CN1145369A - 用作配体的肽 - Google Patents
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Abstract
一种式(I)的肽(H2N-X1-Thr-X2-CO)n-R(I)其中,X1和X2彼此不同,其为L或D构型的精氨酸或酪氨酸的氨基酸残基,其中苏氨酸和酪氨酸的羟基及精氨酸的胍部分可分别由肽化学中常规使用的用于保护羟基和胍部分的化合物来保护,n是1、2、3或4,和当n为2、3或4时,R是适于形成二聚物、三聚物或四聚物的基团,而当n是1时,R为OH、单一氨基酸残基,或含多至7个氨基酸残基的肽链。
Description
本发明涉及用作配体的肽,制备该肽的方法,以及该肽作为免疫球蛋白配体的应用。
更特别的是,本发明涉及能与免疫球蛋白不变区部分本身以非共价结合的肽。
免疫球蛋白,即所谓的抗体,在诊断和治疗领域是非常重要的。实际上,在第一种情况下,免疫球蛋白被广泛地用作对生物液体中的化合物进行定性和定量的试剂,而在第二种情况下,免疫球蛋白被用作能将其本身与生物分子相结合的药剂,其中所述的生物分子存在于体现治疗重要性的生理过程中,考虑到上述重要性,从产业角度出发,免疫球蛋白的生产尤其是它们的纯化是非常重要的。
可从动物血清中或从适合的细胞系培养物中获得免疫球蛋白。
通过常规色谱法进行免疫球蛋白的纯化,如离子交换或凝胶过滤,或优选使用亲和色谱法,亲和色谱法采用的柱子由固定化A蛋白制备,A蛋白得自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus),其本身能特异性地与免疫球蛋白的不变区部分结合[Siodahl,J.Eur.J.,Biochem 78:471-490(1977)]。但是,当大规模使用A蛋白时就会受许多限制,这是因为它的提取来源需要精心的控制和仔细的纯化,以使采用所述蛋白而纯化的产品免受污染。此外,A蛋白对于变性条件和在用来除去生物杂质如病毒或核酸片断的试剂存在下不是很稳定的。最终使得A蛋白的生产成本非常高并限制其大规模用于纯化。
因此,考虑到识别免疫球蛋白不变区部分的能力,仍非常需要具有极类似于A蛋白的合成配体,但其生产成本低。并且,由于是通过合成而得,不会含生物杂质。
现在已发现含精氨酸、苏氨酸和酪氨酸的氨基酸残基的肽具有这些性质。
特别的是,已发现含下面序列的肽具有上述性质
-HN-X1-Thr-X2-CO- (S)其中
X1是具有L或D构型的精氨酸或酪氨酸的氨基酸残基,
X2是具有L或D构型的酪氨酸或精氨酸的氨基酸残基,
Thr是具有L或D构型的苏氨酸的氨基酸残基,
但条件是,当X2为酪氨酸时,X1为精氨酸,且当X2为精氨酸时,X1为酪氨酸。
优选的是,序列(S)中至少一个氨基酸残基具有D构型。
更为优选的是,序列(S)中有两个或三个氨基酸残基全部为D构型。
因此本发明的第一个目的是提供式(I)的肽
(H2N-X1-Thr-X2-CO)n-R (I)其中
X1和X2彼此不同,其为L或D构型的精氨酸或酪氨酸的氨基酸残基,其中苏氨酸和酪氨酸的羟基及精氨酸的胍部分可分别用肽化学中保护羟基和胍部分的常规化合物进行保护,
n是1、2、3或4,和
当n为2、3或4时,R为适于形成二聚物、三聚物或四聚物的基团,而当n为1时,R是OH,单一的氨基酸残基或含多至7个氨基酸残基的肽链。
本文所用的术语"二聚物"、"三聚物"和"四聚物"是指含2、3或4个序列(S)的肽。
适于形成二聚物(n=2)的基团的典型例子为赖氨酸残基。适于形成三聚物(n=3)的基团的典型例子是式为Lys-Lys的二肽赖氨酰-赖氨酸。适于形成四聚物(n=4)的基团的典型例子是式为Lys-Lys(ε-Lys)的支链三肽。
四聚物式(I)的典型例子具有下式
(H2N-X1-Thr-X2-CO)4-Lys2-Lys-Gly-OH (A)其中
X1和X2具有上述的意义,且其中苏氨酸和酪氨酸的羟基及精氨酸的胍部分可分别用肽化学中保护羟基和胍部分的常规化合物进行保护。
肽合成中用于保护羟基的许多保护基报道于文献(G.A.Grant,Synthetic peptides:a user′s guide,Freeman,N.Y.,1992)中。
所说保护基的典型例子有:叔丁基(tBu)(La Joie,G.Crivici,A.Adamson,J.G."Synthesis" 571-572(1990))和苄基(Yojima"Tetrahedrion")44:805-819(1988))。
由文献(Grant,G.A.Synthetic peptides:A user′sguide,Freeman,N.Y.,1992)也已知许多用于保护精氨酸的胍部分的基团。
所述保护基的典型例子有:2,2,5,7,8-五甲基苯并二氢吡喃-6-磺酰基(Pmc)和4-甲氧基-2,3,6-三甲基苯基(Mtr)(Ramage &Green,"Tetrahedron Letters,28,2287(1987);Fujino等"ChemPlarm,Bull.,29,2825(1981)。
如此被保护的式(I)化合物的典型例子为实施例1(d)的化合物Boc-D-Arg(Pbf)-D-Thr(tBu)-D-Tyr(tBu)-OMe和实施例2的化合物(H2 N-Arg(Pmc)-Thr(OtBu)-Tyr(OtBi)-CO)4 Lys2-Lys-Gly-OH。
当n为1和R为含1至7个氨基酸残基的肽时,含于该序列中所有氨基酸彼此可以不同或相同,并具有L或D构型。优选为D构型,而且,优选为简单和廉价的氨基酸。
n等于1的R的具体例子为Gly或Ala,Gly-Gly,Gly-Ala,Ala-Gly,Ala-Ala,Gly-Gly-Gly,Ala-Ala-Ala,Gly-Gly-Gly-Gly,Gly-Gly-Gly-Gly-Gly,Gly-Ala-Gly-Ala-Gly,Ala-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala。
按常规的液相肽制备和固相肽制备技术可容易地制备式(I)的肽。
固相法的制备优选通过自动合成仪来进行。合适的自动合成仪的典型例子为Applied,Biosystems(Foster City,CA,USA)的431A型合成仪。优选的是,根据生产者建议的合成方法进行制备,所述方法通常是基于文献(Atherton & Sheppard,1989,SolidPhasePeptide Synthesis:A practical approach,IRLPress,Oxford)中描述的熟知方法。
本发明的第三个目的是在所述免疫球蛋白或免疫球蛋白的混合物的分离过程中使用式(I)化合物与至少一种免疫球蛋白形成复合物。
由于与式(I)化合物的非共价结合能形成复合物的免疫球蛋白的例子有小鼠IgG、大鼠IgG、鸡IgY、山羊IgG、牛IgG、人IgG、人IgA和其它物种的IgA,人IgM和其它物种的IgM。
一例典型的分离和纯化免疫球蛋白的方法包括:
(i)在亲和色谱载体上固定化本身能与至少一种免疫球蛋白非共价结合的化合物,
(ii)将所说的亲和色谱载体装入一色谱柱中,
(iii)用一种能促进免疫球蛋白和固定化化合物间相互作用的缓冲液来平衡所述的柱子,
(iv)在所述柱上装载含至少一种免疫球蛋白的液体,
(v)用至少一种能洗脱杂质而不影响免疫球蛋白和固定化化合物间相互作用的液体来洗涤所述的柱子,
(vi)用解离洗脱液洗脱预先吸附于柱子上的所述的免疫球蛋白,
该方法特征在于,本身能与至少一种免疫球蛋白非共价结合的化合物为式(I)化合物,其中X1、X2、n和R意义同上。
按常规方法进行步骤(i)至(vi)。
优选的是,用于亲和色谱的载体用环氧化物基团预活化,以便与肽和蛋白直接偶联。典型的合适载体的例子是Pharmacia(瑞典)的活化的CH SepharoseTM 4B树脂,树脂Protein-PakTM(Waters,美国),树脂EupergitTM C30N(Rohm & Haas,德国)或BioRad(美国)的Affi-GelTM。
步骤(i)优选于pH8.5至9.0的弱碱缓冲液中进行。
步骤(iii)优选使用中性缓冲液,如pH65的25mM Bis-Tris溶液,或pH7.0的50mM磷酸盐缓冲液。
步骤(v)优选使用弱离子强度的中性缓冲液,例如pH6.5的25mM的Bis-Tris溶液。
用于步骤(vi)的解离洗脱液的例子包括酸性或碱性水溶液。典型的例子包括pH2.5的乙酸水溶液或pH9.0的碳酸氢钠水溶液。
此分离和纯化方法广泛地描述于文献[Narayanan,S.R.,"Preparative affinity Chromatography of proteins"J.Chromatogr,658:237-258(1994),及其中引用的参考文献;Lowe,C.R.,"Laboratory technique in Biochemistry and MolecularBiology",Work and Burdon,Vol.7,part 2,Elsevier,N.Holland,Amsterdam;Ey et al.Immunochemistry,15:429(1978)]中。
按所熟知的ELISA法,本发明化合物也可用于免疫球蛋白的定性或定量测定中。
根据ELISA法的一例典型的免疫球蛋白或免疫球蛋白混合物的定量测定的方法包括:
(1)在用于ELISA测定的微滴板上固定化本身能与至少一种免疫球蛋白非共价结合的化合物,
(2)在所述微滴板上将要测定的含免疫球蛋白或多种免疫球蛋白的试样进行温育,
(3)洗涤所述的微滴板,
(4)检测如此形成的固定化化合物/免疫球蛋白复合物,该方法特征在于,本身能与至少一种免疫球蛋白非共价结合的化合物是式(I)化合物,其中X1、X2、n和R具有上述意义。
根据ELISA法进行的免疫球蛋白的分析测定广泛描述于文献("Immunochemistry in Practice",Johnstone & Thorpe,(1987),Blackwell,Oxford,UK)中。
优选的是,步骤1在一塑料微滴板上进行,如有96孔的PVC微滴板,孔中充满了pH9.0的0.1M的碳酸氢钠溶液及含有不同量的配体(0-50μg/孔)。温育24小时之后,除去过量溶液,并用磷酸盐缓冲液洗涤微滴板,用3%牛血清白蛋白溶液填充孔以消除非特异作用的位点。
步骤2中,以磷酸盐缓冲液洗涤微滴板,并以含免疫球蛋白,优选用生物素衍生的免疫球蛋白的溶液装填小孔。然后将微滴板于20-37℃下温育4-18小时。
步骤3中优选用磷酸盐缓冲液进行洗涤。
向每孔中加入与过氧化物酶结合的抗生物素蛋白溶液来完成步骤4。温育2小时后,洗涤微滴板,优选再使用磷酸盐缓冲液洗涤。然后加入邻苯二胺溶液并用合适的ELISA读数器检测颜色形成。
下面的实施例及附图会更清楚地得到本发明的这些及更进一步的特征,其中
图1表示了从精制血清中纯化兔免疫球蛋白,其是在由固定化式(H-L-Arg-L-Thr-L-Tgr)4-Lys2-Lys-Gly-OH化合物制备的柱子上使用亲和色谱法;
图2表示由纯化兔免疫球蛋白得到的各部分的聚丙烯酰胺凝胶上的电泳分析,其中纯化是用不同缓冲液和不同量的血清使用式(H-L-Arg-L-Thr-L-Tyr-)4-Lys2-Lys-Gly-OH化合物进行的。
使用来自Applied Biosystems(Foster City,CA,USA)-431A型自动肽合成仪,软件版本为1.1,根据生产商建议的合成方法及文献(Atherton and Sheppard,1988,Solid Phase peptidesynthesis:A practical approach,IRL Press,Oxford)中公知和广为报道的方法学为基础,进行式(I)化合物的固相合成。
下面的实施例中,"Cat.No"表示目录编号。
在不以任何方式限制本发明的情况下,下面实施例用于更好地说明本发明。
实施例1
溶液制备式(I)的肽(X1=Arg,X2=Tyr,n=1,R=OH),其中氨基酸具有D构型
合成起始于被保护的二肽Z-D-Thr(tBu)-D-Tyr(tBu)-OMe的制备,随后首先脱去N末端的Z保护基,将二肽与保护的精氨酸氨基酸偶联得到衍生的Boc-O-Arg(Pbf)-D-Thr(tBu)-D-Tyr(tBu)-OMe,将其完全脱保护后得到式(I)的肽。a)H-D-Tyr(tBu)-OMe(M.W.251 amu)的制备
向冷却至-15℃的H-D-Tyr(tBu)-OH(3.55g,15mmol,BachemFeinchemilalien,cat.No.F2170)的CH3 OH(100ml)悬浮液中加入3.54g SOCl2(30mmol,Aldrich,cat.No.23046-4)。室温下振摇2小时,90℃下振摇2小时后,蒸发除去溶剂,残留物经KOH干燥一夜。由此得到4.21g盐酸盐粗产物(14.7mmol)。收率98%。b)Z-D-Thr(tBu)-D-Tyr(tBu)-OMe(M.W.541 amu)的制备
向7.21g(10mmol) Z-D-Thr(tBU)-OH[DCHA(BachemFeinchemikalien,Cat,No C-1480)]和1.65ml(16.2mmol)N-甲基吗啉(NMM,Sigma,cat.No M-7889)的75ml无水N-甲基吡咯烷酮(NMP)中,振摇情况下在-10℃下滴加稀释于9ml CHCl3中的2.12ml(16.2mmol)氯甲酸异丁酯(IBCF,Sigma,cat,No I-3253)。20分钟后,滴加溶于75ml NMP的4.21g(14.7mmol)-H-D-Tyr(tBU)-OMe.HCl和1.75ml NMM溶液。然后进一步加入NMM(约3ml)以达到pH为7.5至8.0。
反应混合物于振摇条件下0℃保持2小时及室温下保持一夜。
将沉淀的盐过滤,通过在硅胶上快速色谱法来浓缩溶液,使用乙酸乙酯-己烷混合物作为洗脱液。得到所需产物(4.03g;7.45mmol),其为纯油状物(TLC)。c)H-D-Thr(tBU)-D-Tyr(tBu)-OMe(M.W.407amu)的制备
4.03g Z-D-Thr(tBu)-D-Tyr(tBu)-OMe(7.45mmol)溶于250ml甲醇中。加入850mg 10%Pd/活性炭(Fluka,cat.No.75990)后,室温振摇条件下在溶液中吹入氢气流4小时。通过TLC来监测加氢反应。过滤除去催化剂及蒸发滤液之后,得到2.88g(7.08mmol,收率95%)的H-D-Thr(tBu)-D-Tyr(tBu)-OMe,其为纯油状物(TLC)。d)Boc-D-Arg(Pbf)-D-Thr(tBu)-D-Tyr(tBu)-OMe(C.M.W.916amu)的制备
含有0.85ml(7.79mmol)NMM的75ml无水NMP中的3.73g(7.08mmol) Boc-D-Arg(Pbf)-OH(Bachem Feinchemikalien,cat.No.A-3750)的清澈溶液,在振摇条件下冷却至-10℃。然后,滴加稀释于6ml CHCl3中的1.02ml(7.79mmol)IBCF。30分钟后,在20分钟内滴加75ml CHCl3中的2.88g(7.08mmol)H-L-Thr(tBu)-L-Tyr(tBu)-OMe溶液。该反应混合物于0℃下保持2小时,并于室温下保持一夜。真空蒸发除去溶剂、并在硅胶柱上通过快速色谱法,使用乙酸乙酯-己烷混合物作为洗脱液来纯化粗物质。如此得到5.58g(6.08mmol,收率86%)的Boc-D-Arg(Pbf)-D-Thr(tBu)-D-Tyr(tBu)-OMe,其为纯油状物(TLC和RP-HPLC)。e)H-D-Arg-D-Thr-D-Tyr-OH(M.W.438amu)的制备
用具有下表组分的100ml混合物处理所述油状物。
表1
组 分 | %(V/V) |
三氟乙酸(TFA,Sigma Chem.Co.St.Louis,Mo | 83 |
H2O | 4 |
苯酚(Sigma) | 6 |
茴香硫醚(Sigma) | 5 |
三异丙基硅烷(TIS,Sigma) | 2 |
真空蒸发三氟乙酸使溶液浓缩至约10ml,并加入150ml冷乙醚沉淀粗制的肽物质。除去沉淀剂后,接着用100ml冷乙醚进行洗涤以更好地溶解清除剂。将全部肽物质溶于50ml H2O/CH3CN/TFA 50/50/0.1中,然后冷冻干燥。
由此回收到1.89g三肽H-D-Arg-D-Thr-D-Tyr-OH,相当于4.32mmol,收率71%。对5μg等份试样产物进行RP-HPLC分析表明其纯度为97%。
通过相似方法制备另外的下列化合物:
H-L-Arg-L-Thr-L-Tyr-OH
H-L-Tyr-L-Thr-L-Arg-OH
H-D-Tyr-D-Thr-D-Arg-OH
下列表A列出了制备收率、最终纯度及由质谱测定的实验观测分子量。
表A
化合物 | 收率 | 纯度 | 观测值 | 理论值 |
(%) | (%) | M.W | M.W | |
H-D-Arg-D-Thr-D-Tyr-OH | 71 | 97 | 438.3 | 438 |
H-L-Arg-L-Thr-L-Tyr-OH | 79 | 97 | 438.7 | 438 |
H-L-Tyr-L-Thr-L-Arg-OH | 76 | 96 | 438.1 | 438 |
H-D-Tyr-D-Thr-D-Arg-OH | 77 | 97 | 438.5 | 438 |
实施例2
固相制备式(I)的肽(X1=Arg,X2=Tyr,n=4,R=Lys-Lys(εLys)-Gly),其中氨基酸具有L构型
使用来自APPLIED BIOSYSTEMS Mod431A型自动肽合成仪,根据Fmoc/HOBt/DCC方法学(konig.W.,和Geiger,R.,1970,Chem.Ber.103,788-798)和生产者(APPLIED BIOSYSTEM,USA)建议的方案,在固相中进行肽的制备。
以0.1mmol规模进行肽的制备,制备起始于用于肽合成的用甘氨酸(Chlorotrichlichloridric NOVOBIOCHEM Cat No.04-12-2800,0.1mmol)预先衍生的酸不稳定树脂(所述甘氨酸的N-末端氨基用Fmoc基团保护),在室温搅拌条件下使用3.0ml哌啶(在N-甲基-2-吡咯烷酮中浓度为20%(ABI Cat.No.400629))于第一个合成循环中处理来脱保护。
然后室温振摇情况下用2.5ml N-甲基-2-吡咯烷酮(Merek Cat.No 806072)洗涤脱保护的树脂5次进行9分钟。
然后,连接氨基酸Fmoc-L(Fmoc)(Novabiochem Cat.No.-4-12-1085)酸,其是通过与羟基苯并三唑(HOBt,APPLIEDbIOSYSTEMS,Cat.No.400662)和二环己基碳化二亚胺(DCC,APPLIED BIOSYSTEMS,Cat.No.400663)溶液一起温育预先转化成相应的苯并三唑化合物活性酯。除去α-和ε位置上的Fmoc保护基后,进行Fmoc-Lys(Fmoc)(NOVABIOCHEMCat.No.04-12-1085)的第二次偶联以形成中心四聚物核R。然后连接Fmoc-Tyr(tBu)-OH(BACHEM FEINCHEMIKALIENCat.No.NB-1225)酸,其是通过与羟基苯并三唑(HOBt,APPLIEDBIOSYSTEMS,Cat.No400662)和二环己基碳化二亚胺(DCC,APPLIED BIOSYSTEMS,Cat.No 400663)溶液一起温育预先转化成相应的苯并三唑化合物活性酯。
将树脂/活化氨基酸悬浮液振摇51分钟,在偶联酪氨酸残基过程中完成苏氨酸残基的活化。通过与羟基苯并三唑(HOBt,APPLIED BIOSYSTEMS,Cat.No.400662)和二环己基碳化二亚胺(DCC,APPLIED BIOSYTEMS,Cat.No 400663)溶液一起温育,1mmol的Fmoc-Thr(tBu) -OH(BachemFEINCHEMIKALIEN Cat No B-1245)被转化为相应的苯并三唑化合物活性酯。
偶联酪氨酸结束时,用N-甲基-吡咯烷酮(NMP)充分洗涤树脂。用3ml 20%哌啶的NMP溶液处理除去Fmoc基。用NMP洗几次后,将预先活化的氨基酸苏氨酸转移在树脂上。偶联反应持续51分钟,并在此过程中第3个氨基酸精氨酸被活化。使用衍生的Fmoc-Arg(Pbf)-OH(BACHEM FEINCHEMIKALIENCat.No B-2375)。活化方法与有关苏氨酸活化所述的方法相同。
苏氨酸乙酰化及随后用哌啶除去Fmoc基后,活化的精氨酸被转移在树脂上以进行偶联反应。进行所需的洗涤次数除去过量的氨基酸及在精氨酸残基上脱保护Fmoc基后,先用NMP充分洗涤树脂,然后用二氯甲烷(DCM)洗涤,最后,树脂通过氩气流干燥。回收得到215.8mg树脂。
用比例为80∶10∶10V/V的乙酸(Merek Cat.No 63),二氯甲烷(Merck Cat.No 6050)和乙醇(Merck Cat No 8006)的混合物处理树脂,制备出完全被保护的式为(H2N-Arg(Pmc)-Thr(OtBu)-Tyr(OtBu)-CO)4-Lys2-Lys-Gly-OH的四聚物。
这种处理使肽从树脂上除去,而不除去氨基酸侧链保护基。
另一种方法是,用10ml三氟乙酸和具有实施例1表1中组成的清除剂混合物处理树脂,得到式为(H2N-Arg-Thr-Tyr-CO)4-Lys2-Lys-Gly-OH的完全脱保护的四聚物。
通过真空下蒸发三氟乙酸使溶液浓缩至约1ml。加入30ml冷乙醚来沉淀粗制肽物质。除去沉淀剂后,用30ml冷乙醚进行第二次洗涤以进一步溶解清除剂。溶于5ml H2O/CH3 CN/TFA50/50/0.1的所有肽物质被冷冻干燥。
回收得到103.8mg的三肽四聚物(H-L-Arg-L-Thr-L-Tyr)4-Lys2-Lys-COOH。5μg等份试样产物的RP-HPLC分析表明纯度近于97%。
用相似方法制备示于表B中的另外的化合物。
表 B
化合物 | 收率(%) | 纯度(%) | 观测值M.W | 理论值M.W |
(H-D-Arg-D-Thr-D-Tyr)4-Lys2-Lys-Gly-OH | 75 | 97 | 438.3 | 2142 |
(H-L-Arg-L-Thr-L-Tyr)4-Lys2-Lys-Gly-OH | 82 | 97 | 438.7 | 2142 |
(H-L-Tyr-L-Thr-L-Arg)4-Lys2-Lys-Gly-OH | 79 | 96 | 438.1 | 2142 |
(H-D-Tyr-D-Thr-D-Arg)4-Lys2-Lys-Gly-OH | 81 | 97 | 438.5 | 2142 |
实施例3
在活化的CH-Sepharose 4B上固定化
实施例1和2的肽,通过亲和色谱法
从血清中纯化免疫球蛋白
式(H-L-Arg-L-Thr-L-Tyr)4-Lys2-Lys-Gly-OH(5mg)的肽溶解于5ml 0.1M pH9.0的碳酸氢钠缓冲液中,然后将其加入1.2g活化树脂CH-Sepharose 4B(Pharmacia,Uppsala,Sweden,Cat.No.17-0490-01)中,该活化树脂CH-Sepharose 4B为用于亲和色谱法的色谱载体,其已被预活化以便直接偶联肽和蛋白。振摇该悬浮液24小时,并通过在不同时间取等分试样的反应混合物及随后对其进行RP-HPLC分析来监测偶联水平。
24小时后,与树脂共价连接得到约90%的初始肽,用50ml1MpH9.0的TRIS溶液洗涤该衍生的树脂,然后将其装入玻璃柱(100×6.6mm I.D.)中。
用相似方法制备本发明其它化合物,所得固定化收率示于表C中。
表 C
化合物 | 固定化收率(%) |
(H-D-Arg-D-Thr-D-Tyr)4-Lys2-Lys-Gly OH | 89 |
(H-L-Arg-L-Thr-L-Tyr)4-Lys2-Lys-Gly-OH | 90 |
(H-L-Tyr-L-Thr-L-Arg)4-Lys2-Lys-Gly-OH | 85 |
(H-D-Tyr-D-Thr-D-Arg)4-Lys2-Lys-Gly-OH | 89 |
H-D-Arg-D-Thr-D-Tyr-OH | 95 |
H-L-Arg-L-Thr-L-Tyr-OH | 93 |
H-L-Tyr-L-Thr-L-Arg-OH | 96 |
H-D-Tyr-D-Thr-D-Arg-OH | 94 |
为纯化免疫球蛋白,以1ml/分钟的流速,用25mM BIS-TRISpH6.5缓冲液(SIGMA,Cat.B9754)来平衡柱子,同时在280nm下监测洗脱液。然后将1ml粗制兔血清(SIGMA Cat.No.R9133)装载于柱子上,在柱空隙容积中洗脱出非保留物质后,将洗脱液改为0.1M乙酸。
收集如此处理的物质,并于聚丙烯酰胺凝胶上进行电脉分析。
通过亲和色谱法从粗制血清中纯化兔免疫球蛋白示于图1中,而收集部分的电泳分析示于图2中。正如电泳分析所清楚表明的,柱子能够保持来自粗制血清的免疫球蛋白部分,而在柱空隙容积中不能保持和洗脱出白蛋白。此外,图2中也表示了相应的各种兔免疫球蛋白的纯化试样的电泳分析,这些纯化试样是在用不同缓冲液即0.1M pH5.7的乙酸铵(A),0.1M pH7.0的磷酸钠(B),或0.1M pH8.5的磷酸钠(C)平衡亲和柱之后而得到的。正如以0.1M乙酸处理而解吸的部分的电泳分析所清楚显示的,在这三种情况下从杂质中得到了最佳纯度的免疫球蛋白。
此外,该柱子显示出显著的纯化能力,使免疫球蛋白能从0.5ml(E),1ml(F)和1.5ml(G)血清中纯化。该柱子的选择性高于那些具有固定化A蛋白的柱子。事实上,在具有同样尺寸的固定化A蛋白柱上纯化相同血清,所得到的纯化部分总含有微量的白蛋白。检测时的单体及多聚体肽以及用L或D构型的氨基酸制备的其类似物的纯化能力均是相似的,并且纯化能力不依赖于所用的亲和色谱载体的类型。实际上,用其它载体如Protein-Pak(Waters,USA),Eupergit C30N(Sigma,USA),和Affi-Gel(Bio-Rad,USA)所得结果相似。
使用固定化式(I)的肽制备的柱子从小鼠、大鼠、山羊、绵羊、马、人及牛血清中分离IgG,以及从粗来源中分离鸡IgY、人IgA和人IgM均会得到相似的结果。
Claims (23)
1.式(I)的肽
(H2N-X1-Thr-X2-CO)n-R(I)其中
X1和X2彼此不同,其为L或D构型的精氨酸或酪氨酸的氨基酸残基,其中苏氨酸和酪氨酸的羟基及精氨酸的胍部分可分别由肽化学中常规使用的用于保护羟基和胍部分的化合物来保护,
n是1、2、3或4,和
当n是2、3或4时,R是适于形成二聚物、三聚物或四聚物的基团,而当n为1时,R是OH、单一的氨基酸残基,或含多至7个氨基酸残基的肽链。
2.根据权利要求1的肽,其特征在于n是1。
3.根据权利要求2的肽,其特征在于R是OH。
4.根据权利要求1的肽,其特征在于n是4。
5.根据权利要求4的肽,其特征在于R是式Lys-Lys(ε-Lys)-的支链三肽。
6.根据权利要求4的肽,其特征在于R是式Lys-Lys(ε-Lys)-Gly的支链四肽。
7.根据1至6的任一权利要求的肽,其特征在于至少一个氨基酸具有D构型。
8.根据1至7的任一权利要求的用作免疫球蛋白配体的式(I)肽。
9.一种分离和纯化免疫球蛋白的方法,其包括:
(i)在亲和色谱载体上固定化本身能与至少一种免疫球蛋白非共价结合的化合物,
(ii)将所说亲和色谱载体装入一色谱柱中,
(iii)用一种能促进免疫球蛋白和固定化化合物间相互作用的缓冲液来平衡所述的柱子,
(iv)用含至少一种免疫球蛋白的液体装载所述的柱子,
(v)用至少一种能洗脱杂质而不影响免疫球蛋白和固定化化合物间相互作用的液体来洗涤所述的柱子,
(vi)用解离洗脱液洗脱预先吸附于柱上的所述免疫球蛋白,其特征在于:本身能与至少一种免疫球蛋白非共价结合的化合物是根据1至7的任一权利要求的式(I)化合物。
10.根据权利要求9的方法,其特征在于亲和色谱的载体用环氧基预活化以便直接与肽和蛋白偶联。
11.根据权利要求10的方法,其特征在于亲和色谱的载体是活化的CH Sepharose 4BTM树脂。
12.根据权利要求9的方法,其特征在于亲和色谱的载体是树脂Protein-PakTM。
13.根据权利要求9的方法,其特征在于步骤(i)是在碱性缓冲溶液存在下进行的。
14.根据权利要求13的方法,其特征在于pH为8.5至9。
15.根据权利要求9的方法,其特征在于用于步骤(iii)中的缓冲溶液为中性且具有弱离子强度。
16.根据权利要求15的方法,其特征在于pH为6.5至7。
17.根据9至16的任一权利要求的方法,其特征在于用于步骤(V)中的洗涤液体是缓冲溶液。
18.根据权利要求17的方法,其特征在于pH为6.5。
19.根据9至18的任一权利要求的方法,其特征在于是用酸或碱性溶液进行步骤(vi)的洗脱。
20.根据权利要求19的方法,其特征在于使用的是pH2.5的乙酸水溶液,pH3的0.1M甘氨酸水溶液,或pH9的碳酸氢钠溶液。
21.一种用于制备根据1至7的任一权利要求的式(I)肽的方法,其特征在于按溶液或固相法进行反应。
22.根据权利要求21的方法,其特征在于使用合适的自动合成仪进行固相制备。
23.根据ELISA法的用于检测免疫球蛋白或免疫球蛋白混合物的方法,其包括:
(i)在用于ELISA测定的微滴板上固定化本身能与至少一种免疫球蛋白非共价结合的化合物,
(ii)在所述微滴板上将要测定的含免疫球蛋白或多种免疫球蛋白的试样进行温育,
(iii)洗涤所述的微滴板,
(iv)检测如此形成的固定化化合物/免疫球蛋白复合物,其特征在于:本身能与至少一种免疫球蛋白非共价结合的化合物是根据1至7的任一权利要求的式(I)化合物。
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