KR20000067911A - 면역글로불린 용액의 저온살균방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 면역글로불린 용액의 저온살균방법으로서, 20 내지 40% w/v 소르비톨 또는 25 내지 45% w/v 슈크로스의 존재 하에 pH 4.0 내지 6.0, 온도 50℃ 내지 70℃에서 1 내지 20 시간 가열시키는 공정을 포함하고, 단백질 농도가 약 3% w/v 이하 또는 그 이하인 면역글로불린 용액의 저온살균방법을 제공한다.

본 발명에 의하면 낮은 응집률, 낮은 항보체 활성 및 정맥 주사용 조제 요건을 만족시키는 변함없는 기능적 활성을 가지는 면역글로불린 제제가 형성되어, 저온살균 과정을 거친 후 정제나 IgG 변환 과정을 추가적으로 실시할 필요가 없다.

Description

면역글로불린 용액의 저온살균방법 {PASTEURIZATION OF IMMUNOGLOBULIN SOLUTIONS}

제조공정시 면역글로불린이 변성되면 면역글로불린 분자가 응집되고 해당 분자의 기능이 상실될 수 있으며, 면역글로불린이 응집된 상태에서 환자의 혈관에 주입되면 보체 폭포현상(complement cascade)으로 인해 역반응을 초래할 수 있다. 종래에는 응집반응을 저지하고 보체결합을 줄이기 위하여 면역글로불린 분자의 Fc 부분을 변화시키거나, 최종산물에서 응집된 면역글로불린의 양을 줄일 수 있는 제조방법을 사용함으로써 이와 같은 문제를 해결해왔다.

면역글로불린의 다양한 기능을 고려해볼 때, 면역글로불린이 화학적 변화를 거치지 않고, 보체의 작용을 포함하여 Fc가 관련된 기능을 유지하는 것이 바람직하다. 즉, 정맥 주사용으로 화학적으로 변화되지 않은 IgG를 제조하기 위해서는 응집물 생성이 최소화되고, 제품 보전기간 중에도 응집물 함량이 3%를 넘지않는 것이 중요하다(British Pharmacopoeia (BP), 1994).

혈장 단백질 제품(plasma protein products) 제조시 중요한 문제 중의 하나는 바이러스 불활성화 단계에서 바이러스는 불활성화하되 면역글로불린 및 기타 단백질은 변성시키지 않도록 하는 것이다. 이와 같이 변환되지 않은 면역글로불린 제품을 생성하기 위하여 pH농도를 낮게하여 배양하는 방법 및 용매/계면활성제 처리법이 주로 사용되었다. 이 두가지 방법은 지질막으로 싸인 바이러스에는 효과적이나 그렇지 않은 바이러스에는 효과적이지 못하다. 알부민 제제에 널리 이용되는 저온살균방법(60℃, 10시간)은 지질막으로 싸이지 않은 바이러스와 지질막으로 싸인 바이러스에 모두 효과적이나, 이를 면역글로불린에 이용하기에는 어려움이 있다. 면역글로불린은 알부민보다 쉽게 열변성되므로 응집반응을 저지하기가 어렵기 때문이다.

이런 면역글로불린 용액의 저온살균방법으로 마그닌 등(Magnin et al. 1989)에 의해 단백질 농도와 이온강도 및 pH를 낮게 유지한 상태에서 IgG를 저온살균하는 방법이 개시되었다. 열처리시 IgG의 응집 정도는 이온강도, 단백질 농도, 온도 및 고온에 노출된 시간에 비례하여 증가하는 것으로 알려져있다. 마그닌 등이 제안한 저온살균된 제품은 안정제가 없어 용액상태로 저장되는 동안 급속히 응집물이 생성된다.

히라오 등(Hirao et al., 1989)에 의해 개시된 IgG 저온살균방법은 마그닌 등에 의한 방법과 유사하나 저온살균 단계에서 IgG를 안정시키기 위해 소르비톨이 포함된다. 이의 바람직한 예로 이온강도가 낮고(0.001 이하), pH4.5∼6.5, 소르비톨 농도 10%∼70% w/v에서 저온살균(바람직하게는 60℃, 10시간)하는 방법에 개시되었다. 여기에서 단백질 농도는 제한되지 않았으나, 이 방법은 단백질 농도 0.1 내지 30% w/v 의 범위에서 작용하는 것으로 알려져있다.

노왁 등(Nowak et al. 1992)에 의해 개시된 IgG의 저온살균방법에서는 살균저온처리 단계에서 IgG를 안정시키기 위하여 고농도의 슈크로스 및 글리신이 사용되었다. 정맥 주사 제제로 사용할 때에는 안정제를 제거하고, 펩신 존재 하에 pH가 낮은 상태에서 인큐베이션하거나, 변환된 면역글로불린을 생성하는 S 술폰화(S sulphonation)과정을 거쳐 처리된다. 이러한 면역글로불린 분자의 변환은 보체 활성 IgG 응집물을 감소시키며, 항보체 활성을 위한 조제 요건을 만족시키게 된다.

본 발명의 목적은 낮은 응집률, 낮은 항보체 활성 및 정맥 주사용 조제 요건을 만족시키는 변함없는 기능적 활성을 가지는 면역글로불린 제제를 형성하기 위한 면역글로불린 용액, 특히 IgG 용액의 저온살균방법을 제공하는 데 있다. 이에 따르면, 저온살균 과정을 거친 후 정제나 IgG 변환 과정을 추가적으로 실시할 필요가 없다.

본 발명은 열처리에 관한 것으로 더 자세하게는 면역글로불린 용액, 특히 면역글로불린 G(Immunoglobulin G, IgG) 용액의 저온살균방법에 관한 것이다.

치료용 IgG 용액 제조시 바이러스를 불활성화시키기 위하여 저온살균방법이 사용될 수 있다. 이 방법은 면역글로불린의 생리 기능을 유지할 수 있는 조건에서 진행되는 것이 바람직하며 또한, 안정된 생성물을 만들어 추가적인 정제 과정을 거칠 필요가 없도록 하는 것이 바람직하다.

도 1(a)은 면역글로불린을 60℃에서 10시간 저온살균할 때의 pH에 따른 응집 생성정도를 보여준다.

도 1(b)는 60℃에서 10시간 저온살균할 때의 단백질 농도가 응집에 미치는 영향 및 해당 제제의 안정도를 보여준다.

도 2 는 60℃에서 10시간 저온살균할 때 단백질 농도 및 소르비톨 농도가 응집활성에 미치는 영향을 보여준다.

본 발명은 20 내지 40% w/v 소르비톨이나 25 내지 45% w/v 슈크로스의 존재하에 해당 용액을 pH4.0 내지 6.0, 온도 50 내지 70℃에서 1 내지 20 시간동안 가열하는 공정이 포함된 IgG 용액 등의 면역글로불린 용액 저온살균방법을 제공한다.

상기 저온살균방법은 이온 강도가 낮은 상태에서 실시하는 것이 바람직하다. (전도도 1.0mS/cm 이하. 더 바람직하게는 0.3 mS/cm 이하)

본 발명은 또한 위에 포괄적으로 기술된 처리방법에 의해 준비된 저온살균 면역글로불린 제제에도 적용된다.

본 발명에서 별도의 언급이 없는 한, 서술된 요소를 포함함을 의미하는 "포함된"이나 "포함된다"란 표현은 서술되지 않은 요소 등을 배제함을 의미하지는 않는다.

본 발명은 치료 효과를 유지하는 저온살균 면역글로불린 제제, 특히, 응집 및 항보체 활성 수준이 치료용으로 허용가능한 범위에 있는 저온살균 면역글로불린 제제 생성법을 제공한다. 본 방법에 따라, 정제된 면역글로불린 시료는 일 예로 60℃에서 10시간 등에서 저온 살균된 후, 응집물을 제거하기 위한 별도의 정제과정이나, 항보체 활성을 저하시키기 위한 변환과정을 거칠 필요없이 조제되고 사용될 수 있다.

본 발명에 의한 방법 중 저온살균 과정에서 소르비톨이 안정제로 사용된 경우는 히라오 등(1989)에 의해 포괄적으로 개시된 방법에 적용된 조건과 유사한 조건이 이용되지만, 본 발명에서는 단백질 농도가 중요한 척도로 사용된다는 차이점이 있다. 이 방법의 바람직한 실시예에서 면역글로불린 용액은 20∼40% w/v의 소르비톨(바람직하게는 20∼33% w/v) 및 단백질 농도 약 3% w/v 이하, pH4.0∼6.0(바람직하게는 4.0∼5.0), 50∼70℃(바람직하게는 60℃)인 조건에서 1∼20시간 동안(바람직하게는 10시간) 저온살균된다. 슈크로스가 안정제로 사용된 본 발명의 바람직한 예에서, 면역글로불린 용액은 25∼45% w/v 의 슈크로스 (바람직하게는 30∼40% w/v), 단백질 농도 약 3% w/v 로 pH4.0∼6.0(바람직하게는 4.4∼5.4) 및 50∼70℃(바람직하게는 60℃)에서 1∼20시간 동안(바람직하게는 10시간) 저온살균된다. 연관된 연구을 통해서 단백질 농도가 이보다 높을 경우 예를 들어 5% w/v 등 일때 과도하게 응집이 일어나고, 생성물이 액상으로 제조되었을 경우 저장기간 중 응집반응이 더욱 진행되는 경향이 발견되었다. 따라서, 저온살균이 이 같은 조건에서 실시되면 적절한 응집물 및 안정성을 갖는 제품을 생산하기 위해 추가적인 정제 단계가 요구된다(Uemura et al. 1989). 이 같은 과정은 바이러스를 담은 배치(batch) 재오염 가능성을 증대시키고, 일부 생성물 손실을 초래하고, 또한 제조공정을 복잡하게한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에서는, 크로마토그래피로 얻어진 면역글로불린 용액이 20-33% w/v 소르비톨의 존재하에 단백질 농도 3% w/v 이하, pH4.8, 전도도 0.3 mS/cm 이하에서 저온살균되었다.

본 발명의 다른 바람직한 실시예에서는 콘 분별증류(Cohn fractionation) 에 의해 얻어진 면역글로불린 용액이 20-33% w/v 소르비톨의 존재하에 단백질 농도 2% w/v 이하, pH4.8, 전도도 0.3mS/cm 이하에서 저온살균되었다.

또 다른 실시예에서는 크로마토그래피로 정제된 면역글로불린이 30-45% w/v 슈크로스의 존재하에 단백질 농도 2% w/v 이하, pH4.4 내지 5.2 에서 저온살균되었다.

치료 목적의 사용을 위하여, 저온살균된 면역글로불린에서 소르비톨 또는 슈크로스를 다이아필터레이션(diafiltration)으로 제거한 후, pH 4.0-6.0, 바람직하게는 4.25-5.5, 10% w/v 말토스 용액 속에 6% w/v 단백질 농도로 조제,제공되는 것이 바람직하다.

본 발명의 상세한 특징은 다음 실시예를 통해서 더 자세히 기술된다. 하기한 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 본 발명의 일 실시예일 뿐 본 발명이 하기한 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예에는 다음의 일반적인 방법들이 이용되었다.

면역글로불린 정제: 일반적인 플라즈마 풀(plasma pools)로부터 콘 분별증류(Cohn fractionation)이나 크로마토그래피를 이용하여 면역글로불린이 정제되었다. 콘 분별증류를 거친 생성물(상등액 III)의 경우 콘-온클리 방법 6(Cohn-Oncley Method 6)에 기초한 방법으로 정제되었다. 크로마토그래피로 정제된 면역글로불린의 경우 콘 분별증류를 사용하여 피브리노겐(분획1)이 제거된 후 이온교환 크로마토그래피를 실시하였다.

면역글로불린 원액 농축액: 상기 두 방법 중 하나로 정제된 시료는 약 10% w/v 로 농축되고 pH4.8에서 다이아필터레이션을 거친 후, 희석하여 전도도 0.3 mS/cm 미만(실시예에서 별도의 언급이 없는 한)이 되도록하 였다.

조제(formulation): 저온살균된 용액은 pH4.25-4.8이 유지되는 가운데 다이아필터레이션으로 소르비톨이 제거된 후 pH4.25-5.5, 말토스 10% w/v에서 6% w/v 용액으로 조제되었다.

응집물의 양: 응집물의 양은 pH7.0 인 0.1M 인산염을 완충용액으로 TSK3000 칼럼 (60cm x 0.5cm)과 0.1 인산염(BP 1988)이나 0.5% NaCL (BP 1994)로 희석된 표본을 사용하여 0.5ml/min의 속도로 크기 배제 크로마토그래피를 실시하여 측정되었다. 280nm 에서 단백질 용출이 관찰되었다.

항보체 활성 측정검사(ACA assay): BP(1994)방법에 따라 검사하고자 하는 면역글로불린 시료를 기니아 피그 보체와 혼합함으로써 항보체 활성이 측정되었다. 응집된 IgG는 보체와 결합, 보체활성을 중화시킨다. 나머지 항보체 활성은 양 적혈구세포(sheep red blood cells)의 융해(lysis)를 관찰하여 결정된다. 활성은 면역글로불린에 노출되지 않은 보체 표준 용액과 비교하여 이용된 보체의 퍼센티지로 표현된다. 본 실시예에서는 유사하지만 약간 변형된 방법이 이용되었다. 면역글로불린 시료의 연속 희석액을 인간 보체와 혼합하고, 양 적혈구세포의 융해를 관찰하여 남아있는 보체의 양을 결정하였다. 결과는 CH50/mg로 표현되었으며, 여기에서 CH50는 50% 보체용혈단위(50% haemolytic units)를 일컫는다. 이 측정검사는 BP검사와 상관관계를 가지며, 10CH50/mg가 항보체 활동에 대한 BP제한점에 해당한다.

Fc 기능 실험: 이 실험은 BP(1994)에 기재된 방법을 따랐다. 양의 적혈구 세포에 온도를 가하고 루벨라(rubella)항원을 도포하였다. IgG 시료에 존재하는 루벨라 항체가 이 항원과 결합되고, Fc도메인을 통해 보체계와 상호작용을 일으켜, 적혈구 융해를 유발시키게 된다. 융해 정도는 Fc기능과 연관된다. 결과는 EPBRP(European Pharmacopoeia Biological Reference Preparation), 배치 1의 퍼센티지로 표현된다. 면역글로불린이 BP요건을 충족시키려면 60% 이상이 되어야한다(BP 1994).

[실시예 1]

면역글로불린 저온살균(안정제가 제공되지 않은 경우)

콘 분별증류로 준비된 면역글로불린 원액 농축액을 1% w/v로 희석하여 pH 4.0, 4.8 또는 5.0으로 조절한 후, 안정제를 넣지않고 60℃에서 10시간 동안 저온살균하였다.

도 1(a)는 각 조건하에서 얻어진 응집물의 양을 나타낸다. 이 결과에 따르면, 해당 조건에서 IgG를 저온살균하면 정맥 주사용으로 부적절한 과도한 수준의 응집이 일어나, 정맥 주사용 면역글로불린 제제의 조제 한계인 3% 이하의 응집물 범위를 벗어나므로 임상적으로 적합하지 않음을 알 수 있다.

도 1(b)는 0.5% 또는 1% w/v 의 IgG에 소르비톨을 넣지 않고 저온살균한 경우로, pH5.5, 10%의 말토스 용액에서 6% w/v IgG이 되도록 조제한 물질은 초기에 응집물이 많이 생성되고, 8℃ 와 25℃에서 13일 이상 두었을 때 응집이 계속 진행됨을 보여준다.

이 결과는 일반적으로 안정제를 제공하지 않고 저온살균을 하면 치료용으로 부적합하게 면역글로불린 내에 응집물이 발생하며, 해당 처리과정을 반복하기 어렵다는 것을 나타낸다.

[실시예 2]

면역글로불린 저온살균(소르비톨이 제공된 경우)

크로마토그래피로 얻어진 면역글로불린 원액 농축액이 다양한 농도의 0% 내지 30% w/v 범위 내의 소르비톨이 제공된 가운데 1% 내지 4% w/v 내의 다양한 단백질 농도에서 조제되었다. pH는 4.8로 유지하고, 60℃에서 10시간 동안 저온살균하였다.

도 2(a) 와 (b)는 소르비톨 농도가 증가할 경우 살균시 면역글로불린이 안정되어 응집 형성이 감소됨을 나타낸다. 실제로 도 2b에는 30% w/v의 소르비톨이 제공된 단백질 농도 1% 에서는 응집이 거의 일어나지 않았음을 알 수 있다. 20%의 소르비톨에 단백질 중량 2%인 경우에도 응집물은 2.0% 이하를 유지하여 정맥 주사용 IgG에 적합한 범위 내에 있다.

상기 조건에서의 면역글로불린 저온살균은 응집물 생성면에서 임상적으로 적합한 면역글로불린 제제를 형성함을 알 수 있다. 추가적인 분류법이 필요하지 않으며, 이 처리 과정은 반복 실시할 수 있다.

[실시예 3]

콘 분별증류 및 크로마토그래피로 정제된 면역글로불린 시료의 저온살균 후 응집물 형성 비교

콘 분별증류 및 크로마토그래피로 정제된 면역글로불린 시료에서 얻은 면역글로불린 원액 농축액을 pH4.8, 15 내지 30 % w/v 소르비톨에서 1 내지 30% w/v IgG 농도로 조제하고 60℃에서 10시간 동안 저온살균하였다. 살균된 생성물에서의 응집물 형성이 크기 배제 크로마토그래피로 검사되었다.

그 결과를 나타낸 표 1에 의하면, 상기 두가지 처리방식에 의해 얻어진 물질이 응집물 형성을 최소화하는 조건에서 저온살균될 수 있음을 보여준다. 크로마토그래피에 의해 정제된 면역글로불린은 30% w/v 소르비톨의 존재하에 3% w/v 의 농도까지 저온살균되었으며, 그 결과, 단백질 농도가 증가하거나 소르비톨 농도가 감소됨에 따라 점진적으로 응집 정도도 증가되었다. 콘 분별증류에 의해 얻어진 물질은 더 많이 응집하려는 경향을 나타내었으며, 단백질 농도 1% w/v 와 소르비톨 농도 30% w/v에서 응집이 최소화되었다.

표1 다양한 단백질 및 소르비톨 농도에서 크로마토그래피로 정제된 면역글로불린(PC-10, PC-11, PC-12) 및 콘 분별증류로 정제된 면역글로불린(IP004,IP005,IP006)의 저온살균시 응집물 형성

	PC-10	PC-11	PC-12	IP004pH4.2	IP004pH 4.8	IP005	IP006
(단백질) %	소르비톨%	응집%	응집%	응집%	응집%	응집%	응집%	응집%
1	152030	0.080.06	0.070.04	0.240.30.27	1.41.730.87	0.810.760.48	1.481.030.41	0.60.41
1.5	152030	0.270.130.06	0.310.230.06	1.180.920.32	4.073.612.08	3.031.060.84	30.850.91	1.591.670.85
2	273033	0.070.080.08	0.060.070.11	0.590.40.45	3.833.321.6	2.092.131.54	2.861.421.84	1.872.411.32
3	273033		0.460.630.71	2.571.11	8.536.396.11	4.185.164.7	7.695.664.3

이로써, 면역글로불린 생성물의 응집 경향은 생성물을 얻기 위해 사용된 정제 과정에 좌우됨을 알 수 있다. 즉, 에탄올 침전의 차이에 의한 콘 분별증류에 의해 생성된 물질은 저온살균 과정 중에 더 불안정하므로, 저농도의 단백질이나 고농도의 소르비톨에서 저온살균되어야 한다. 이는 상대적으로 조건이 좋지않은 분별증류로 면역글로불린 분자가 불안정화되어 분자의 열변성 감수성이 증가된 결과일 수 있다. 크로마토그래피로 정제된 물질은 저온살균 과정 중 더 안정한 상태이며, 따라서 고농도의 단백질 및 저농도의 소르비톨이 살균에 이용될 수 있다.

[실시예 4]

저온살균된 면역글로불린의 기능적인 특성

저온살균된 정맥 주사용 면역글로불린의 항체 타이터(titre), Fc기능, ACA 및 응집물 정도가 표 2에 나타나있다. 크로마토그래피에 의해 정제된 정맥 주사용 면역글로불린은 pH4.8, 30 % w/v의 소르비톨이 제공된 가운데 단백질 농도 3% w/v이하에서 저온살균되었다. 저온살균 후, 다이아필터레이션에 의해 소르비톨이 제거되고 pH 4.25, 10% w/v 말토스 및 단백질 농도 6% w/v에서 면역글로불린이 조제되었다. 비교를 위해 콘 분별증류에 의해 정제된 저온살균되지 않은 정맥 주사용 면역글로불린 제품을 상기 방법대로 조제한 후, 이에 대한 데이터를 얻었다.

표2 크로마토그래피로 얻어진 저온살균 면역글로불린의 특성

	PC-11	PC-12	PC-13	저온살균되지 않은면역글로불린
헤파티스A 항체(U/ml)	51	25	48	48(27-62)
헤파티스B 항체(IU/ml)	3.24	1.70	2.54	3.06(1.6-4.0)
CMV 항체 (μ??ml)	14456	8455	8521	9815(6439-14434)
디프테리아 안티톡신(IU/ml)	1.9	1.2	2.1	2.0(1-2.9)
테타너스 안티톡신 휴먼(IU/ml)	17	11	23	20(11-24)
Fc기능(% int.std.)	132	105	112	106(90-113)
ACA(CH50/mg)	3	3	3	〈 2-4
응집물(응집%)	0.4	0.1	0.8	0.1(0-0.4)

표 3은 저온살균 및 이후의 조제에서 같은 조건이 사용된 저온살균된 콘 분별증류를 거친 면역글로불린의 특성(항체 타이터(titre), Fc기능, ACA 및 응집물의 양)데이터이다.

표3 저온살균된 면역글로불린의 특성

배치	조제 pH	응집%
		0주	13주	26주	52주
PC1	5.87	0.61	-	1.5	0.8
PC2	5.59	0.64	-	1.0	1.0
PC5	4.63	0.41	0.4	0.7	-
PC6	4.29	0.51	2.0	1.2	-
PC7	4.68	1.8	2.3	1.8	-
PC8	4.72	0.2	0.6	0.1	-
PC9	4.71	0.9	1.0	0.0	-
PC10	4.68	0.9	1.0	0.0	-
PC11	4.19		0.0	-	-
PC12	4.25	0.1	0.1	-	-
PC13	4.25	0.8	-	-	-

이로써, 저온살균된 면역글로불린 -크로마토그래피나 콘 분별증류에 의해 얻은 것 모두-의 성질은 저온살균되지 않은 제품의 성질과 유사함을 알 수 있다. 콘 분별증류를 거치고 저온살균된 제품에서 응집물이 더 많이 생성되었지만, 그 경우에도 정맥 주사용 제품 허용치 내의 응집물이 생성되었다.

[실시예 5]

저온살균 면역글로불린의 안정성

액상 면역글로불린 제제와 관련하여 중요한 문제 중의 하나가 응집 형성과 관련한 잠재적인 불안정성이다. 크로마토그래피로 정제된 면역글로불린 용액이 pH 4.8에서, 30% w/v 소르비톨 농도을 가지고 2% w/v 단백질 용액으로 저온살균되었다. 저온살균된 물질은 상기 pH 농도에서 10%의 말토스의 존재하에 6% w/v 단백질로 조제되었다. 4℃로 저장된 생성물의 응집 형성 정도를 크기배제 크로마토그래피로 검사하였다.

크로마토그래피로 정제된 면역글로불린을 4℃에서 13주 및 52주간 보관한 후 응집물 형성을 살펴본 결과가 표 4에 나타나있다.

표4 크로마토그래피로 정제된 저온살균 면역글로불린의 응집물양(4℃ 저장)

	IP004	IP005	IP006	저온살균되지 않은면역글로불린
헤파티스A 항체(U/ml)	60	40	65	48 (27-62)
헤파티스B 항체(U/ml)	3.61	3.53	3.92	3.06(1.6-4.0)
CMV 항체 (μ??ml)	18308	12568	9906	9815(6439-14434)
디프테리아 안티톡신(IU/ml)	2.1	2.4	2.0	2.0 (1-2.9)
테타너스 안티톡신 휴먼(IU/ml)	20	26	16	20 (11-24)
Fc기능(% int.std.)	-	125%	114%	106 (90-113)
ACA(CH50/mg)	2	3	4	〈 2-4
응집물(응집%)	1.2	2.0	0.9	0.1 (0-0.4)

그 결과, 생성물의 응집물 형성은 조제 pH 범위에서 안정된 상태임을 알 수있다. 또한, 항체타이터 등의 성질도 또한 안정된 수준이었다(미도시).

이로써 전도도 0.3mS/cm이하, pH 약 4.8에서 소르비톨이 약 30% w/v 의 농도로 제공되고, 단백질 농도가 3% 이하, 바람직하게는 2% w/v 이하일 때, 60℃, 10시간 저온살균된 면역글로불린 제제의 안정성이 확인되었다.

[실시예 6]

바이러스 불활성화 연구

저온살균 단계의 바이러스 불활성화 포텐셜을 다음과 같은 모델 바이러스를 이용하여 측정하였다.

* 막으로 둘러싸인 바이러스인 HIV, HCV의 모델 바이러스로서 sindbis virus

* 막으로 둘러싸인 바이러스인 HCV의 모델 바이러스로서 BVDV (bovine viral diarrhoea virus)

* 막으로 둘러싸인 바이러스 HBV의 모델 바이러스로서 DHBV(duck hepatitis B virus)

* 막으로 둘러싸이지 않은 바이러스 HAV(hepatitis A virus) 등의 모델 바이러스로서 EMC(encephalomyocarditis) 및 Theilar's virus

* HIV

크로마토그래피 또는 콘 분별증류로 얻어진 면역글로불린 원액이 소르비톨 30% w/v의 존재 하에 2% w/v 단백질로 희석되고 pH 4.8로 조절되었다. 이와 같이 준비된 샘플에 바이러스를 넣고 60℃에서 10시간 저온살균하였다. 이 불활성화 조사 결과는 표 5에 나타나있다. 이에 따르면 살균 과정 중 막으로 둘러싸이거나 둘러싸이지 않은 바이러스 모두에서 실질적으로 바이러스 비활성화가 이루어졌다.

표5

공정단계	막으로 둘러싸인 바이러스(log10 감소인자)(log10 reduction factor)	막으로 둘러싸이지 않은 바이러스(log10 감소인자)
	Sindbis	BVDV	HIV	EMC	Theilar's
저온살균	〉 5.2	〉 5.5	〉 4.7	〉 5.4	〉 5.9

[실시예 7]

저온살균된 면역글로불린: 근육 주사용 조제

근육 주사용 면역글로불린(IMIG) 제품은 통상적으로 콘분획II(Cohn Fraction II)에서 얻어진다. 동결 건조 후, 이 물질은 단백질 농도 16 % w/v가 되게 재구성되고 22.5mg/ml이 되게 글리신을 첨가하는 한편 pH는 6.5 로 조정된다.

바이러스 활성을 저지하기 위한 저온살균방법이 이 근육 주사용 면역글로불린 제품(IMIG)에도 적용될 수 있음을 알 수 있었다.

IMIG-VI는 다이아필터레이션을 거친 상등액III으로부터 제조되며, 순수한 면역글로불린 시료는 콘 분별증류로 얻어진다. pH4.8, 30% w/v 소르비톨의 존재 하에서 단백질 농도 0.5-2.0% w/v IgG를 저온살균을 하여 바이러스를 불활성화하였다. 저온살균된 IgG를 농축하고,소르비톨을 제거하기 위해 다이아필터 과정을 거친 후, 단백질 농도 16% w/v에 글리신이 22.5mg/ml이 되게 첨가하여, pH6.5로 조제한다.

저온살균한 보통의 IMIG-VI 배치 세 개 및 대체 방식에 의한 배치의 특성이 표 6 및 7에 제시되어있다. IMIG-VI와 IMIG는 측정된 비교값에서 대부분 유사하였다. 항체타이터는 두 제품에서 유사했다. IMIG-VI가 IMIG보다 응집물이 많이 형성되는 한편, ACA는 더 낮았다. 프리칼라크레인 및 칼라크레인으로 알 수 있는 프로테아제 활동은 IMIG-VI에서 더 낮았으며, 플라즈미노겐은 두가지 모두에서 다 관찰되지 않았다. Fc기능은 IMIG-VI에서 더욱 활발하였고, IgG 서브클래스 분포(subclass distribution)는 두 제품에서 비슷했다.

따라서, 저온살균방법으로 면역글로불린 제품 특성이 불리하게 변화되지 않기 때문에, 이 방법이 근육 주사용 제품으로 이용될 수 있음을 알 수 있다.

표6 IMIG-VI 및 IMIG 최종산물의 임상전 배치 분석

(Preclinical Batch Analysis for IMIG-VI and IMIG Final Products)

	제한범위	IMIG(n=19)	IMIG-VI
			PN004	PN005	PN006
감마 글로불린	≥98%	99.7(97-100)	100%	100%	100%
단백질조성:응집물모너머+다이머+알부민단편	≤10%≥85%≤5%	1.3 (0.23-3.1)98.7 (96.9-99.8)0.1 (0.0-0.4)	8.191.20.8	6.492.90.7	9.290.20.6
단백질(TCA)	144-176 mg/ml	157.9(141-167)	145.6	151.8	149.8
pH	6.4-6.8	6.5(6.4-7.2)	6.5	6.5	6.4
글리신	20-25 mg/ml	21.3 (19.6 - 23.6)	22.1	20.9	21.3
Hep B	≥ 0.1 IU/ml	6.8(1.04-11.9)	3.54	5.39	7.0
Hep A	≥ 100 IU/ml	126.4 (84-235)	146	114	118
생식(sterility)	통과	통과	통과	통과	통과

(괄호안의 숫자는 범위를 나타냄)

표 7 IMIG-VI 및 IMIG 최종산물의 특성 연구 결과

	IMIG (n=3)	IMIG-VI
		PN004	PN005	PN006
프리칼리크레인 엑티베이터(IU/ml)	36.5(25.7-56.3)	〈 1.0	〈 1.0	〈 1.0
엔도톡신(EU/ml)	0.64(0.48-0.96)	〈 0.6	〈 0.6	〈 0.6
무(無)항보체활성(CH50/mg*)	22(18-24)	6	8	3
Fc기능(EPGRP** %)	82(76-88)	102%	109%	85%
소르비톨 (% w/v)	n/a	0.14%	0.04%	0.23%
디프테리아(IU/ml)	4.63(3.8-5.5)	6.2	5.2	5.7
테타너스(IU/ml)	41.0(39-44)	45	46	41
IgG 서브클래스(%)G1G2G3G4	54.8(53.0-56.1)38.5(37.4-39.6)4.6(3.3-5.2)2.1(2.1-2.2)	55.537.47.42.5	55.534.16.83.6	56.233.97.92.0
IgA (mg/ml)	〈 0.018	〈 0.018	〈 0.018	〈 0.018
IgM(mg/ml)	0.05 (〈0.02-0.111)	〈 0.02	〈 0.02	〈 0.02
플라스미노겐(g/ml)	〈 0.19	〈 0.19	〈 0.19	〈 0.19
칼리크레인(50IU/ml PKA Std 퍼센티지)	634(64-1206)	116	65	400
테타너스(IU/ml)	56(53-60)	51	56	58
CMV (u/ml)	22263(15079-29408)	21693	21649	26416
대상포진(IU/ml)	17.67(15-20)	18	15	14

* CH50는 50% 보체용혈단위(50% haemolytic units)를 의미함.

** European Pharmacopoeia Biological Reference Preparation (배치1)

(괄호 안의 수치는 범위를 나타냄)

[실시예 8]

슈크로스로 안정화된 저온살균 면역글로불린

크로마토그래피로 정제된 면역글로불린을 슈크로스 존재 하에 60℃에서 10시간 저온살균하였다. 세가지 연구가 수행되었다. 연구 1, 2에서 4℃, pH4.8, 8% 용액으로 5개월간 저장된 크로마토그래피로 정제된 면역글로불린이 원료로 사용되었다. 연구 3에서는 새로 준비된 크로마토그래피를 거친 면역글로불린을 사용하였다.

연구 1

저온살균 후 pH 와 슈크로스 농도가 IgG 중합반응에 미치는 영향을 검토하는 연구 결과가 표 8에 나타나있다. 단백질 농도는 1.5% w/v였다. 그 결과, 저온살균시 면역글로불린의 응집을 최소화하는 최적 pH는 pH4.8임을 알 수 있었다. 또

한, 슈크로스 농도를 20%에서 30%로 증가시키면 형성되는 응집량이 줄어드는 것도 알 수 있었다. pH4.4 내지 5.2이고 30%의 슈크로스가 사용되었을 때, BP요건을 충족시키는 결과가 얻어졌다.

pH	단백질 조성	슈크로스 농도
		20%	25%	30%
4.0	응집물다이머모너머	9.3213.9575.31	7.5913.4377.57	7.2412.4779
4.4	응집물다이머모너머	3.829.6785.65	3.218.5187.47	2.677.0489.54
4.8	응집물다이머모너머	2.316.8190.41	1.575.0292.87	1.213.6394.85
5.2	응집물다이머모너머	4.796.3688.85	2.014.9193.08	1.433.6394.94

표8 순수한 면역글로불린 용액의 저온살균 후, pH 및 슈크로스 농도가 IgG 중합

반응에 미치는 영향

연구 2

면역글로불린 제제의 저온살균 후 단백질과 슈크로스 농도가 IgG 중합반응에 미치는 영향을 검토하는 연구 결과가 표 9에 나타나 있다. pH는 4.8로 일정하게 유지되었다. 이로써, 단백질 농도가 증가하면 단백질 응집도 증가하는 것을 알 수 있었다. 그 러나 단백질 농도가 2% (w/v)을 넘지않고, 슈크로스 농도가 35% 이상일 경우, 제품은 BP 조건을 충족시켰다.

표9 순수한 면역글로불린 용액(pH4.8) 저온살균 후, 단백질 및 슈크로스 농도가 IgG 중합반응에 미치는 영향

단백질농도 % w/v	단백질 조성	슈크로스 농도(%)
		30	35	40
0.5	응집물다이머모너머	0.181.598.32	0.221.3398.45	0.211.2598.54
1.0	응집물다이머모너머	0.683.396.01	0.652.7196.64	0.52.2797.23
1.5	응집물다이머모너머	1.844.9293.23	1.373.8594.78	1.072.7396.2
2.0	응집물다이머모너머	4.555.5789.89	2.714.2893.01	1.993.3894.63

연구 3

새로이 준비된 순수한 면역글로불린을 저온살균하여 본 발명의 처리방법의 효과를 더 실험하였다(표 10). 그 결과, 새로이 준비된 면역글로불린 용액의 저온살균 이후의 IgG 중합반응 정도는 매우 낮으며, 4℃에서 5개월간 저장된 제제에서 훨씬 낮은 수준의 중합반응이 관찰됨이 확인되었다.

표 10 새로 준비된 면역글로불린 용액(pH4.8)의 저온살균 후, 단백질 및 슈크로스 농도가 IgG 중합반응에 미치는 영향

단백질농도 % w/v	단백질 조성	슈크로스 농도(%)
		30	35	40	45
0.5	응집물다이머모너머	0.020.299.77	0.020.1799.81	0.030.2399.74	0.040.1899.78
1.0	응집물다이머모너머	0.020.2699.72	0.020.3199.67	0.030.3299.65	0.040.3399.63
1.4	응집물다이머모너머	0.010.2799.71	0.040.3399.64	0.030.299.77	0.040.1399.83
1.6	응집물다이머모너머	0.010.799.29	0.030.4299.56	0.040.2999.67	0.050.1899.77
2.0	응집물다이머모너머	0.010.6799.33	0.010.4699.53	0.020.5799.4	0.060.3399.61

상기 실시예를 통해, 추가적으로 폴리머 분자나 변성된 분자를 제거하기 위한 분별(fractionation)을 거치지 않고 BP 요건을 충족시키는 저온살균된 면역글로불린 용액이 생성될 수 있음을 알 수 있다.

가능한 저온살균 조건은 슈크로스 농도 30%-45% (w/v), 2% w/v 농도의 순수한 면역글로불린 용액, 적어도 pH4.4 - 5.2까지이다.

본 발명이 제공하는 치료 효과를 유지하는 저온살균 면역글로불린 제제, 특히, 응집 및 항보체 활성 수준이 치료용으로 허용가능한 범위에 있는 저온살균 면역글로불린은 저온 살균 후, 응집물을 제거하기 위한 별도의 정제과정이나, 항보체 활성을 저하시키기 위한 변환과정을 거칠 필요없이 조제되고 사용될 수 있다.

참고문헌:

1. Hirao, Y.K., (1989). "Process for heat treating chemically unmodified gammaglobulin". US Patent 5845199: 1-5.

2. Magnin, A.A.(1989). "Pasteurization of immunoglobulin solutions". US Patent 4849508:

3. Nowak, T.J. (1992). Virus safety of human immunoglobulins: Efficient inactivation of hepatitis C and other human pathogenic viruses by the manufacturing procedure. J.Med. Virol. 36:209-216.

4. Uemura, Y.K.(1989). Inactivation and elimination of viruses during the fractionation of an intravenous immunoglobulin preparation: Liquid heat treatment and polyethylene glycol fractionation. VoxSang. 56:155-161.

Claims (9)

1. 면역글로불린 용액의 저온살균방법으로서,

   상기 용액을 20 내지 40% w/v 소르비톨 또는 25 내지 45% w/v 슈크로스의 존재 하에 pH 4.0 내지 6.0, 온도 50℃ 내지 70℃에서 1 내지 20 시간 가열시키는 공정을 포함하고, 상기 용액의 단백질 농도가 약 3% w/v 이하 또는 그 이하인 면역글로불린 용액의 저온살균방법.
2. 제1항에 있어서,

   상기 면역글로불린 용액이 IgG 용액인 방법.
3. 제2항에 있어서,

   상기 면역글로불린 용액이 콘 분별증류로 얻은 IgG 농축물인 방법.
4. 제2항에 있어서,

   상기 면역글로불린 용액이 크로마토그래피로 정제된 IgG 용액인 방법.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,

   상기 가열이 이온 강도가 낮고, 전도도1.0mS/cm 또는 그 이하인 가운데 실시되는 것인 방법.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,

   상기 면역글로불린 용액의 단백질 농도가 약 2% w/v 이거나 그 이하인 방법.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,

   상기 가열이 온도 60℃에서 10시간 동안 실시되는 것인 방법.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,

   소르비톨이나 슈크로스를 제거하기 위하여 상기 저온살균된 면역글로불린 용액을 다이아필터하는 단계를 더욱 포함하는 방법.
9. 상기 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 처리방법을 거친 저온살균된 면역글로불린 제제.