RS51406B - Monoklonska antitela na humani ldl receptor, njihova produkcija i korišćenje - Google Patents

Abstract

Monoklonsko antitelo, himerično antitelo, potpuno humanizirano antitelo, anti-anti-ID antitelo ili neki fragment istog koji specifično prepoznaje i vezuje rastvorljiv ljudski LDL-receptor i njegov fragment, koji je sposoban da inhibira replikaciju virusa hepatitis C a koji se može dobiti putem imunizacije životinja sa ljudskim rastvorljivim LDLR+291 tj. formom rastvorljivog ljudskog receptora koji uključuju sekvence amino kiseline od Asp+4 do Glu +291 sekvence ljudskog rastvorljivog LDLR, mimo monoklonskog antitela C7.Prijava sadrži još 18 patentnih zahteva.

Description

POLJE PRONALASKA

Ovaj pronalazak se odnosi na monoklonska antitela koja specifično prepoznaju humane receptore za lipoproteine niske gustine (LDLR). Ova antitela su korisna na pr. za identifikaciju i prečišćavanje humanih solubilnih LDLR (hs LDLR) u proizvodnim procesima kao i za identifikaciju i lečenje bolesti kao stoje hepatitis C infekcija (HCV).

STANJE TEHNIKE

Holesterol, komponenta svih eukariotskih plazma membrana je neophodan za rast i vijabilnost ćelija viših organizama. Međutim, viši nivoi holesterola u serumu uzrokuju bolest i smrt jer doprinose stvaranju aterosklerotskih plakova u arterijama po ćelom telu. Glavno mesto sinteze holesterola kod sisara jeste jetra. Značajne količine holsterola se stvaraju i u tankom crevu. Brzina stvaranja holsterola u ovim organima značajno zavisi od količine holsterola koji se apsorbuje pošto se unese ishranom. Ćelije izvan jetre i tankog creva dobijaju holsterol iz plazme, a ne sintezomde novo.Holesterol i drugi lipidi se transportuju telesmm tečnostima preko lipoproteina, koji se klasifikuju po rastućoj gustini. Jedan lipoprotein poredstavlja česticu koja se sadrži od srži hidrofobnih lipida okruženih školjkom polarnih lipida i apoproteina. Ovi lipoprotein imaju dve uloge: oni solubilizuju visoko hidrofobne lipide i sadrže signale koji regulišu kretanje određenih lipida u specifične ciljne ćelije i tkiva, i izvan njih. Holesterol se transportuje u telesnim tečnostima pomoću lipoproteina niske gustine (LDL) koji se vezuje za specifični receptor na plazma membranu ne-hepatičkih ćelija. Kompleks receptor-LDL se onda internalizuje u ćelije transportnim mehanizmom koji je poznat kao receptorski posredovana endocitoza (Goldstein i sar. 1979). Receptor lipoproteina niske gustine (LDL) predstavlja prototip porodice strukturno povezanih receptora na površini ćelija koji posreduju endocitozu multiplih liganda u ćelijama sisara.

Jedan LDL receptor se sastoji od 822 amino kiselinskih ostatka i ima molekulsku težinu 164000. Sastoji se od nekoliko domena od kojih neki imaju istu homologiju sekvenci sa ostalim proteinima. Njegov NHo-terminalni domen koji se vezuje za ligand sastoji se od 292 ostatka organizovanih u 7 nesavršenih ponovaka bogatih cisteinom.

Svaki ponovak sadrži šest cisteinskih ostatka koji su disulfidno vezani za modele jedan za tri, dva za pet, i četiri za šest (Bieri i sar. 1995). Ovaj domen prate četiri dodatna domena: prvi se sastoji od 400 amino kiselinskih ostataka i homologan je SFG receptorima, drugi se sastoji od 58 amino kiselinskih ostataka bogatih šećerima vezanim za kiseonik, a treći je sam trans-membranski domen od 22 amino kiselinska ostataka i četvrti je citoplazmični domen od 50 amino kiselinskih ostataka (Sudhof i sar. 1985; Brown i sar. 1986).

Fiziološki značaj LDL receptora otkrili su Brown i Goldstein ispitujući familijarnu hiperholesterolemiju (FH). Pokazalo se daje ova bolest posledica molekulskog genetskog defekta koji dovodi do odsustva ili deficijencije funkcionalnih receptora za LDL (Brown i sar. 1976). Opisano je nekoliko klasa FH mutacija (Goldstein lsar. 1975).

Rastvorljivi oblici sLDLR koji imaju antivirusnu aktivnost identifikovani su i izolovani iz supernatanta kulture ćelija indukovanih interferonom (Fischer i sar. 1993) i telesnih tečnosti (Fischer i sar. 1994). Identifikovano je nekoliko proteina indukovanih interferonom koji su presudni za indukciju antivirasnog stanja preko IFN. Jedan takav protein koji ima antivirusnu aktivnost proizveden je i akumuliran u supernatantu kulture humanih amnionskih WTSH ćelija. Ovaj protein je prečišćen do homogenosti i identifikovan kao sLDLR (vidi EP 0 553 667 i Fischer i sar. 1993). Pokazalo se da se ovaj sLDLR sekretuje u medijum od strane ćelija sisara koje ulaz u antivirusno stanje kao odgovor na interferon. Za razliku od interferona, sLDLR ne indukuje antivirusno stanje u ćelijama, već je sam po sebi antivirusni. Utvrđeno je da sLDLR mora da bude prisutan tokom celog procesa maturacije virusne replikacije i pupljenja, što govori da može da bude uključen i u složeni proces koji vodi do mhibicije vimsnog sklopa ili pupljenja (neobjavljeni podaci). Nedavno je pokazano daje endocitoza virusa hepatitisa C posredovana LDL receptorima na gajenim ćelijama (Agnello i sar. 1999). Ovi i drugi nalazi govore da porodica LDL receptora može da služi kao receptor za viruse. Prema tome, antitela koja se stvaraju protiv sLDL receptora mogu da blokiraju ulazak i pupljenje virusnih čestica tako što će se vezivati za ćelijski LDL receptor.

Jedino raspoloživo monoklonko antitelo (Mab) na LDLR za koje se do danas zna jesteCl,antitelo na goveđi LDLR (Beisiegel i sar. 1981, komercijalno ga proizvodi

Amersham, Velika Britanija) i pripremljen je imunizacijom miša LDLR iz kore goveđeg nadbubrega koji je prečišćen do homogenosti. Membrane kore goveđeg nadbubrega su solubilzovane, a receptori su delimično prečišćeni elucijom iz DEAE celulozne kolone (Beisiegel i sar. 1981). Antitelo na goveđi LDLR samo blago unakrsno reaguje sa humanim LDLR.

U stvari, pokazano je da C7 Mab na goveđi LDLR ima značajne nedostatke kada se koristi za detekciju i kvantitaciju rekombinantog humanog LDLR:

a) ima veoma niski afinitet za humani LDLR

b) Značajno unakrsno reaguje sa nečistoćama dobijemm iz ćelijske kulture.

Do sada nismo imali specifična antitela na humani LDLR Ovo iznenađuje jer je

bilo krajnje uobičajeno da se dobijaju antitela na nove proteine, bilo za prečišćavanje, identifikaciju ili u cilju razvijanja eseja. Moguće je da takva antitela do sada nisu bila razvijena jer je uslov za dobijanje monoklonskih antitela da postoji dovoljno velika količina visoko prečišćenog antigena koji omogućava efikasnu imunizaciju miša. Visoko prečišćeni antigen je onaj koji izgleda kao jedini veći pik u RP-HPLC. Staviše, metode za identifikaciju i kvantifikaciju antigena tokom procesa purifikacije nije lako utvrditi. U skladu sa pronalaskom, test antivirusne aktivnosti koji je ovde opisan korišćen je za identifikaciju LDLR tokom procesa purifikacije.

Postoji potreba da se genenšu specifična Mab na human solubilni LDLR da se obezbedi sredstvo za razvoj efikasnog imunoeseja (ELISA) i za identifikaciju tog proteina VVestern blot tehnikom. Ova antitela su potrebna za praćenje i kvantifikaciju rekombinantih solubilnih LDLR tokom razvoja proizvodnje i procesa prečišćavanja rekombinantnog proteina za detekciju prirodnog proteina.

KRATAK PRIKAZ PRONALASKA

Ovaj pronalazak omogućuje genensanje ćelijskih linija hibndoma koje proizvode monoklonska antitela koja su u stanju da specifično prepoznaju i vežu humani LDL receptor i njegove fragmente.

Još specifičnije, ovaj pronalazak omogućava generisanje ćelijskih linija hibridoma koje proizvode monoklonska antitela koja su u stanju da specifično prepoznaju i vežu humani solubilni LDL receptor.

Prema tome, ovaj pronalazak se odnosi na monoklonska antitela, himerska antitela, humanizovana antiela, anti-anti-Id antitela ili njihove fragmente koji specifično prepoznaju i vezuju humane LDL receptore i njihove fragmente, osim monoklonskog antitela C7.

Ovaj pronalazak obezbeđuje takva monoklonska antitela koja prepoznaju i vezuju humane solubilne LDLR i zadovoljavaju sledeće potrebe: 1 Mab koja mogu da se koriste kao par u ELISA, na pr. sendvič ELISA (Enzimski Linkovani Imuno Sorbentni Esej) za detekciju humanih solubilnih

LDLR.

2. Mab koja mogu da se koriste za identifikaciju LDLR analizom Western blot, 3. Mab koja mogu da se koriste za neutralizaciju antivirusne aktivnosti humanih solubilnih LDLR, 4. Mab koja mogu da se koriste za inhibiciju virusne infekcije, kao što je HCV.

Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje metodu za detekciju i/ili kvantifikaciju humanih LDLR koja obuhvata upotrebu specifičnih monoklonskih antitela u skladu sa pronalaskom i to metodom koja je poznata za ove namene.

Ovaj pronalazak obezbeđuje i klonirane hibridome koji obuhvataju ćelije slezine iz sisara imunizovanih rekombinantnim humanim LDLR i homogenom ili heterogenim limfoidinom ćelijom.

Jedno monoklonsko antitelo u skladu sa ovim pronalaskom priprema se na konvencionalni način, na pr. gajenjem kloniranog hibridoma koji obuhvata ćeliju slezine iz sisara imunizovanog hsLDL i homogene ili heterogene limfoidine ćelije u tečnoj sredini ili abdomenu sisara da se omogući hibndomu da proizvede i akumulira monoklonsko antitelo.

Ovaj pronalazak u svom drugom aspektu, obezbeđuje metodu za prečišćavanje humanog LDLR koji obuhvata kontakt sa materijalom koji sadrži sirovi LDLR sa monoklonskim antitelom u skladu sa ovim pronalaskom. Kolona sa adsorbovanim LDLR specifičnim monoklonskim antitelom može da se koristi kao korak za prečišćavanje afiniteta, u procesu prečišćavanja rekombinantnog proteina.

Metoda za detekciju i merenje rekombinantog humanog LDLR koji obuhvata korišćenje monoklonskih antitela iz ovog pronalaska kao antitela u ELISA testu kako je to opisano u primeru 5.

Kako LDLR ili fragment LDLR za imunizaciju životinja svaki LDLR može da se koristi sve dotle dok LDLR potiče od toplokrvnih sisara. Može da se koristi i LDLR mutein. Reprezentativni pnmer ovakvog sisarskog humanog solubilnog LDLR jeste solubilni LDLR +291 oblik koji uključuje amino kiselinsku sekvencu koja počinje sa amino kiselinom Asp na položaju +4, a završava se sa amino kiselinom Glu na položaju +291 sekvence humanog LDLR, a može da se koristi i ma koja druga forma, kao što je forma +292, i td.

KRAĆI OPIS SLIKA

Na Slici 2 pokazan je redosled gde se ilustruje razvoj monoklonskih antitela na r-hsLDLR.

Slika 2 pokazuje analizu Western blot oblika +291 r-hsLDLRu liniji 1, urinarnog hsLDLR u liniji 2, i rekombinanti humani p55 TNF receptor kao negativnu kontrolu (r-hTPB-1) u liniji 3, sa monoklonskim antitelima pokazanim ispod svake trake. Strelice sa leve strane slike pokazuju položaj markera molekulske težine, a strelice sa desne strane slike ukazuju na položaj hsLDLR oblika pokazanim iznad svake strelice.

Slika 3 pokazuje dejstvo Mab 12.6, 28 i 29.8 na produkciju HCV(+) i (-) traka u kulturi FT 167. Ćelije su tretirane 30 minuta pre infekcije Mab anti-LDLr (8 li 2 u.g/ml). Zatim, ćelije su inficirane preko noći sa 25 ul HCV(+) seruma (No 42;lb). Dan posle infekcije, obavljena su tri pranja i dodat je novi medijum koji je menjan na svakih 48 sati. Pet dana po infekciji, ubrani su hepatociti, RNK je prečišćena, a 1 u.g ćelijske RNK je analizovan uz pomoć rTth R-PCR (Perkin Elmer) Svi eseji su rađeni u duplikatu.

+SP: esej koji detektuje pozitivni lanac RNK; -SP: esej koji detektuje negativni lanac RNK; X: šlepa proba.

DETALJNI OPIS PRONALASKA

Generisana su monoklonska antitela (Mab) na humani solubilni LDLR (hsLDLR). Korišćenjem ovih monoklonskih antitela, razvijena je jedna ELISA ijedna Western blot procedura za identifikaciju hsLDLR i esej za neutralizaciju antivirusne aktivnosti hsLDLR.

Mab su generisani kod miševa, imunizovanih rekombinantim +291 oblikom hsLDLR koji se sastoji od N-terminalnog liganda vezivajućeg iz humanog solubilnog LDLR od Asp +4 do Glu +291. Rekombinantni +291 oblik domena hsLDLR proizveden je u ćelijama CHO i prečišćen do homogenosti.

Imunizovani miševi su proizvodili signifikantne titre specifičnih antitela. Po pregledu hibridoma, pet klona (brojevi 12, 28, 29, 30 i 50) identifikovani su kao najbolji proizvođači antitela. Ovi kloni su odabrani za dalje subkloniranje. Po subkloniranju, izolovano je 29 subklona koji su imali visoku produktivnost antitela, i ampule ovih klona roditelja i subklona su zamrznute.

Jedan par monoklonskih antitela je odabran za ELISA test na r hsLDLR. Mab 28 je odabrano kao antitelo za oblaganje, a Mab 29.8 obeleženo biotinom odabrano je kao drugo antitelo. Pokazano je da su Mab 12.6 i 29.8 pogodni za identifikaciju nativnog i rekombinantnog hsLDLR u analizi VVestern blot, a Mab 28 i 30 su se pokazali pogodnim za identifikaciju rekombinantnog hsLDLR u analizi Western blot. Pokazalo se i da su Mab 12.6 i 50.30 pogodna za mhibiranje antivirusne aktivnosti hsLDLR.

U skladu sa ovim pronalaskom, pokazano je i da Mab 12.6, 28 i 29.8 inhibiraju replikaciju virusnog genoma virusa hepatitis C (HCV) kod primarne kulture humanih hepatocita. Prema tome, ova antitela mogu da se koriste ua lečenje infekcije hepatitisa C (Slika 3).

Određenje izotip podklase Mab proizvedenog od strane klona. Kloni 12.6, 28, 29.8 i 30 identifikovani su kao IgGl dok je utvrđeno daje klon 50.30 IgM.

Mab koja su razvijena protiv +291 oblika hsLDLR prepoznavala su i druge oblike hsLDLR, t.j. oblik +292 i oblik + J31 r- hsLDLR koji je proizveden u rekombinantim ćelijama CHO, sve u analizi ELISA i VVestern blot. Oblik +292 obuhvata receptorski deo N-terminalnog dela od amino kiselinskog ostatka Asp +4 do Cys +292, a oblik +331 obuhvata N-terminalni deo receptora od amino kiselinskog ostatka Asp +4 do Cys +331.

Antigen koji je korišćen za imunszaciju miševa za genensanje monoklonskih antitela bio je oblik r- hsLDLR +291 oblik, koji je proizveden u ćelijama CHO. Produkcija r- hsLDLR obavljana je u bioreaktorima, korišćenjem stacionarne faze Fibracel matnx sistema, dok je r- hsLDLR prečišćavan do homogenosti i korišćen za imunizaciju miševa.

Imune ćelije slezine miša koji je najbolje reagovao korišćene su za fuziju i genensanje hibndoma.

Što se tiče antitela pomenutih u ovom tekstu, izraz «monoklonska antitela» označava monoklonska antitela, himerna antitela, potpuno humanizovana antitela, antitela na idiotipska antitela (anti-anti-Id antitelo) koja mogu biti obeležena u solubilnoj ili vezanoj formi, kao i njihovi fragmenti koji se dobijaju ma kojom poznatom tehnikom, kao što je, ali ne ograničavajući se na, enzimsko cepanje, peptidna sinteza ili tehnike rekombinacije.

Jedno monoklonsko antitelo sadrži supstancijalno homogenu populaciju antitela specifičnih za antigene, a ta populacija sadrži supstancijalno slična epitopska mesta vezivanja. Mab mogu da se dobiju metodama poznatim stručnjacima za ovu bolest. Videti na primer: Kohler i Milstein, nature, 256:495-497 (1975); US Patent br. 4.376.110; Ausubel i sar. Urednici, Harlovv i Lane ANTITELA: LABORATORIJSKI PRIRUČNIK( Antibodies: A Laboratory Mamiat),Cold Spring Harbor Laboratorv (1998) i Colligan i sar. Tekući protokoli u imunologiji( Current Protocols in Immunology),Greene Publishing Association and Willey Interscience NY (1992 - 1996), čiji sadržaji ovde predstavljaju korišćenu literaturu i koji su ovde uključeni citiranjem. Ovakva antitela mogu biti imunološke klase uključujući IgG, IgM, IgE, IgA, GILD i ma koja od njihovih podklasa. Hibridom koji proizvodi Mab iz ovog pronalaska može da se kultivišein vi tro, in situiliin vivo.Produkcija visokih titara Mabin situiliinvivo čini ovaj trenutno preporučenim načinom proizvodnje.

Himerska antitela su molekuli čiji se različiti delovi dobijaju od različitih životinjskih vrsta, kao što su oni koji imaju promenljivi region dobijen iz mišjeg Mab i konstantnog regiona humanog imunoglobulina Himerska antitela se prvenstveno koriste za smanjenje imunogenosti u primeni i da povećaju proizvodnju, na primer tamo gde mišja Mab imaju veći prinos od hibndoma ali veću imunogenost kod ljudi, tako da se koriste humana/mišja himerska Mab. Himerska antitela i metode za njihovu produkciju su poznati u nauci (Cabilly i sar.Proc. Natl. Acad. Sci. USA81:3273-3277 (1 ,,984); Mornson i sar.Proc. Natl. Acad. Sci. USA81: 6851 - 6855 (1984); Boulianne etal.Nature312:643-646 (1984); Cabilly i sar. European Patent Application 125023

(objavljeno 14. novembra 1984); Neuberger et al.Nature314:268-270 (1985); Tamguchi i sar. European Patent Application 171496 (objavljeno 19. februara 1985); Morrison i sar. 173494 (objavljeno 5. marta 1986); European Patent Application; Neuberger etal. PCT

aplikacija WO 8601533 (objavljeno 13. marta 1986); Kudo i sar. European Patent Applicationl84187 (objavljeno 11. juna 1986); Sahagan i sar.J. Immunol.137: 1066-1074 (1986); Robinson et al. Međunarodna patentna aplikacija br. WO8702671 (objavljena 7. maja 1987); Lm i sar.Proc. Natl Acad. Sci. USA84:3439-3443 (1987); Sun i sar.Proc. Natl Acad. Sci. USA84:214-218 (1987); Better i sar.Science240:1041-1043 (1988); Riechmann i sar.Nature332: 323-327 i Harlovv & Lane, ANTITELA: LABORATORIJSKI PRIRUČNIK (vidi gore). Ova literatura je u celini inkorporirana u ovaj pronalazak citiranjem.

«Potpuno humanizovana antitela» su molekuli koji sadrže i promenljive i konstantne regione humanih imunoglobulina. Potpuno humanizovana antitela mogu potencijalno da se koriste za terapijske svrhe, dok su ponovljeni tretmani potrebni za hronične i rekurentne bolesti kao što su autoimune bolesti. Jedna metoda za pripremu potpuno humanih antitela sastoji se od «humanizacije» mišjeg humoralnog imunog sistema, t.j. produkcije sojeva miševa koji su u stanju da proizvode humani Ig (ksenomiš), uvođenjem humanih imunoglobulinskih (Ig) lokusa u kojima se endogeni Ig geni inaktiviraju. Ig lokusi se sve složeniji u smislu njihove fizičke strukture i preraspodele gena i procesa ekspresije koji su potrebni da se proizvede širi imuni odgovor. Raznolikost antitela se prvenstveno generiše kombinatornom preraspodelom između različitih V, D i J gena prisutnih u lokusima Ig. Ovi lokusi poseduju i pomešane regulatorne elemente koji kontrolišu ekspresiju antitela, eksluziju alela, promenu klase i sazrevanje afiniteta. Uvođenje nepreraspoređenih humanih Ig transgena u miševe pokazalo je daje rekombinantna mašinerija miša kompatibilna sa genima čoveka. Staviše, hibndomi koji sekretuju antigen-specifične hu-mAbs raznih izotipova mogu da se dobiju imunizacijom ksenomiševa antigenom.

Potpuno humanizovana antitela i metode za njihovu produkciju poznate su u ovoj oblasti (Mendez i sar.Nature Genetics15: 146-156 (1997); Buggemann isar. Eur. J. Immunol.21:1323-1326 (1991); Tomizuka i sar.Proc. Natl. Acad. Sci. USA97: 722-727

(2000) Patent VVO 98/24893.

Jedno anti-idiotipsko (anti-Id) antitelo jeste antitelo koje prepoznaje jedinstvene determinante koje se generalno vezuju za antigensko mesto vezivanja na antitelu. Jedno Id antitela može da se pripremi imunizacijom životinje iste vrste i genetskog tipa (na pr. soj miševa) kao izvora Mab na koja se pripremaju anti-Id. Imunizovana životinja će prepoznati i odgovoriti na idiotipske determinante imunizujućeg antitela proizvodnjom antitela na te idiotipske determinante (anti Id- antitelo). Vidite, na primer, US Patent br. 4.699.880 koji je ovde u celini uključen citiranjem.

Anti Id-antitela mogu da se koriste i kao jedan «imunogen» da se indukuje imunološki odgovor kod druge životinje, proizvodeći takozvano anti-anti-Id antitelo. Ovo anti-anti-Id može da bude epitopski identično sa originalnim Mab koje indukuje anti-Id. Tako, konšćenjem antitela na idiotipske odrednice Mab, moguće je da se identifikuju drugi kloni koji ispoljavaju antitela identične specifičnosti.

Prema tome, Mab generisana protiv LDLR, njegovi izorofmi, analozi, fragmenti ili derivati ovog pronalaska mogu da se koriste da se indukuju anti-Id antitela kod odgovarajućih životinja, kao što su BALB/c miševi. Ćelije slezine iz takvih imunizovanih miševa koriste se za proizvodnju anti-iD hibridoma koji sekretuju anti-Id Mab Dalje, anti-Id Mab mogu da se kupliraju za nosač kao što je «keyhole limpet» hemocijanin (KLH) i da se koristi za imunizaciju dodatnih BALB/c miševa. Serumi ovih miševa će sadržati anti-anti-Id antitela koja imaju svojstva vezivanja originalnog Mab specifičnog za epitop gornjeg LDLR proteina, ili analoga, fragmenata ili njihovih derivata.

Anti-Id Mab tako imaju svoje sopstvene idiotipske epitope ili «idiotope» koji su strukturno slični procenjivanim epitopima. Izraz «monoklonska antitela» takođe ima za cilj da uključi i intaktne molekule kao i njihove fragmente, kao što su na primer Fab i F(ab')2 koji su u stanju da vezuju antigen. Fab i F(ab')2 fragmenti nemaju Fc fragment intaktnog antitela, izlaze mnogo brže iz cirkulacije, i mogu da imaju manje nespecifičnog tkivnog vezivanja nego intaktno antitelo (Wahl i sar. J. Nucl. Med. 24: 316-325 (1983).

Očigledno je Fab i F(ab')2 i drugi fragmenti antitela koji su korisni u ovom

pronalasku mogu da se koriste i za detekciju i kvantitativno određivanje LDLR proteina u skladu sa metodom koja se ovde otkriva za intaktne molekule antitela. Ovakvi fragmenti se tipično proizvode proteolitičkim cepanjem, korišćenjem enzima kao stoje papain (da se proizvedu fragmenti Fab) ili pepsin (da se proizvedu fragmenti F(ab')2).

Zajedno monoklonsko antitelo se kaže daje u stanju da vezuje jedan molekul ako je u stanju da specifično reaguje sa molekulom tako da se taj molekul veže za antitelo. Izraz «epitop» se koristi tako da označava onaj deo ma kog molekula koji je u stanju da se veže za antitelo, koji to antitelo takođe može da prepozna. Epitopi ili «antigenske determinante)) se obično sastoje od hemijski aktivnih površinskih grupa molekula kao što su amino kiseline ili bočni lanci šećera i imaju specifične trodimenzionalne strukturne karakteristike kao i specifične karakteristike naelektrisanja

Jedan «antigen» je molekul ih deo molekula koji je u stanju da se veže za antitelo, a taj antigen je dodatno sposoban da izazove da životinja proizvede antitelo koje je sposobno da se vezuje za epitop tog antigena. Jedan antigen može da ima jedan ili više epitopa. Specifična reakcija o kojoj je ovde reč treba da ukaže na to da će antigen reagovati, na visoko specifičan način, sa jednim epitopom na odgovarajuće antitelo a ne sa brojnim drugim antitelima koja mogu da provociraju drugi antigeni.

Ova antitela, uključujući fragmente antitela, korisna u ovom pronalasku, mogu da se koriste kvantitativno ili kvalitativno da otkriju LDLR proteine u uzorku ili da otkriju prisustvo ćelija koje eksprimiraju LDLR proteine ovog pronalaska. Ovo može da se postigne tehnikama imunofluorescencije korišćenjem fluorescentno obeleženog antitela (vidi dole) udruženog s fluorescentnom mikroskopijom, flou citometnjom ili fluorimetnjskom detekcijom.

Antitela (ili njihovi fragmenti) korisni u ovom pronalasku mogu da se koriste histološki, kao u imunofluorescentnoj ili imunoelektronskoj mikroskopiji, zain situdetekciju LDLR proteina ovog pronalaskaIn situdetekcija može da se postigne uklanjanjem histološkog uzorka sa pacijenta, i obezbeđivanjem obeleženog antitela iz ovog pronalaska na takav uzorak. Ovo antitelo (ili njegov fragment) se po mogućstvu obezbeđuje tako što se obeleženo antitelo (ili fragment) nanosi na biološki uzorak. Korišćenjem ovakve procedure, moguće je da se otkrije ne samo prisustvo LDLR proteina već i njegova distribucija na ispitivanom tkivu. Korišćenjem ovog pronalaska, oni koji imaju odgovarajuća znanja će lako primetiti da svaka od širokog spektra histoloških metoda (kao što su procedure prebojavanja) može da se modifikuje tako da se postigne ovakva detekcijain situ.

Ovakvi eseji za LDLR proteine ovog pronalaska tipično uključuju inkubaciju biološkog uzorka, kao što je biološka tečnost, tkivni ekstrakt, sveže ubrane ćelije kao što su limfociti ili leukociti, ili ćelije koje su bile inkubirane u tkivnoj kulturi, u prisustvu obeleženog antitela koje je u stanju da identifikuje LDLR proteine i detektuje antitela uz pomoć bilo koje tehnike koja je dobro poznata u ovoj struci.

Biološki uzorak može da se spoji sa podlogom čvrste faze ili nosačem kao što je nitroceluloza, ili druga podloga čvrste faze ili nosač koji je u stanju da imobilizuje ćelije, ćelijske čestice ili rastvorljive proteine. Podloga ili nosač mogu onda da se operu

odgovarajućim puferom posle čega sledi tretman obeležemm antitelom u skladu sa ovim pronalaskom, kako je već gore napomenuto. Podloga čvrste faze ih nosač mogu onda da se operu puferom drugi put da se ukloni nevezano antitelo. Količina vezanog obeleživača na pomenutoj čvrstoj podlozi ili nosaču može onda da se detektuje konvencionalnim

sredstvima.

Izrazi «podloga čvrste faze», «nosač čvrste faze», «čvrsta podloga», «čvrsti nosač», «nosač» ili «podloga» označavaju svaku podlogu odnosno nosača koji je u stanju da veze antigen ili antitela. U dobro poznate pologe ili nosače spadaju staklo, polistiren, polipropilen, polietilen, dekstran, najlon amilaze, prirodne i modufikovane celuloze, poliakrilamidi, magmatske stene i magnetit. Priroda nosača može da bude bilo rastvorljiva u određenoj men ili nerastvorljiva za svrhe ovog pronalaska. Potporni materijal može da ima bukvalno svaku moguću strukturnu konfiguraciju sve dotle dok je vezani molekul u stanju da veže antitelo ili antigen. Prema tome, konfiguracija podloge ili nosača može da bude sferna, kao u perli, cilindrična, kao unutrašnja površina epruvete, ili kao spoljašnja površina štapića. Ili, površina može da bude ravna kao što je list, test traka, ltd. Polistirenske perle spadaju u preporučene podloge ili nosače. Stručnjaci za ovu oblast će znati i mnoge druge odgovarajuće nosače za vezivanje antitela ili antigena, ili će biti u stanju da utvrde ovo korišćenjem rutinskih eksperimenata.

Aktivnost vezivanja date serije antitela, ovog pronalaska kako je gore napomenuto, može da se odredi u skladu sa dobro poznatim metodama. Stručnjaci za ovu oblast će biti u stanju da odrede operativne i optimalne uslove testiranja za svako određivanje korišćenjem rutinskih eksperimenata.

I drugi koraci kao što su pranje, mešanje, mućkanje, filtriranje i slično mogu da se dodaju ovim esejima kao što je uobičajeno za svaku pojedinu situaciju.

Jedan od načina na koji antitela u skladu sa ovim pronalaskom mogu da se obeleže povezivanjem istog sa enzimom i korišćenjem u jednom enzimskom imunoeseju (EIA). Ovaj enzim, za uzvrat, kada se kasnije izloži odgovarajućem supstratu, reagovaće sa tim supstratom na takav način da se proizvede hemijska sredina koja može da se detektuje, na pr. spektrofotometrijski, fluorometrijski ili vizuelnim sredstvima. Enzimi koji mogu da se koriste da obeleže antitela tako da se ova mogu detektovati, uključuju, ali nisu ograničena na malat dehidrogenazu, stafilokoknu nukleazu, delta-5-steroid izomerazu, kavasnu alkohol dehidrogenazu, alfa-glicerofosfat dehidrogenazu, tnoza fosfat izomerazu, ren peroksidazu, alkalnu fosfatazu, asparaginazu, glukozooksidazu, beta galaktosidazu, nbonukleazu, ureazu, katalazu, glukozo-6-fosfat dehidrogenazu, glukoamilazu i acetilholin esterazu. Ovo otkrivanje može da se postigne kolonmetrijskim metodama koje koriste hromogeni supstrat za ovaj enzim. Detekcija može da se prati i vizuelnom komparacijom obima enzimske reakcije supstrata u poređenju s slično pripremljenim standardom.

Detekcija može da se pripremi i korišćenjem niza drugih imunoeseja. Na primer, radioaktivnim obeležavanjem antitela ili fragmenata antitela moguće je otkriti R-PTPazu korišćenjem radioimunoeseja (RIA). Dobar opis RIA može da se nađe u knjizi Laboratorijske tehnike i biohemija u molekularnoj biologiji, autora Work T.S: i sar. North Holland Rubhshing Companv, NY (1978) s posebno citiranim poglavljem pod naslovom «Uvod u radioimunoesej i srodne tehnike» autora T. Charda, koja se ovde uključuje citiranjem. Radioaktivni izotop može da se detektuje na načine kao što su korišćenje gama brojača ili scintilacijskog brojača ili autoradiografijom.

Mogućeje i da se obeleži antitelo u skladu sa ovim pronalaskom sa fluorescentnim jedinjenjem. Kada se fluorescentno obeleženo antitelo izloži svetlosti odgovarajuće talasne dužine, njeno prisustvo može onda da se detektuje zbog fluorescencije. U ostala najčešće korišćena jedinjenja za fluorescentno obeležavanje spadaju fluorescein izotiocijanat, rodamin, ficoeritin, pikocijanin, alofikocijanin, o-ftaldehid i fluoreskamin.

Ovo antitelo može da se obeleži tako da može da se otkrije i korišćenjem metala koji emituju fluorescenciju, kao što su<1>52E, ili drugi iz serije lantanida. Ovi metali mogu da se spajaju za antitela korišćenjem grupe metalnih helata kao to je dietilenetriamin pentasirćetna kiselina /ETPA).

Ovo antitelo može da se obeleži tako da može da se detektuje i spajanjem za hemiluminescentno jedinjenje. Prisustvo hemiluminescentno obeleženog antitela se onda određuje detekcijom prisustva luminescencije koja proističe tokom hemijske reakcije. Primen posebno korisnih jedinjenja za hemiluminescentno obeležavanje uključuju luminol, izoluminol, teromatični akrinidijum ester, imidazol, akrinidijum so i oksalatni estar.

Isto tako, bioluminescentno jedinjenje može da se koristi za obeležavanje antitela ovog pronalaska. Bioluminescencija je tip hemiluminescencije koja se nalazi u biološkim sistemima u kojima katalitički protein povećava efikasnost hemiluminescentne reakcije. Prisustvo bioluminescentnog proteina se određuje detekcijom prisustva luminescencije. Važna bioluminescentna jedinjenja u smislu obeležavanja su luciferin, liciferaza i ekvorin.

Jedan molekul antitela iz ovog pronalaska može da se adaptira za korišćenje u imunometrijskom eseju, koji je poznat i kao esej «sa dva mesta» ili «sendvič». U jednom tipičnom imunometrisjkom eseju, količina neobeleženog antitela (ih fragmenta antitela ) vezuje se za čvrstu podlogu ili nosač, a količina rastvorljivog antitela koje je obeleženo da se može detektovati dodaje se da se omogući detekcija i/ili kvantitativno određivanje ternarnog kompleksa koji se stvara između antitela čvrste faze, antigena i obeleženog antitela.

Tipični i preporučeni imunometrijski eseji uključuju eseje «uzvodne» u kojima se antitelo koje se vezuje za čvrstu fazu prvo stupa u kontakt sa uzorkom koji se testira da se ekstrahuje antigen iz uzorka formiranjem binarne čvrste faze kompleksa antitelo - antigen. Posle odgovarajućeg perioda inkubacije, čvrsta podloga ili nosač se ispere da se ukloni ostatak tečnog uzorka, uključujući nereagovani antigen, ako ga ima, a onda se dovodi u kontakt sa rastvorom koji sadrži nepoznatu količinu obeleženog antitela (koji funkciomše kao «reporterski molekul»). Posle jedne sekunde perioda inkubacije da se omogući da obeleženo antitelo stupi u kompleksa sa antigenom vezanim za čvrstu podlogu ili nosač preko obeleženog antitela, čvrsta podloga ili nosač se ispiraju drugi put da se uklone nereagovana obeležena antitela.

U drugoj vrsti «sendvič» eseja, koji može da bude koristan sa antigenima iz ovog pronalaska, koriste se takozvani «simultam» i «reverzni» eseji. Simultani esej uključuje pojedinačni korak inkubacije jer se antitelo vezano za čvrstu podlogu ili nosač i obeleženo antitelo zajedno dodaju u uzorak koji se testira. Pošto se inkubacija uspori, čvrsta podloga ili nosač se ispira da se ukloni ostatak tečnog uzorka i obeleženo antitelo koje nije u kompleksu. Onda se određuje prisustvo obeleženog antitela povezanog sa čvrstom podlogom ili nosačem, kako bi bilo u konvencionalnom «uzvodnom» sendvič eseju.

Kod «reverznog» eseja, koristi se postepeno dodavanje prvo rastvora obeleženog antitela u uzorak tečnosti praćeno dodavanjem neobeleženog antitela vezanog za čvrstu podlogu ili nosač posle odgovarajućeg perioda inkubacije. Posle druge inkubacije, čvrsta faza se ispire se na konvencionalni način da se oslobodi ostatka uzorka koji se testira i rastvora nereagovanog obeleženog antitela Određivanje obeleženog antitela povezano sa čvrstom podlogom ili nosačem se onda određuje kao u «simultanom» ili «uzvodnom» eseju.

Ovaj pronalazak će sada biti ilustrovan sledećim primerima koji ovaj pronalazak ne ograničavaju.

PRIME RI

Primer 1. Priprema CHO i -hsLDLR

Stabilne rekombinantne CHO ćelije koje eksprimiraju humani solubilni LDLR generisane su ko-transfekcijom CHO-DUKX ćelija koje nemaju gen za dihidrofolat reduktazu (DHFR) (Urlaub G. I sar. 1980) s dva vektora ekspresije: psLDLROl koji sadrži N-terminalni ligan vezujući domen LDLR, s početkom na aminokiselinskom ostatku Asp (+4) do Glu 291 (+291) i pDHFR sa sadržajem mišjeg gena za DHFR, gde su oba kontrolisana promotorom i transkripcionim terminacionim elementima ranog regiona SV40. Transfekcija se obavlja katjonskim lipozomima korišćenjem LipofectAmine

(Gibco BRL), u skladu sa protokolom koji opisuje proizvođač. Sedamdeset dva sata po transfeckiji ćelije se prenose u selektivnu sredinu gde nema deoksi i nbonukleozida i dodaje se 10% dijaliziranog FCS. Ćelije koje ispoljavaju DHFR aktivnost su mogle da formiraju kolonije, koje su izolovane podizanjem ovih ćelija papirnim diskovima namočenim u tripsin. Ove ćelije su gajene i pregledane na r-hsLDLR aktivnost. Transfektirane ćelije su potom podvrgnute genskoj amplifikaciji uz pomoć MTX, a zatim subkloniranju i selekciji stabilnih proizvodnih klona.

r-hsLDLR (+291) je proizveden ćelijama stabilnog proizvođača CHO klona opisanog kao #33-10-29-21 u petolitarskom CelliGen bioreaktoru u međijumu bez seruma (Gibco CHO-A-SFM kat. Br- 95-0091DJ). Sirovi ubrani materijal je klarifikovan filtracijom kroz filtersko punjenje 0,8 - 0,2 u (Gelman Kat. Br. CSS92DSCCK) i koncentrovan 1 OOstruko preko 5-kDa membrane. Oblik +291 r-hsLDLR koji je korišćen za prvu imunizaciju, prečišćen je korišćenjem procesa purifikacije na malo. U ovom procesu je korišćena kolona za katjonsku izmenu DEAE-Sepharose, a potom se primenjivao korak hidrofobne interakcije na koloni Butil-TSK, a potom kolona HTP, i

hromatografija za isključivanje po veličini (SEC) na koloni Sephacrvl 100. Odabrana je frakcija #27 SEC, jer ona sadrži specifičnu antivirusnu aktivnost od 780 jedinica/u.g koja je detektovana u jednom antivirusnom eseju opisanom u Primeru 9 dole. Protein u ovoj frakciji je identifikovan kao r-hsLDLR N-terminalnom analizom.

Druga serija CHO +291 r-hsLDLR je prečišćena i korišćena za udarne injekcije miša. Ona je prečišćena korišćenjem procesa rafiniranja i boljim prinosom koji je uključivao sledeće korake: a) klarifikacija i koncentracija 100x sirovog ubranog materijala; b) kolona zajonsku izmenu HQ POROS, i s) dva koraka hidrofobne interakcije (HIC) . uzimanje na koloni Butil-TSK i protok kroz kolonu Fenil 5PW. Nevezana frakcija iz poslednjeg koraka HIC dijalizirana je i prečišćena preko kolone za jonsku izmenu HS-POROS . Poslednji korak je bila kolona hidroksiapatita (HTP). Tako je r-hsLDLR dobijen prečišćavanjem na oko 90%, elucijom kao jedinim većim pikom u

RP-HPLC.

Primer2. Imunizacija miša

10 u.g prečišćene frakcije #27 r-hsLDLR iz kolone SEC iz Primera 1, gore, u koncentraciji od 100 mg/ml, homogenizovano je kompletnim Freundovim adjuvantom (CFA, 50% v/v) i ubrizgano u šapicu svakog od pet živih Balb/C ženki miševa starih 7 nedelja.

Četiri nedelje po prvoj imunizaciji, miševi su dobili udarnu dozu od 10 u.g, intramuskularno, istog prečišćenog r-hsLDLR u 50% (v/v) rastvoru CFA.

Dve nedelje po prvoj injekciji, serum miševa je testiran na antitela na r-hsLDLR korišćenjem direktnog ELISA testa kako je opisano u Pnmeru 3, dole.

Dva miša, M -1 i M -2, s najznačajnijom specifičnom imunoreaktivnošću sa r-hsLDLR dobili su dodatnu udarnu dozu, 10 nedelja po drugoj injekciji, sa 10 u,g prečišćenog r-hsLDLR koji je dobijen u procesu rafiniranog prečišćavanja opisanom u Pnmeru 1, gore.

Posle 14 nedelja, miševima je puštana krv i ona je testirana na antitela na r-hsLDLR. Udarna doza im je davan još dva puta, i to po 50 (j.g r-hsLDLR u PBS: prvo mtrapentonealno, a zatim, dva dana kasnije, i intrapentonealno i intravenski.

Miševima je puštana krv dve nedelje kasnije posle druge injekcije, a antiserum je testiran na anti-r-hsLDLR aktivnost korišćenjem direktnog ELISA testa kako je opisano u Pnmeru 3, dole. Svaki antiserum je razblažen serijski 1:100- 1:32.000 i nanesen u duplikatu na ploču sa 96 udubljenja obloženu sa 10 J po udubljenju r-hsLDLR prečišćenog korišćenjem procesa rafiniranog prečišćavanja opisanog u Primeru 1, gore. Pufer za ovaj esej i DMEM +10% hsLDLR sa sadržajem PBS +1 % BSA ili Gelatin +0,05% Tween 20+0,05% Thimerosal su korišćeni kao slepe probe u prvom udubljenju u svakom redu. Normalni mišji serum (NMS) nanošenje u istom rasponu razblaženja u poslednja dva reda kao negativna kontrola. Apsorbanca enzimske reakcije merena je ELISA čitačem na 492 i 405 nm.

Rezultati ovog testa pokazuju da serumi miša M-l imaju veću specifičnu reaktivnost sa r-hsLDLR i stoga je taj miš žrtvovan, a ćelije slezine su uzete za fuziju sa ćelijama mijeloma (Eshhar Z. 1985).

Primer 3. Direktni ELISA test za testiranje antiseruma i skrining klona

hibridoma

Direktni ELISA test za skrining za pozitivne antiserume rađen je na sledeći način: 96 udubljenjaje obloženo sa 100 u.1 r-hsLDLR (prečišćenog procesom rafinirane purifikacije iz prvog primera: 100 jedimca/udubljenju (10J/udubljenju( u PBS +1% Gelatine (Sigma, Kat. Br. G-7765) + 0,9 mM Ca2 i 0,5 mM Mg'<2>, pH 5,6, što će se u daljem tekstu nazivati puferom eseja, tokom 90 minuta na 37°C uz mućkanje. Ploče su ispirane šest puta u PBS + 0,05% Tween 20 (Polioksietilen- Sorbitan Monolauretan - Sigma P-1379), u daljem tekstu će se nazivati rastvor za ispiranje.

Uzorci antiseruma imunizovanog miša su senjski razblaživani 1:100 - 1: 32.000, ili je supernatant kulture ćelija hibridoma dodavan u udubljenja i inkubiran 90 minuta na 37°C uz mućkanje, a onda je šest puta ispirano rastvorom za ispiranje 10 u.1 ren peroskidaze (HRP) - APA konjugovanih kozjih antitela na miša (Sigma Kat Br. 4601-1) razblaženi 1:1200 dodato je u udubljenja i inkubirano 90 minuta na 3 7°C uz mućkanje, a onda je šest puta ispirano rastvorom za ispiranje.

100 u.1 rastvora supstrata (pripremljenog rastvaranjem jedne tablete OPD i jedne

tablete H2O2u 20 ml vode) dodavano je u udubljenja i inkubirano na RT 30 minuta. Enzimska reakcija je zaustavljana dodavanjem 100 p.1 4N HC1 po udubljenju,

Apsorbanca u 96 udubljenja na ploči merena je korišćenjem ELISA čitača na 492 i 405 nm, a rezultati su izračunavani korišćenjem četiri parametrijska logistička algoritma, MultiCalc softver PC kompjutera povezanog za ELISA čitač.

Primer 4. Fuzija, priprema hibridoma, odabir klona i prečišćavanje antitela iz

ascitne tečnosti

Proces fuzije i odabir ćelija hibridoma obavljeni su u skladu sa protokolima

Eshhar Z. 1985. Ukratko, ćelije slezine miša M-2 gajene su 2-4 dana pre fuzije, spajane su sa ćelijama mijeloma kraćom inkubacijom sa PEG. PEGje prvo polako razblaživan sa DMEM a onda potpuno uklanjan centrifugiranjem. Ove ćelije su ponovo suspendovane u DMEM-HAT medijumu, distribuirane u 96 udubljenja na ploči u koncentraciji od oko 3,4x10"* ćelija po udubljenju i inkubirane 10-14 dana u jednom inkubatoru 8% C02na 37°C. Medijumje promenjen u svim ćelijama hibridoma za DMEM uz dodatak 10% konjskog seruma (HS) u roku od 10 dana. Uzorci supematanta kulture hibridoma ispitivani su na prisustvo monoklonskih antitela (Mab) na r-hsLDLR direktnim ELISA testom koji je opisan u Pnmeru 3 gore. Pufer eseja i DMEM +10% HS korišćeni su kao slepe probe, Mab C7 (komercijalno ga proizvodi Amersham) i M-l antiserum korišćeni su kao pozitivne kontrole, dok je monoklonsko antitelo na rastvorljivi p55 TNF receptor korišćen kao negativna kontrola. Ćelije iz udubljenja, u čijem prisustvu su otkrivena antitela u supernatantu kulture, prenete su na ploče sa 24 udubljenja a onda u T-bočice od 25 cm<2>. Ekspandirane kulture su praćene na sekreciju Mab na r-hsLDLR. Ampule ćelija iz pozitivnih kultura su zamrznute i čuvane u tečnom azotu.

Ukupno oko 1000 kultura je ispitano da se otkrij u antitela na r-hsLDLR. 54 kulture s najvišom imunološkom aktivnošću ponovo su testirane nekoliko puta. Pet kultura (12, 28, 29, 30 i 50) s najvećom aktivnošću klonirano je ograničenom dilucijom u pločama sa 96 udubljenja. Supernatanti iz rastućih klona testirani su nekoliko puta na antitela na r-hsLDLR direktnim ELISA testom.

Ćelije pozitivnih klona hibridoma gajene su u bočicama tkivne kulture u DMEM sa sadržajem 1 5% konjskog seruma, a ampule u zamrznute od dela kulture. Parelelno, ćelije klona različitih hibridoma su ubrizgavane, u po 2-4 miša, da se dobije ascitna tečnost. Antitela su prečišćavana od ascitne tečnosti bilo precrpitacijom amonijum

sulfatom ili na koloni proteina G. Ukratko, 7,5 ml ascitne tečnosti je razbiaženo 1:3 u 20 mM fosfatnog pufera pH 7 i uneto u kolonu Proteina G od 5 ml (Cl 0/10). Ova kolona je isprana sa 20 mM fosfatnog pufera pH 7, a Mab su eluirana sa 100 mM glicinskog pufera pH 2,7. pH elucione frakcije podešenoje na 7-7,5 sa 1 M Tns pufera pH 9,3.

Primer5: Ispitivanje parova Mab koji će se koristiti u ELISA i optilamizacija parametara ELISA testa

Mab prečišćena iz ascitne tečnosti kao u primeru 4 gore korišćena su da se obavi skup eksperimenata u formatu matrice da se odabere najbolji odgovarajući par Mab koji će se koristiti kao prva i druga antitela u sendvič ELISA testu na r-hsLDLR opisanom u Primeru 6 dole. Ukratko, 96 udubljenja na ploči obloženo je ascitnom tečnošću dobijenom od pet hibridoma (#12, 28.28, 29.08, 30 i 50.05) prečišćenim bilo precipitacijom amonijum sulfatom ili na koloni proteina G. Antitela su ispitivana korišćenjem oblika +291 kao i +292 (iz ammokiselinskog ostatka Asp +4 do Cys + 292) i + 33 1 (od amino kiselinskog ostatka Asp +4 do Cys + 331) oblika r-hsLDLR proizvedenog u ćelijama CHO, kao antigene. Po jedan ml od svakog od gore prečišćenih Mab obeleženje biotinom za brzo ispitivanje njihove pogodnosti da budu druga antitela u sendvič ELISA testu. Ukratko, 1,5 mg Mab prečišćenih precipitacijom amonijum sulfatom podešeno je na pH 8,5 sa 30 ul 0,5 M NaHCO?. 0,75 Biotin-OSu N-hidroksisukcinimido-biotin (Biotin-OSu, Sigma, Kat. Br. #H1759, iz rastvora od 5 mg u 200 u.1 DMSO) dodato je u rastvor antitela i inkubirano dva sata na sobnoj temperaturi blagim mućkanjem praćeno inkubacijom na 2-8°C preko noći. Reakcioni rastvor je punjen u kolonu Sephadex G-25M (Pharmacia, kat. Br. #17-0851-01= PD10 da se razdvoje biotinilirana Mab i višak nereagovanog biotin-OSu

Prvi preliminarni eksperimenti pokazali su da Mab 29.08 i 30 proizvode najviši signal u odnosu na pozadinu kada se koriste kao druga antitela u ELISA testu.

Reakcija ova dva klona testirana je ponovo kao druga antitela sa antitelima 12, 28, 29.08 i 50 koja su korišćena za oblaganje ploča. Rezultati ovog eksperimenta jasno pokazuju daje Mab 28 bilo antitelo najpogodnije za oblaganje

Najbolji rezultati u smislu intenziteta signala i njegove specifičnosti, dobijem su sa Mab 28 i iskonšćeni za oblaganje ploče za mikrotitraciju, a Mab 29.08 obeleženo biotinom kao drugo antitelo. Korišćenjem ovih Mab, dobri rezultati su dobijeni sa sve tri forme (+291, +292 i + 331) r-hsLDLR. Sa svim oblicima, apsorbanca na 492/405 nm iznosila je oko 1,3 OD.

Tri oblika r-hsLDLR antigena analizovani su u serijskim razblaženjima u rasponu koncentracija od 0,9 - 1000 ng/ml. Kriva doznog-odgovora dobijena je sa Mab za oblaganje i biotiniliranim Mab 29.08 kao drugim antitelom. Ova kombinacija dala je linearni odgovor u rasponu koncentracije od 1-10 ng/ml r-hsLDLR.

Različiti parametri koji mogu da utiču na ELISA test kao što su koncetracija reagensa, periodu inkubacije, odabir pufera i ploče su optimalizovani testiranjem sledećih parametara: Oblaganje udubljenja na ploči za mikrotitraciju sa 5 - 10 ng/ml Mab 28 u PBS, Sastav pufera:

a) PBS + Tvveen 20

b) Tris + Ca"2 + NaCl + Tvveen 20

Rastvori za blokiranje

a) 1 % Gelatin u PBS, 0,05% Tvveen, 0,005% Thimerosal

b) 1 % BSA u PBS, 0,05% Tvveen, 0,005% Thimerosal

c) 1 % FBS u PBS, 0,05% Tvveen, 0,005% Thimerosal

d) 1 % mleka u PBS, 0,05% Tvveen, 0,005% Thimerosal

e) I blok, Hy Pep i Hy Kvasac

- Drugo Mab 29.08 obeleženo biotinom, u koncentracijama 1:500, 1:1000, 1:2000, 1.4000, 1:8000, 1.1 0000 što odgovara rasponu koncentracija od 109,74 - 0,537l^g/ml. - Koncentracije ekstravidina: 1:500, 1:1000, 1:2000, 1:4000, 1:8000, 1:10000, što odgovara rasponu koncentracije od 4 - 0,2 ug/ml.

Na bazi ovih eksperimenata utvrđena je finalna procedura za sendvič ELISA test opisana u Primeru 6, dole.

Primer 6. Utvrđivanje sendvič ELISA testa za r-hsLDLR

Sendvič ELISA test na r-hsLDLR utvrđenje korišćenjem Mab 28 i 29.08. Ukratko, 96 udubljenja na ploči obloženo je sa 100 u.1 Proteinom G prečišćenog Mab 28 (5 |ig/ml) preko noći na 2-8°C ili 3 sata na 37°C. Ploče su onda oprane pet puta sa PBS +0,05% Tween 20. Ploče su inkubirane sa 200 ul rastvora za blokiranje (PBS + 1% BSA ili Gelatin + 0,05% Tvveen 20 + Thimerosal 0,05% jedan sat na 37°C ili preko noći na 4°C i pere se pet puta s PBS +0,05% Tvveen 20. 100 u.1 uzoraka ili antigena kalibracijske krive (CHO + 291 r-hsLDLR, 0,5 - 32 ng/ml razblaženo u rastvoru za blokiranje) dodato je u udubljenja i inkubirano 90 minuta na 37°C uz mućkanje. Ploče su onda oprane pet puta sa PBS +0,05% Tvveen 20.

100 u.1 po uzorku biotiniliranog Mab 29.08 (0,67 ng/ml) je dodato u rastvor za blokiranje i inkubirano mućkanjem jedan sat na 37°C. Ploče su inkubirane pet puta sa PBS +0,05% Tvveen 20. 100 u.1 komercijalnog konjugata ekstravidin -peroksidaza (ExtrAvidin TM-peroxidase BioMakor, Kat. Br. 0645-1) razblaženo 1: 10.000 dodato je u udubljenja i inkubirano mućkanjem jedan sat na 37°C. Ploče su onda prane pet puta sa PBS +0,05% Tvveen 20. 125 ul gore pomenutog rastvora supstrata dodato je u svako udubljenje i inkubirano oko 10 minuta dok se ne razvije boja odgovarajućeg intenziteta. Reakcija je zaustavljena dodavanjem 125 ul 4N HC1. Apsorbanca u 96 udubljenja na ploči očitana je korišćenjem ELISA čitača na 492 i 405 nm talasne dužine i rezultati su izračunavani MultiCalc softverom PC kompjutera povezanog za ELISA čitač.

Primer7. Izotip monoklonskih antitela

Ig izotip monoklonskih antitela određen je korišćenjem komercijalnog kita za određivanje izotipa (PharMingen International) u skladu sa procedurom koji proizvođač daje za ovaj test. Klonovi 12.6, 28, 29.8 i 30 identifikovani su kao IgGl, dok se pokazalo daje klon 50.30 klase IgM.

Primer 8. Analiza SDS-PAGE VVestern blot

Oblik +292 prečišćenog r-hsLDLR i nativni LDLR prečišćen iz humanog urina analizovam su tehnikom VVestern blot s monoklonskim antitelima razvijenim na r-hsLDLR. Ukratko, 12% SDS Poly Akrilamidni gel je napunjen sa 100 ng/traci CHO +291 oblikom r-hsLDLR, ili nativnim unnarnim hsLDLR ili TBP-1 sirovim ubranim (kao negativna kontrola) pod reduktivnim uslovima (40 mM DTT). Jedna traka je napunjena markerima niske molekulske težine (LMW). Ovaj komplet uzoraka propuštan je pet puta. Proteini koji su odvojeni na gelu preneti su elektroelucijom na nitrocelulozne membrane. Ove membrane su inkubirane u PBS sa sadržajem 10% obranog mleka, 0,1% Tvveen 20 tokom 16 sati. Membrane su isečene u trake i svaka traka je inkubirana 2 sata na sobnoj temperaturi sa jednim od pet odabranih Mab: 12.6, 30, 50.30, 28 ili 29.08 (ascitna tečnost razblažena 1:4000).

Membranske trake su ispirane s PBS sa sadržajem 0,1% Tvveen 20 (3 x 15 min) i inkubirane 1 sat sa drugim antitelom - kozjim anti-miš konjugovanim s ren peroksidazom - alkalna fosfatazom (razblaženo 1: 10.000, BioMakor) 2 sata na sobnoj temperaturi.

Ove trake su ispirane s PBS sa sadržajem 0,1% Tvveen 20 (3 x 15 min). Pozitivne trake su detektovane pojačanom hemiluminescencijom (ECL, Amersham).

Monoklonska antitela #12.6 i #29.8 prepoznaju i urinamu i +291 formu prečišćenog r-hsLDLR u VVestern blot analizi (Slika 2): Mab 28 i 30 prepoznaju +291 formu prečišćenog r-hsLDLR.

Primer 9. Inhibicija r-hsLDLR antivirusne aktivnosti monoklonskim antitelima

Mab koja specifično reaguju sa r-hsLDLR testirana su na sposobnost da blokiraju antivirusnu aktivnost r-hsLDLR (oblik +291)in vitro,korišćenjem eseja inhibicije citopatskog efekta (CPE) u sistemu VSV/VVISH.

Ćelije WISH (humanog amnionskog porekla) gajene su u MEM uz dodatak 10% FBS i 4 mM glutamina u inkubatoru na 37°C, 5% CO2. Ćelije koje eksponencijalno rastu zasejane su u pločama za kulturu sa 96 udubljenja gustinom od 40.000 ćelija po udubljenju dvadeset četiri sata pre započinjanja eseja. Uzorci za testiranje1standardi

razblaženi su1podeljeni u udubljenja sa sadržajem ćelija. U udubljenja je odmah dodat VSV, s umnožavanjem infekcije (MOI) od 5 pfu/ćeliji. Ploče su inkubirane 16-18 sati na 37°C a onda su prane etanolom. Jedan sloj preživelih ćelija posmatrane je s Gram kristal violetnim prebojavanjem. Kvantifikacija citopatskog efekta u odnosu na standard obavljana je poređenjem gustine boje sa standarnom koncentracijom.

Za analizu neutralizujućeg efekta antitela, r-hsLDLR je prethodno inkubiran 30 minuta na 37°C s rastućom koncentracijom ascitne tečnosti od testiranih Mab. Ovi rastvori su onda dodavani u kulturu ćelija WJSH na ploču za mikrotitraciju sa 96 udubljenja, a onda je dodavan vezikularni stomatitis virus (VSV). Posle 18 sati inkubacije, liziranje ćelija posredovano VSV određeno je prebojavanjem preostalih ćelija kristal violetnom bojom. Semi-kvantifikacija citopatskog efekta u odnosu na standard obavljanaje poređenjem gustine boje (koja se određuje ELISA čitačem) sa standarnom koncentracijom.

Dejstvo Mab testirano je s povećanom koncentracijom r-hsLDLR. Kao stoje prikazano na Tabeli 1, pokazalo se da dva monoklonska antitela (12.6150.30) ispoljavaju neutralizujuće dejstvo.

U eksperimentu pokazanom na Tabeli 1, inhibitorno dejstvo dva Mab testirano je u razblaženju ascitne tečnosti od 1:40. Pri ovom razblaženju, Mab 12.6 je ispoljavalo nešto veću aktivnost od Mab 50.30. Ovo može da bude posledica osobina Mab, kao i razlike u koncentraciji monoklonskih antitela u ascitnoj tečnosti.

Inhibitorno dejstvo Mab može da se prevaziđe povećanjem r-hsLDLR u odnosu na koncentraciju Mab. U stvari, pn koncentracijama r-hsLDLR od 62,5 U/ml, nijedno Mab nije imalo nikakvog dejstva na aktivnost r-hsLDLR pri analiziranim koncentracijama antitela.

Inhibicija antivirusne aktivnosti r-hsLDLR određena je korišćenjem rastućih koncentracija Mab 12.6 i 50.30. Mab 12.6 je inhibiralo antivirusnu aktivnost r-hsLDLR za oko 60% pri razblaženju od 1:40 (ascitne tečnosti) i za oko 35% pri razblaženju od 1:20.500 Klon 50.30 inhibrao je aktivnost r-hsLDLRza oko 45% pri razblaženju od 1:40 (ascitne tečnosti) i za oko 15% pri razblaženju od 1:20.500.

Kriva odgovora na dozu dobijena sa oba Mab i opažanje daje njihovo inhibitorno dejstvo oslabljeno viškom r-hsLDLR govori da Mab vrše svoje dejstvo vezivanjem za r-hsLDLR.

Primer 10. Inhibicija replikacije HCV monoklonskim antitelima

Mab specifična za r-hsLDLR testirana su na sposobnost da inhibiraju HCV replikaciju u humanim hepatocitima u primarnoj kulturi. Celijska kultura FT167 dobijena je od 57-ogodišnjeg muškarca kome je bila potrebna resekcija lobektomije zbog medicinskih indikacija (metastaza tumora kolona, desni režanj).

Primarne kulture hepatocita pripremljene su dvostepenom metodom perfuzuje kolagenazom (Maurel P. Adv. Drug. Del. Rev. 22:105 - 132 (1996), Pichard L. i sar. Mol. Pharmacol. 41: 1047- 1055 (1992), Ferrini J.B. i sar. Chem. Biol. Interactions

107:31 - 45 (1997)). Vijabilnost ćelija pre postavljanja na ploču određenaje korišćenjem tnpan plavog testa ekskluzije. Četiri miliona ćelija u 3 ml medijuma kulture postavljeno je na plastične posude prečnika 60 mm koje su prethodno obložene kolagenom. Medijum kulture koji dugo traje i koji je bez sadržaja seruma sadržao se od Williams'E koji je dobijen kako je objavljeno (Lanford R. i sar. In Vitro Cell. Dev. Biol. 25:174-182

(1989)). Ovaj medijum je posle toga obnavljan u intervalima od 48 sati. Kulture su održavane na 37°C u vlažnoj atmosferi vazduha sa 5% ugljen dioksida. Pod ovim uslovima gajenja, humani hepatociti zadržavaju svoj diferencijalni fenotip najmanje 35 dana (Ferrini JB i sar. Chem. Biol. Interactions 107: 31-45 (1997)) i osetljivi su na infekciju HCV i podložni su replikaciji virusnog genoma (Fournier C. I sar. J. Gen. Virol 79: 2367-2374 (1998)).

HCV pozitivni uzorak seruma: banka humanog seruma od pacijenata koji su na testu bili anti-HCV antitelo pozitivni sa EIS HCV 3.0 i utvrđenje Chiron RUBA HCV 3.0 SIA. Nijedan od ovih pacijenata nije imao HBV ili HTV ko-infekciju. U svakom uzorku seruma HCV RNK je kvantifikovana Roche monitorom i genotipizacija je urađena linijskim esejem (Inno-Lipa HCV II, Innegenetics). Uzorci seruma su čuvani na -80°C, u malim alikvotima da bi se izbegli ciklusi zamrzavanja i odmrzavanja. U ovim eksperimentima korišćen je uzorak S42 (genotip lb; virusno opterećenje 410 000 kopija po ml).

Za infekciju i naknadne tretmane kulture hepatocita su prenesene u sterilnim uslovima u laboratoriju P3 (visoko ograničenje za mikroorganizme infektivne po čoveka). Tri dana po postavljanju na ploču, kada se ćelije oporave od traume izolacije,invitroinfekcija hepatocita se obavlja inkubacijom preko noći sa 25 \ xL HVC -pozitivnog uzorka seruma (S42) u 3 mL medijuma. Po infekciji, ćelije su tri puta prane sa 3 mL svežeg medijuma i gajenje je nastavljeno pod normalnim uslovima u dugotrajnom medijumu kulture. Ćelije su tretirane sa 3 različita monoklonska antitela protiv r-hsLDLR , Mab 16.6, Mab28 i mab29.8. Trideset minuta po infekciji, ćelije su izložene količini od 2 do 8 u,g/ml različitih Mab. Onda su ćelije inficirane kako je gore opisano.

Kontrolne kulture su inficirane pod sličnim uslovima, ali u odsustvu antivirusnog tretmana. U paralelnim eksperimentima, iste kulture su tretirane sa 5000 U/raL IFNa, u istim uslovima za poređenje (IFNa snažno inhibira replikaciju HCV u referentim ćelijama). Svi tretmani su rađeni u duplikatu.

Petog dana po infekciji, medijum je uklonjen, a kulture su oprane tri puta hladnim slanim rastvorom puferovanim fosfatom. RNK je prečišćena od 4 x IO<6>hepatocita korišćenjem guanidinium izotiocijanatnekisehne procedurom ekstrakcije fenolom.

(Chomczvnski PN i Sacci N. Analyt. Biochem. 162: 156- 159 (1987)). Precipitirana RNK je rastvorena u 50 ul vodi tretiranoj dietilpirokarbonatom (DEPC i kvantifikovana. Jedan u.g ćelijske RNK je analizovan rTth RT PCR esejem specifičnim za lanac.

Da bi se izbeglo eventualno zagađenje, RT-PCR specifičan za trake je obavljan sekvencijalno, korišćenjem tri različite prostorije: sobe pre PCR, sobe za PCR i sobe posle PCR. RNK rastvorena u 10 u.1 vodi tretiranoj - DEPC pokrivena je mineralnim uljem i zagrevana na 95°C jedan minut. Temperatura je snižena na 70°C pa je dodato 10 ul prethodno zagrejane reakcione mešavine cDNK. Onda je temperatura spuštena na 60°C tokom 2 minuta zbog očvršćavanja a reakcija cDNKje obavljena 20 minuta na 70°C korišćenjem rTth DNK polimeraze (Perkm-Elmer). Temperatura je održavana na 70°C dok je dodavano 40 u.1 prethodno zagrejane mešavine PCR. Uslovi PCR, obavljeni na Gene Amp®PCR-System 9600 (Perkin-Elmer) sastojali su se od inicijalnog ciklusa na 94°C tokom 1 minuta, 50 ciklusa na 94°C tokom 15 sekundi, 58°C tokom 30 sekundi, 72°C tokom 30 sekundi i finalnog koraka ekstenzije na 72°C tokom 7 minuta. Za esej pozitivnih lanaca HCV RNK, nukleotidna sekvenca reverznog prajmera P3 je: 5'-TGG/ATGCACGGTCTACGAGACCTC-3', (nt 342-320), a uzvodnog prajmera P4 je: 5'-CACTCCCCTGTGAGGAACT -3', (nt: 38 - 56) (Laskus T. I sar. J. Gen. Virol. 78: 2747

- 2750 (1997)). Isti prajmeri su korišćeni i u obrnutom (reverznom) redosledu da bi se

otkrile negativne trake. Jedna desetina umnoženog proizvoda analizirana je gel elektroforezom na agarozi (2%), a potom je bojena BET i fotografisana pod UV svetlom. U svim serijama eksperimenata napravljena su razblaženja sintetske HCV RNK (+) i (-) trake i 1 p.g ukupne RNK jetre dodato da se imitiraju uslovi za analizu hepatocita u kulturi. Ove mešavine su korišćene kao pozitivne kontrole za test RT-PCR i analizu.

Na slici 3 vidi se daje produkcija HCV negativne trake, u prisustvu Mab protiv LDLR potpuno inhibirana u kulturi FT167. Prema tome replikacije virusnog genoma su snažno inhibisane. Ovi rezultati su bili u skladu sa stanovištem da LDLR može da bude receptor za HCV.

Primer 11. Produkcija humerskih antitela na LDLR

Glasnička - mRNK se prečišćava iz linije hibridoma koja proizvodi Mab specifična za LDLR.

Specifična cDNK se sintetizuje sa oligonukleotidima koji su komplementarni za 5' kraj eksona CH1 iz domena veoma teških lanaca (oligo 1) i iz 5' Ciceksona promenljivog domena lakih lanaca (oligo 2) korišćenjem prečišćene mRNK kao templata

Dve cDNK su dobijene od kojih jedna enkodira promenljivi region (specifičan za LDLR) teškog lanca, a druga promenljivi region (specifičlan za LDLR) lakog lanca. Ove cDNK su klonirane i sekvencirane.

Za konstrukciju himerskog teškog lanca, varijabilni region kloniranog humanog Ig gena za teški lanac (korišćenjem genetskih manipulacija) je zamenjen kloniranim DNK mišjim varijabilnim domenom (specifičan za LDLR) koji kodira teški lanac U genetske manipulacije spada ekscitacija promenljivog regiona humanog Ig, korišćenjem specifičnih restriktivnih enzima i ligacije mišjeg promenljivog regiona. Ista procedura se obavlja da se dobije himerski laki lanac

Konstruišu se dva ekspresivna plazmida sisara, jedan koji uključuje gen himerskog teškog lanca i drugi koji uključuje gen himerskog lakog lanca. Oba vektora se koriste za ko-transkefciju linije ćelija hibridoma (SP6).

Proizvodnja LDLR specifičnog Ig se testira ELISA ih Western blot analizom koristeći supu kulture transfektovanih ćelija kao sekundarno antitelo. Afinitet himerskog antitela za svoj ligand prati se uz pomoć Biacore.

Primer 12. Priprema transgenih miševa koji se proizvode tako da sadrže lokus gena humanog imunoglobulina (ksenomiš) i priprema humanih monoklonskih antitela protiv r-hsLDLR

Priprema ksenomiša je opisana u VV098/24893 i Mendez MJ i sar. Nature genetics 15: 146-56(1997).

Biblioteke humanih-kvaščevih veštačkih hromozoma (YAC) pretražuju se da se nađe YAC sa sadržajem varijabilnog regiona humanih teških lanaca (oko 1000 kb)

(metoda kloniranja YAC je metoda izbora kada su potrebni umetci veći od 100 kb).

YAC se karakterišu Southern blot analizom i pulsnom elektroforezom polja (PFGE). YAC treba da uključi i regione Cu. C5, Dh i Vh u kongifiguraciji germinativne linije.

Korišćenjem preklapajućih sekvenci koje se nalaze u YAC, ovi YAC se rekombinuju u kvascu strategijom postepene rekombinacije. Pre rekombinacije kraj YAC 3' (sa regionom V) se ligira za HPRT selektabilni marker. Struktura rekombinovanog YAC se potvrđuje pomoću PFGE i Southern blot analize (prisustvo lokusa humanog teškog lanca iz regiona C za Vh region u konfiguraciji germinativne linije).

Acentrični krak YAC se cilja vektorom koji nosi kompletni konstantni region y2, mišji pojačivač, gen rezistencije na neomicin, da bi se dobio finalni teški lanac koji sadrži celokupni promenljivi region t.j. 82Vh gena, 6 Jh gena i 3 različita konstantna regiona Cu CS Cy s njihovim odgovarajućim regulatornim sekvencama. Ovaj YAC je dezigniran s njihovim odgovarajućim regulatornim sekvencama. Ovaj YAC je nazvan H2. Ovaj konstrukt se koristi za produkciju ksenomiša.

Slična strategija onoj koja se koristi gore se koristi za rekonstrukciju lokusa kapa, osim što je marker za odabir neomicina ligiran za rekonstruisani YAC sa sadržajem celog lokusa kapa. Ovaj YAC je nazvan yK2.

Yac koji sadrže yH2 uvode se u ćeliju ES fuzijom YAC sa sadržajem sferoplasta sa HPTR deficijentnim E14.TG3B mišjim ES ćelijama. Odabiraju se HPRT pozitivne ćelije. Pozitivni kloni se propagiraju i analiziraju Southern blot i CHEF blot tehnikama. Odabiraju se kloni sa sadržajem intaktnih yH2 YAC.

Uvođenje i selekcija yK2 YAC u ćelijama ES obavlja se isto kao što je opisano za yH2 YAC.

ES ćelije sa sadržajem yH2 se mikroinjektiraju u mišje C57BL/6J blastocite. Proizvedeni himersni mužjaci su procenjivani transmisijom germinativne linije na potomstvo.

yH2 i yK2 transgeni miševi se pare sa Dl miševima (homozigotni za lokuse genski ciljanih inaktiviranih mišjih teških i kapa lanaca). Svaki od yH2,DI transgenih sojeva se pari sa yK2;DI transgenim sojem da se generišu sojevi ksenomiševa.

Rekonstitucije razvoja B ćelija i produkcija antitela kod ksenomiša se procenjuje flou citometrijom i ELISA testom.

Imunizacija ksenomiša se obavlja kao što je opisano u Primeru 2.

Metode za pripremu hibridoma i traženje pozitivnih klona slične su onima koje su opisane u pnmerima 3 i 4.

Klonovi hibridoma 12.6, 28, 29.8, 30 9 50.30 deponovani su u Nacionalnoj kolekciji kultura mikroorganizama (CNCM), u Pasterovom institutu u Parizu, po Budimpeštanskom ugovoru i nazvani su, navedenim redosledom depozit broj 1-2390,1-2391,1-2392, 1-239311-2394.

Claims (19)

1. Monoklonsko antitelo, himerično antitelo, potpuno humanizirano antitelo, anti-anti-ID antitelo ili neki fragment istog koji specifično prepoznaje i vezuje rastvorljiv ljudski LDL-receptor i njegov fragment, koji je sposoban da inhibira replikaciju virusa hepatitis C a koji se može dobiti putem imunizacije životinja sa ljudskim rastvorljivim LDLR+291 tj. formom rastvorljivog ljudskog receptora koji uključuju sekvence amino kiseline od Asp+4 do Glu+291 sekvence ljudskog rastvorljivog LDLR, mimo monoklonskog antitela C7.

2. Monoklonsko antitelo prema Zahtevu 1 kod koga se monoklonsko antitelo generiše pomoću Hibridom-klon 12.6, deponovan kod CNCM pod br. 1-2390, klon 28, deponovan kod CNCM pod brojem 1-2391, klon 29.8, deponovan kod CNCM pod brojem 1-2392.

3. Monoklonsko antitelo prema Zahtevu 1 dobijeno pomoću Hibridom-klon 12.6 deponovan kod CNCM pod br. 1-2390

4. Monoklonsko antitelo prema Zahtevu 1 dobijeno pomoću Hibridom-klon 28 deponovan kod CNCM pod br. 1-2391

5. Monoklonsko antitelo prema Zahtevu 1 dobijeno pomoću Hibridom-klon 29.8 deponovan kod CNCM pod br. 1-2392

6. Monoklonsko antitelo prema Zahtevu 1 dobijeno pomoću Hibridom-klon 30 deponovan kod CNCM pod br. 1-2393

7. Monoklonsko antitelo prema Zahtevu 1 dobijeno pomoću Hibridom-klon 50.30 deponovan kod CNCM pod br. 1-2394

8. Monoklonsko antitelo prema bilo kom od Zahteva od 1-7 koji pripada imunoglobilinskom izotipu IgG ili IgM

9. Hibridom-klon 12.6 deponovan kod CNCM pod br. 1-2390

10. Hibridom-klon 28 deponovan kod CNCM pod br. 1-2391

11. Hibridom-klon 29.8 deponovan kod CNCM pod br. 1-2392

12. Hibridom-klon 30 deponovan kod CNCM pod br. 1-2393

13. Hibridom-klon 50.30 deponovan kod CNCM pod br. 1-2394

14. Postupak detekcije i/ili kvantifikacije rastvorljivog ljudskog LDLR koji uključuje korišćenje monoklonskog antitela prema bilo kom od Zahteva od 1 od 8

15. Postupak za pripremu monoklonskog antitela koji uključuje rast kloniranog hibridoma koji sadrži ćeliju slezine sisara imuniziranu na maksimalno prečišćen rastvorljiv ljudski LDLR+291 tj. na formu rastvorljivog ljudskog receptora koji uključuje formu sekvence amino kiseline od Asp+4 do Glu+291 sekvence ljudskog rastvorljivog LDLR i homogene ili heterogene limfoidne ćelije u tečnom medijumu ili abdomenu miša tako da bi hibridom mogao da proizvede i akumulira monoklonsko antitelo.

16. Postupak prečišćavanja ljudskog LDLR koji obuhvata dodir materijala koji sadrži sirovi ljudski LDLR sa monoklonskim antitelom prema jednom od Zahteva od 1-8 ili sa monoklonskim antitelom pripremljenim metodom iz Zahteva 15

17. Postupakin vitroza inhibiranje replikacije virusa hepatitisa C, koji uključuje kontakt ćelija sa monoklonskim antitelom iz Zahteva 1 do 8 pre inficiranja virusom hepatitis C da se inhibira replikacija hepatitisa C u ćeliji.

18. Upotreba monoklonskog antitela prema Zahtevima od 1 do 8 za pripremu medikamenta za lečenje infekcije hepatitisom C.

19. Monoklonsko antitelo prema Zahtevima od 1 do 8 za upotrebu kao lek.