Biophys. Commun., 159, 991-998, 1989 ）
によってヒト臍帯静脈由来血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）
に対して増殖阻害作用をもつことが示唆されているが、
実験に用いたサンプル中に混入する恐れのあるエンドト
キシンによるＨＵＶＥＣ増殖阻害作用を否定できない。
本発明で発見されたＩＬ−６のＨＵＶＥＣ増殖促進作用
はエンドドキシンが生物的作用を誘導しないレベルにま
で除去されたサンプルを用いて得られた結果であり、Ｉ
Ｌ−６の本質的な作用と考えられる。
【００１１】ＥＣＧＡの有効成分として用いる場合のＩ
Ｌ−６またはＩＬ−８は、天然の細胞から産生されたも
の、あるいは遺伝子組換え技術を用いて作製されたも
の、さらには化学合成されたもののいずれでも良く、特
に限定されない。
Ｌ−６またはＩＬ−８は、天然の細胞から産生されたも
の、あるいは遺伝子組換え技術を用いて作製されたも
の、さらには化学合成されたもののいずれでも良く、特
に限定されない。
【００１２】ＩＬ−８またはＩＬ−６の産生細胞として
は、正常細胞では末梢血白血球、線維芽細胞、角化細
胞、血管内皮細胞などがあげられ、ＬＰＳ（リポ多糖）
やポリＩ：ポリＣなどの誘発剤、あるいはＩＬ−１、Ｔ
ＮＦ（腫瘍壊死因子）などのサイトカインで誘導するこ
とでＩＬ−８またはＩＬ−６が産生される。腫瘍細胞に
おいてはＩＬ−８またはＩＬ−６の持続産生株が得られ
れば効率良く生産することができる。また遺伝子組換え
技術を用いて生産する場合には、ＣＨＯ（チャイニーズ
ハムスター卵巣）細胞、マウスＣ１２７細胞などを宿主
細胞に用いることができる。同様にカイコ、夜盗蛾など
の昆虫細胞、大腸菌、枯草菌、酵母などの微生物を宿主
とすることも可能である。
は、正常細胞では末梢血白血球、線維芽細胞、角化細
胞、血管内皮細胞などがあげられ、ＬＰＳ（リポ多糖）
やポリＩ：ポリＣなどの誘発剤、あるいはＩＬ−１、Ｔ
ＮＦ（腫瘍壊死因子）などのサイトカインで誘導するこ
とでＩＬ−８またはＩＬ−６が産生される。腫瘍細胞に
おいてはＩＬ−８またはＩＬ−６の持続産生株が得られ
れば効率良く生産することができる。また遺伝子組換え
技術を用いて生産する場合には、ＣＨＯ（チャイニーズ
ハムスター卵巣）細胞、マウスＣ１２７細胞などを宿主
細胞に用いることができる。同様にカイコ、夜盗蛾など
の昆虫細胞、大腸菌、枯草菌、酵母などの微生物を宿主
とすることも可能である。
【００１３】正常細胞あるいは腫瘍細胞で産生する場合
はその培養上清、また遺伝子組換え動物細胞を用いる場
合はその培養上清、遺伝子組換え昆虫細胞あるいは成虫
においてはその培養上清か虫体抽出液、さらに遺伝子組
換え微生物にあってはその培養上清あるいは菌体抽出液
をそれぞれ原料として、種々のクロマトグラフィーによ
り分離することができる。クロマトグラフィーはＩＬ−
６またはＩＬ−８に親和性をもつものであれば、いずれ
も利用できる。例えば、二酸化ケイ素やリン酸カルシウ
ムを素材とするカラム、ヘパリンや疎水基をリガンドと
して有するカラム、金属キレートカラム、イオン交換カ
ラムなどであり、さらに分子ふるいカラムも利用可能な
担体として挙げることができる。
はその培養上清、また遺伝子組換え動物細胞を用いる場
合はその培養上清、遺伝子組換え昆虫細胞あるいは成虫
においてはその培養上清か虫体抽出液、さらに遺伝子組
換え微生物にあってはその培養上清あるいは菌体抽出液
をそれぞれ原料として、種々のクロマトグラフィーによ
り分離することができる。クロマトグラフィーはＩＬ−
６またはＩＬ−８に親和性をもつものであれば、いずれ
も利用できる。例えば、二酸化ケイ素やリン酸カルシウ
ムを素材とするカラム、ヘパリンや疎水基をリガンドと
して有するカラム、金属キレートカラム、イオン交換カ
ラムなどであり、さらに分子ふるいカラムも利用可能な
担体として挙げることができる。
【００１４】経口投与のための剤形としては、具体的に
は錠剤、丸剤、散剤、カプセル剤、顆粒剤、シロップ
剤、乳剤、懸濁剤などが挙げられる。かかる剤形は自体
公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用
いられる担体もしくは賦形剤を含有するものである。非
経口投与のための剤形としては、たとえば、軟膏剤、注
射剤、湿布剤、塗布剤、吸入剤、坐剤、経皮吸入剤など
が挙げられる。
は錠剤、丸剤、散剤、カプセル剤、顆粒剤、シロップ
剤、乳剤、懸濁剤などが挙げられる。かかる剤形は自体
公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用
いられる担体もしくは賦形剤を含有するものである。非
経口投与のための剤形としては、たとえば、軟膏剤、注
射剤、湿布剤、塗布剤、吸入剤、坐剤、経皮吸入剤など
が挙げられる。
【００１５】有効成分として用いられるＩＬ−６または
ＩＬ−８の作用濃度範囲は０．１ｎｇ／ｍｌ〜１００μ
ｇ／ｍｌであり、好ましくは０．０１〜１０μｇ／ｍｌ
である。これらは単独あるいは両者一緒に用いることで
有効成分としての能力を発現させることができる。
ＩＬ−８の作用濃度範囲は０．１ｎｇ／ｍｌ〜１００μ
ｇ／ｍｌであり、好ましくは０．０１〜１０μｇ／ｍｌ
である。これらは単独あるいは両者一緒に用いることで
有効成分としての能力を発現させることができる。
【００１６】またグルココルチコイドを用いる場合は、
天然物（コルチゾール（ヒドロコルチゾン）、コルチコ
ステロン、コルチゾンなど）、あるいは化学合成物（デ
キサメタジン、プレドニゾロンなど）のどちらでも良
く、その作用濃度範囲は１０-9〜１０-3Ｍであり、好ま
しくは１０-7〜１０-4Ｍである。
天然物（コルチゾール（ヒドロコルチゾン）、コルチコ
ステロン、コルチゾンなど）、あるいは化学合成物（デ
キサメタジン、プレドニゾロンなど）のどちらでも良
く、その作用濃度範囲は１０-9〜１０-3Ｍであり、好ま
しくは１０-7〜１０-4Ｍである。
【００１７】本発明の血管内皮細胞増殖剤の有効投与量
および投与回数は、投与形態、患者の年齢、体重、治療
すべき症状の性質もしくは重篤度によっても異なるが、
通常０．１〜１００μｇ／ｋｇ、好ましくは１〜１０μ
ｇ／ｋｇを一回または数回に分けて投与することができ
る。
および投与回数は、投与形態、患者の年齢、体重、治療
すべき症状の性質もしくは重篤度によっても異なるが、
通常０．１〜１００μｇ／ｋｇ、好ましくは１〜１０μ
ｇ／ｋｇを一回または数回に分けて投与することができ
る。
【００１８】なお、本発明にかかるＩＬ−６の定量は抗
ＩＬ−６モノクローナル抗体を用いた酵素免疫測定法
（ＥＩＡ）(Ida et. al., Biochem. Biophys. Res. Com
mun.,165, 728-734, 1989) やヒトＢＣＤＦに反応して
ＩｇＭを産生するヒトＢ細胞株ＣＬ−４(Hirano et a
l., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 5490-5494,198
5)、あるいはＩＬ−６依存性マウスハイブリドーマ７Ｔ
Ｄ１株(Snick et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 8
3, 9678-9683, 1986) の増殖性を指標として定量するこ
とができる。同様にＩＬ−８も、ＥＩＡ（DeForge and
Remick, Immunol. Inuest., 20, 89-97, 1991 ）、ある
いはヒト好中球（Yoshimura et al., J. Immunol., 13
9, 788-793, 1987 ）やラット好中球（Watanabe dt a
l., Jap. J. Pharmacol., 39, 102-104, 1985）の走化
能を指標にして定量することができる。
ＩＬ−６モノクローナル抗体を用いた酵素免疫測定法
（ＥＩＡ）(Ida et. al., Biochem. Biophys. Res. Com
mun.,165, 728-734, 1989) やヒトＢＣＤＦに反応して
ＩｇＭを産生するヒトＢ細胞株ＣＬ−４(Hirano et a
l., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 5490-5494,198
5)、あるいはＩＬ−６依存性マウスハイブリドーマ７Ｔ
Ｄ１株(Snick et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 8
3, 9678-9683, 1986) の増殖性を指標として定量するこ
とができる。同様にＩＬ−８も、ＥＩＡ（DeForge and
Remick, Immunol. Inuest., 20, 89-97, 1991 ）、ある
いはヒト好中球（Yoshimura et al., J. Immunol., 13
9, 788-793, 1987 ）やラット好中球（Watanabe dt a
l., Jap. J. Pharmacol., 39, 102-104, 1985）の走化
能を指標にして定量することができる。
【００１９】
【実施例】次に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に
説明するが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。
説明するが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。
【００２０】実施例１ 天然型ＩＬ−６の調製：ヒト線維芽細胞を１×１０6 細
胞／ｍｌで５％新生仔ウシ血清を含むイーグルＭＥＭ１
リットルに播種し、２リットルのガラス培養層で０．３
％マイクロキャリヤー（“Ｃｙｔｏｄｅｘ１”、ファル
マシア社）に接着させて、攪拌しながら３７℃、５日間
培養した。その後、無血清イーグルＭＥＭ培地１リット
ルに交換し、１００国際単位／ｍｌでヒト・インターフ
ェロンβを加えた。２４時間後、さらにポリ（Ｉ）：ポ
リ（Ｃ）を１０μｇ／ｍｌで加え、その２時間後、少量
のメチルセルロースを含むイーグルＭＥＭ培地に置換
し、その後６日間培養を続けた。培養終了後、マイクロ
キャリヤーを沈降させた後、上清を別の容器に移し、Ｉ
Ｌ−６精製原液とした。
胞／ｍｌで５％新生仔ウシ血清を含むイーグルＭＥＭ１
リットルに播種し、２リットルのガラス培養層で０．３
％マイクロキャリヤー（“Ｃｙｔｏｄｅｘ１”、ファル
マシア社）に接着させて、攪拌しながら３７℃、５日間
培養した。その後、無血清イーグルＭＥＭ培地１リット
ルに交換し、１００国際単位／ｍｌでヒト・インターフ
ェロンβを加えた。２４時間後、さらにポリ（Ｉ）：ポ
リ（Ｃ）を１０μｇ／ｍｌで加え、その２時間後、少量
のメチルセルロースを含むイーグルＭＥＭ培地に置換
し、その後６日間培養を続けた。培養終了後、マイクロ
キャリヤーを沈降させた後、上清を別の容器に移し、Ｉ
Ｌ−６精製原液とした。
【００２１】このＩＬ−６精製原液から次に示すよう
に、シリカ、ヘパリン、逆相クロマトグラフィーにより
ＩＬ−６を分離した。フィルターで濾過して不容物を除
去した精製原液１リットルを高圧蒸気滅菌したシリカカ
ラム（８ｍｌ、５０００ｎｍpore、富士デビソン）に流
し、２０ｍＭリン酸緩衝液（ＰＢ）（ｐＨ７）２５ｍｌ
で．洗浄した後、２０ｍＭ塩酸（ｐＨ２）で溶出を行な
い、ＩＬ−６画分１０ｍｌを得た。この画分に０．３Ｍ
リン酸水素２ナトリウム溶液を添加してｐＨ６．４に調
製し、沈殿物を遠心分離（３０００ｒｐｍ、３０分）し
てから“ＡＦ−ヘパリン・トヨパール６５０Ｍ”カラム
（１ｍｌ、東ソー）に遠心上清をかけた。このカラムを
１０ｍＭＰＢ（ｐＨ６．４）５ｍｌで洗浄後、さらに
０．３Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭＰＢ（ｐＨ７．
２）５ｍｌでＩＬ−６を溶出させた。このＩＬ−６画分
に５Ｍ塩化ナトリウムを添加し、最終塩化ナトリウム濃
度が３Ｍとなるように調整し、“ブチルトヨパール６５
０Ｍ”カラム（１ｍｌ、東ソー）に流してＩＬ−６を吸
着させた。この後、、２Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍ
Ｍ ＰＢ（ｐＨ７．２）、２Ｍ塩化ナトリウムを含む２
０ｍＭ塩酸（ｐＨ１．８）、２０ｍＭ塩酸（ｐＨ１．
８）、０．５Ｍ ＰＢ（ｐＨ５．８）、５０ｍＭＰＢ
（ｐＨ５．８）でそれぞれ５ｍｌずつ洗浄し、最後に５
０ｍＭ ＰＢ（ｐＨ７．２）２ｍｌでＩＬ−６を回収し
た。得られた標品はＣ１８−ＨＰＬＣおよびＳＤＳ−ポ
リアミドケル電気泳動による純度検定で純度９５％以上
を示した。また、この標品のエンドトキシン含量は“エ
ンドスペシー”（生化学工業）による測定で０．０５Ｅ
Ｕ（エンドトキシン・ユニット）／ｍｌであった。
に、シリカ、ヘパリン、逆相クロマトグラフィーにより
ＩＬ−６を分離した。フィルターで濾過して不容物を除
去した精製原液１リットルを高圧蒸気滅菌したシリカカ
ラム（８ｍｌ、５０００ｎｍpore、富士デビソン）に流
し、２０ｍＭリン酸緩衝液（ＰＢ）（ｐＨ７）２５ｍｌ
で．洗浄した後、２０ｍＭ塩酸（ｐＨ２）で溶出を行な
い、ＩＬ−６画分１０ｍｌを得た。この画分に０．３Ｍ
リン酸水素２ナトリウム溶液を添加してｐＨ６．４に調
製し、沈殿物を遠心分離（３０００ｒｐｍ、３０分）し
てから“ＡＦ−ヘパリン・トヨパール６５０Ｍ”カラム
（１ｍｌ、東ソー）に遠心上清をかけた。このカラムを
１０ｍＭＰＢ（ｐＨ６．４）５ｍｌで洗浄後、さらに
０．３Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭＰＢ（ｐＨ７．
２）５ｍｌでＩＬ−６を溶出させた。このＩＬ−６画分
に５Ｍ塩化ナトリウムを添加し、最終塩化ナトリウム濃
度が３Ｍとなるように調整し、“ブチルトヨパール６５
０Ｍ”カラム（１ｍｌ、東ソー）に流してＩＬ−６を吸
着させた。この後、、２Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍ
Ｍ ＰＢ（ｐＨ７．２）、２Ｍ塩化ナトリウムを含む２
０ｍＭ塩酸（ｐＨ１．８）、２０ｍＭ塩酸（ｐＨ１．
８）、０．５Ｍ ＰＢ（ｐＨ５．８）、５０ｍＭＰＢ
（ｐＨ５．８）でそれぞれ５ｍｌずつ洗浄し、最後に５
０ｍＭ ＰＢ（ｐＨ７．２）２ｍｌでＩＬ−６を回収し
た。得られた標品はＣ１８−ＨＰＬＣおよびＳＤＳ−ポ
リアミドケル電気泳動による純度検定で純度９５％以上
を示した。また、この標品のエンドトキシン含量は“エ
ンドスペシー”（生化学工業）による測定で０．０５Ｅ
Ｕ（エンドトキシン・ユニット）／ｍｌであった。
【００２２】実施例２ 天然型ＩＬ−８の調製法：ヒト線維芽細胞を１×１０6
細胞／ｍｌで５％新生仔ウシ血清を含むイーグルＭＥＭ
１リットルに播種し、２リットルのガラス培養層で０．
３％マイクロキャリヤー（“Ｃｙｔｏｄｅｘ１”、ファ
ルマシア社）に接着させて、攪拌しながら３７℃、５日
間培養した。その後、無血清イーグルＭＥＭ培地１リッ
トルに交換し、１００国際単位／ｍｌでヒト・インター
フェロンβを加えた。２４時間後、さらにポリ（Ｉ）：
ポリ（Ｃ）を１０μｇ／ｍｌで加え、その２時間後、少
量のメチルセルロースを含むイーグルＭＥＭ培地に置換
し、その後６日間培養を続けた。培養終了後、マイクロ
キャリヤーを沈降させた後、上清を別の容器に移し、Ｉ
Ｌ−８精製原液とした。
細胞／ｍｌで５％新生仔ウシ血清を含むイーグルＭＥＭ
１リットルに播種し、２リットルのガラス培養層で０．
３％マイクロキャリヤー（“Ｃｙｔｏｄｅｘ１”、ファ
ルマシア社）に接着させて、攪拌しながら３７℃、５日
間培養した。その後、無血清イーグルＭＥＭ培地１リッ
トルに交換し、１００国際単位／ｍｌでヒト・インター
フェロンβを加えた。２４時間後、さらにポリ（Ｉ）：
ポリ（Ｃ）を１０μｇ／ｍｌで加え、その２時間後、少
量のメチルセルロースを含むイーグルＭＥＭ培地に置換
し、その後６日間培養を続けた。培養終了後、マイクロ
キャリヤーを沈降させた後、上清を別の容器に移し、Ｉ
Ｌ−８精製原液とした。
【００２３】このＩＬ−８精製原液から次に示すよう
に、シリカ、ヘパリン、逆相クロマトグラフィーにより
ＩＬ−８を分離した。フィルターで濾過して不容物を除
去した精製原液１リットルを高圧蒸気滅菌したシリカカ
ラム（８ｍｌ、５０００ｎｍpore、富士デビソン）に流
し、２０ｍＭリン酸緩衝液（ＰＢ）（ｐＨ７）２５ｍｌ
で．洗浄した後、２０ｍＭ塩酸（ｐＨ２）で溶出を行な
い、ＩＬ−８画分１０ｍｌを得た。この画分に０．３Ｍ
リン酸水素２ナトリウム溶液を添加してｐＨ６．４に調
整し、沈殿物を遠心分離（３０００ｒｐｍ、３０分）し
てから“ＡＦ−ヘパリン・トヨパール６５０Ｍ”カラム
（１ｍｌ、東ソー）に遠心上清をかけた。このカラムを
１０ｍＭＰＢ（ｐＨ６．４）５ｍｌで洗浄後、さらに
０．３Ｍ塩酸ナトリウムを含む２０ｍＭＰＢ（ｐＨ７．
２）５ｍｌで洗浄、続いて２Ｍ塩化ナトリウムを含む２
０ｍＭ ＰＢ（ｐＨ７．２）２ｍｌでＩＬ−８を溶出さ
せた。さらに純度を上げるために、２ｍｌｋＩＬ−８画
分をＣ１８カラム（”ＺｏｒｂｏｘＰＲＯ−１０ Ｐ
Ｌ”、４．６×２５０ｍｍ、三井東圧）に吸着させ、
０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（ｐＨ２）を含む
アセトニトリルの濃度勾配溶離による高速液体クロマト
グラフィー（ＨＰＬＣ）によりＩＬ−８を分離した。得
られた標品はＣ１８−ＨＰＬＣおよびＳＤＳ−ポリアミ
ドケル電気泳動による純度検定で純度９５％以上を示し
た。また、この標品のエンドトキシン含量は“エンドス
ペシー”（生化学工業）による測定で０．０５ＥＵ／ｍ
ｌであった。ＩＬ−８精製標本はＴＦＡとアセトニトリ
ルを除去するため凍結乾燥を行なって実験に供した。
に、シリカ、ヘパリン、逆相クロマトグラフィーにより
ＩＬ−８を分離した。フィルターで濾過して不容物を除
去した精製原液１リットルを高圧蒸気滅菌したシリカカ
ラム（８ｍｌ、５０００ｎｍpore、富士デビソン）に流
し、２０ｍＭリン酸緩衝液（ＰＢ）（ｐＨ７）２５ｍｌ
で．洗浄した後、２０ｍＭ塩酸（ｐＨ２）で溶出を行な
い、ＩＬ−８画分１０ｍｌを得た。この画分に０．３Ｍ
リン酸水素２ナトリウム溶液を添加してｐＨ６．４に調
整し、沈殿物を遠心分離（３０００ｒｐｍ、３０分）し
てから“ＡＦ−ヘパリン・トヨパール６５０Ｍ”カラム
（１ｍｌ、東ソー）に遠心上清をかけた。このカラムを
１０ｍＭＰＢ（ｐＨ６．４）５ｍｌで洗浄後、さらに
０．３Ｍ塩酸ナトリウムを含む２０ｍＭＰＢ（ｐＨ７．
２）５ｍｌで洗浄、続いて２Ｍ塩化ナトリウムを含む２
０ｍＭ ＰＢ（ｐＨ７．２）２ｍｌでＩＬ−８を溶出さ
せた。さらに純度を上げるために、２ｍｌｋＩＬ−８画
分をＣ１８カラム（”ＺｏｒｂｏｘＰＲＯ−１０ Ｐ
Ｌ”、４．６×２５０ｍｍ、三井東圧）に吸着させ、
０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（ｐＨ２）を含む
アセトニトリルの濃度勾配溶離による高速液体クロマト
グラフィー（ＨＰＬＣ）によりＩＬ−８を分離した。得
られた標品はＣ１８−ＨＰＬＣおよびＳＤＳ−ポリアミ
ドケル電気泳動による純度検定で純度９５％以上を示し
た。また、この標品のエンドトキシン含量は“エンドス
ペシー”（生化学工業）による測定で０．０５ＥＵ／ｍ
ｌであった。ＩＬ−８精製標本はＴＦＡとアセトニトリ
ルを除去するため凍結乾燥を行なって実験に供した。
【００２４】実施例３ ヒト血管内皮細胞増殖活性測定：分娩後に廃棄されたヒ
ト臍帯から分離された血管内皮細胞（endothelial cel
l: ＥＣ）を被験細胞として、次の通り行なった。
ト臍帯から分離された血管内皮細胞（endothelial cel
l: ＥＣ）を被験細胞として、次の通り行なった。
【００２５】ＥＣを２５cm2 プラスチックフラスコ中で
１０％ウシ胎児血清を含むＭ１９９培地（Flow社）８ｍ
ｌに、ＥＣの増殖支持因子としてヒト線維芽細胞の無血
清培養上清（fibroblast-conditioned medium:ＦＣＭ）
を１０％で加え、３７℃、５％ＣＯ2 でコンフルエント
になるまで培養を続けた。
１０％ウシ胎児血清を含むＭ１９９培地（Flow社）８ｍ
ｌに、ＥＣの増殖支持因子としてヒト線維芽細胞の無血
清培養上清（fibroblast-conditioned medium:ＦＣＭ）
を１０％で加え、３７℃、５％ＣＯ2 でコンフルエント
になるまで培養を続けた。
【００２６】コンフルエントになったＥＣを０．２５％
トリプシン処理して剥がし、２．５％ウシ胎児血清およ
び１０％ＦＣＭを含むＭ１９９培地中に懸濁し、Ｉ型コ
ラーゲンをコートした２４ウェル・プラスチック・プレ
ート（Corning 社）に５０００個／０．５ｍｌ／ウェル
で播種した。３７℃、１日培養後、実施例１および２で
得られたＩＬ−６およびＩＬ−８を適量加えて、さらに
３７℃、５％ＣＯ2 下で５日間培養を続けた。また、グ
ルココルチコイドの併用効果を調べる際には、ヒドロコ
ルチゾン（和光純薬）を１０-4Ｍで各ウェルに加えて培
養した。培養終了後、各ウェルのＥＣを０．２５％トリ
プシンで剥がし、コールカウンターＺＭで細胞数を計測
した。この測定では１測定条件について３ウェルを使用
し、細胞数は対照に対する割合（％）で算出し、同時に
標準偏差も求めた。
トリプシン処理して剥がし、２．５％ウシ胎児血清およ
び１０％ＦＣＭを含むＭ１９９培地中に懸濁し、Ｉ型コ
ラーゲンをコートした２４ウェル・プラスチック・プレ
ート（Corning 社）に５０００個／０．５ｍｌ／ウェル
で播種した。３７℃、１日培養後、実施例１および２で
得られたＩＬ−６およびＩＬ−８を適量加えて、さらに
３７℃、５％ＣＯ2 下で５日間培養を続けた。また、グ
ルココルチコイドの併用効果を調べる際には、ヒドロコ
ルチゾン（和光純薬）を１０-4Ｍで各ウェルに加えて培
養した。培養終了後、各ウェルのＥＣを０．２５％トリ
プシンで剥がし、コールカウンターＺＭで細胞数を計測
した。この測定では１測定条件について３ウェルを使用
し、細胞数は対照に対する割合（％）で算出し、同時に
標準偏差も求めた。
【００２７】この結果を、図１（ＩＬ−６のＥＣ増殖促
進作用）、図２（ＩＬ−８のＥＣ増殖促進作用）、およ
び図３（ＩＬ−６とＩＬ−８の併用によるＥＣ増殖促進
作用）に示す。図１および図２から明らかなように、Ｉ
Ｌ−６（図１）、ＩＬ−８（図２）ともに、培養液中へ
の添加量の増加に伴ってＥＣの増殖促進が認められ、そ
の効果は１０-4Ｍヒドロコルチゾン（ＨＣ）存在下によ
り顕著であった。また、図３に示したように、ＩＬ−６
とＩＬ−８の併用でもＥＣの増殖促進効果が認められ
た。
進作用）、図２（ＩＬ−８のＥＣ増殖促進作用）、およ
び図３（ＩＬ−６とＩＬ−８の併用によるＥＣ増殖促進
作用）に示す。図１および図２から明らかなように、Ｉ
Ｌ−６（図１）、ＩＬ−８（図２）ともに、培養液中へ
の添加量の増加に伴ってＥＣの増殖促進が認められ、そ
の効果は１０-4Ｍヒドロコルチゾン（ＨＣ）存在下によ
り顕著であった。また、図３に示したように、ＩＬ−６
とＩＬ−８の併用でもＥＣの増殖促進効果が認められ
た。
【００２８】
【発明の効果】本発明のＩＬ−６またはＩＬ−８の単
独、あるいは両者を有効成分とする血管内皮細胞増殖剤
は、火傷や創傷などの治癒促進剤、炎症時の組織修復剤
および血管障害の治療剤として有用である。さらに、Ｉ
Ｌ−６が有効成分の場合には、該因子の既知活性である
抗体産生促進作用、またＩＬ−８が有効成分の場合に
は、該因子の既知活性である好中球遊走作用、さらには
ヒドロコルチゾン併用の場合には該因子の既知活性であ
る抗炎症作用などにより、血管内皮細胞増殖剤としての
創傷治癒作用や組織修復作用がより効果的に発現される
ことが期待できる。
独、あるいは両者を有効成分とする血管内皮細胞増殖剤
は、火傷や創傷などの治癒促進剤、炎症時の組織修復剤
および血管障害の治療剤として有用である。さらに、Ｉ
Ｌ−６が有効成分の場合には、該因子の既知活性である
抗体産生促進作用、またＩＬ−８が有効成分の場合に
は、該因子の既知活性である好中球遊走作用、さらには
ヒドロコルチゾン併用の場合には該因子の既知活性であ
る抗炎症作用などにより、血管内皮細胞増殖剤としての
創傷治癒作用や組織修復作用がより効果的に発現される
ことが期待できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ヒドロコルチゾン（ＨＣ）の存在下および非
存在下におけるインターロイキン６の血管内皮細胞（Ｅ
Ｃ）増殖促進作用を示す。
存在下におけるインターロイキン６の血管内皮細胞（Ｅ
Ｃ）増殖促進作用を示す。
【図２】 ヒドロコルチゾン（ＨＣ）の存在下および非
存在下におけるインターロイキン８の血管内皮細胞（Ｅ
Ｃ）増殖促進作用を示す。
存在下におけるインターロイキン８の血管内皮細胞（Ｅ
Ｃ）増殖促進作用を示す。
【図３】 インターロイキン６およびインターロイキン
８の併用時の血管内皮細胞（ＥＣ）増殖促進作用を示
す。
８の併用時の血管内皮細胞（ＥＣ）増殖促進作用を示
す。
Claims (3)
- 【請求項１】 インターロイキン類を有効成分とする血
管内皮細胞増殖剤。 - 【請求項２】 インターロイキン類がインターロイキン
６および／またはインターロイキン８である請求項１記
載の血管内皮細胞増殖剤。 - 【請求項３】 有効成分としてさらにグルココルチコイ
ドを含有する請求項１または２記載の血管内皮細胞増殖
剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3314927A JPH05148156A (ja) | 1991-11-28 | 1991-11-28 | 血管内皮細胞増殖剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3314927A JPH05148156A (ja) | 1991-11-28 | 1991-11-28 | 血管内皮細胞増殖剤 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05148156A true JPH05148156A (ja) | 1993-06-15 |
Family
ID=18059327
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3314927A Pending JPH05148156A (ja) | 1991-11-28 | 1991-11-28 | 血管内皮細胞増殖剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05148156A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002036164A1 (fr) * | 2000-10-27 | 2002-05-10 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Agent abaissant le taux sanguin de vegf contenant un antagoniste de il-6 en tant que principe actif |
| JP2013537889A (ja) * | 2010-09-09 | 2013-10-07 | マクロキュア，リミテッド | 活性化白血球馴化上清および創傷治癒のための使用 |
-
1991
- 1991-11-28 JP JP3314927A patent/JPH05148156A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002036164A1 (fr) * | 2000-10-27 | 2002-05-10 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Agent abaissant le taux sanguin de vegf contenant un antagoniste de il-6 en tant que principe actif |
| US8173126B2 (en) | 2000-10-27 | 2012-05-08 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Blood VEGF level-lowering agent containing IL-6 antagonist as the active ingredient |
| JP2013537889A (ja) * | 2010-09-09 | 2013-10-07 | マクロキュア，リミテッド | 活性化白血球馴化上清および創傷治癒のための使用 |
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