JPH0920795A - リガンドとして有用なペプチド - Google Patents

リガンドとして有用なペプチド

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JPH0920795A
JPH0920795A JP8161800A JP16180096A JPH0920795A JP H0920795 A JPH0920795 A JP H0920795A JP 8161800 A JP8161800 A JP 8161800A JP 16180096 A JP16180096 A JP 16180096A JP H0920795 A JPH0920795 A JP H0920795A
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 低コストで汚染物を含有せずリガンドとして
有用なペプチド、その製造方法及び免疫グロブリンリガ
ンドとしてのその使用を提供すること。 【解決手段】 次の一般式（１） (H2N−X1−Thr −X2−CO）n −R ．．．．（１） （式中のX1とX2は互いに異なる基であって、Ｌ又はＤ構
造のアルギニン又はチロシンのアミノ酸残基を示し、ト
レオニン及びチロシンの水酸基とアルギニンのグアニジ
ン部分とは水酸基とグアニジン部分とを夫々保護するペ
プチド化学により常用される化合物により保護されてい
る場合もあり、Thr はＬ又はＤ構造を有するトレオニン
のアミノ酸残基を示し、ｎは１、２、３又は４を示し、
R はｎが２、３又は４の場合には二量体、三量体又は四
量体を生成するのに適する基を示し、ｎが１の場合には
R はOH基、単独アミノ酸残基又はアミノ酸残基が７以下
のペプチド鎖を示す）で表されることを特徴とするペプ
チド。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はリガンドとして有用
なペプチド、その製造方法及び免疫グロブリンリガンド
としてのその使用に関するものである。さらに詳述する
と、本発明は免疫グロブリンの一定部分にそれ自体を非
共有的に結合し得るペプチドに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】抗体としても知られる免疫グロブリン
は、診断及び治療分野で極めて重要である。事実、免疫
グロブリンは先ず第一に生物学的流体中の化合物の同定
及び定量化用に有用な試薬として広く使用される一方、
第二に治療上重要な生理学的方法中に含まれる生物学的
分子にそれ自体結合し得る薬剤として使用される。前述
の重要性を考慮して、免疫グロブリンの製造特に精製は
産業的観点から極めて重要である。
【０００３】免疫グロブリンは動物の血清又は適当な細
胞系の培養により得られる。免疫グロブリンの精製は従
来のクロマトグラフィー技術、例えばイオン交換又はゲ
ル濾過、又は好ましくはスタフィロコッカス オウレウ
ス（Staphylococcusaureus ）から得られ免疫グロブリ
ンの一定部分にそれ自体特定的に結合し得るプロテイン
Ａの固定化により製造したカラムを用いるカラムクロマ
トグラフィー（ジェー．シオダールの論文「ヨーロピア
ン ジャーナル オブ バイオケミストリー」第７８巻
第４７１〜４９０頁１９７７年）により行なわれる。然
し、プロテインＡはプロテインＡを用いて精製した生成
物の汚染を防止する為には、抽出起源に由来して注意深
い制御と精製を必要とするので、大規模に使用するには
多大な制約がある。また、プロテインＡは、ビールス又
は核酸部分等の生物学的汚染物を除去するのに用いられ
る薬剤の存在下で、変性条件に対し極めて安定ではな
い。最後に、プロテインＡの製造コストは極めて高くつ
き、大規模に精製する場合の使用を制限する。
【０００４】従って、免疫グロブリンの一定部分を認識
する能力に関する限り、低コストで製造できれば、プロ
テインＡを模倣し得る合成リガンドに対する多大な需要
が依然として存在する。また、合成物が起源なので、生
物学的汚染物が存在しなくなる。今や、これ等の諸特性
は、アルギニン、トレオニン及びチロシンのアミノ酸残
基を有するペプチドにより示されることが見出された。
【０００５】特に、前述の諸特性は、次の配列を有する
ペプチドにより示されることを見出した。 −HN−X1−Thr −X2−CO− ．．．．．（Ｓ） 式中で、X1はＬ又はＤ構造を有するアルギニン又はチロ
シンのアミノ酸残基を示し、X2はＬ又はＤ構造を有する
チロシン又はアルギニンのアミノ酸残基を示し、Thrは
Ｌ又はＤ構造を有するトレオニンのアミノ酸残基を示
し、X2がチロシンの場合にはX1はアルギニンを示し、X2
がアルギニンの場合にはX1はチロシンを示す。配列
（Ｓ）のアミノ酸残基の少なくとも一者以上がＤ構造を
有することが好ましい。配列（Ｓ）のアミノ酸残基の二
者又は三者の全てがＤ構造を有することが特に好まし
い。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の第一
の目的は、次式（１） （ H2N−X1−Thr −X2−CO）n −R ．．．（１） （式中のX1とX2は互いに異なる基であって、Ｌ又はＤ構
造のアルギニン又はチロシンのアミノ酸残基を示し、ト
レオニン及びチロシンの水酸基とアルギニンのグアニジ
ン部分とは水酸基とグアニジン部分とを夫々保護するペ
プチド化学により常用される化合物により保護されてい
る場合もあり、 ThrはＬ又はＤ構造を有するトレオニン
のアミノ酸残基を示し、ｎは１、２、３又は４を示し、
Rはｎが２、３又は４の場合には二量体、三量体又は四
量体を生成するのに適する基を示し、ｎが１の場合には
RはOH基、単独アミノ酸残基又はアミノ酸残基が７以下
のペプチド鎖を示す）で表されるペプチドを提供するに
ある。
【０００７】ここで「二量体」、「三量体」及び「四量
体」の語は、２、３又は４ケの配列（Ｓ）を有するペプ
チドを意味する。二量体（ｎ＝２）を生成するのに好適
な基の代表的一例はリシン残基である。三量体（ｎ＝
３）を生成するのに好適な基の代表的一例は、式 Lys−
Lys で表わされるジペプチドリシル−リシンである。四
量体（ｎ＝４）を生成するのに好適な基の代表的一例
は、式 Lys−Lys(ε−Lys)で表される分枝鎖状トリペプ
チドである。式（１）を有する四量体の代表的一例は、
次式（Ａ） (H2N−X1−Thr −X2−CO)4−Lys2−Lys −Gly −OH ．．．．（Ａ） （式中のX1とX2は前述したものを示し、トレオニン及び
チロシンの水酸基とアルギニンのグアニジン部分とは水
酸基とグアニジン部分とを夫々保護するペプチド化学に
より常用される化合物により保護されている場合もあ
る）で表される。ペプチド合成にあたって水酸基を保護
する保護基は、文献に多数報告されている（ニューヨー
ク市フリーマン社１９９２年発行の使用者への案内書に
記載されているジー．エー．グラントの論文「合成ペプ
チド」）。
【０００８】前述の保護基の代表的例は、第３級ブチル
（tBu)（ジー．ラ ジョイェ、エー．グリビッチ、ジェ
ー．ジー．アダムソン「合成」第５７１〜５７２頁１９
９０年）とベンジル基（ヨジマの論文「テトラヘドロ
ン」第４４号第８０５〜８１９頁（１９８８年））であ
る。アルギニンのグアニジン部分を保護するのに有用な
多数の基も、文献から多数知られている（ニューヨーク
市フリーマン社１９９２年発行の使用者への案内書に記
載されているジー．エー．グラントの論文「合成ペプチ
ド」）。前述の保護基の代表的例は、2,2,5,7,8 −ペン
タメチルクロマン−6 −スルホニル(Pmc) と4 −メトキ
シ−2,3,6 −トリメチル−ベンゼン（Mtr)である（ラマ
ージュ エンド グリーンの論文「テトラヘドロン レ
ターズ」第２８号第２２８７頁１９８７年と藤野等の論
文「ケミカル ファーマシューティカル ブーリチン」
第２９号第２８２５頁１９８１年）。
【０００９】かくて保護した式（１）の化合物の代表的
例は、実施例１（ｄ）の化合物 Boc−D −Arg(Pbf)−D
−Thr(tBu)−D −Tyr(tBu)−OMe と、実施例２の (H2N
−Arg(Pmc)− Thr(OtBu)−Tyr(OtBu) −CO)4−Lys2Lys
−Gly −OHである。ｎが１で Rがアミノ酸残基数１〜７
のペプチドである場合、配列中に含まれる全てのアミノ
酸は、互いに異なるもの又は同じものであって良く、Ｌ
又はＤ構造を有する。Ｄ構造がＬ構造より好適である。
また、単純で安価なアミノ酸が好ましい。
【００１０】ｎが１の場合の Rの特定の例は、Gly 又は
Ala 、Gly −Gly 、Gly −Ala 、Ala −Gly 、Ala −Al
a 、Gly −Gly −Gly 、Ala −Ala −Ala 、Gly −Gly
−Gly −Gly 、Gly −Gly −Gly −Gly −Gly 、Gly −
Ala −Gly −Ala −Gly 、Ala −Gly −Ala −Gly −Al
a −Gly −Ala である。式（１）のペプチドは従来の液
相ペプチド製造技術と固体相ペプチド製造技術の双方に
より、容易に製造できる。固体相ペプチド製造技術によ
る製造は自動合成機により行うのが好適である。好適な
自動合成機の代表的な一例は、米国カリホルニア州フォ
スター市のアプライド バイオシステムス社から販売さ
れている４３１型である。製造は同社から推奨されてい
る合成処理により行うのが好ましく、そのような合成処
理は文献に多数記載されている既知方法に基づいて通常
行う（１９８９年のオクスフォードＩＲＬプレス発行の
「実用的接近」中のアサートン及びシェパードの論文
「固体相ペプチド合成」）。
【００１１】本発明の第３の目的は、前述の免疫グロブ
リン又はその混合物の分離工程において、少なくとも１
ケ以上の免疫グロブリンと錯体を生成する式（１）の化
合物の使用を提供するにある。式（１）の化合物との非
共有結合により錯体を生成し得る免疫グロブリンは、例
えばマウスIgG 、ラットIgG 、チキンIgY 、山羊IgG 、
牛IgG 、ヒトIgG 、ヒトIgＡ及び他の種のこれ等の免疫
グロブリンであり、ヒトIgM 及び他の種のIgMである。
【００１２】免疫グロブリンの分離生成方法の代表的一
例は、（ｉ）少なくとも１ケ以上の免疫グロブリンに対
しそれ自体を非共有的に結合し得る化合物を、アフィニ
ティークロマトグラフィーの支持体上に固定化する段階
と、（ii）前述のアフィニティークロマトグラフィーの
支持体をクロマトグラフィーカラム中に充填する段階
と、(iii)免疫グロブリンと固定化した化合物との間の
相互作用を促進し得る緩衝剤を用いて、前述のクロマト
グラフィーカラムを平衡化する段階と、（iv) 少なくと
も１ケ以上の免疫グロブリンを有する流体を前述のカラ
ムに負荷させる段階と、（ｖ）免疫グロブリンと固定化
した化合物との間の相互作用を妨げることなく不純物を
溶離し得る少なくとも一種以上の液体を用いて前述のカ
ラムを洗浄する段階と、（vi）カラム上に先に吸着した
前述の免疫グロブリンを解離性溶離剤により溶離する段
階とを有する免疫グロブリンの分離精製方法において、
少なくとも１ケ以上の免疫グロブリンに対しそれ自体を
非共有的に結合し得る化合物が式（１）の化合物である
（式中のX1、X2、n 、R 及び Thrは上述したと同じもの
を示す）ことを特徴とする免疫グロブリンの分離精製方
法である。
【００１３】（ｉ）〜（vi）の段階は、従来技術により
行う。アフィニティークロマトグラフィーの支持体は、
ペプチド及びプロテインとの直接結合の為にエポキシド
基を用いてアフィニティークロマトグラフィーの支持体
を予め活性化することが好ましい。好適な支持体の代表
的例は、スウェーデンのファーマシア社から市販されて
いる樹脂活性化したＣＨセファロース（登録商標名）４
Ｂ、米国ウォータース社から市販されている樹脂プロテ
イン−パック（登録商標名）、ドイツ国ローム エンド
ハース社から市販されている樹脂ユーペルギット（登
録商標名）Ｃ３０Ｎ又は米国ビオラッド社から市販され
ているものである。
【００１４】段階（ｉ）はｐＨが８．５〜９．０の弱塩
基性緩衝溶液の存在下で実施することが好ましい。段階
(iii) は中性緩衝剤、例えばｐＨ６．５の２５ミリモル
のＢｉｓ−Ｔｒｉｓ溶液又はｐＨ７．０の５０ミリモル
の燐酸塩緩衝剤溶液、を用いて行うことが好ましい。段
階（ｖ）は低イオン強度の中性緩衝剤、例えばｐＨ６．
５の２５ミリモルのＢｉｓ−Ｔｒｉｓ溶液を用いて行う
ことが好ましい。段階（ｖ）で有用な解離性溶離液は、
例えば酸性又は塩基性溶液である。代表的な例はｐＨ
２．５の酢酸水性溶液又はｐＨ９．０の重炭酸ナトリウ
ム水性溶液である。
【００１５】この分離精製技術は広く文献に記載されて
いる（１９９４年発行のジャーナルオブ クロマトグラ
フィー第６５８号第２３７〜２５８頁に記載されている
エス．アール．ナラヤナンの論文「プロテインの予備的
アフィニティークロマトグラフィー」と、オランダ国ア
ムステルダムのエヌ．エルゼヒールのワーク エンド
ブルドン第７巻第２部に記載されたシー．アール．ロー
ウェの論文「生化学及び分子生物学における実験室技
術」と、１９７８年発行の免疫化学第１５巻第４２９号
に記載されたエイ等の論文）。
【００１６】本発明の化合物は周知のＥＬＩＳＡ技術に
より免疫グロブリン又は免疫グロブリン混合物の定性的
又は定量的測定に用いることもできる。ＥＬＩＳＡ技術
による免疫グロブリン又は免疫グロブリン混合物の定量
的測定方法の代表的一例は、（ｉ）少なくとも１ケ以上
の免疫グロブリンに対しそれ自体を非共有的に結合し得
る化合物をＥＬＩＳＡ測定用のマイクロタイタープレー
ト上に固定化する段階と、（ii）測定しようとする単数
又は複数の免疫グロブリンを含有する試料を前述のマイ
クロタイタープレート上で培養する段階と、(iii)前述
のマイクロタイタープレートを洗浄する段階と、（iv）
かくて生成した固定化した錯化合物／免疫グロブリンを
検査する段階と、を有する免疫グロブリン又はその混合
物の試験方法において、少なくとも１ケ以上の免疫グロ
ブリンに対しそれ自体を非共有的に結合し得る化合物が
式（１）の化合物である（式中のX1、X2、n 、R 及び T
hrは女子下津市田と同じものを示す）ことを特徴とする
免疫グロブリン又はその混合物の試験方法である。
【００１７】ＥＬＩＳＡ技術による免疫グロブリンの分
析的測定方法は、文献に広く記載されている（英国オク
スフォード市ブラックウエルのジョンストン エンド
トルペの論文「実地での免疫化学」１９８７年）。段階
（ｉ）ではプラスチックス製、例えばＰＶＣ製のマイク
ロタイタープレートに９６ケの凹みを設け、種々な量
（０〜５０μｇ／凹み）のリガンドを含有するｐＨ９．
０の０．１M の重炭酸ナトリウム溶液を充填したものを
用いることが好ましい。２４時間の培養後、過剰の溶液
を除去し、燐酸塩緩衝剤を用いてマイクロタイタープレ
ートを洗浄し、凹みに３％牛アルブミン溶液を充填し
て、特定の相互作用部位を根絶する。
【００１８】段階（ii）では燐酸塩緩衝剤を用いてマイ
クロタイタープレートを洗浄し、凹みに好ましくはビオ
チンを用いて誘導体化した免疫グロブリン含有溶液を充
填する。次いでマイクロタイタープレートを２０〜３７
℃で４〜１８時間培養する。段階(iii) での洗浄は燐酸
塩緩衝剤を用いて行うのが好ましい。段階（iv）はペル
オキシダーゼに抱合したアビジンの溶液を各凹みに添加
することにより行う。２時間の培養後、マイクロタイタ
ープレートを洗浄する。洗浄は再び燐酸塩緩衝剤を用い
るのが好ましい。次いで O−フェニレンジアミン溶液を
添加し、適当なELISA 読取機により色の生成を検出す
る。本発明のこれ等の特色及びその他の特色は、以下の
実施例と図面の説明からさらに明瞭になるであろう。
【００１９】図１は兎の粗血清から免疫グロブリンを精
製することを示す図であり、図２は兎の血清の精製から
誘導した画分のポリアクリルアミド ゲル上での電気泳
動分析を示す図である。式（１）の化合物の固体相合成
は、米国カリホルニア州フォスター市のアプライド バ
イオシステムスから市販されている４３１Ａ型自動ペプ
チド合成機とソフトウエア バージョン1.1を用い、製
造者により推奨されている合成処理に従い、文献に広く
報告されている既知の技術方法（英国オクスフォード市
ＩＲＬプレス発行の「実際の試み」に記載されたアサー
トン エンド シェパードの論文「固体相ペプチドの合
成」１９８８年）に基づいて行なった。
【００２０】
【実施例】以下の実施例は本発明を一そう良く説明する
為のもので、如何なる意味でも本発明を限定するもので
はない。実施例中で「Cat.No. 」はカタログ番号を示
す。 〔実施例１〕アミノ酸がＤ構造を有する式（１）のペプチド（X1が A
rgであり、X2が Tyrであり、n が１であり、R がOHであ
るもの）の溶液調製 この合成は保護されたペプチド Z−D −Thr(ｔBu) −D
−Tyr(ｔBu) −OMe の調製から始まり、次いでこれを先
ずNdテルミナスのZ 保護基を除去し、アルギニンアミノ
酸と結合させて誘導体 Boc−D −Arg(Pbf)−D −Thr(tB
u)−D −Tyr(tBu)−OMe を得、然る後完全に脱保護して
式（１）のペプチドとした。
【００２１】a) H−D −Tyr(tBu)−OMe （分子量２５１
amu ）の調製 H−D −Tyr(tBu)−OH（３．５５ｇ、１５ミリモル、バ
ッヘム ファインケミカリーエン社製、カタログ番号Ｆ
−２１７０）を１００ｍｌのCh3OH に懸濁し−１５℃に
冷却した懸濁液に、３．５４ｇのSOCl2(３０ミリモル、
アルドリッヒ社製、カタログ番号２３，０４６−４）を
添加した。室温で２時間次いで９０℃で２時間振盪した
後、溶媒を蒸発により除去し、残留物を KOH上で一夜乾
燥した。かくて、４．２１ｇの粗生成物を塩酸塩（１
４．７ミリモル）として得た。収率９８％。
【００２２】b) Z−D −Thr(ｔBu) −D −Tyr(ｔBu) −
OMe （分子量５４１amu ）の調製 ７．２１ｇ（１０ミリモル）の Z−D −Thr(ｔBu) −D
−Tyr(ｔBu) −OMe （ＤＣＨＡ、バッヘム ファインケ
ミカリーエン社製、カタログ番号Ｃ−１４８０）と１．
６５ｍｌ（１６．２ミリモル）の N−メチル モルホリ
ン（ＮＭＭ、シグマ社製、カタログ番号Ｍ−７８８９）
とを７５ｍｌの乾燥した N−メチル ピロリドン（ＮＭ
Ｐ）に溶解した溶液に、振盪しながら−１０℃で、２．
１２ｍｌ（１６．２ミリモル）のイソブチルクロロホル
ミエート（ＩＢＣＦ、シグマ社製、カタログ番号Ｉ−３
２５３）を９ｍｌの CHCl3中に希釈した溶液を滴加し
た。２０分後、４．２１ｇ（１４．７ミリモル）の H−
D −Tyr(tBu)−OMe ・HCl と１．７５ｍｌのＮＭＭとを
７５ｍｌのＮＭＰに溶解した溶液を滴加した。次いで、
約３ｍｌのＮＭＭをさらに添加して、ｐＨを７．５〜
８．０とした。
【００２３】反応混合物を０℃で２時間振盪した後、−
夜室温で振盪した。析出した塩を炉別し、溶液をAcOEt
−ヘキサンを溶離液として用いるシリカゲル上のフラッ
シュ クロマトグラフィーにより濃厚化した。所望の生
成物（４．２３ｇ、７．４５ミリモル）を純粋な油状物
（ＴＬＣ）の形で得た。
【００２４】c) H−D −Thr(tBu)−D −Tyr(tBu)−OMe
(分子量４０７amu)の調製 ４．０３ｇの Z−D −Thr(tBu)−D −Tyr(tBu)−OMe
(７．４５ミリモル）を２５０ｍｌのCH3OH 中に溶解し
た。活性炭上に担持した１０％のPd８５０ｍｇ（フルカ
社製、カタログ番号７５９９０）を添加した後、振盪し
ながら室温の溶液上に水素気流を４時間流した。この水
素化反応をＴＬＣによりモニターした。触媒を濾別し、
濾液の蒸発後、２．８８ｇ（７．０８ミリモル、収率９
５％）の H−D −Thr(tBu)−D −Tyr(tBu)−OMe を純粋
な油状物（ＴＬＣ）の形で得た。
【００２５】d) Boc−D −Arg(Pbf)−D −Thr(tBu)−D
−Tyr(tBu)−OMe(分子量９１６amu ）の調製 ３．７３ｇ（７．０８ミリモル）の Boc−D −Arg(Pbf)
−OH（バッヘム ファインケミカリエン社製、カタログ
番号Ａ−３７５０）を７５ｍｌの乾燥したＮＭＰ中に溶
解した清澄な溶液であって０．８５ｍｌ（７．７９ミリ
モル）のＮＭＰを含有するものを、振盪しながら−１０
℃に冷却した。次いで、１．０２ｍｌ（７．７９ミリモ
ル）のＩＢＣＦを６ｍｌの CHCl3中に希釈した溶液を滴
加した。３０分後、２．８８ｇ（７．０８ミリモル）の
H−L −Thr(tBu)−L −Tyr(tBu)−OMe を７５ｍｌのCH
Cl3 中に溶解した溶液を２０分で滴下した。反応混合物
を０℃で２時間常温で一夜維持した。溶媒を真空蒸発さ
せ、粗生成物をAcOEt −ヘキサンを溶離液として用いる
シリカゲルカラム上のフラッシュ クロマトグラフィー
により精製した。かくて、５．５８ｇ（６．０８ミリモ
ル、収率８６％）のBoc−D −Arg(Pbf)−D −Thr(tBu)
−D −Tyr(tBu)−OMe を純粋な油状物（ＴＬＣ及びＲＰ
−ＨＰＬＣ）として得た。
【００２６】e) H−D −Arg −D −Thr −D −Tyr −OH
( 分子量４３８ａｍｕ）の調製 前述の油状物を次の組成を有する混合物１００ｍｌを用
いて２時間処理した。
【表１】
【００２７】トリフルオロ酢酸の真空蒸発により溶液を
約１０ｍｌに濃縮し、１５０ｍｌの低温エチルエーテル
の添加により粗ペプチド性物質を析出させた。析出剤の
除去後、１００ｍｌの低温エチルエーテルを用いて順次
に洗浄して、スカベンジャーがより良く可溶化するよう
にした。全てのペプチド性物質を５０ｍｌのH2O/CH3CN/
TFA の50/50/0.1 比の溶液中に溶解した後、凍らせ、凍
結乾燥した。かくて、４．３２ミリモルに相当する１．
８９ｇのトリペプチド H−D −Arg−D −Thr −D −Tyr
−OHを回収した。収率７１％。生成物の一分液５μｇ
をＲＰ−ＨＰＬＣ分析したところ、純度９７％であっ
た。
【００２８】同様に作業して次の化合物をさらに調製し
た。 H −L −Arg −L −Thr −L −Tyr −OH H −L −Tyr −L −Thr −L −Arg −OH H −D −Tyr −D −Thr −D −Arg −OH 調製収率、最終純度及び実験的に質量分光法により測定
した分子量は、次の表２に示す通りであった。
【００２９】
【表２】
【００３０】〔実施例２〕アミノ酸がＬ構造を有する場合の式（１）のペプチド
（式中でX1が Argを示し、X2が Tyrを示し、ｎ＝４であ
り、Ｒ＝Lys-Lys(εLys)−Gly を示す）の固体相調製 このペプチドの調製は、米国アプライド バイオシステ
ムス社の４３１型の自動ペプチド合成機を用い、Fmoc/H
OBt/DCC の方法（ケミカル ベリヒテ第１０３号第７８
８〜７９８頁１９７０年に記載されたダブリュ．コーニ
ヒとアール ガイガーの論文）により、製造者が推奨す
る様式に基づいて行なった。
【００３１】この調製は０．１ミリモル規模で行ない、
N-末端アミノ基をFmoc基で保護したグリシン（クロロト
リチリクロリドリック、ノボビオケム社製、カタログ番
号０４−１２−２８００、０．１ミリモル）を用いて予
め誘導体化したペプチド合成用酸不安定樹脂から出発
し、これを最初の合成サイクル中で３．０ミリモルのピ
ペリシン（Ｎ−メチル−２−ビロリドン（ＡＢＩ社製、
カタログ番号４００６２９）中に２０％）を用いて室温
で１４分間振盪する処理により保護を解除した。保護を
解除した樹脂を、２．５ｍｌのＮ−メチル−２−ピロリ
ドン（メルク社製、カタログ番号８０６０７２）を５回
用いて、室温で振盪しながら９分間洗浄した。
【００３２】次いで、ヒドロキシベンゾトリアゾール
（ＨＯＢｔ、アプライド バイオシステムス社製、カタ
ログ番号４００６６２）及びジシクロヘキシルカルボジ
イミド（ＤＣＣ、アプライド バイオシステムス社製、
カタログ番号４００６６３）の溶液を用いる培養により
相応するベンゾトリアゾール化合物活性エステルに予め
変性したアミノ酸Fmoc−Lys(Fmoc)(ノバビオケム キャ
タリスト社製、カタログ番号０４−１２−１０８５）酸
を結合させた。α位及びε位のFmoc保護基の除去後、Fm
oc−Lys(Fmoc)(ノバビオケム キャタリスト社製、カタ
ログ番号０４−１２−１０８５）の２回目の結合を達成
して、中央の四量体コアＲを生成した。次いで、ヒドロ
キシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ、アプライド バイ
オシステムス社製、カタログ番号４００６６２）及びジ
シクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ、アプライド
バイオシステムス社製、カタログ番号４００６６３）の
溶液を用いる培養により相応するベンゾトリアゾール化
合物活性エステルに予め変性したFmoc−Tyr(tBu)−OH
（バッヘム ファインケミカリーエン社製、カタログ番
号Ｂ−１２５５）酸を結合させた。
【００３３】この樹脂／活性化したアミノ酸の懸濁液を
５１分間振盪した。チロシン残基の結合中、トレオニン
樹脂の活性化を達成した。１ミリモルのFmoc−Thr(tBu)
−OH（バッヘム ファインケミカリーエン社製、カタロ
グ番号Ｂ−１２４５）を、ヒドロキシベンゾトリアゾー
ル（ＨＯＢｔ、アプライド バイオシステムス社製、カ
タログ番号４００６６２）及びジシクロヘキシルカルボ
ジイミド（ＤＣＣ、アプライド バイオシステムス社
製、カタログ番号４００６６３）の溶液を用いる培養に
より相応するベンゾトリアゾール化合物活性エステルに
変性した。
【００３４】チロシンの結合が終了したとき、樹脂をＮ
−メチル−ピロリドン（ＮＭＰ）を用いて入念に洗浄し
た。Fmoc基の除去はＮＭＰ中に溶解した２０％のピペリ
シン３ｍｌを用いる処理により達成した。ＮＭＰを用い
て数回洗浄した後、予め活性化したアミノ酸トレオニン
を樹脂上に移送した。結合反応は５１分間続き、その時
間中第三のアミノ酸アルギニンを活性化した。誘導体Fm
oc−Arg(Pbf)−OH（バッヘム ファインケミカリーエン
社製、カタログ番号Ｂ−２３７５）を用いた。活性化方
法はトレオニンの活性化と同様であった。
【００３５】トレオニンのアシル化とそれに続くピペリ
ジンを用いるFmoc基の除去の後、活性化したアルギニン
を結合段階用に樹脂上に移送した。過剰のアミノ酸を除
去する為所要の洗浄を行ないアルギニン残基上において
もFmoc基を脱保護した後、樹脂を先ずＮＭＰを用いて次
いでジクロロメタン（ＤＣＭ）を用いて入念に洗浄し
た。最後に樹脂をアルゴン気流により乾燥した。215.8
mgの樹脂を回収した。樹脂を酢酸（メルク社製、カタロ
グ番号６３）、ジクロロメタン（メルク社製、カタログ
番号６０５０）及びエタノール（メルク社製、カタログ
番号８００６）の８０：１０：１０V/V 比の混合物を用
いて処理することにより、次式 (H2N-Arg(Pmc)-Thr(OtBu)-Tyr(OtBu)-CO)4-Lys2-Lys-Gl
y-OH で表される充分に保護された四量体を調製した。
【００３６】この処理は樹脂からのペプチドの脱着を可
能とするが、アミノ酸側鎖の保護基の脱着を可能とはし
ない。或いは又、実施例１の表１に示した組成を有する
トリフルオロ酢酸及びスカベンジャーの混合物１０ｍｌ
を用いて樹脂を処理することにより、次式 (H2N-Arg−Thr-Tyr-CO)4-Lys2-Lys-Gly-OH で表される充分に脱保護された四量体が得られる。
【００３７】前述の樹脂溶液を真空下でトリフルオロ酢
酸を蒸発させることにより、約１ｍｌに濃縮した。３０
ｍｌの低温エチルエーテルの添加により、粗ペプチド性
物質を析出させた。析出剤の除去後、３０ｍｌの低温エ
チルエーテルを用いて第２回の洗浄を行ない、スカベン
ジャーをさらに可溶化した。全てのペプチド性物質を５
ｍｌのH2O/CH3CN/TFA の50/50/0.1 比の溶液中に溶解し
た後、凍らせ、凍結乾燥した。１０３．８ｍｇの四量体
性トリペプチド（H-L-Arg-L-Thr-L-Tyr-)4-Lys2-Lys-CO
OHを回収した。生成物の一部分５μｇをＲＰ−ＨＰＬＣ
分析したところ、純度が９７％に近かった。同様に実施
して、表３に示す化合物をさらに調製した。
【００３８】
【表３】
【００３９】〔実施例３〕活性化したＣＨ−セファロース４Ｂ上の実施例１及び２
のペプチドの固定とアフィニティー クロマトグラフィ
ーにより血清からの免疫グロブリンの精製 式(H-L-Arg
-L-Thr-L-Tyr-)4-Lys2-Lys-Gly-OH で表されるペプチド
（５ｍｇ）をｐＨ９．０の０．１M 重炭酸ナトリウム緩
衝液５ｍｌ中に溶解し、次いで１．２ｇの活性化した樹
脂ＣＨ−セファロース４Ｂ（スウェーデン国ウップサラ
のファルマシア社製、カタログ番号１７−０４９０−０
１）、これはペプチド及びプロテインとの直接結合用に
予め活性化したアフィニティー クロマトグラフィー用
のクロマトグラフィー支持体である、に添加した。この
懸濁液を２４時間振盪し、反応混合物の一部分を種々異
なる時間に採取して、ＲＰ−ＨＰＬＣ分析することによ
り結合レベルをモニターした。
【００４０】２４時間後、約９０％の当初ペプチドが樹
脂に共有結合して生成した。この誘導体化した樹脂を５
０ｍｌのｐＨ９．０の１M TRISを用いて洗浄し、次いで
ガラスカラム（１００×６．６ｍｍ内径）上に充填し
た。本発明の他の化合物を用いて同様に実施して、次の
表４に示す免疫グロブリン収率を得た。
【００４１】
【表４】
【００４２】免疫グロブリンを生成する為に、カラムを
２５ミリモルのｐＨ６．５のＢＩＳ−ＴＲＩＳ緩衝液
（シグマ社製、カタログ番号Ｂ９７５４）を用いて、１
ｍｌ／分の流量で平衡化し、一方溶離液を２８０ｎｍで
モニターした。次いで、１ｍｌの粗兎血清（シグマ社
製、カタログ番号Ｒ９１３３）をカラム上に負荷させ、
カラム空隙容積に非保持物質を溶出した後、溶離液を
０．１Ｍ酢酸に変更した。
【００４３】かかる処理により脱着した物質を集合し、
ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動分析により分析し
た。粗血清からの兎免疫グロブリンのアフィニティーク
ロマトグラフィーによる精製を図１に示し、集合した諸
部分の電気泳動分析を図２に示す。電気泳動分析から明
らかに判るように、カラムは粗血清からの免疫グロブリ
ン部分を保持することができ、一方、アルブミンは保持
されず、カラム空隙容積に溶出された。また、図２は、
異なる緩衝剤即ち（Ａ）ｐＨ５．７の０．１Ｍ酢酸アン
モニウム、（Ｂ）ｐＨ７．０の０．１ M 燐酸ナトリウ
ム又は（Ｃ）ｐＨ８．５の０．１Ｍ燐酸ナトリウムを用
いて、アフィニティーカラムの平衡後に得た幾つかの兎
免疫グロブリンの精製に相応する電気泳動分析をも示
す。０．１Ｍ酢酸を用いる処理により脱着さた諸部分の
電気泳動分析から明らかに判るように、３つの場合の何
れにおいても免疫グロブリンが汚染物から最適に精製さ
れた。
【００４４】さらに、カラムは（Ｅ）０．５ｍｌの血清
からの免疫グロブリンの精製、（Ｆ）１ｍｌの血清から
の免疫グロブリンの精製及び（Ｇ）１．５ｍｌの血清か
らの免疫グロブリンの精製を可能とする極めて優れた精
製能力を示した。このカラム選択性は固定化したプロテ
インＡを用いるカラムの選択性よりも優れていた。実際
に、同じ大きさを有する固定化したプロテインＡのカラ
ム上での同じ血清の精製は、常に痕跡量のアルブミンを
含有する精製諸部分を提供した。検査下の単量体性及び
多量体性ペプチドの双方及びＬ又はＤ構造のアミノ酸を
用いて調製したそれ等の同族体の精製能力は同様であ
り、使用したアフィニティークロマトグラフィー支持体
の種類によっては左右されなかった。実際に、プロテイ
ン−パック（米国ウオータース社製）、ユーペルギット
Ｃ３０Ｎ（米国シグマ社製）及びアフィ−ゲル（米国ビ
オ−ラド社製）等のような他の支持体を用いた場合に
も、同様な結果を得た。
【００４５】マウス、ラット、山羊、羊、馬、ヒト及び
牛の血清からのＩｇＭの単離並びに粗給源からの鶏のＩ
ｇＹ、ヒトのＩｇＡ及びヒトのＩｇＭの単離にあたり、
式（１）の固定化したペプチドを用いて調製したカラム
を用いて同様な結果を得た。
【図面の簡単な説明】
【図１】式(H−Ｌ−Arg −Ｌ−Thr −Ｌ−Tyr-)4−Lys2
−Lys −Gly −OHで表わされる化合物の固定化により製
造したカラム上でアフィニティークロマトグラフィーを
用いることにより、兎の粗血清から免疫グロブリンを精
製することを示す図である。
【図２】式(H−Ｌ−Arg −Ｌ−Thr −Ｌ−Tyr-)4−Lys2
−Lys −Gly −OHで表わされる化合物と種々な緩衝剤と
種々な量の血清を用いることによる兎の血清の精製から
誘導した画分のポリアクリルアミド ゲル上での電気泳
動分析を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 7/06 8517−4Ｈ Ｃ０７Ｋ 7/06 7/08 8517−4Ｈ 7/08 19/00 8517−4Ｈ 19/00 (72)発明者 アントニオ ヴェルドリヴァ イタリア国 ナポリ 80053 カステラム マレ ディ スタビア ヴィア エッフェ ペトラルカ 33 (72)発明者 メノッチ ルヴォ イタリア国 アヴェリノ 83058 トレヴ ィコ ヴィア ダンテ アリギエリ 34

Claims (23)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 次の一般式（１） (H2N−X1−Thr −X2−CO）n −R ．．．．（１） （式中のX1とX2は互いに異なる基であって、Ｌ又はＤ構
    造のアルギニン又はチロシンのアミノ酸残基を示し、ト
    レオニン及びチロシンの水酸基とアルギニンのグアニジ
    ン部分とは水酸基とグアニジン部分とを夫々保護するペ
    プチド化学により常用される化合物により保護されてい
    る場合もあり、Thr はＬ又はＤ構造を有するトレオニン
    のアミノ酸残基を示し、ｎは１、２、３又は４を示し、
    R はｎが２、３又は４の場合には二量体、三量体又は四
    量体を生成するのに適する基を示し、ｎが１の場合には
    R はOH基、単独アミノ酸残基又はアミノ酸残基が７以下
    のペプチド鎖を示す）で表されることを特徴とするペプ
    チド。
  2. 【請求項２】 ｎが１である請求項１記載のペプチド。
  3. 【請求項３】 ＲがOH基である請求項２記載のペプチ
    ド。
  4. 【請求項４】 ｎが４である請求項１記載のペプチド。
  5. 【請求項５】 Ｒが式 Lys−Lys(ε−Lys)−で表される
    分枝鎖状トリペプチドである請求項４記載のペプチド。
  6. 【請求項６】 Ｒが式 Lys−Lys(ε−Lys)−Gly で表さ
    れる分枝鎖状テトラペプチドである請求項４記載のペプ
    チド。
  7. 【請求項７】 少なくとも１ケ以上のアミノ酸がＤ構造
    を有する請求項１、２、３、４、５、又は６記載のペプ
    チド。
  8. 【請求項８】 免疫グロブリンのリガンドとして用いる
    為の請求項１、２、３、４、５、６又は７記載の式
    （１）のペプチド。
  9. 【請求項９】 （ｉ）少なくとも１ケ以上の免疫グロブ
    リンに対しそれ自体を非共有的に結合し得る化合物を、
    アフィニティークロマトグラフィーの支持体上に固定化
    する段階と、（ii）前述のアフィニティークロマトグラ
    フィーの支持体をクロマトグラフィーカラム中に充填す
    る段階と、（iii)免疫グロブリンと固定化した化合物と
    の間の相互作用を促進し得る緩衝剤を用いて、前述のク
    ロマトグラフィーカラムを平衡化する段階と、（iv）少
    なくとも１ケ以上の免疫グロブリンを有する流体を前述
    のカラムに負荷させる段階と、（ｖ）免疫グロブリンと
    固定化した化合物との間の相互作用を妨げることなく不
    純物を溶離し得る少なくとも一種以上の液体を用いて前
    述のカラムを洗浄する段階と、（vi）カラム上に先に吸
    着した前述の免疫グロブリンを解離性溶離剤により溶離
    する段階とを有する免疫グロブリンの分離精製方法にお
    いて、少なくとも１ケ以上の免疫グロブリンに対しそれ
    自体を非共有的に結合し得る化合物が、請求項１、２、
    ３、４、５、６又は７記載の式（１）の化合物であるこ
    とを特徴とする免疫グロブリンの分離精製方法。
  10. 【請求項１０】 ペプチド及びプロテインとの直接結合
    の為にエポキシド基を用いてアフィニティークロマトグ
    ラフィーの支持体を予め活性化する請求項９記載の方
    法。
  11. 【請求項１１】 アフィニティークロマトグラフィーの
    支持体が樹脂活性化したＣＨセファロース（登録商標）
    ４Ｂである請求項１０記載の方法。
  12. 【請求項１２】 アフィニティークロマトグラフィーの
    支持体が樹脂プロテイン−パック（登録商標）である請
    求項９記載の方法。
  13. 【請求項１３】 塩基性緩衝剤溶液の存在下で段階
    （ｉ）を行う請求項９記載の方法。
  14. 【請求項１４】 ｐＨが８．５〜９である請求項１３記
    載の方法。
  15. 【請求項１５】 段階(iii) で用いる緩衝剤溶液が中性
    であって弱いイオン強度を有する請求項９記載の方法。
  16. 【請求項１６】 ｐＨが６．５〜７である請求項１５記
    載の方法。
  17. 【請求項１７】 段階（ｖ）で用いる洗浄液が緩衝溶液
    である請求項９、１０、１１、１２、１３、１４、１５
    又は１６記載の方法。
  18. 【請求項１８】 ｐＨが６．５である請求項１７記載の
    方法。
  19. 【請求項１９】 酸性又は塩基性溶液を用いて溶離段階
    （vi）を行う請求項９、１０、１１、１２、１３、１
    ４、１５、１６、１７又は１８記載の方法。
  20. 【請求項２０】 ｐＨ２．５の酸性水性溶液、ｐＨ３の
    グリシンの０．１M水性溶液又はｐＨ９の重炭酸ナトリ
    ウム水性溶液を用いる請求項１９の方法。
  21. 【請求項２１】 溶液相技術又は固体相技術により反応
    を行うことにより、請求項１、２、３、４、５、６又は
    ７記載の式（１）のペプチドを製造する方法。
  22. 【請求項２２】 固体相内での製造を適当な自動合成機
    を用いて行う請求項２１の方法。
  23. 【請求項２３】 ＥＬＩＳＡ技術により免疫グロブリン
    又はその混合物を試験するにあたり、（ｉ）少なくとも
    １ケ以上の免疫グロブリンに対しそれ自体を非共有的に
    結合し得る化合物を、ＥＬＩＳＡ決定用マイクロタイタ
    ープレート上に固定化する段階と、（ii）測定しようと
    する単数又は複数の免疫グロブリンを含有する試料を前
    述のマイクロタイタープレート上で培養する段階と、(i
    ii)前述のマイクロタイタープレートを洗浄する段階
    と、（iv）かくて生成した固定化した錯化合物／免疫グ
    ロブリンを検査する段階と、を有する免疫グロブリン又
    はその混合物の試験方法において、少なくとも１ケ以上
    の免疫グロブリンに対しそれ自体を非共有的に結合し得
    る化合物が請求項１、２、３、４、５、６又は７記載の
    式（１）の化合物であることを特徴とする免疫グロブリ
    ン又はその混合物の試験方法。
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