HU210026B - Heparin-free composition for stabilizing blood plasma during pasteurization, and process for pasteurizing blood plasma - Google Patents

Description

A találmány tárgya heparinmentes készítmény vérplazma stabilizálására pasztörizálás alatt és eljárás vérplazma pasztörizálására. Találmányunk olyan készítményre vonatkozik, amely lehetővé teszi a vérplazma stabilizálását a pasztörizálás alatt. Találmányunk egy az említett készítmény felhasználásával végzett eljárásra és az így előállított plazma oldatokra is vonatkozik. Az így előállított oldatokat plazmatöltő kezeléseknél vagy vérkoagulációs faktor helyettesítő kezeléseknél lehet felhasználni.

A teljes vagy krioprotein mentes humán plazmát használják még az ún. „töltőkezeléseknél” olyan személyek kezelésére, akik súlyos égési sebeket vagy súlyos sérüléseket szenvedtek, vagy akik nagy műtéten estek át, vagyis minden olyan esetben, amikor a beteg jelentős folyadékveszteséget szenvedett.

Az ilyen típusú kezeléseknél általában olyan plazmát használnak, amelyet előzetes kontrolion átesett, egészséges emberektől vettek, a kontroll szerepe, hogy a vírusos megbetegedések átadásának veszélyét ki lehessen küszöbölni. Az eljárás azonban nem teszi lehetővé a preszerológiai állapotban lévő vírusok által okozott fertőzések teljes kiküszöbölését, különösen a különböző hepatitis és AIDS vírusok esetén.

Továbbra is fontos tehát a vírus inaktiválási eljárások és stabilizáló készítmények kifejlesztése, amelyek segítségével a plazma lényeges biológiai funkciói megőrizhetők.

Kimutatták, hogy a hepatitis B vírus teljesen inaktiválható 60 °C-on 10 órán keresztül történő hevítéssel 0,5 mólos nátrium-citrát jelenlétében (lásd Tábor és munkatársai: Thrombosis Rés 22, 1981, 233-238). Ezzel a kezeléssel azonban a plazma bizonyos fehérjéinek a biológiai aktivitása csökken (lásd Tábor és munkatársai és Barrowcliffe és munkatársai: Fr. J. Haemotology 55, 1983, 37-46).

Különböző vérplazmából tisztított gyógyászati értékű fehérjék hagyományosan pasztörizálhatók 60 °Con 10 órán keresztül különféle stabilizáló szerek jelenlétében. Ismert azonban, hogy olyan készítmények, amelyek az egyik biológiai hatást stabilizálják, néha teljesen hatástalanok egy másik hatás esetén.

Például a WO 91/01762. számon közzétett szabadalmi leírásból ismert, hogy főként fibrinogént tartalmazó fehérjekeveréket monoszacharid, például glükóz és alkoholos cukor, például szorbit jelenlétében pasztörizálnak. A pasztörizálandó oldat heparint is tartalmaz. Előnyösen nem tartalmaz azonban kalciumiont.

A 106,269. számú európai szabadalmi leírásban hemofília ellenes kriocsapadék pasztörizálását ismertetik kalciumion, aminosav, például glicin, alanin, hidroxiprolin, prolin, glutamin vagy amino-vajsav és monovagy oligoszacharid, például szacharóz, vagy cukoralkohol jelenlétében.

A 117,064. számú európai szabadalmi leírásból ismert, hogy Vili vérkoagulációs faktort tartalmazó oldatot vagy frakciót hőkezelnek nagy koncentrációban alkalmazott szorbit jelenlétében.

A 139,975. számú európai szabadalmi leírásból ismert egy eljárás pasztörizált humán plazmatartalmú termék előállítására, amelynek során a humán plazmából eltávolítják a protrombin faktorokat és a lipoproteineket, majd a kapott plazmaterméket aminosav, például glicin, alanin, hidroxi-prolin, prolin, glutamin vagy amino-vajsav és egy szénhidrát, például szacharóz, valamint adott esetben kétértékű fém, például kalcium jelenlétében hevítik.

Ezen különféle kísérleti adatokból arra a következtetésre juthatunk, hogy a teljes plazma (friss plazma vagy fagyasztott friss plazma vagy krioprotein mentes plazma) virális inaktiválása nem lehetséges pasztörizálással.

Mivel azonban a gyógyászatban szükség van a teljes plazmára, a bejelentő olyan készítményeket kívánt kifejleszteni, amelyekkel a plazmában lévő valamennyi gyógyászati értékű tényező biológiai aktivitása egyidejűleg megvédhető a denaturálódással szemben a pasztörizálás alatt.

Korábbi 90 08375 számú francia szabadalmi bejelentésünkben kimutattuk, hogy szorbit, heparin, lizin és kalcium-klorid keveréke hatékonyan stabilizálja a plazma faktorok biológiai aktivitását a pasztörizálási eljárás során.

Mivel azonban ebben a stabilizáló keverékben, vagyis a végső készítményben is heparin van jelen, azoknak a betegeknek, akik már átestek heparin kezelésen, nem injektálható ez a plazma.

Ez az oka annak, hogy egy másik olyan készítményt kutattunk, amely ugyanezt a stabilizáló hatást biztosítja.

Mivel korábban azt tapasztaltuk, hogy a szorbit bizonyos fokú védelmet nyújt a hő hatására bekövetkező denaturálódással szemben, azonban a vele kapott eredmények plazmamintánként változtak és a hatékonyság is alacsony volt, különböző olyan adalékokat kerestünk, amelyek a szorbittal keverve annak stabilizáló hatását növelik. Jó eredményeket kaptunk oly módon, hogy 50 tömeg% körüli mennyiségben a szorbithoz szacharózt adagoltunk.

Másrészt, mivel a kalcium-kloridról megfigyeltük, hogy hosszan tartó hevítés alatt nem stabil, ezt a vegyületet kalcium-glükonáttal helyettesítettük, amely jól ellenáll a pasztörizáló körülményeknek.

Továbbá trinátrium-citrát hozzáadása elősegítette az elegy védőhatását, feltéve, hogy koncentrációját gondosan választjuk meg, mivel túl kis adag a plazma spontán koagulációjához vezet, túl nagy adag pedig lelassítja a koagulációs faktorok későbbi aktivitását a plazma gyógyászati felhasználása során.

Végül a keverékhez legalább két aminosavat, előnyösen lizint és arginint is adagolunk.

A találmány szerinti stabilizáló készítmény tehát szorbit, szacharóz, kalcium-glükonát, trinátrium-citrát, lizin és arginin elegye. Egy liter kiindulási pasztörizálandó plazmához a különböző adalékanyagokból a következő koncentrációkat alkalmazzuk:

- szorbit: 800-1400 g, előnyösen 1300 g,

- szacharóz: 400-600 g, előnyösen 514 g,

- kalcium-glükonát: 1,34-2,24 g, előnyösen 1,79 g,

- trinátrium-citrát: 2,35-7,35 g, előnyösen 4,4 g,

- lizin: 1-10 g, előnyösen 5 g,

- arginin: 1-10 g, előnyösen 5 g.

A találmány szerinti készítményt a friss plazmához

HU 210 026 Β vagy a fagyasztott, majd felengedett friss plazmához vagy a kriocsapadék fehérjéitől mentes plazmához adagoljuk, mielőtt a plazmát pasztörizáljuk. A pasztörizálást úgy végezzük, hogy a plazmát 60+1 °C-ra melegítjük folyadékállapotban 10 órán keresztül.

A pasztörizálás után a hőmérsékletet fokozatosan csökkentjük 20 °C-ra és az oldatot dialízisnek vetjük alá a szorbit és a szacharóz eltávolítása érdekében. A dializáló puffer pH-ja 7,5, a puffer 2,94 g/1 trinátrium-citrátot, 1,79 g/1 kalcium-glükonátot, 5,84 g/1 nátrium-kloridot, 10 g/1 koncentrációban lizint és 3 g/1 koncentrációban arginint tartalmaz. Szükség esetén különböző összetételű dializáló pufferek ugyancsak használhatók. Az oldatot azután töményítjük annak érdekében, hogy a plazmafehérjék fiziológiai dózisát helyreállítsuk. A kapott oldatot tisztító, majd sterilizáló szűrésnek vetjük alá, majd kiszereljük és mélyhűtjük vagy liofilizáljuk.

Találmányunk a plazma pasztörizálására szolgáló eljárásra is vonatkozik, amely abból áll, hogy a találmány szerinti készítményt a plazmához adagoljuk, mielőtt azt melegítjük, majd a pasztörizált plazmát a fentiekben definiált pufferrel szemben dializáljuk.

Ez az eljárás különösen előnyös, mert nagy menynyiségű, különböző, egymástól független forrásból származó plazmára alkalmazható, amelynek mennyisége egy liter és néhány száz liter közötti lehet. így a 60 literes vagy ennél nagyobb adagok pasztörizálásával a megfelelő ellenőrző vizsgálatok elvégzése után biztosítható a termék állandó biokémiai minősége.

Találmányunk a találmány szerinti eljárás során nyert pasztörizált plazma oldatokra is vonatkozik, amelyek teljes plazmából vagy bizonyos fehérjéktől mentes (például a kriocsapadék fehérjéktől mentes) plazmából állnak, és amelyek gyógyászati célra használhatók, akár a teljes plazma helyettesítésére, akár egy adott vérfaktor hiány pótlására.

A találmány szerinti készítmény és eljárás alkalmazható állati eredetű plazmára is. Előnyösen alkalmazható például szarvasmarha magzati szérum esetén, amelyet bizonyos sejtkultúrákhoz adalékként használnak, különösen gyógyászati termékek előállításához.

Találmányunkat a következőkben egy példán keresztül is bemutatjuk, de nem kívánjuk az oltalmi körét erre korlátozni.

Példa

601 felengedett plazmához enyhe keverés közben a következő keveréket adagoljuk:

mennyiség a kezdeti plazma egy literéhez szorbit 1300g szacharóz 514 g kalcium-glükonát 1,79 g trinátrium-citrát 4,4 g lizin 5 g arginin 5 g

A pasztörizálást termosztált kádban végezzük, oly módon, hogy az elegyet 10 órán keresztül 60 °C-on tartjuk.

A pasztörizálás után a hőmérsékletet fokozatosan °C-ra csökkentjük, majd az oldatot dialízisnek vetjük alá a szorbit és a szacharóz eltávolítása érdekében.

A dialízist például egy kazettás ultraszűrő rendszerrel (Pellicon^R) végezzük.

A dializáló puffer összetétele a következő:
trinátrium-citrát	2,94 g/1
lizin	10 g/1
arginin	3 g/1
kalcium-glükonát	1,79 g/1
nátrium-klorid	5,84g/l
A szorbit eltávolítását kolorimetriás meghatározás-

sál, a szacharóz eltávolítását enzimes analízissel ellenőrizzük a végtermékben.

Adott esetben a dialízis után a kapott terméket ugyanezen a berendezésen besűríthetjük, annak érdekében, hogy a koagulációs faktort 1 U/ml körüli értékre állítsuk vissza, amely megfelel a jó minőségű gyógyászati plazmában található értéknek. A terméket 370 mosmol/1 ozmózis nyomáson 7-7,5 között pH értéknél dializáljuk.

A kapott terméket szűréssel sterilizáljuk például Millipack^R 40 (Millipore^R) szűrőn, amelynek pórusmérete 0,22 pm. A kapott terméket ezután műanyag zacskókba vagy palackokba adagoljuk a fagyasztáshoz vagy liofilizáláshoz.

A pasztörizálás hatását a vírusok inaktiválására különféle vírusokon végeztük, amelyeket a „group of experts in biotechnology/pharmacology of the European authotorities fór the validiation of processes of elimination and viral inactivation of biological products” szakértői csoport ajánlásában találhatunk. A kapott eredményeket az 1. táblázatban foglaljuk össze.

1. táblázat

Vírus	Genom	Szerke- zet	Fertőzőképesség csökkenése (lóg 10)	Időtartam
HÍV	RNS	E	>5	<10 perc
POLIO SABIN 1	RNS	NE	>6,23	<5 óra
VACCINE	DNS	E	>4,30	<1 óra
HERPES-AU- JESZKY	DNS	E	>4,15	>5 óra
PARAINFLUENZA 3-AS TÍPUS	RNS	E	>6,30	<2 óra
REOVÍRUS 3-AS TÍPUS	RNS	NE	>3,28	<10 óra
SINDBIS	RNS	E	>5,74	<5 óra

E = bevonattal NE = bevonat nélkül

Hat egymást követő kísérleti adagon végzett minőségellenőrző vizsgálat eredményeit a 2-4. táblázatban tüntetjük fel.

HU 210 026 Β

2. táblázat

Vérfaktorok visszanyerése

	Koncentráció (U/ml)	Kitermelés (%)
Fehérjék (g/1)	60,0+106	93±2
VIII faktor: c (IU/ml)	1,10+0,26	74±7
VIII faktor: c (kromogén)	0,70±0,09	83±13
V faktor: c	l,12±0,25	83±4
XI faktor: c	0,98±0,06	88±7
IX faktor: c	0,64±0,10	59±7
VII faktor: c	0,65±0,05	67±6
Fibrinogén Ag (g/1)	3,10±0,28	92±5
Koagulálható fibrinogén (g/1)	2,50±0,17	92±3
Antrithrombin III aktivitás (g/1)	0,99±0,04	92+3
α-1-antitripszin aktivitás (g/1)	0,96±0,10	92±3
APTT	35-38 másodperc	-

3. táblázat

Minőségellenőrzés: proteázok és bomlástermékek hiánya

	Koncentráció (U/l)
Trombin	<0,01
pKA (%)	<2
Kallikrein (%)	3
IXa faktor (U/ml)	<0,1
Xa faktor (U/ml)	<0,1
VIIb/FVIIa faktor	0,97
Proteolitikus aktivitása (S.2288-AOD/mn)	0,03
Fibrinogén bomlástermékek (ng/ml)	<250

4. táblázat

In vivő minőségellenőrzés állatkísérletben

Patkányokon végzett vizsgálatok:
“ vérnyomás	-2%
- szívritmus	változatlan
- toxicitás (intravénás injektálással 25 ml/kg-ban)	toxicitás hiánya
Nyulakon végzett vizsgálat:
- pirogenicitás	nem pirogén

A fentiekben definiált stabilizáló készítmény jelenlétében pasztörizált plazma tehát megfelel a gyógyászati célra meghatározott szabványoknak.

Claims (9)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Vérplazma pasztörizálás alatti stabilizálására szolgáló készítmény, azzal jellemezve, hogy 1 1 kezdeti plazmára vonatkoztatva 800-1400 g szorbitot, 400-600 g szacharózt, 1,34-2,24 g kalcium-glükonátot, 2,35-7,35 g trinátriumcitrátot, 1-10 g lizint és 1-10 g arginint tartalmaz.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a szorbit koncentrációja 1300 g/1 kezdeti plazma.
3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a szacharóz koncentrációja 514 g/1 kezdeti plazma.
4. 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a kalcium-glükonát koncentráció 1,79 g/1.
5. 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a trinátrium-citrát koncentráció 4,4 g/1.
6. 6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy mind a lizin, mind az arginin koncentráció 5 g/1.
7. 7. Eljárás vérplazma pasztörizálására, azzal jellemezve, hogy a plazmához a melegítés előtt szorbitot, szacharózt, kalcium-glükonátot, trinátrium-citrátot, lizint és arginint tartalmazó készítményt adagolunk, 1 1 kiindulási plazmára vonatkoztatva a következő koncentrációkban:

   - szorbit: 800-1400 g/1,

   - szacharóz: 400-600 g/1,

   - kalcium-glükonát: 1,34-2,24 g/1,

   - trinátrium-citrát: 2,35-7,35 g/1,

   -lizin: 1-10 g/1,

   -arginin: 1-10 g/1, majd a készítményből a melegítés után a cukrokat eltávolítjuk, oly módon, hogy azt trinátrium-citrátot, kalcium-glükonátot, nátrium-kloridot, lizint és arginint tartalmazó pufferrel szemben dializáljuk.
8. 8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy dializáló pufferként 2,94 g/1 trinátrium-citrátot, 1,79 g/1 kalcium-glükonátot, 5,84 g/1 nátrium-kloridot, 10 g/1 lizint és 3 g/1 arginint tartalmazó puffért alkalmazunk.
9. 9. A 7. vagy 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy liter és néhány száz liter közötti mennyiségű plazma pasztörizálására alkalmazzuk.