LT3226B - Composition for stabilizing blood plasma during pasteurisation and pasteurized plasma solution for therapeutic use - Google Patents

Description

Išradimas apima kompoziciją, leidžiančią stabilizuoti kraujo plazmą pasterizacijos metu, pasterizacijos būdą, naudojant minėtą kompoziciją ir tuo būdu gautus plazmos tirpalus skirtus, ypatingai, plazmos perpylimui bei kraujo krešėjimo faktoriaus terapijai.

Visa žmogaus plazma ar plazma be krioproteinų iki šiol yra naudojama perpylimo terapijoje asmenims, kenčiantiems nuo sunkių nudegimų ar rimtų sužeidimų arba patyrusiems dideles chirurgines intervencijas, bendrai visais atvejais, kai pacientai netenka didelio skysčio kiekio.

Bendrai šio tipo gydymui yra naudojama plazma, gauta iš atskirų sveikų asmenų, prieš tai patikrintų, siekiant užkirsti kelią bet kokiai rizikai perduoti virusines ligas. Tačiau ši procedūra neužtikrina visiško rizikos užteršti virusais priešserologinėj e stadijoje pašalinimo, ypatingai, įvairiais hepatito bei AIDS virusais.

Todėl yra svarbu tęsti virusų inaktyvacijos metodų ir stabilizavimo kompozicijų, kurios apsaugotų svarbiausias biologines plazmos funkcijas, paiešką.

Buvo parodyta, jog hepatito B virusas yra pilnai inaktyvuojamas, kaitinant 10 vai. 60°C temperatūroje esanti 0.5 M natrio citrato (Tabor et ai. Thrombosis Res. 22, 1981, 233-238). Tačiau šis apdorojimas sąlygoja kai kurių plazmos baltymų biologinio aktyvumo praradimą (Tabor et ai. and Barrowcliffe et ai. Fr. J. Haemotology 55, 1983, 37-46).

Įrodyta, jog galima Įvairius, turinčius terapinę vertę proteinus, išvalytus iš kraujo plazmos, pasterizuoti

Įprastu būdu - 10 vai. 60°C temperatūroje, esant įvairiems stabilizuojantiems agentams. Tačiau pažymėta, jog kompozicijos, stabilizuojančios vienos rūšies biologinį aktyvumą, gali neturėti jokio poveikio kitos rūšies biologiniam aktyvumui.

Šios skirtingos eksperimentinių duomenų išvados sudaro įspūdį, jog visos plazmos (šviežios plazmos ar užšaldytos šviežios plazmos) ar plazmos be krioproteinų virusinė inaktyvacija negali būti pasiekta pasterizavimo būdu.

Nežiūrint to, kadangi yra medicininis poreikis visos plazmos, pareiškėjas ieškojo kompozicijų, kurios užtikrintų vienalaikę visų plazmos faktorių, turinčių terapinę vertę, biologinio aktyvumo apsaugą nuo denatūracijos pasterizavimo metu.

Tokiu būdu, Prancūzijos patento paraiškoje Nr. 90 08 375 pareiškėjas parodė, jog mišinys, susidedantis iš sorbito, heparino, lizino ir CaCl₂, efektyviai stabilizavo plazmos faktorių biologinį aktyvumą pasterizavimo metu.

Tačiau dėl heparino buvimo šiame stabilizuojančiame mišinyje ir tuo pačiu galutiniame produkte pacientai, jau gydyti heparinu, negali būti injekuoti šia plazma.

Štai kodėl pareiškėjas ieškojo kitos kompozicijos, atliekančios tą pačią stabilizavimo funkciją.

Iš anksto pastebėjęs, jog sorbitas tam tikru mastu sustiprina apsaugą nuo terminės denatūracijos, bet rezultatai kinta tarp plazmos pavyzdžių ir efektyvumas nėra aukštas, pareiškėjas ieškojo įvairių priedų, kurie, sumaišyti su sorbitu, padidintų mišinio stabilizuojančią galią; ypač gerus rezultatus gavo, pridėjus į mišinį sacharozės tokį kiekį, kuris atitinka apytiksliai 50% sorbito kiekio.

Iš kitos pusės, pastebėjus, jog CaCl₂ nėra stabilus ilgai kaitinant, jis buvo pakeistas kalcio gliukonatu, pasižyminčiu geru rezistentiškumu pasterizavimo sąlygose .

Be to, trinatrio citrato pridėjimas sustiprino mišinio apsauginį efektą, jei jo koncentracija buvo tiksliai reguliuojama: pernelyg maža dozė sąlygoja spontanišką plazmos koaguliaciją, tuo tarpu pernelyg didelė jo dozė sumažina vėlesnį koaguliavimo faktorių aktyvumą plazmos terapinio naudojimo metu.

Pagaliau, mažiausiai dvi amino rūgštys, pageidautina lizinas ir argininas, yra dedamos į mišinį.

Tokiu būdu stabilizavimo kompozicija pagal šį išradimą susideda iš sorbito, sacharozės, kalcio gliukonato, trinatrio citrato, lizino ir arginino mišinio. Yra naudojamos įvairių priedų, skirtų plazmai pasterizuoti, šios koncentracijos (1 litrui pradinės plazmos):

- sorbitas, 800-1.400 g, pageidautina 1.300 g

- sacharozė, 400-600 g, pageidautina 514 g

- kalcio gliukonatas, 3-5 mM, pageidautina 4 mM

- trinatrio citratas, 8-25 mM, pageidautina 15 mM

- lizinas, 1-10 g, pageidautina 5 g

- argininas, 1-10 g, pageidautina 5 g.

Kompozicija pagal šį išradimą yra dedama į šviežią plazmą arba į užšaldytą ir atšildytą šviežią plazmą, arba į plazmą, neturinčią krioprecipitato proteinų, t

prieš minėtos plazmos pasterizaciją, ją kaitinant skystame būvyje 10 vai. 60°C±l°C temperatūroje.

Po pasterizacijos temperatūra palaipsniui mažinama iki 20°C ir tirpalas dializuojamas, norint pašalinti sorbitą ir sacharozę. Dializės tirpalo pH yra 7.5 ir jį sudaro 10 mM trinatrio citrato, 4 mM kalcio gliukonato, 0.1 M natrio chlorido, 10 g/ltr lizino ir 3 g/ltr arginino. Pagal pareikalavimą gali būti taip pat naudojami įvairių sudėčių dializės buferiai. Tada tirpalas koncentruojamas norint atstatyti plazmos proteinų fiziologinę normą. Gautas tirpalas filtruojamas ir tada paskirstomas ir laikomas užšaldytas ar liofilizuotas.

Išradimas taip pat liečia plazmos pasterizacijos būdą, kuris apima kompozicijos pagal šį išradimą įdėjimą į plazmą prieš jos kaitinimą, po to pasterizuotos plazmos dializę prieš aukščiau aprašytą buferį.

Šis būdas ypatingai naudingas, kadangi jis gali, būti pritaikytas didelėms plazmos, gautos iš keleto atskirų šaltinių, partijoms ir gali svyruoti nuo 1 litro iki keleto šimtų litrų. 60 ir daugiau litrų partijų pasterizacij a gali būti atliekama po atitinkamos kontrolės, taip įgalinant garantuoti produkto atitinkamą biocheminę kokybę.

Išradimas taip pat apima pasterizuotus plazmos tirpalus, gautus išradimo būdu, minėtus tirpalus, įskaitant visą plazmą ar plazmą be kai kurių proteinų (tokių, kaip krioprecipitato proteinai), skirtus terapiniam naudojimui, taip pat skirtus pakeisti visą plazmą arba kompensuoti atskiro kraujo faktoriaus nepakankamumą.

Kompozicija ir būdas pagal šį išradimą taip būti pritaikyti gyvulinės kilmės plazmai. Jie naudingai pritaikyti, pav., fetaliniam pat gali gali būti veršelių pav., serumui, naudojamam kaip priedas ląstelių kultūroms, daugiausia skirtoms terapinių produktų paruošimui.

Sekantis pavyzdys pateikia šio išradimo igyvendinimo formą, neapribojant jo apimties.

Pavyzdys:

Sekantis mišinys yra dedamas i 60 ltr atšildytos plazmos, ją nestipriai maišant:

kiekis pradinės plazmos litrui sorbitas 1.300 g sacharozė 514 g kalcio gliukonatas 4 mM trinatrio citratas 15 mM lizinas 5 g argininas 5 g

Pasterizacij a yra atliekama termostatuotame inde, kaitinant 10 vai. 60°C temperatūroje.

Po pasterizacijos temperatūra palaipsniui sumažinama iki 20°C ir tada tirpalas dializuojamas, siekiant pašalinti sorbitą ir sacharozę.

Dializė atliekama, pav., naudojant kasetinę ultrafiltracijos sistemą (Pellicon®).

Dializės buferio kompozicija yra tokia:

- trinatrio citratas 10 mM

- lizinas 10 g/ltr

- argininas 3 g/ltr

- kalcio gliukonatas 4 mM

- natrio chloridas 0.1 M

Sorbito pašalinimas kontroliuojamas kolorimetriškai, o sacharozės - fermentinės analizės būdu, tiriant galutinį produktą.

Po dializės gali sekti, jei tai reikalinga, koncentravimas, naudojant tą pačią Įrangą, norint atstatyti koaguliavimo faktoriaus kieki apytiksliai iki 1 V/ml, kaip yra geros kokybės terapinėje plazmoje. Produktas yra dializuoj amas, esant 370 mosmol/1 osmosiniam slėgiui ir pH 7-7.5.

Po to produktas sterilizuojamas filtracijos būdu, pav., naudojant Millipack® 40, Millipore® su 0.22 μ dydžio poromis. Tada produktas išpilstomas į plastmasinius maišelius arba butelius ir užšaldomas arba liofilinamas.

Virusinės inaktyvacijos efektyvumas pasterizuojant buvo vertinamas, pasirenkant virusus, rekomenduojamus Europos specialistų ekspertų grupės biotechnologijos/ farmacijos srityje biologinių produktų virusų eliminavimo ir inaktyvavimo procesams ratifikuoti. Rezultatai pateikti I lentelėje.

I lentelė

Virusas	Genas	Struk- tūra	Infektiškūmo sumažėj imas (log 10)	Trukmė
ŽIV	RNR	E	>5	<10 min.
POLIO SABIN 1	RNR	NE	>6.23	<5 vai.
VAKCINA	DNR	E	>4.30	<1 vai.
HERPES-AUJESZKY	DNR	E	>4.13	<5 vai.
PARA gripo 3 tipas	RNR	E	>6.3;	<2 vai.
REOVIRUSO 3 tipas	RNR	NE	>3.28	<10 vai.
SINDBIS	RNR	E	>5.74	<5 vai.

E - su apvalkalėliu NE - be apvalkalėlio

Kokybės kontrolės rezultatai, gauti 6 sekančiose viena paskui kitą reguliuojamose partijose, pateikti sekančiose lentelėse.

II lentelė.

Kraujo faktorių atstatymas

	KDNCENTPACIJA, U/ml	IŠEIGA, %
Proteinai (g/ltr)	60.0+10.6	93+2
Faktorius VIII:C (lU/ml	1.10+0.26	94+7
Faktorius VIII:C (chromogeninis)	0.70+0.09	83 + 13
Faktorius V:C	1.12 + 0.25	83 + 4
Faktorius XI:C	0.98+0.06	88 + 7
Faktorius IX:C	0.64+0.10	59 + 7
Faktorius VII:C	0.65+0.05	67 + 6
Fibrinogenas Ag (g/ltr)	3.10+0.28	92+5
Krešėjantis fibrinogenas (g/ltr)	2.50+0.17	92+3
Antitrombino III aktyvumas (g/ltr)	0.99+0.04	92 + 3
Alfa-l-antitripsino aktyvams (g/ltr)	0.96+0.10	92 + 3
APTT	35-38 sekundės	-

III lentelė.

Kokybės kontrolė: proteazės ir skilimo produktų nebuvimas

	KDNCENTRACIJA (U/l)
Trombinas	<0.01
PKA (%)	<2
Kalikreinas (%)	3
Faktorius IXa (U/ml)	<0.1
Faktorius Xa (U/ml)	<0.1
Faktorius VIIb/F Vila	0.97
Proteolitinis aktyvumas (S. 2288 - OD/mn)	0.03
Fibrinogeno skilimo produktai (ng/ml)	<250

IV lentelė.

Kokybės kontrolė in vivo

Testas su žiurkėmis:

- Kraujo spaudimas

- Pulsas

- Toksiškumas (intraveninė injekcija - 25 ml/kg

Testas su triušiais:

- pirogeniškumas < -2% nepakitęs toksiškumo nėra nepirogeniškas

Plazma, pasterizuota esant anksčiau aprašytai stabilizavimo kompozicijai, atitinka standartus, nustatytus terapiniam naudojimui.

Claims (12)

1. IŠRADIMO APIBRĖŽTIS

   1. Kompozicija kraujo plazmai stabilizuoti pasterizacijos metu, besiskirianti tuo, kad ji susideda iš sorbitolio, sacharozės, kalcio gliukonato, trinatrio citrato, lizino ir arginino mišinio.
2. 2. Kompozicija pagal 1 punktą, besiskiriant i tuo, kad sorbitolio koncentracija yra 800-1400 g/1 pirminės plazmos, o geriausiai 1300 g/1.
3. 3. Kompozicija pagal 1 arba 2 punktą, besiskirianti tuo, kad sacharozės koncentracija yra 400600 g/1, o geriausiai 514 g/1.
4. 4. Kompozicija pagal bet siskirianti koncentracija yra 3-5 mM,
5. 5. Kompozicija pagal bet siskirianti koncentracija yra 8-25 mM,
6. 6. Kompozicija pagal bet siskirianti koncentracijos yra 1-10 g/ kurį iš 1-3 punktų, b e tuo, kad kalcio gliukonato geriausiai 4 mM.

   kurį iš 1-4 punktų, b e tuo, kad trinatrio citrato o geriausiai 15 mM.

   kurį iš 1-5 punktų, b e tuo, kad lizino ir arginino , o geriausiai 5 g/1.
7. 7. Kraujo plazmos pasterizacijos būdas, besiskiriantis tuo, kad prieš šildymo stadiją į plazmą įveda kompoziciją pagal bet kurį iš 1-6 punktų, o po šildymo stadijos cukrus iš kompozicijos pašalina dializės būdu prieš buferį, turintį trinatrio citratą, kalcio gliukonatą, natrio chloridą, liziną ir argininą.
8. 8. Budas pagal 7 punktą, besiskiriantis tuo, kad buferis dializei turi 10 mM trinatrio citrato,

   4 mM kalcio gliukonato, 0,1 M natrio chlorido, 10 g/1 lizino ir 3 g/1 arginino.
9. 9. Būdas pagal 7 punktą arba 8 punktą, besiski5 riantis tuo, kad jis taikomas plazmos tūriams nuo 1 1 iki kelių šimtų litrų.
10. 10. Visa plazma, skirta terapiniam naudojimui, besiskirianti tuo, kad buvo pasterizuota,

    10 naudojant būdą pagal bet kurį iš 7-9 punktų.
11. 11. Nusodintos, veikiant šalčiui, plazmos supernatantas, skirtas terapiniam naudojimui, besiskiriantis tuo, kad buvo pasterizuotas, naudojant

    15 būdą pagal bet kurį iš 7-9 punktų.
12. 12. Plazma arba gyvulinės kilmės serumas, besiskiriantys tuo, kad buvo pasterizuoti, naudojant būdą pagal bet kurį iš 7-9 punktų.