CN103209682A

CN103209682A - 活化白血球调节上清液以及用于伤口愈合的用途

Info

Publication number: CN103209682A
Application number: CN2011800434575A
Authority: CN
Inventors: M.施尔文; E.贝恩; M.布比斯; I.吉尼斯
Original assignee: Macrocure Ltd
Current assignee: Macrocure Ltd
Priority date: 2010-09-09
Filing date: 2011-09-08
Publication date: 2013-07-17
Also published as: BR112013005610A2; US9168287B2; EP2613765A2; US20160089420A1; EA201390314A1; AU2011300430A2; AU2011300430C1; AU2011300430B2; JP2013537889A; US9439950B2; MX2013002539A; SG188266A1; WO2012032418A3; US20130224148A1; CA2810629A1; WO2012032418A2; AU2011300430A1; AU2011300430B9

Abstract

本发明公开治疗性活化白血球调节上清液、它们的制备方法，以及使用所述调节上清液来修复伤口或促进伤口愈合的方法。

Description

活化白血球调节上清液以及用于伤口愈合的用途

相关申请的交叉引用

本申请要求2010年9月9日提交的临时申请序列No.61/381,296的权益，所述临时申请的公开内容以引用的方式并入本文中。

发明背景

伤口愈合过程涉及白细胞的参与，白细胞又名白血球。白血球包括粒细胞、单核细胞和淋巴细胞。不同类型的粒细胞包括嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞。单核细胞分化成巨噬细胞，所述巨噬细胞负责吞噬组织碎片或侵入性外来物质。三种常见淋巴细胞类型为T细胞、B细胞和自然杀伤细胞。T细胞和B细胞在识别身体内抗原中起到重要作用(Parkin，2001)。自然杀伤(NK)细胞通过改变主要组织相容性复合物(MHC)的水平来鉴别受感染细胞，并且破坏受感染细胞(Moretta，2008)。

伤口愈合过程以三个重叠阶段发生。(Li，2007；Broughton，2006；Tsirogianni，2006；Singer，1999；Martin，1997)。第一阶段为发炎阶段。所述发炎阶段的特征在于嗜中性粒细胞募集，接着是单核细胞募集到伤口部位，在伤口部位所述嗜中性粒细胞和所述单核细胞杀死并吞噬细菌(Agaiby，1999)。

称为增殖阶段的第二伤口愈合阶段涉及形成新肉芽组织。纤维母细胞增殖并迁移到伤口空间中，并且合成胶原蛋白以及细胞外基质的其它组分(Greiling，1997)。同时，发生血管生成，从而向代谢活性新肉芽组织提供养分和氧(Tonnesen，2000)。来自完整表皮的角质细胞开始在临时基质上迁移并且开始增殖，从而为新上皮组织引路(Kim，1992)。

重塑是伤口愈合中的第三阶段以及最终阶段。其特征在于纤维母细胞分化成肌纤维母细胞，肌纤维母细胞使伤口边缘收缩并闭合在一起(Tomasek，2002)。通过降解和再合成来重塑胶原蛋白纤维使伤口通过胶原蛋白纤维再定向来获得强度(由生长因子密切控制的过程)(Werner，2003)。

白血球在愈合过程的参与在很大程度上与它们的细胞因子和生长因子的产生相关(Keen，2008)。白血球子集的募集由化学引诱物细胞因子(趋化因子)调节，所述化学引诱物细胞因子如为活化并选择性引导各种白血球子集来到伤口的介白素(IL)-8、生长调节蛋白α(GRO-a)和单核细胞趋化性蛋白-1(MCP-1)(Rossi和Zlotnik，2000)。粒细胞产生蛋白酶并且活性氧中间体巨噬细胞(Macrophage)产生促炎细胞因子和生长因子(Riches，1996)。促炎细胞因子(包括介白素1-α和1-β(IL-1-α和IL-1-β)、IL-6和肿瘤坏死因子(TNF)-α)在伤口修复的发炎阶段和增殖阶段都起到重要作用。这些细胞因子还调节免疫反应。血管生成由低氧、氧化氮(NO)、VEGF和纤维母细胞生长因子2(FGF-2)加强(Liekens，2001)。TGF-β通过募集纤维母细胞以及刺激它们的胶原蛋白I、III和V、蛋白聚糖、纤连蛋白和其它ECM组分的合成来促进纤维变性过程。TGF-β同时抑制蛋白酶(C.U.Niesler和M.WJ.Ferguson，2001)。PDGF由血小板以及活化巨噬细胞、内皮细胞和纤维母细胞释放，其在调节纤维母细胞和平滑肌细胞募集和增殖室中起主要作用(C.H.Heldin和B.Westermark，1999)。类似地，淋巴细胞除为免疫学效应细胞之外还产生生长因子(Blotnik，1994)，并且在伤口愈合晚期促进组织重塑。

治疗伤口的挑战经常由患有多种病理(如糖尿病、冠状动脉病和高血压)的患者加重。这些疾病因各种生理条件而具有加重血管并发症的常见作用。伤口引发的并发症可引起发病率和死亡率提高(Doshi，2008)。

常规伤口治疗包括手术清创术、抗生素疗法和各种敷料(Moran，2008；Fonder，2008)。对常规治疗具有抗性的伤口也称为难愈合伤口。这些伤口导致生活质量降低并且可导致发病率和死亡率提高。因此，需要持续用于伤口愈合的有效组合物和方法。

发明概述

本发明的一个方面涉及用于制备由活化白血球调节的大致上无细胞上清液(活化白血球调节上清液(“ALCS”))的方法。在一些实施方案中，方法包括以下步骤：a)在活化白血球的时间和温度条件下(例如在约室温至约37℃的温度下持续约90分钟至约24小时，并且在一些实施方案中在室温下持续约8小时至约20小时)孵育人白血球(在本文中也称为第一次孵育)；b)使白血球经受低渗透压休克(例如通过使白血球与生理学上可接受的水溶液(如蒸馏水)接触来实现)；c)以有效恢复等渗性的量向步骤b的白血球中添加生理学上可接受的盐溶液；d)混合步骤c的白血球与培养基如血清(其可与白血球获自同一血样或不同血样)以形成孵育组合物；e)在调节培养基的时间和温度条件下孵育组合物，因此产生ALCS(在本文中也称为第二次孵育)；以及f)从e)的孵育组合物分离至少一些白血球和其它细胞物质，以便产生大致上无细胞ALCS。

在另一实施方案中，本发明涉及制备大致上无细胞活化白血球调节上清液(ALCS)的方法，所述方法包括以下步骤：a)在活化白血球的时间和温度条件下孵育人白血球；b)使白血球经受低渗透压休克；c)以恢复等渗性的量向步骤b)的白血球中添加盐溶液，接着从所得溶液分离白血球；d)混合步骤c)白血球与血清以形成孵育组合物；e)在提高孵育组合物中至少一种细胞因子或生长因子的浓度的时间和温度条件下孵育所述孵育组合物；以及f)从e)的孵育组合物分离白血球和其它细胞物质，以便产生大致上无细胞ALCS。

在一些实施方案中，步骤a)的孵育在约12℃至约28℃的温度下发生，持续约8小时至约20小时的时间范围。在其它实施方案中，步骤a)的孵育在约18℃至约24℃的温度下发生，持续约8小时至约12小时的时间范围。在又其它实施方案中，步骤a)的孵育在12℃至约28℃的温度下发生，持续约90分钟、超过2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时或12小时至约20小时的时间范围。在另其它实施方案中，步骤a)的孵育在最高约37℃的温度下发生并且持续5小时至约24小时的时间范围。

在一些实施方案中，在白血球粘着和/或含有包含白血球激动剂或粘着分子的支架的容器中进行步骤a)。

在一些实施方案中，步骤b)包括使白血球与水或低渗盐溶液接触约25秒至约45秒。

在一些实施方案中，a)的白血球和d)的血清获自同一供体。在其它实施方案中，a)的白血球和d)的血清获自不同供体。

在一些实施方案中，如下获得d)的血清：g)使单独的人血浆样本与凝结剂接触，其中a)的血浆和白血球可获自同一供体或不同供体，以及h)去除凝结的固体，其中g)中的接触与a)的孵育大致上同时进行。在某些情况下，g)的血清在接触白血球之前被冷冻。此外，在某些实施方案中，血浆获自AB+供体。在某些实施方案中，凝结剂是CaCl₂。

在又其它实施方案中，本发明涉及制备大致上无细胞ALCS活化白血球调节上清液(ALCS)的方法，所述方法包括：a)获得活化白血球；b)使活化白血球与孵育培养基接触以形成孵育组合物；c)在足以提高孵育组合物中至少一种细胞因子或生长因子的浓度的温度和时间下孵育所述孵育组合物；以及d)从孵育组合物去除白血球以产生大致上无细胞ALCS活化白血球调节上清液(ALCS)。

在涉及制备ALCS的方法的任一实施方案中，可在室温下孵育孵育组合物约8小时至约18小时至72小时的时间。或者，可在约37℃下孵育孵育组合物约1小时至约5小时的时间。

另外，在涉及制备ALCS的方法的任一实施方案中，方法可进一步包括冷冻、冻干或冷冻干燥ALCS。

同样地，在涉及制备ALCS的方法的任一实施方案中，方法可进一步包括混合在制备第一ALCS后剩余的白血球与第二血清或其它生理学培养基以形成第二孵育组合物；在提高孵育组合物中至少一种细胞因子或生长因子的浓度的时间和温度条件下孵育第二孵育组合物，因此产生第二ALCS样本；以及从第二孵育组合物分离白血球和其它细胞物质，以便产生大致上无细胞ALCS的第二样本。

在利用血清的那些实施方案中，血清可获自血浆样本，血浆样本可获自已在约37℃下与凝结剂接触的同一或不同全血样本(即，来自同一人或不同人)。在一些实施方案中，接触可在与a)中白血球孵育大致上同时的时间，接着从凝结血浆样本分离血清。在其它实施方案中，血清或血浆获自商业性或非盈利性供应商，并且可为新鲜的或者呈存放相容形式，如被冷冻。

在一些实施方案中，由活化白血球调节上清液是在一般介于约1小时至约18小时的范围内并且在约22℃至约37℃下的时间和温度条件下进行。

另一方面，本发明涉及通过本发明方法产生的大致上无细胞活化白血球调节上清液。

又一方面，本发明涉及大致上无细胞活化白血球调节上清液，所述上清液包含至少约1000pg/mL人IL-8、至少约10-20pg/mL人IL-6，以及至少约20pg/mL人TNFα。

在其它方面，本发明涉及用于治疗伤口的本发明的大致上无细胞活化白血球调节上清液。在一些实施方案中，伤口是褥疮性溃疡、压迫性溃疡、下肢溃疡、腱炎、深胸骨伤口、手术后伤口、躯体区域的难愈合的手术后伤口、在采集大隐静脉后的大隐静脉伤口、静脉曲张性溃疡、烧伤、战场伤口或肛裂。在一些实施方案中，下肢溃疡是在糖尿病患者中。在一些实施方案中，伤口是静脉曲张性溃疡、压迫性溃疡或手术后溃疡。

在其它方面，本发明涉及任一用于抑制伤口开始感染的本发明的大致上无细胞活化白血球调节上清液。在一些实施方案中，伤口由外伤导致。在某些实施方案中，外伤由手术导致。

本发明的另一方面涉及治疗伤口(也称为促进伤口愈合)的方法，所述方法包括向伤口施用或以其它方式涂覆如本文所述的大致上无细胞活化白血球调节血清(ALCS)(包括通过本文所述的制备方法产生的ALCS)，或包含ALCS和敷料、支架或基质的制品。因此，本发明还涉及如本文所述的大致上无细胞ALCS(包括通过本文所述的制备方法产生的ALCS)或包含ALCS和敷料、支架或基质的制品在治疗伤口或促进伤口愈合的方法中的用途。

在一些实施方案中，伤口是褥疮性溃疡、压迫性溃疡、下肢溃疡、腱炎、深胸骨伤口、手术后伤口、躯体区域的难愈合的手术后伤口、在采集大隐静脉后的大隐静脉伤口、静脉曲张性溃疡、烧伤、战场伤口或肛裂。在一些实施方案中，下肢溃疡是在糖尿病患者中。在一些实施方案中，伤口是静脉曲张性溃疡、压迫性溃疡或手术后溃疡。

本发明的另一方面涉及抑制伤口开始感染的方法，所述方法包括向伤口施用或以其它方式涂覆如本文所述的大致上无细胞活化白血球调节血清(ALCS)(包括通过本文所述的制备方法产生的ALCS)，或包含ALCS和敷料、支架或基质的制品。因此，本发明还涉及如本文所述的大致上无细胞ALCS(包括通过本文所述的制备方法产生的ALCS)或包含ALCS和敷料、支架或基质的制品在抑制伤口开始感染的方法中的用途。

在一些实施方案中，伤口由外伤导致。在某些实施方案中，外伤由手术导致。

在任一涉及向伤口涂覆本发明ALCS的实施方案中，可将ALCS注入伤口中、注入包围伤口的组织中、涂覆于开放性伤口或经由敷料涂覆于伤口。另外，在任一涉及向伤口涂覆本发明ALCS的实施方案中，ALCS可来源于自体血样或来源于同种异体血样。

在其它方面，本发明针对一种制品，所述制品包含本发明的大致上无细胞活化白血球调节上清液以及敷料、支架或基质。在一些实施方案中，敷料是纱布、绷带、非粘着性网状物、膜、箔、泡沫或组织粘着剂。在其它实施方案中，敷料是选自以下的保水障壁：糊剂、乳膏、软膏、非渗透性或半渗透性膜或箔、水状胶体、水凝胶或其组合。在其它实施方案中，敷料是抗微生物敷料。

在那些涉及支架或基质的实施方案中，支架或基质在植入之前可为固体。或者，支架或基质可为在植入后固化的凝胶。

本文所用的术语上清液“调节(conditioning)”和“调节上清液”是指细胞因子(至少IL-8)和生长因子浓度大于正常生理学水平并且有效用于伤口愈合的上清液。分离白血球的步骤f)可经由离心或重力沉降进行，所述离心或重力沉降使得白血球以可容易地从液体部分分离的细胞团块形式聚集，以制备大致上无细胞活化白血球调节上清液的一个实施方案。

本发明提供若干优势，包括例如有效愈合伤口的组合物，所述组合物含有高浓度细胞因子和生长因子，但大致上无细胞。这种特征允许协调使用麻醉剂与适用于伤口愈合的其它药物，所述其它药物可能另外不利地与白血球相互作用。组合物的大致上无细胞性质还进一步降低由免疫细胞(如粒细胞和淋巴细胞)导致的有害副作用的可能性。因此，可使用较高浓度的白血球以调节上清液，从而提高其中生物学上活性激动剂的量。组合物可就起始物质来说在无供体-患者匹配的严格准则下制备。组合物受到冷冻或冻干，因此提供较长保存期限和就用途来说的多功能性。举例来说，一批的一部分可被冷冻并且用于其它施用，因此避免从同一供体获得额外血液的需要。这种特征还提供较均一并且较安全的产品。此外，在从液体部分去除后，即刻或在短暂存放之后，活化白血球可用以调节新一份血清。因此，方法允许再使用活化白血球来制备其它批调节血清。

附图简述

图1示意性描绘用于产生本发明的ALC组合物的代表性系统的第一部分，所述第一部分包括袋A-C(第1组)，其为血液存放袋或容器，其中袋A含有从供体采集的浓缩的红细胞；袋B含有血浆；并且袋C含有白血球(其从全血初始分离之后形成通常称为白细胞层(buffy coat)的层)。

图2A示意性描绘用于产生本发明的ALC组合物的代表性系统的第二部分，在含RBC的袋A从系统去除并且来自图1的袋B和袋C与袋1-5(第2组)密接(weld)后，所述第二部分包括7袋之组；并且图2B展示6袋之组，其可代替图2A中的袋1-5加以使用。

详述

血液在本文中定义为全血或任一其构成部分(例如血浆、白血球、血小板或红细胞)。可存在于本发明ALCS中的可溶性因子的量可低于或高于完全血液中的可溶性因子的量。

本文关于任何并且所有值(包括数值范围的下端和上端)所用的术语“约”表示任何值都具有+/-0.5％至+/-20％(以及其间的值，例如±1％、±1.5％、±2％、±2.5％、±3％、±3.5％、±4％、±4.5％、±5％、±5.5％、±6％、±6.5％、±7％、±7.5％、±8％、±8.5％、±9％、±9.5％、±10％、±10.5％、±11％、±11.5％、±12％、±12.5％、±13、±13.5％、±14％、±14.5％、±15％、±155％、±16％、±165％、±17％、±175％、±18％、±185％、±19％、±19.5％和±20％)的可接受偏差范围。

除非上下文另外明确规定，否则本文以及随附权利要求中所用的单数形式“一个”、“一种”、“或”以及“所述”包括复数指示物。

实践本发明方法的起始物质可获自若干来源。全血或其一种或多种组分(例如白血球和血浆)可获自自体来源或同种异体来源。在本发明的一个实施方案中，从最终将用ALCS治疗的患者采集血样，所述血样在本文中称为自体血样或来源。在来源(即，血液或它的组分)获自除预定ALCS接受者之外的个体(其称为同种异体血样或来源)的实施方案中，这些起始物质可方便地获自血库。可通过血库针对红细胞抗原的不规则抗体以及可输血传播的疾病对样本进行筛选。更具体来说，筛选可用抗体使用Abbott PRISM仪器针对以下来进行：B型肝炎、C型肝炎、HIV1/2、HTLV和梅毒(Syphilis)(-HCV；HbsAg；抗HIV1/2O+；以及抗HTLV I/II)。也可通过分子方法(NAT-核酸测试)针对HIV、HCV和HBV来筛选样本。分子筛选可使用可商购获得的仪器配置(例如Chiron的TIGRIS系统)实现。

在那些涉及同种异体来源的实施方案中，样本可获自具有相同血型的作为预定ALCS接受者的供体。在其它实施方案中，样本可获自具有任何血型的供体，所述任何血型包括不同于预定ALCS接受者的血型。举例来说，因为白血球在制备ALCS的过程中大致上被去除，所以当使用血浆或血清时，血浆或血清可获自替代性来源，如具有AB+血液的供体，其为血浆和血清的通用供体。血浆和/或血清可为新鲜的、被存放(例如在1-6℃下存放小于24小时)、被干燥或以其它方式预处理(例如病原体减少的血浆和/或血清和溶剂/清洁剂(SD)处理的血浆和/或血清)。用以制备本发明的一些实施方案的血浆可为新鲜的或存放在1-6℃下小于24小时，或为新鲜冷冻血浆或干燥血浆，或病原体减少的血浆，或溶剂/清洁剂(SD)处理的血浆。白血球可获自具有任何血型的患者。与来源无关，样本的所有必需处理都可在无需高度专业化仪器的情况下进行。

现参考图1和图2来描述制备本发明的ALCS组合物的示例性实施方案，图1和图2说明含有两组互连无菌袋的系统。密封系统以便不会暴露于外部环境。具体地说，连接两组的管密接在一起，也即接合，以形成一个使用无菌连接装置的系统(例如Terumo的

-II目录号ME-203AH)。更具体来说，为确保与无菌性标准的顺应性，管的密接和切割是通过通常在约300℃(但无菌性可通过在较低或甚至较高温度下预热来有效达到)下预热特别圆片(wafer)来进行。这种高温提高密接程序的无菌性。为进一步确保无菌性，密接可在100,000级别容积区域内的100级别生物安全柜(Biological Safety Cabinet)中进行。

如这些图中说明，系统含有两个无菌袋组。含有袋A、袋B和袋C的第1组是常用于输血的标准的可商购获得的三个一组的袋组。经由静脉穿刺在血库中采集体积通常为约400ml至约550ml的人血样，并且放入袋A中，接着使用标准技术分级分离成它的组分部分，装入袋A、袋B和袋C中。举例来说，离心含有血样的袋A。离心之后，例如使用Baxter制造的血液组分提取器来分离血液组分。将含有白血球的白细胞层放入袋C中，血浆放入袋B中并且红血球保留在袋A中。因此，由于这个过程，因此袋A含有浓缩的红血球；袋B含有血浆；并且袋C含有白细胞层，所述白细胞层含有白血球(以及可能残余血浆和红血球)。或者，血液组分可经由本领域中已知的机采技术(apheresis technique)从全血分离。

接着使袋A与三袋组断开。如图2所说明，接着密接袋B和袋C以定做输注袋1-5(第2组)以形成用以依次制备活化白血球混悬液和ALCS的系统。如这些实施方案中所述，袋1-5的体积分别是500ml、50ml、50ml、100ml和500ml。如上文所公开，用无菌连接装置进行密接。

用于白血球的第一次孵育和第二次孵育的袋1含有200ml无菌过滤空气。如果袋1能透气，那么不需要气袋。也可处理或另外改进透气袋以使它们变得对白血球具有粘着性。举例来说，袋可含有支架，如粘着性珠粒和/或白血球激动剂，如补体蛋白、干扰素-α、干扰素-γ和介白素-12。白血球对袋表面的粘着性可能益于它们释放可溶性激动剂的能力。袋可由粘着性塑料或正规塑料制成，所述塑料以如变得粘着的方式处理(电晕放电、液气等离子体等)，或用细胞外基质蛋白涂布或被化学修饰。支架可呈不同形状，并且具体来说可为生物可降解微珠或生物不可降解微珠。支架或珠粒可为生物可降解或生物不可降解，例如由胶原蛋白或PLA、PGA(聚乳酸、聚乙醇酸)或类似合成聚合物、透明质酸、海藻酸盐或纤维蛋白密封层制成。珠粒可为合成水凝胶珠粒、明胶珠粒、用粘着受体涂布的珠粒、活化刺激物或刺激性抗体。接着可离心出具有粘着性细胞的支架或珠粒以及所有其它细胞。而且，产品中另外不需要的刺激物将连同支架或珠粒一起消除。

袋2含有溶液(例如20ml缓冲氯化钠溶液(8.91％NaCl，USP)，或任何其它生理学上可接受的含有无机离子、有机渗透物(如蔗糖)的溶液，或一些其组合，如乳酸林格氏(Ringer′s)(哈特曼氏(Hartmann′s))溶液)，所述溶液用以使白血球在低渗透压休克后恢复等渗性。当将氯化钠溶液加入200ml蒸馏水(在袋5中)中时，其变成0.9％NaCl溶液。袋3含有20ml无菌过滤空气。袋4含有溶液(例如约60ml缓冲氯化钙溶液(1.17％CaCl₂二水合物，USP)，其用于凝结袋B中的血浆，并且帮助分离成血小板和血清。袋5含有约200ml水。

在一个替代实施方案中，可使用图2B中说明的6袋组来代替图2A中说明的袋1-5。其它额外的袋帮助维持清洁室制备位置的无菌性。在本发明方法的这个实施方案中，在分离成白细胞层、血浆和RBC后，将如先前所述的白血球从袋C转移到无菌袋1，并且将血浆放入也无菌的第六袋中，接着使6袋系统从原始三个一组的袋组分离。

所述组被包装成单一单元并且使用高压蒸汽灭菌，从而极大降低患者继发性感染的风险。

接着将白血球从袋C转移到袋1中，并且在袋维持在垂直或平坦位置时并且在使白血球变活化的活化条件(包括时间和温度)下孵育。

出于本发明的目的，在本发明的各个方面和实施方案中，“白血球活化”定义为涉及至少一个阶段的过程，通过所述阶段，细胞(白血球)经历从静止状态到功能活性状态的过渡，伴随有生物活性物质的合成或预合成物质(例如细胞因子，如IL-8)从细胞质移位到细胞膜或它们被释放到细胞外培养基中。

“上清液”是已通过离心、重力沉降、过滤或其它细胞去除方法变得大致上无细胞的细胞外培养基。

出于本发明的目的，在本发明的各个方面和实施方案中，“大致上无细胞”上清液定义为每毫升含有少于约1×10⁶个白血球的上清液。在一些实施方案中，大致上无细胞上清液每毫升含有少于约1×10⁵个、约1×10⁴个、约1×10³个、约1×10²个或约1×10¹个白血球。在一些实施方案中，大致上无细胞上清液是检测不到白血球的上清液。

白血球活体内活化可涉及细胞靠近血管壁迁移并沿血管壁迁移(由P-选择蛋白(以及CD42b表达提高)介导)、白血球对内皮壁的粘着性提高、散布和外渗(由与内皮配体ICAM-1和ICAM-2相互作用的活化CD11b以较大程度介导)；经由与细胞外基质蛋白(例如层粘连蛋白)相互作用迁移到炎症中心，以及对发炎刺激物的功能反应，如呼吸爆发、脱颗粒、吞噬作用以及释放细胞因子。

出于本发明的目的，白血球活化由至少一个，但经常是两个或更多个以下若干指标指示。白血球活化的一个指标是白血球群体(包括粒细胞、单核细胞和淋巴细胞)上活化形式CD11b受体的表达提高，和/或CD62L表达水平较低，CD62L是一种选择蛋白粘着受体，其从白血球表面脱落，从而促进白血球经由CD11b对内皮细胞的坚固粘着性。在一些实施方案中，白血球也可显示CD69(一种淋巴细胞特异性活化标记)水平提高、表达血小板标记42B(由于活化粒细胞和单核细胞与白细胞层中残余血小板之间经由p-选择蛋白的相互作用)，和/或IL-8产量提高。白血球活化的其它标志可包括以下一者或多者的产量提高：蛋白质或多肽、脂质、糖、氧自由基和用作粘着分子的其它生物化学部分、除IL-8外的细胞因子、生长因子、酶、转录因子以及细胞信号转导受体和介质。由未经受孵育的“新鲜白细胞层”(如本文所述)中所含的白血球的观点来评估这些分子中任一者的改变的表达水平。一旦白血球活化，它们便保持活化，并且如本文所述可达到较高活化水平，例如CD11b表达水平甚至更高；CD69表达水平更高或甚至更高，以及CD62L表达水平甚至更低。另外，白血球一旦活化便可进一步提高它们产生细胞因子(如IL-8、IL-6、TNF-α和VEGF)的能力。实施例中提供指示白血球活化的细胞表面标记和所分泌可溶性因子的其它实例。因此，“活化白血球组合物”是包含显示至少一个活化标志的白血球的组合物。在一些实施方案中，活化白血球进一步包含血小板。

在一些实施方案中，通过使白血球在室温下静置来简单孵育白血球。出于本发明的目的，室温是指在约12℃至约28℃，并且在一些实施方案中在约16℃至约25℃，约18-25℃以及约20-25℃的范围内的温度。孵育时期可视温度而变化并且一般从约30分钟至约24小时变化。活化白血球需要的孵育时间将粗略地与进行孵育所处的温度成反比。因此，温度越高，孵育时间越短。举例来说，在使白血球在室温下静置的实施方案中，孵育时间一般在自约90分钟、以及超过2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23小时或超过24小时的范围(以及其子范围，包括例如最少时间为自90分钟、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时或以上的任何时间)内。在优选实施方案中，孵育时间在约3小时、4小时、5小时、6小时、7小时或8小时至约20小时的范围内。在一个更优选实施方案中，白血球孵育在约18℃至约24℃下发生，持续约8小时至约12小时。在其它实施方案中，白血球孵育涉及使其暴露于热，例如在高于室温并且最高约37℃的温度下。在高温下的孵育时期一般是在30分钟、45分钟、60分钟或90分钟至约2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时或12小时(以及甚至更多，呈小时增量)至约24小时的范围(以及其子范围，包括例如最少时间为自30分钟、45分钟、60分钟或90分钟、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时等的任何时间)内的任何时间。

孵育之后，一般使白血球混悬液经受低渗透压休克。在优选实施方案中，即刻(即，在完成前述步骤后未经任何插入步骤或不必要的延迟，通常小于2分钟)进行低渗透压休克。举例来说，在图中所述的系统中，低渗透压休克可通过将蒸馏水从袋5转移到含有白血球的袋1中来起始。低渗透压休克处理通常进行约25-45秒。因为据信损失较少CD4+T细胞，所以优选这范围内的更短时间。已知CD4+T细胞产生各种可益于伤口愈合的细胞因子(例如IFNγ、IL-2、IL-4、IL-17)。在这个步骤之后，并且优选地在其后即刻，白血球恢复等渗性。再次参考图中所述的系统，作为一个示例性实施方案，这通过将氯化钠溶液从袋2转移到袋1来实现。氯化钠溶液与水中细胞混悬液的体积比一般是约1∶10。

在恢复等渗性的处理之后，离心整个系统。这个过程去除在两个先前步骤过程中添加的水和盐溶液，并且防止白血球暴露于(红血球)溶血产物。由于离心结果，因此白血球形成团块。离心之后，将上清液从袋1转移到袋C中，并且将袋1中因离心而形成的白血球团块重悬于血清中或用于通过白血球进行调节的其它培养基中。

在一个实施方案中，血清通过一系列分离步骤获得，所述一系列分离步骤可与第一次白血球孵育同时进行，所述第一次白血球孵育要求血浆与如CaCl₂的凝结剂接触。这个过程引起形成主要是纤维蛋白链与血小板聚集体的血块。由于这种处理，所得血清的残余血小板水平一般在每μL约0个至约0.2×10³个的范围内。因此，在这个实施方案中，将CaCl₂从袋4转移到袋B中。通常使现含有血浆与CaCl₂的组合物的袋B在约37℃的温度下凝结。尽管在这个实施方案中血浆保持与凝结剂接触与孵育白血球大致上相同时期以达到活化目的，但血浆可保持与凝结剂接触不同时间和大致上较短的时间，例如约90分钟至约24小时。

使袋1中在恢复等渗性和离心后获得的白血球团块与约20ml至约200ml或更多的袋B血清(其可与白血球获自相同或不同血样)混合以形成在这种情况下包含血清的孵育组合物。

尽管已描述了使用示例性袋系统制备的活化白血球，但可使用如下制备的任何组合物以提供用于制备活化白血球调节上清液的活化白血球：孵育白血球一段时间以使白血球从静止状态过渡到功能活性状态、使白血球经受低渗透压休克，以及恢复白血球组合物的等渗性。

另外，尽管在孵育组合物中经常使用血清(具体来说是人血清)，但也可使用其它培养基，只要所述其它培养基是支持从活化白血球释放细胞因子、生长因子和/或其它可溶组分的生理学培养基。举例来说，可使用血浆来代替血清。也可使用的其它孵育培养基包括可能添加有糖和对于细胞生存力和功能来说必需的其它组分(如氨基酸)的培养基，或盐水或缓冲盐水溶液(例如乳酸林格氏溶液(LactatedRinger′s solution)、乙酸林格氏溶液、汉克氏平衡盐溶液(Hank′sbalanced salt solution；HBSS)、厄尔氏平衡盐溶液(Earle′s balanced saltsolution；EBSS)、标准盐水柠檬酸盐(SSC)、HEPES缓冲盐水(HBS)、格氏平衡盐溶液(Gey′s balanced salt solution；GBSS))。盐水溶液和培养基可补充有人血清或临床级血清，或血清取代物。孵育组合物可选地或另外地含有血清蛋白，如人白蛋白或牛白蛋白、γ-球蛋白、转铁蛋白或来自不同组织的其它蛋白质、植物蛋白或植物提取物。此外，如干扰素-γ的激动剂可加入孵育组合物中以促进可溶性激动剂从细胞释放。

孵育组合物是在调节上清液的时间和温度条件下孵育，因此产生活化白血球调节上清液。这些条件包括约室温的温度(即，在约12℃至约28℃，并且在一些实施方案中约16℃至约25℃、约18-25℃以及约20-25℃的范围内)至约37℃。孵育时间一般是在30分钟、45分钟、60分钟或90分钟至约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18、24、36、48、60小时至约72小时或甚至更长时间的范围内的任何值。在一些实施方案中，在室温下孵育组合物约1小时至约48小时，例如在约18℃至约24℃下约8小时至约18小时，或约1小时、约24小时或约48小时。在其它实施方案中，在约37℃下孵育组合物约1小时至约5小时，或约30分钟、约60分钟，或约5小时。因此，因为白血球分泌到上清液中，众多细胞因子、生长因子和其它可溶性生物学上活性分子在所述过程结束时以超标准浓度(即，高于从正常非病原性供体分离的血清中的浓度，并且在自体血清的情况下，高于具有伤口的患者的血清中的浓度)存在于上清液中，所以上清液变得被调节。为刺激产生和分泌细胞因子，可将如干扰素-γ的激动剂加入孵育组合物中。如工作实施例中所示，由于第二次孵育，因此白血球达到较高活化水平，例如CD11b和具体来说CD69的表达水平甚至更高、CD62L的表达水平甚至更低，以及IL-8和其它细胞因子和生长因子的产量提高。

在这第二次孵育之后，白血球例如通过离心、重力沉降、过滤或其它细胞去除方法大致上去除。在一些实施方案中，完全去除白血球以提供无细胞ALCS。举例来说，在那些利用袋系统的实施方案中，再次离心整个袋系统(以使袋1中白血球团块从ALCS分离)。或者，使具有白血球和调节血清的袋1在离心之前与系统分离，使新的空袋(图2中未显示)与袋1密接(即接合)，接着离心这两个袋以从ALCS分离白血球团块。在离心之后，将袋1的液体部分转移到系统中的剩余空袋中或转移到新袋中。

在那些通过离心去除白血球的实施方案中，离心力一般在300g-10,000g的范围内并且离心时间在5分钟-60分钟之间。在那些需要减少或消除残余血小板的实施方案中，使用1000g以上的重力(g-force)以使血小板也将是团块。较高速度(约10,000g)可用于那些需要减少或消除残余红血球、RBC残留物和其它碎片的实施方案中。

根据本发明的一个方面，ALCS的至少一种细胞因子、生长因子或可溶性介质(选自IL-8、PDGF、Ang-1、VEGF、IL-6、TNFα或IL-1β)的浓度为用以制备产生所述ALCS的孵育组合物，但在使培养基与活化白血球组合物接触之前的相同培养基中所述相同细胞因子、生长因子或可溶性介质的浓度的至少约1.25、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10倍或更多倍。举例来说，在一些实施方案中，ALCS的至少一种细胞因子、生长因子或可溶性介质(选自IL-8、PDGF、Ang-1、VEGF、IL-6、TNFα、IL-1β，或其组合或子组合)的浓度为表7中所述的未调节血清的IL-8、PDGF、Ang-1、VEGF、IL-6、TNFα或IL-1β水平的至少约1.25、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10倍或更多倍(包括或不包括标准偏差)。在一些实施方案中，较高浓度是相对于至少IL-8、至少PDGF、至少Ang-1、至少VEGF、至少IL-6、至少TNFα或至少IL-1β来说。在其它实施方案中，较高浓度是相对于IL-8、PDGF、Ang-1、VEGF、IL-6、TNFα或IL-1β中至少两者、至少三者、至少四者、至少五者、至少六者或所有七者来说。

在这个程序之后，大致上无细胞ALCS可被冷冻，或冻干或冷冻干燥。从维持细胞因子和生长因子活性的观点来看，添加剂，如防腐剂(例如抗氧化剂、糖(如海藻糖)、氯化钠)可能有益。也可存放白血球团块，由此允许再用以调节其它培养基以提供额外的ALCS。

在那些利用血清和/或血浆的实施方案中，应注意尽管用于本发明的各个方面的血清和/或血浆可与活化白血球组合物(从相同或不同血样)同时制备，但在替代实施方案中，血清和/或血浆与活化白血球组合物独立地制备。举例来说，血清和/或血浆可获自商业性或非盈利性血液产品供应商。血清和/或血浆可新近获自一个或多个供体，或它可已存放一段时间并且可冷冻存放。此外，因为用以制备血清和/或血浆的血样无需与用以制备活化白血球的血样相同(无论它们来自相同供体与否)，所以它们的制备无需与活化白血球组合物的制备在相同实际地点或同时发生。

在那些在使用之前存放ALCS的实施方案中，其可存放在室温下、冷藏或冷冻。在那些在室温下存放ALCS的实施方案中，其保存期限范围是它产生之后最多约5天，例如在它产生之后约12小时、24小时、48小时、72小时或更多小时。

在那些冷藏存放ALCS的实施方案中，其保存期限为至少约7天或更多天，例如至少约1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周或8周，或约1-2周、约1-3周、约1-4周、约1-5周、约1-6周、约1-7周或约1-8周。

在那些冷冻存放ALCS的实施方案中，其可冷冻存放，接着在需要时解冻。在一些实施方案中，冷冻ALCS的保存期限为至少约1周至1个月，或至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个月或11个月至1年，或至少约1年、至少约2年或至少约3年。

在其它实施方案中，ALCS组合物可从较小体积的血样制备，所有溶液的体积以及较小袋的使用都相称地减少。此外，使用这些不同尺寸的袋和不同体积的血清得到具有不同浓度可溶性物质的ALCS。甚至在这些实施方案中，同种异体血样或自体血样可用作起始物质。如在紧急情况下，在治疗具有否则健康免疫系统但罹患一些类型的外伤伤口(例如战场病状和战斗病状)的患者时，使用较小体积向临床医师提供自主进行血液采集，而不使用外部血库的能力。在这些实施方案中，可省去对可传播疾病和抗原的测试。然而在这些情况下，具有难愈合伤口的患者不是用于有效ALCS制备的临床上可接受的献血者。当产生这种情况时，ALCS将通过本文所述的手段从同种异体供体产生。

罹患伤口的患者可能受到生理损害或否则是健康的。举例来说，由于代谢系统已受损，因此糖尿病和其它医学上受损的患者是来源于异源血液的ALCS的候选者，这是因为他们自己的白血球对于所述程序来说可能不是最优的。然而，否则健康的患者(如在外伤患者的实例中)也是本发明的ALCS组合物的良好候选者。

本发明适用于治疗和促进任何类型伤口的愈合。在一些实施方案中，将ALCS，例如大致上无细胞ALCS作为唯一的活性伤口愈合剂施用至伤口。在其它实施方案中，其与其它治疗药征(modality)组合使用。例如用标准注射器或类似涂覆装置的涂覆容易性使得本发明的ALCS组合物安全并易于使用。

适于用本发明进行的治疗的伤口通常呈活组织的烧伤、刺伤、割伤或撕伤的形式。皮肤伤口可穿透表皮、真皮或在完整厚度伤口的情况下穿透皮下组织。因此，适于用本发明组合物和方法进行的治疗的伤口的代表类型包括烧伤(例如由暴露于火或对皮肤高度腐蚀的试剂导致)、溃疡(例如褥疮性溃疡或任何其它压迫性溃疡、静脉曲张性溃疡和糖尿病性溃疡)、腱炎、深胸骨伤口(例如在开心脏术之后)；在冠状动脉重建术以及采集大隐静脉后的大隐静脉手术伤口；以及在腹部手术和任何其它类型手术后的手术后伤口。其它伤口是由外伤引起的伤口，如在战斗或其它暴力活动期间产生的伤口，包括由枪击、刀或任何能导致皮肤切伤或撕伤的其它物件导致的伤口。口腔(例如牙齿)伤口，以及作为医药副作用或作为各种病理的症状(例如与卡波氏肉瘤(Kaposi′s Sarcoma)相关的痛处)出现的伤口，以及内部伤口(例如肌肉组织破裂，如肛裂)，和胃肠道伤口或病变，如胃部或肠部溃疡)也可适于用本发明进行的治疗。

ALCS也可用以治疗任何由血管机能不全而加重的伤口。出于本发明的目的，血管机能不全是指血液循环不充分，从而导致对患病区域的灌注不足。这机能不全可由外伤(例如与骨折相邻的血管结构的损伤)或各种病理(例如糖尿病和动脉粥样硬化)导致。在任一情况下(外伤诱发或疾病诱发)，血管机能不全都降低有效伤口愈合的可能性。ALCS可适用于改善这些患者的伤口愈合结果并且应根据本文所述的方法来施用。另外，治疗方案(treatment algorithm)不应受限于伤口严重度或伤口类型，或血管机能不全的程度。在呈现最严重伤口和血管机能不全的患者中，ALCS可能较有效。

活化白血球调节上清液特别适用于治疗糖尿病性足溃疡和褥疮性溃疡。褥疮性溃疡是由卧床不起患者体表的长期压力和血流量受阻导致的皮肤和深部组织的慢性压迫性溃疡(Berlowitz，2007)。褥疮性溃疡导致老年人发病和死亡。至少48％IV期压迫性溃疡在治疗一年之后仍未愈合。(Girouard，2008)。罹患褥疮的患者通常还患有共病态病理，如糖尿病和高血压。这些病理进一步使褥疮的成功治疗复杂化。

在其它方面，本发明涉及抑制伤口开始感染的方法，所述方法包括向伤口施用本发明组合物。在一个实施方案中，伤口由外伤导致。在另一实施方案中，伤口由手术导致。

在那些涉及治疗伤口的方法的方面，伤口也可通过向伤口施用包含本发明组合物的制品来治疗。

一般来说，涂覆活化白血球调节血清是借助于一次或多次将ALCS直接注入伤口或包围伤口的组织中来实现。ALCS可直接涂覆到开放性伤口中。注射器中的全部样本可配置，并且如果依据临床参数确定其它ALCS为必需的，那么临床医师可选择施用所述额外的ALCS。

可将ALCS注入各种位置的伤口。在一个实施方案中，对于伤口的全部长度，约每一厘米至约每三厘米进行注射。在各注射部位，注射0.1-0.3ml ALCS。在其它实施方案中，整个注射器可一次性注入伤口内的单一部位。

为了注入伤口中，优选的是使用鲁尔锁(Luer-Lock)注射器或在注射器与针之间具有锁定机构的任何其它可商购获得的注射器。伤口(具体来说是压伤)的生物间隔经常受限。当注入伤口中时，有导致注射器与针分离的压力风险。使用锁定注射器消除这种风险。如果将18G或更大针用于抽吸，那么将其与在22-35G尺寸范围内的针交换以便注入伤口中。

当不可能注入伤口组织中时，ALCS可直接涂覆到伤口空腔中。这种方法中的涂覆可用注射器或管进行直接涂覆来进行。

ALCS可借助于敷料涂覆于伤口部位或其周围。干敷料包括纱布和绷带、非粘着性网状物、膜和箔、泡沫以及组织粘着剂。保水障壁敷料包括糊剂、乳膏和软膏、非渗透性或半渗透性膜或箔、水状胶体、水凝胶，以及组合产品。生物活性敷料包括抗微生物敷料、相互作用性敷料、单组分生物敷料和组合产品(例如软膏、凝胶剂、纤维蛋白密封剂、生长因子和血管生成因子(例如PDGF、VEGF、胶原蛋白)。在一些实施方案中，用浸泡在ALCS中的无菌纱布填充伤口。敷料(例如无菌纱布垫)可充满组合物，如乳酸林格氏(哈特曼氏)溶液、含海藻酸盐的敷料、聚氨基甲酸酯敷料或羧甲基纤维素敷料，涂覆所述敷料来覆盖伤口，接着涂覆干敷料。如果主题伤口被高度感染，那么可涂覆银敷料，如Silverlon。注射后敷料的选择是依据临床医师的决定。商业可得性、既往临床成功史和患者耐受性是在选择伤口敷料中考虑的所有因素。敷料可定期去除，例如通常在约24小时之后去除以例如用无菌水和肥皂冲洗伤口。

在另一实施方案中，使ALCS在施用之前与生理惰性和/或可再吸收的基质或支架组合。基质或支架可由适于植入人中的任何材料形成。举例来说，基质或支架可包含任何生物相容性材料，包括胶原蛋白、透明质酸或明胶、泡沫或其组合。胶原蛋白可获自任何来源，包括从人组织或其它产生胶原蛋白的哺乳动物的组织制备的胶原蛋白。ALCS与基质/支架材料的组合可形成借助于压力配合或通过注射向人施用的泡沫、凝胶或油灰。这允许将ALCS持续递送到有利于患者的部位。泡沫可包含纤维蛋白密封剂。在一些实施方案中，ALCS与基质/支架材料的混合物是以商业方式制备并且预混合着提供给健康保健提供体。在其它实施方案中，健康保健提供体在向人施用之前混合ALCS与基质/支架。

ALCS可涂覆于伤口一次，或一旦临床医师确定是否必需再涂覆一次，便可涂覆于伤口多于一次，例如在4周之后涂覆。可考虑的因素包括伤口尺寸(宽度、长度和深度)增大、化脓、发热或指示顽固伤口感染的任何其它迹象或症状，其使得再治疗得到批准。除再治疗外，可在临床医师认为适当的任一点指示转诊以便手术清创术。

ALCS可与任何其它常规伤口治疗结合使用，所述常规伤口治疗如为温热(治疗热)、电刺激、磁、激光光线疗法、摆线振动疗法和超声波。它也可与生物学疗法一起使用，生物学疗法如为幼体疗法、皮肤取代物、培养角质细胞(Epicel，Genzyme biosurgery)、人皮肤替代法(Dermagraft，Smith and Nephew Inc.)、尸源性处理真皮(Alloderm，LifeCell Corporation)、双层皮肤等效物(Apligraf，Organogenesis Inc.)、TransCyte(Smith and Nephew Inc.)、生长因子(PDGF是目前唯一许可表面使用的生长因子)，以及纤维蛋白密封剂。在一些实施方案中，ALCS与VAC结合使用，VAC是一种由KCI制造的可商购获得的伤口疗法。VAC通过向伤口施加负压来促进伤口愈合。在这些实施方案中，ALCS在VAC疗法之前优选地涂覆于伤口。在又其它实施方案中，ALCS与高压疗法结合使用(Thackham，2008)。举例来说，ALCS可就在患者接受高压疗法之前涂覆于伤口。ALCS也可与低能冲击波疗法(例如脉冲为每厘米伤口长度约0.1mJ/mm²；5Hz)结合使用。参见例如Dumfarth等，Ann.Thorac.Surg.86：1909-13(2008)。

在治疗后，可评估伤口的长度、宽度和高度测量值。通常，当这些参数的所有测量值都可忽略时，认为伤口愈合。ALCS也可提供止痛作用。

现将根据以下非限制性实施例来描述本发明的方面。

实施例1-细胞活化分析。

通过分析各种白血球群体(粒细胞、单核细胞和淋巴细胞)上的细胞表面标记(即CD11b、CD62L和CD69)来表征根据本发明的用于调节血清的优选实施方案制备的活化白血球组合物。

CD11b是ICAM-1(CD54)和其它配体的粘着受体。它主要在粒细胞和单核细胞/巨噬细胞上表达，但也在淋巴细胞上以较低水平表达。在白血球活化时，CD11b在细胞表面上的表达增高。另外，CD11b改变构形。活化形式的CD11b由抗体CBRM1/5识别。非活化形式的CD11b由不同抗体(D12)识别。

CD62L是来自选择蛋白家族的粘着受体。它在所有类别的白血球(包括粒细胞、单核细胞和淋巴细胞)上都组成型表达。在活化时，白血球表面快速脱落CD62L。

CD69是淋巴细胞活化抗原。在活化时，淋巴细胞表面上CD69表达很早就增高。

在以下三个时间点对白血球取样：在制备方法开始之前即刻(新鲜白细胞层(FBC)；就在第一次孵育之后(孵育的白细胞层(IBC))；以及在活化过程结束时(EAP)，意思是在低渗透压休克之后，接着在37℃下与血清一起第二次孵育90分钟。在各时间点，用针对相应活化标记的特异性单克隆抗体标记白血球，接着通过流式细胞测量术分析。

对于抗体染色来说，以PBS/0.02％叠氮化钠洗涤来自各时间点的细胞，并且以0.5×10⁶/100μl重悬于FACS染色液(PBS，2％正常小鼠血清；0.02％叠氮化钠)中。将100μl细胞混悬液的等分试样与适当单克隆抗体在+4℃下在黑暗中一起孵育30分钟。在孵育之后，用红血球溶解缓冲液处理细胞、洗涤、重悬于PBS中，并且在FACSCalibur流式细胞仪(Becton Dickinson)上分析。使抗-CD11b和抗-CD62L抗体与藻红素(PE)缀合，并且使CD69抗体与异硫氰酸萤光素(FITC)缀合。为了更好地区分白血球群体，用CD11b标记的细胞也用针对单核细胞标记CD14的与别藻蓝蛋白(allophycocyanin；APC)缀合的抗体双标记，并且用CD62L抗体标记的细胞也用粒细胞标记CD15-APC双标记。为了鉴别T淋巴细胞和B淋巴细胞，用CD69抗体染色的细胞也用抗-CD3-APC抗体和抗CD19-APC抗体双染色。将在相同条件下用不相关但同型匹配的抗体(以及抗-CD14或抗-CD15，或抗-CD3/CD19抗体)染色的细胞用作阴性对照。单核细胞确定为CD14鲜明阳性细胞，并且粒细胞鉴别为CD14微暗阳性细胞或CD15鲜明阳性细胞(具有高侧光散射性质(SSC))。T淋巴细胞确定为CD3阳性细胞并且B淋巴细胞确定为CD19阳性细胞。4-6个这些实验的结果概述于表1、表2和表3中。数据是以染色细胞+/-标准偏差的平均萤光强度形式呈现。

表1中所示的数据证明，在所有白血球群体上与新鲜白细胞层(FBC)相比，由一般(D12)与抗活化形式(CBRM1/5)抗体两者都识别的CD11b的表达水平在活化过程结束时(EAP)显著增高。活化形式CD11b的上调较显著。

表1：白血球群体上指示白血球活化的CD11b表达。

表2：白血球群体上指示白血球活化的CD62L表达。

表3：T淋巴细胞和B淋巴细胞上指示它们活化的CD69表达。

制备方法的不同阶段的CD62L表达的比较证明，它已在经过孵育的白细胞层(IBC)的阶段在所有白血球群体上都大幅并且显著地降低。在活化过程结束时(EAP)，CD62L水平可忽略(表2)。

如表3中所示，CD11b上调和CD62L下调符合特异性淋巴细胞活化标记CD69的表达，所述CD69的表达从几乎无表达增高到适度但显著水平。

实施例2-在血清中孵育期间由活化白血球分泌细胞因子的分析。

根据本发明的一个优选实施方案，离心含有10×10⁶个细胞的活化白血球组合物，并且将细胞团块重悬于5ml血清中。在不同孵育时间点在37℃下使用R&D系统的最优化ELISA板来测量IL-8和其它细胞因子的浓度。平行测量用于白血球重悬的血清(无白血球)中细胞因子的浓度(pg/ml)，并且从在活化白血球存在下产生的值中减去。IL-8的五个实验的结果以平均值±标准偏差的形式概述于表4中。各种细胞因子和生长因子(GF)的其它实验的结果概述于表5中(n＞10)。

表4.由活化白血球释放到血清中的IL-8的浓度(pg/ml)。

表5.由活化白血球释放到血清中的细胞因子和生长因子的浓度(pg/ml)

表4和表5中呈现的数据证明活化白血球支持IL-8和与伤口愈合有关的其它细胞因子和生长因子持续释放到上清液中至少5小时的能力。

实施例3.从原料(新鲜白细胞层)和从中间体以及在制备方法结束阶段取样的白血球释放细胞因子和生长因子的能力的比较。

在以下三个时间点对白血球取样：在制备方法开始之前即刻(新鲜白细胞层(FBC))；就在第一次孵育之后(孵育的白细胞层(IBC))；以及在活化过程结束时(EAP)，意思是在低渗透压休克之后，接着在37℃下与血清一起第二次孵育90分钟。根据本发明的一个优选实施方案，在各时间点，离心含有10×10⁶个细胞的白血球组合物，并且将细胞团块重悬于5ml培养基(RPMI)或对应于各样本的原始培养基(血浆对应于新鲜白细胞层，并且血清对应于孵育的白细胞层和最终产物)中。在37℃下，各样本的白血球在RPMI中孵育1小时，并且在血浆/血清中孵育5小时，并且使用R&D系统的最优化ELISA板来测量在这些时期内释放的各种细胞因子的浓度。尽管RPMI不含有任何细胞因子，但平行测量用于白血球重悬的相应血浆或血清(无白血球)中细胞因子的浓度(pg/ml)，并且从在活化白血球存在下产生的值中减去。结果以平均值±标准偏差(n＝3-6)的形式概述于表6中。

表6.在制备方法的不同阶段取样的白血球的细胞因子和生长因子释放的比较。

表6中呈现的数据证明，尽管原料(白细胞层)的白血球具有较低的释放细胞因子的能力，但白血球的细胞因子释放在制备方法期间增大并且在制备结束时最大。根据本发明的一个优选实施方案，当在制备结束时将活化白血球重悬于血清中时，与RPMI中的释放相比，细胞因子释放要高2-3倍。

实施例4.最终产物中细胞因子含量的分析。

测量在室温下与活化白血球一起孵育1小时、24小时和48小时后的最终产物(在细胞通过离心沉淀之后)的液体部分中与伤口愈合有关的各种细胞因子和生长因子的浓度。使用eBioscience的最优化ELISA板进行测定。结果以平均值±标准偏差(n＞10)的形式概述于表7中。

表7.在制备结束后的各种时刻的细胞因子含量

表7中所示的数据证明在制备结束时，ALCS含有显著量的相关细胞因子和生长因子。当根据本发明的一个优选实施方案使活化白血球与血清一起预孵育的时间延长时，细胞因子浓度增大。在由活化白血球调节之前使用的血清中各自细胞因子和生长因子(除Ang-1以外)的含量显著较低，是1/3-1/2。

申请中引用的出版物的列表

J Parkin等，An Overview of the Immune System.Lancet.2001；357：1777-1789。

A Moretta等，Human NK Cells：From HLA Class I-Specific KillerIg-like Receptors to the Therapy of Acute Leukemias.Immunol.Rev.2008年8月；224：58-69。

J.Li等，Pathophysiology of Acute Wound Healing.ClinicalDermatol.2007年1月-2月；25(1)：9-18。

G.Broughton第2等，Wound Healing：An Overview.Plast ReconstrSurg.2006年6月；117(7增刊)：1e-S-32e-S。

AK Tsirogianni等，Wound Healing：Immunological Aspects.Injury.2006年4月；37增刊1：S5-12.Epub2006。

AJ Singer等，Cutaneous Wound Healing.New Eng.J.Med.1999；341(10)：738-46。

P.Martin，Wound Healing-Aiming For Perfect Skin Regeneration.Science1997；276(5309)：75-81。

AD Agaiby等，Immuno-Inflammatort Cell Dynamics DuringCutaneous Wound Healing.J.Anat.1999年11月；195(Pt4)：531-42。

D.Rossi，Zlotnik，A.The biology of chemokines and their receptors.Annu.Rev.Immunol.2000，18，217-242.13。

DWH Riches，Macrophage Involvement In Wound Repair，Remodeling and

In The Molecular and Cellular Biology ofWound Repair，(1996)lnd edn(Clark RAF编著)，第95±141页.NewYork，London：Plenum Press。

D.Greiling等，Fibronectin Provides a Conduit for FibroblastTransmigration from Collagenous Stroma into Fibrin Clot ProvisionalMatrix.J.Cell.Sci.1997；110：861-70

MG Tonnesen等，Angiogenesis In Wound Healing.J.Investig.Dermatol.Symp.Proc.2000；5(1)：40-6。

JP Kim等，Mechanisms of Human Keratinocyte Migration onFibronectin：Unique Role of RGD Site and Integrins.J.Cell.Physiol.1992；151：443-50。

JJ Tomasek等，Myofibroblasts and Mechano-Regulation ofConnective TissueRemodelling.Nat.Rev.Mol.Cell.Biol.(2002)3；349-363

S Werner等，Regulation of Wound Healing by Growth Factors andCytokines.Physiol Rev.2003年7月；83(3)：835-70。

D.A.Keen，Review of Research Examining the Regulatory Role ofLymphocytes inNormal Wound Healing.J.Wound Care.2008。

S.Liekens等，Angiogenesis：regulators and clinical applications.Biochem Pharmacol.2001年2月1日；61(3)：253-70。

C.U.Niesler和M.WJ.Ferguson.“TGF-beta superfamily cytokinesin wound healing”in TGF-beta and Related Cytokines in Inflammation.Breit，S.N.和S.M.Wahl编著，Birkhauser，Basel，2001第173-198页。

C.H.Heldin和B.Westermark.Mechanism of action and in vivo roleof platelet-derived growth factor.Physiol Rev.1999年10月；79(4)：1283-316。

S.Blotnik，T lymphocytes synthesize and export heparin-bindingepidermal growth factor-like growth factor and basic fibroblast growthfactor，mitogens for vascular cells and fibroblasts：differential productionand rrlease by CD41 and CD81 T cells.Proc.Natl.Acad.Sci.USA199491，2890-2894。

BM Doshi等，Wound Healing From a Cellular Stress ResponsePerspective.Cell Stress Chaperones.2008年12月；13(4)：393-9。

GJ Moran等，Antimicrobial Prophylaxis for Wounds and Proceduresin the Emergency Department.Infect.Dis.Clin.North Am.2008。

MA Fonder等，Treating the Chronic Wound：A Practical Approachto the Care of Nonhealing Wounds and Wound Care Dressings.J.Am.Acad.Dermatol.2008年2月；58(2)：185-206。

JA Thackham等，The Use of Hyperbaric Oxygen Therapy to TreatChronic Wounds：AReview.Wound Repair Regen.2008，1998年5月-6月；16(3)：321-30。

DR Berlowitz等，Are all pressure ulcers the result of deep tissueinjury？AReview of the Literature.Ostomy Wound Manage.2007年10月；53(10)：34-8。

K.Girouard等，The symptom of pain with pressure ulcers：a reviewof the literature.Ostomy Wound Manage.2008年5月；54(5)：30-40，32。

Dumfarth等，Prophylactic low-energy shock wave therapy improveswound healing after vein harvesting for coronary artery bypass graftsurgery：a prospective，randomized trial.Ann Thorac Surg.2008年12月；86(6)：1909-13。

说明书中引用的所有出版物(包括专利出版物和非专利出版物两者)都指示本发明所属领域的技术人员的技能水平。所有这些出版物都以引用的方式并入本文中，引用程度如同各个别出版物特定地并且个别地被指示以引用的方式并入一样。

尽管本文中已参考具体实施方案描述了本发明，但应了解这些实施方案仅说明本发明的原理和应用。因此应了解，可对说明性实施方案进行众多改进，并且可设计其它安排而不背离本发明的精神和范畴，本发明的精神和范畴由随附权利要求界定。

Claims

1.用于治疗伤口的大致上无细胞活化白血球调节上清液(ALCS)，其中如下制备所述ALCS：

a)获得活化白血球；

b)使所述活化白血球与孵育培养基接触以形成孵育组合物；

c)在足以提高所述孵育组合物中至少一种细胞因子或生长因子的浓度的温度和时间下孵育所述孵育组合物；以及

d)从所述孵育组合物去除白血球以产生大致上无细胞ALCS活化白血球调节上清液(ALCS)。

2.用于治疗伤口的大致上无细胞活化白血球调节上清液(ALCS)，其中所述组合物包含至少约1000pg/mL人IL-8、至少约10-20pg/mL人IL-6，和至少约20pg/mL人TNFα。

3.用于治疗伤口的大致上无细胞活化白血球调节上清液(ALCS)，其中如下制备所述ALCS：

a)在活化所述白血球的时间和温度条件下孵育人白血球；

b)使所述白血球经受低渗透压休克；

c)以恢复等渗性的量向步骤b)的所述白血球加入盐溶液，接着从所得溶液中分离所述白血球；

d)混合步骤c)的所述白血球与血清以形成孵育组合物；

e)在提高所述孵育组合物中至少一种细胞因子或生长因子的浓度的时间和温度条件下孵育所述组合物；以及

f)从e)的所述孵育组合物中分离所述白血球和其它细胞物质以产生大致上无细胞ALCS。

4.如权利要求1、2或3中任一项所述的ALCS，其中所述伤口是褥疮性溃疡、压迫性溃疡、下肢溃疡、腱炎、深胸骨伤口、手术后伤口、躯体区域的难愈合的手术后伤口、在采集大隐静脉后的大隐静脉伤口、静脉曲张性溃疡、烧伤、战场伤口或肛裂。

5.如权利要求4所述的ALCS，其中所述下肢溃疡是在糖尿病患者中。

6.如权利要求4所述的ALCS，其中所述伤口是静脉曲张性溃疡、压迫性溃疡或手术后溃疡。

7.用于抑制伤口开始感染的大致上无细胞活化白血球调节上清液(ALCS)，其中如下制备所述ALCS：

a)获得活化白血球；

b)使所述活化白血球与孵育培养基接触以形成孵育组合物；

d)从所述孵育组合物去除白血球以产生大致上无细胞活化白血球调节上清液(ALCS)。

8.用于抑制伤口开始感染的大致上无细胞活化白血球调节上清液(ALCS)，其中所述ALCS包含至少约1000pg/mL人IL-8、至少约10-20pg/mL人IL-6，和至少约20pg/mL人TNFα。

9.用于抑制伤口开始感染的大致上无细胞活化白血球调节上清液(ALCS)，其中如下制备所述ALCS：

a)在活化所述白血球的时间和温度条件下孵育人白血球；

b)使所述白血球经受低渗透压休克；

d)混合步骤c)的所述白血球与血清以形成孵育组合物；

10.如权利要求7、8或9中任一项所述的ALCS，其中所述伤口是由外伤导致。

11.如权利要求10所述的ALCS，其中所述外伤是由手术导致。

12.如权利要求1、2、3、7、8或9中任一项所述的ALCS，其中所述ALCS被注入所述伤口中。

13.如权利要求1、2、3、7、8或9所述的ALCS，其中所述ALCS被注入包围所述伤口的组织中。

14.如权利要求1、2、3、7、8或9所述的ALCS，其中所述ALCS被涂覆到所述开放性伤口中。

15.如权利要求14所述的ALCS，其中所述ALCS经由敷料涂覆于所述开放性伤口。

16.如权利要求15所述的ALCS，其中所述敷料是干敷料、障壁敷料或生物活性敷料。

17.如权利要求1、2、3、7、8或9中任一项所述的ALCS，其中所述ALCS来源于自体血样。

18.如权利要求1、2、3、7、8或9中任一项所述的ALCS，其中所述ALCS来源于同种异体血样。

19.用于治疗伤口的方法，所述方法包括向所述伤口施用大致上无细胞活化白血球调节上清液(ALCS)，其中如下制备所述ALCS：

a)获得活化白血球；

b)使所述活化白血球与孵育培养基接触以形成孵育组合物；

20.用于治疗伤口的方法，所述方法包括向所述伤口施用大致上无细胞活化白血球调节上清液(ALCS)，其中所述组合物包含至少约1000pg/mL人IL-8、至少约10-20pg/mL人IL-6，和至少约20pg/mL人TNFα。

21.用于治疗伤口的方法，所述方法包括向所述伤口施用大致上无细胞活化白血球调节上清液(ALCS)，其中如下制备所述ALCS：

a)在活化所述白血球的时间和温度条件下孵育人白血球；

b)使所述白血球经受低渗透压休克；

d)混合步骤c)的所述白血球与血清以形成孵育组合物；

22.如权利要求19、20或21中任一项所述的方法，其中所述伤口是褥疮性溃疡、压迫性溃疡、下肢溃疡、腱炎、深胸骨伤口、手术后伤口、躯体区域的难愈合的手术后伤口、在采集大隐静脉后的大隐静脉伤口、静脉曲张性溃疡、烧伤、战场伤口或肛裂。

23.如权利要求22所述的方法，其中所述下肢溃疡是在糖尿病患者中。

24.如权利要求22所述的方法，其中所述伤口是静脉曲张性溃疡、压迫性溃疡或手术后溃疡。

25.用于抑制伤口开始感染的方法，所述方法包括向所述伤口施用大致上无细胞活化白血球调节上清液(ALCS)，其中如下制备所述ALCS：

a)获得活化白血球；

b)使所述活化白血球与孵育培养基接触以形成孵育组合物；

26.用于抑制伤口开始感染的方法，所述方法包括向所述伤口施用大致上无细胞活化白血球调节上清液(ALCS)，其中所述ALCS包含至少约1000pg/mL人IL-8、至少约10-20pg/mL人IL-6，和至少约20pg/mL人TNFα。

27.用于抑制伤口开始感染的方法，所述方法包括向所述伤口施用大致上无细胞活化白血球调节上清液(ALCS)，其中如下制备所述ALCS：

a)在活化所述白血球的时间和温度条件下孵育人白血球；

b)使所述白血球经受低渗透压休克；

d)混合步骤c)的所述白血球与血清以形成孵育组合物；

28.如权利要求25、26或27中任一项所述的方法，其中所述伤口是由外伤导致。

29.如权利要求28所述的方法，其中所述外伤是由手术导致。

30.如权利要求19、20、21、25、26或27中任一项所述的方法，其中所述ALCS被注入所述伤口中。

31.如权利要求19、20、21、25、26或27中任一项所述的方法，其中所述ALCS被注入包围所述伤口的组织中。

32.如权利要求19、20、21、25、26或27中任一项所述的方法，其中所述ALCS被涂覆到所述开放性伤口中。

33.如权利要求32所述的方法，其中所述ALCS经由敷料涂覆于所述开放性伤口。

34.如权利要求33所述的方法，其中所述敷料是干敷料、障壁敷料或生物活性敷料。

35.如权利要求19、20、21、25、26或27中任一项所述的方法，其中所述ALCS来源于自体血样。

36.如权利要求19、20、21、25、26或27中任一项所述的方法，其中所述ALCS来源于同种异体血样。

37.制备大致上无细胞ALCS活化白血球调节上清液(ALCS)的方法，所述方法包括：

a)获得活化白血球；

b)使所述活化白血球与孵育培养基接触以形成孵育组合物；

38.制备大致上无细胞活化白血球调节上清液(ALCS)的方法，所述方法包括以下步骤：

a)在活化所述白血球的时间和温度条件下孵育人白血球；

b)使所述白血球经受低渗透压休克；

c)以恢复等渗性的量步骤b)的所述白血球加入盐溶液，接着从所得溶液中分离所述白血球；

d)混合步骤c)的所述白血球与血清以形成孵育组合物；

e)在提高所述孵育组合物中至少一种细胞因子或生长因子的浓度的时间和温度条件下孵育所述孵育组合物；以及

39.如权利要求38所述的方法，其中步骤a)的所述孵育在约12℃至约28℃的温度下发生，持续约8小时至约20小时的时间范围。

40.如权利要求39所述的方法，其中步骤a)的所述孵育在约18℃至约24℃的温度下发生，持续约8小时至约12小时的时间范围。

41.如权利要求38所述的方法，其中步骤a)的所述孵育在约12℃至约28℃的温度下发生，持续约90分钟、超过2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时或12小时至约20小时的时间范围。

42.如权利要求38所述的方法，其中步骤a)的所述孵育在最高约37℃的温度下发生并且持续5小时至约24小时的时间范围。

43.如权利要求38所述的方法，其中步骤a)在白血球粘着和/或含有包含白血球激动剂或粘着分子的支架的容器中进行。

44.如权利要求38所述的方法，其中步骤b)包括使所述白血球与水或低渗盐溶液接触约25秒至约45秒。

45.如权利要求38所述的方法，其中a)的所述白血球和d)的所述血清获自同一供体。

46.如权利要求38所述的方法，其中a)的所述白血球和d)的所述血清获自不同供体。

47.如权利要求38所述的方法，其中d)的所述血清是通过g)使单独的人血浆样本与凝结剂接触，其中a)的所述血浆和所述白血球可以获自同一供体或不同供体；和h)去除凝结的固体，其中g)中的所述接触与a)的所述孵育大致上同时进行。

48.如权利要求47所述的方法，其中g)的所述血清在接触白血球之前冷冻。

49.如权利要求47所述的方法，其中所述血浆获自AB+供体。

50.如权利要求47所述的方法，其中所述凝结剂是CaCl2。

51.如权利要求37或38所述的方法，其中所述孵育组合物在室温下持续约8小时至约18小时至72小时的时间。

52.如权利要求37或38所述的方法，其中所述孵育组合物在约37℃下孵育约1小时至约5小时的时间。

53.如权利要求37或38所述的方法，所述方法进一步包括冷冻、冻干或冷冻干燥所述ALCS。

54.如权利要求38所述的方法，所述方法进一步包括

i)混合步骤f)的所述白血球与第二血清以形成第二孵育组合物；

j)在提高所述孵育组合物中至少一种细胞因子或生长因子的浓度的时间和温度条件下孵育所述第二孵育组合物，因而产生所述ALCS的第二样本；以及

k)从j)的所述第二孵育组合物分离所述白血球和其它细胞物质，以便产生所述大致上无细胞ALCS的第二样本。

55.大致上无细胞活化白血球调节上清液，其通过如权利要求37或权利要求38所述的方法产生。

56.大致上无细胞活化白血球调节上清液，其包含至少约1000pg/mL人IL-8、至少约10-20pg/mL人IL-6，和至少约20pg/mL人TNFα。

57.制品，所述制品包含如权利要求55或56所述的大致上无细胞活化白血球调节上清液以及敷料、支架或基质。

58.如权利要求57所述的制品，其中所述敷料是纱布、绷带、非粘着性网状物、膜、箔、泡沫或组织粘着剂。

59.如权利要求57所述的制品，其中所述敷料是选自以下的保水障壁：糊剂、乳膏、软膏、非渗透性或半渗透性膜或箔、水状胶体、水凝胶或其组合。

60.如权利要求57所述的制品，其中所述敷料是抗微生物敷料。

61.如权利要求57所述的制品，其中所述支架或基质在植入之前是固体。

62.如权利要求57所述的制品，其中所述支架或基质是在植入之后固化的凝胶。