BG107063A

BG107063A - Моноклонални антитела за човешки ldl-рецептор, тяхното получаване и използване

Info

Publication number: BG107063A
Application number: BG107063A
Authority: BG
Inventors: Nachum Yonah; Dany Suissa; Ilana Belzer; Francesco Antonetti; Moshe Smolarsky; Michel Dreano
Original assignee: Applied Research Systems Ars Holding N.V.
Priority date: 2000-03-13
Filing date: 2002-09-05
Publication date: 2003-05-30
Also published as: SK287348B6; DK1263790T3; ES2282238T3; US20030186343A1; HUP0300142A2; JP4768193B2; EA200200974A1; EP1263790A1; HU226194B1; NO330904B1; PL206041B1; KR20020089384A; ZA200206654B; MXPA02009091A; EE200200517A; UA78489C2; HK1055750A1; KR100882081B1; HRP20020704B1; HRP20020704A2

Abstract

Изобретението се отнася до моноклонални антитела за човешки LDL рецептор, които са полезни за идентифициране и пречистване на LDL и за лечение, например на хепатит С инфекция.

Description

ОБЛАСТ НА ТЕХНИКАТА

Настоящото изобретение се отнася до моноклонални антитела, които разпознават специфично човешкият рецептор за w ниско-плътностните липопротеини (LDLR). Тези антитела са полезни например за идентифициране и пречистване на човешки разтворим LDLR (hsLDLR) в методите за получаване, така както и за идентифициране и лечение на заболявания, такива като хепатит С инфекция (HCV).

ПРЕДШЕСТВАЩО СЪСТОЯНИЕ НА ТЕХНИКАТА

Холестеролът, компонент на всички еукариотни плазматични мембрани, е съществен за растежа и жизнеспособността на клетките във висшите организми. Обаче високите серумни нива на холестерол, водят до заболявания и смърт, тъй като допринасят за образуването на атеросклеротични плаки в артериите на целия организъм. Основното място за синтез на холестерол в бозайниците е черният дроб. Значителни количества от холестерол се образуват също така и от тънките черва. Скоростта на образуване на холестерол от тези органи зависи до голяма степен от количеството холестерол, абсорбирано от източниците на храна. Клетките освен чернодробните и тези от тънките черва, получават холестерол предимно от плазмената мембрана, отколкото чрез синтезирането му de novo. Холестеролът и другите липиди се транспортират в телесните течности чрез липопротеини, които са класифицирани според увеличаването на плътността им. Липопротеинът е частица, съставена от сърцевинна част от хидрофобни липиди, обкръжени от обвивка от полярни липиди и апопротеини. Тези липопротеини изпълняват две функции: те разтварят силно хидрофобните липиди и те съдържат сигнали, които регулират движението на отделните липиди навътре и навън към специфични прицелни клетки и тъкани. Холестеролът се транспортира в телесните течности чрез ниско-плътностни липопротеини (LDL), които се свързват със специфичен рецептор върху плазмената мембрана на клетки, различни от чернодробните. След това, комплексът рецептор-LDL се интернализира в клетките чрез транспортен механизъм, известен като рецепторно медиирана ендоцитоза (Goldstein et al., 1979). Рецепторът за ниско-плътностният липопротеин (LDL) е прототип на семейство от структурно сходни клетъчно повърхностни рецептори, които медиират ендоцитозата на много лиганди в клетките на бозайниците.

LDL рецепторът се състои от 822 аминокиселинни остатъка и има молекулна маса 164000. Той се състои от няколко домена, някои от които имат хомоложна секвенция с други белтъци. Неговият NH₂-KpaeH лиганд-свързващ домен се състои от 292 остатъка, организирани в 7 богати на цистеин несъвършенни повтора. Всеки повтор съдържа шест цистеинови остатъка, които са свързани с дисулфиден мост, като те могат да са от един до три, два до пет и четири до шест (Bieri et al., 1995). Освен този домен има четири допълнителни домена: първият се състои от 400 аминокиселинни остатъка и е хомоложен на EGF

Γ' w

рецептора, вторият се състои от 58 аминокиселинни остатъка, богати на О-свързани захари, третият е единичен трансмембранен домен от 22 аминокиселинни остатъка и четвъртият е цитоплазмен домен от 50 аминокиселинни остатъка (Sudhof et al., 1985), (Brown et al., 1986).

Физиологичното значение на LDL рецептора е разкрито чрез изследванията на Brown и Goldstein при семейна хиперхолестеролемия (FH). Открито е, че заболяването се дължи на молекулен генетичен дефект, водещ до липса или недостиг на функционални рецептори за LDL (Brown et al., 1976). Характеризирани са няколко класа FH мутации. (Goldstein et al., 1975).

Идентифицирана е и е изолирана разтворимата форма на sLDLR, притежаваща антивирусна активност от културална супернатанта на интерферон-индуцирани клетки (Fischer et al., 1993) и в телесни течности (Fischer et al., 1994). Идентифицирани са няколко интерферон-индуцирани белтъка, които допринасят за индуциране на антивирусното състояние чрез IFNs. Получен е и е натрупан един такъв белтък, притежаващ антивирусна активност в културална супернатанта от човешки амниотични WISH клетки. Този белтък е пречистен до хомогенност и е идентифициран като sLDLR (виж ЕР 0 553 667 и Fischer et al., 1993). Намерено е, че sLDLR се секретира в средата от клетки на бозайници, които преминават в антивирусно състояние в отговор на интерферон. За разлика от интерферона, sLDLR не индуцира антивирусно състояние в клетките, но самият той има антивирусна активност. Открито е очевидно, че sLDLR трябва да присъства през време на процеса на завършване на вирусната репликация и формиране на вирусните частици, което допуска че той може да бъде включен в сложния процес, водещ до подтискане на сглобяването или формирането на вирусните частици (непубликувани данни). Неотдавна е показано, че в култивирани клетки ендоцитозата на вируса на хепатит С се медиира от LDL рецептори (Agnello et al., 1999). Тези и други открития допускат, че семейството на LDL рецепторите, могат да изпълняват ролята на вирусни рецептори. Следователно създаването на антитела срещу sLDLR рецепторите, могат да блокират навлизането и формирането на вирусните частици, чрез свързване с клетъчния LDL рецептор.

Единственото налично моноклонално антитяло за LDLR известно до сега е С7, антитяло за говежди LDLR (Beisiegel et al., 1981, налично в търговската мрежа от Amersham, UK), което е получено чрез имунизиране на мишки с говежди LDLR от надбъбречен кортекс, пречистено до хомогенност. Мембраните от говежди надбъбречен кортекс са разтворени и рецепторът е пречистен частично чрез елуиране през DEAE-целулозна колона (Beisiegel et al., 1981). Антитялото към говеждия LDLR крос-реагират съвсем слабо с човешки LDLR.

Фактически открито е, че С7 моноклоналното антитяло за говежди LDLR има значителни недостатъци, когато се използва за детекция и количествено определяне на рекомбинантен човешки LDLR:

а) То има много слаб афинитет към човешкия LDLR

б) То крос-реагира до голяма степен с примесите получени от клетъчна култура

Преди това не е имало налични специфични антитела за човешки LDLR. Това е доста изненадващо, тъй като е много просто да се получат антитела срещу нови белтъци, било то за пречистване, идентифициране или с цел разработване на анализ. Възможно е досега да не са получени такива антитела, поради това, че условието за получаване на моноклонални антитела е наличието на достатъчно големи количества от силно пречистен антиген, което позволява ефективно имунизиране на мишки. Силно пречистен антиген е този, който се появява като единичен основен пик в RP-HPLC. Освен това, не е лесно да се създадат методи за идентифициране и количествено определяне на антигена по време на методите за пречистване. Съгласно изобретението, описаният тук анализ за антивирусна активност, се използва за идентифициране на LDLR по време на методите (**' ^w за пречистване.

Необходимо е да се създадат специфични моноклонални антитела за човешки разтворим LDLR, за да се осигурят начини за развитието на ефективен имуноанализ (ELISA) и за идентифициране на белтъка чрез Western блот. Тези антитела са необходими за контрол и количествено определяне на рекомбинантен човешки разтворим LDLR, за разработването на методите за получаване и пречистване на рекомбинантния белтък и за детекция на естествения белтък.

L

ТЕХНИЧЕСКА СЪЩНОСТ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Настоящото изобретение позволява създаването на хибридомни клетъчни линии, произвеждащи моноклонални антитела, способни да разпознават специфично и да се свързват с човешкия LDL рецептор и негови фрагменти.

По-специално настоящото изобретение позволява създаването на хибридомни клетъчни линии, произвеждащи антитела, способни да разпознават специфично и да се свързват с човешкия разтворим LDL рецептор.

Следователно настоящото изобретение се отнася до моноклонално антитяло, химерно антитяло, наподобяващо човешкото антитяло, анти-анти-Id антитяло или негов фрагмент, Което разпознава специфично и се свързва с човешкия LDL рецептор и негови фрагменти, освен моноклонално антитяло С7.

Настоящото изобретение осигурява такива моноклонални антитела, които разпознават и се свързват с човешкия разтворим LDLR и отговарят на следните нужди:

** 1. Моноклонални антитела, които могат да се използват като двойка при ELISA, например ELISA сандвич (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), за детекция на човешки разтворим LDLR.

2. Моноклонални антитела, които могат да се използват за идентифициране на LDLR при Western блот анализ.

3. Моноклонални антитела, които могат да се използват за неутрализиране на антивирусната биологична активност на човешкия разтворим LDLR.

4. Моноклонални антитела, които могат да се използват за подтискане на вирусна инфекция, такива като НС V.

Освен това, настоящото изобретение осигурява метод за детекция и/или количествено определяне на човешки LDLR, който включва използването на специфични моноклонални антитела съгласно изобретението, по познатия за тази цел начин.

Настоящото изобретение осигурява също така клонирана хибридома, включваща клетка от далак на бозайник, имунизиран с рекомбинантен човешки LDLR и хомогенна или хетерогенна лимфоидна клетка.

Съгласно изобретението, моноклоналното антитяло се приготвя по конвенционален начин, например чрез растеж на клонирана хибридома, включваща клетка от далак на бозайник, имунизиран с hs LDL и хомогенна или хетерогенна лимфоидна клетка, в течна среда или в коремната област на бозайник, за да може хибридомата да произвежда и да натрупва моноклоналното антитяло.

В друг вариант, изобретението осигурява метод за пречистване на човешкия LDLR, който съгласно изобретението включва контактуване на материала, съдържащ непречистен LDLR с моноклонално антитяло. Колоната с абсорбираното LDLR специфично моноклонално антитяло, може да се използва като афинитетно пречистващо стъпало, в метода за пречистване на рекомбинантния белтък.

Метод за детекция и оценка на рекомбинантен човешки LDLR, който включва използване на антитяло, такова като моноклоналните антитела от изобретението, при ELISA анализа, както е описан в Пример 5.

Тъй като за имунизиране на животни може да се използва LDLR или фрагмент от LDLR, то може да се използва всеки LDLR, ако той е LDLR от топлокръвен бозайник. Може да се използва също така и мутеин на LDLR. Типичен пример за такъв човешки разтворим LDLR е разтворимата LDLR +291 форма, която включва аминокиселинна последователност, започваща с аминокиселина Asp в позиция +4 и завършваща с аминокиселината Glu, в позиция +291 от секвенцията на човешкия LDLR, като могат да се използват също така и каквито и да се други форми, такива като, +292 форма и т.н.

КРАТКО ОПИСАНИЕ НА ФИГУРИТЕ

Фигура 1 показва последователните етапи при получаването на моноклонални антитела към r-hs LDLR.

Фигура 2 показва Western блот анализ на +291 формата от r-hs LDLR в старт 1, hs LDLR от урина в старт 2 и рекомбинантен човешки р55 TNF рецептор, като негативна контрола (г-hTBP-l) в старт 3, с моноклоналните антитела, посочени под всеки старт. Стрелките от лявата страна на фигурата показват позицията на молекулната маса на маркерите, а стрелките от дясната страна на фигурата показват позицията на hs LDLR формата, посочена над всяка стрелка.

Фигура 3 показва ефектите на моноклонални антитела 12.6, 28 и 29.8 при продукцията на HCV (+) и HCV (-) вериги в култура от FT 167. Клетките се третират в продължение на 30 минути, преди заразяване с моноклонално антитяло анти LDLR (8 или 2 pg/ml). След това клетките се инфектират в продължение на една нощ с 25 pl от HCV (+) серум (№ 42;lb). Един ден след инфекцията, се провеждат три измивания и се прибавя нова среда и тя се сменя на всеки 48 часа. Пет дена след инфекцията, хепатоцитите се събират, РНК се пречиства и се анализира 1 pg клетъчна РНК чрез rTth RT-PCR (Perkin Elmer). Анализът се извършва двукратно.

+ SP: положително-верижен РНК анализ; - SP отрицателноверижен РНК анализ; X: контрола.

ПОДРОБНО ОПИСАНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Създават се моноклонални антитела (Mabs) към човешки разтворим LDLR (hs LDLR). Като се използват тези моноклонални антитела, се разработва ELISA и Western блотинг метод за идентифициране на hs LDLR и анализ за неутрализиране на антивирусната активност на hs LDLR.

Моноклоналните антитела се произвеждат от мишки, имунизирани с рекомбинантната +291 форма на hs LDLR, която е съставена от N-краен лиганд свързващ домен от човешкия разтворим LDLR, от Asp +4 до Glu +291. Рекомбинантната +291 форма на hs LDLR, се получава в СНО клетки и се пречиства до хомогенност.

Имунизираните мишки произвеждат значителни тигри от специфични антитела. След скриниране на хибридомите, са идентифицирани пет клона (номера 12, 28, 29, 30 и 50), като най-силни продуценти на антитела. Тези клонове се избрани за следващото субклониране. След субклониране са изолирани 29 субклона, които имат висока продуктивност на антитела и родителските клонове и субклоновете се замразяват в ампули.

Избира се двойка от моноклонални антитела за ELISA за гhs LDLR. Като покриващо антитяло е избрано Mab 28, a Mab 29.8 белязано с биотин е избрано като второ антитяло. Намерено е, че моноклоналните антитела 12.6 и 29.8 са подходящи за идентифициране на нативен и рекомбинантен hs LDLR при Western блот анализ и че моноклоналните антитела 28 и 30 са подходящи за идентифициране на рекомбинантен hs LDLR при Western блот анализ. Намерено е, че моноклоналните антитела 12.6 и 50.30 са подходящи за подтискане на антивирусната активност на hs LDLR.

Съгласно изобретението е намерено също така, че моноклонални антитела 12.6,28и29.8 подтискат регшикацията на вирусния геном, на хепатит С вирус (HCV) в първични клетъчни култури от човешки хепатоцити. Следователно, тези антитела могат да се използват за лечение на инфекции с хепатит С (Фигура 3).

Определен е изотипен субклас от моноклонално антитяло, получен от клоновете. Клоновете 12.6, 28, 29.8 и 30 са идентифицирани като IgGi, докато клон 50.3 е намерен че е IgM.

Моноклоналните антитела, получени срещу формата +291 от hs LDLR разпознават също така други форми на hs LDLR, т.е. +292 формата и +331 формата на г-hsLDLR, продуцирани от СНО клетки, при ELISA и Western блот анализи. Формата +292 включва N-крайната част от рецептора, от аминокиселинния остатък Asp +4 до Cys +292, а формата +331 включва Nкрайната част от рецептора, от аминокиселинен остатък Asp +4 до Cys +331.

Антигенът използван за имунизиране на мишки, за производство на моноклонални антитела е r-hs LDLR +292 форма, която се получава в СНО клетки. Получаването на r-hs LDLR се извършва в биореактори, като се използва стационарно фазова система с матрикс Fibracel. r-hs LDLR се пречиства до хомогенност и се използва за имунизиране на мишки.

За сливане и създаване на хибридоми се използват имунни клетки от далак от мишки с най-добър отговор.

По отношение на антителата използвани навсякъде тук, терминът “моноклонално антитяло” е предназначен да включва моноклонални антитела, химерни антитела, наподобяващи напълно човешките антитела, антитела за анти-идиотипни антитела (анти-анти-Id антитяло), които могат да се бележат в разтворима или свързана форма, така както и техни фрагменти, доставени чрез известните техники, такива като, но не ограничаващи се до, ензимно разграждане, пептиден синтез или рекомбинантни техники.

Моноклоналното антитяло съдържа по същество хомогенна популация от антитела, специфични към антигени, които популации всъщност съдържат сходни епитоп свързващи места. Моноклонални антитела могат да се получат чрез методите добре известни на специалистите в областта. Виж например, Kohler and Milstein, Nature, 256:495-497 (1975); U. S. Patent No 4, 376, 110; Ausubel et al., eds., Harlow and Lane ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory (1988); and Colligan et al., eds., Cunent Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc, and Wiley Interscience N. Y., (1992-1996), чието съдържание е включено изцяло тук в справката. Такива антитела могат да са от всеки имуноглобулинов клас, включващ IgG, IgM, IgE, IgA GILD и който и да е техен подклас. Хибридома, произвеждаща моноклонално антитяло от настоящото изобретение, може да бъде култивирана in vitro, in situ или in vivo. Получаването на висок тигър от моноклонални антитела in vivo или in situ, понастоящем е предпочитан метод за получаване.

Химерните антитела са молекули, при които различните части са получени от различни животински видове, такива като тези, притежаващи вариабелна област, получена от мишо моноклонално антитяло и константна област от човешки имуноглобулин. Първоначално химерните антитела са използвани за намаляване на имуногенността при прилагане и за увеличаване добивите при получаване, например където мишите моноклонални антитела имат по-високи добиви от хибридоми, но по-висока имуногенност при хора, така, че се използват човешки/миши химерни моноклонални антитела.

Химерните антитела и методите за тяхното получаване са известни от нивото на техниката (Cabilly et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81:3273-3277 (1984); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 81:6851-6855 (1984); Boulianne et al., Nature, 312:643646 (1984); Cabilly et al., European Patent Application 125023 (публикуван на 14 ноември, 1984); Neuberger et al., Nature, 314:268-270 (1985); Taniguchi et al., European Patent Application 171496 (публикуван на 19 февруари, 1985); Morrison et al., European Patent Application 173494 (публикуван на 5 март, 1986); Neuberger et al., PCT Aplication, WO 8601533, (публикуван на 13 март, 1986); Kubo et al., European Patent Application 184187 (публикуван на 11 юни, 1986); Sahagan et al., J. Immunol., 137:1066-1074 (1986); Robinson et al., International Patent Application No. WO 8702671 (публикуван на 7 май, 1987); Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84:3439-3443 (1987); Sun et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84:214-218 (1987); Better et al., Science, 240:1041-1043 (1988); Riechmann et al., Nature, 332:323327, and Harlow and Lane, antibodies: a laboratory manual, supra. Тези референции са включени изцяло тук в справката.

“Наподобяващи напълно човешките антитела” са молекули, съдържащи както вариабелната, така и константната област от човешкия имуноглобулин. Антителата, наподобяващи напълно човешките могат да се използват с терапевтична цел, там където е необходимо повторно лечение, при хронични и повтарящи се заболявания, такива като автоимунни заболявания. Един метод за получаване на ангитела, наподобяващи напълно човешките антитела, се състои от “хуманизиране” на мишата хуморална имунна система, т.е. получаване на миши щамове, способни да произвеждат човешки Ig (Xenomice), чрез въвеждане на човешки имуноглобулинов Ig локус в мишки, при които ендогенните Ig гени са инактивирани. Ig локусите са необичайно сложни както по отношение на тяхната физична структура и генна реорганизация, така и по отношение на процесите на експресия, необходими в крайна сметка за производството на широк имунен отговор. Разнообразието на антитела се генерира първоначално от комбинираното реконструиране между различни V, D и J гени, присъстващи в Ig локусите. Тези локуси съдържат също така разпръснати регулаторни елементи, които контролират експресията на антитялото, алелното изключване, включването на клас и афинитетно зреене. Въвеждането на прегрупирани човешки Ig трансгени в мишки показва, че мишата рекомбинативна машина е съвместима с човешките гени. Освен това, хибридоми, секретиращи антигенспецифични hu-mAbs от различни изотипове, могат да се получат чрез имунизиране на Xenomice с антиген.

Наподобяващите напълно човешките антитела и методите за тяхното получаване са известни от нивото на техниката (Mendez et al., Nature Genetics 15:146-156 (1997); Buggemann et al., Eur. J. Immunol., 21:1323-1326 (1991); Tomizuka et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 97:722-727 (2000), Patent WO 98/24893.

Анти-идиотипно антитяло (anti-Id) е антитяло, което разпознава уникални детерминанти, обикновено свързани с антиген-свързващото място от антитялото. Анти-идиотипното антитяло може да се получи чрез имунизиране на животно от същия вид и генетичен тип (например, миша линия), както източника на моноклоналното антитяло, към който е приготвено анти Id. Имунизираното животно ще разпознава и ще реагира на идиотипните детерминанти от имунизираното антитяло, чрез произвеждане на антитяло към тези идиотипни детерминанти (анти-Id антитяло). Виж например, U. S. Патент, № 4, 699, 880, който е включен изцяло тук в справката.

Анти-Id антитялото може да се използва също така и като “имуноген”, за да индуцира имунен отговор в друго животно, произвеждащо така нареченото анти-анти-Id антитяло. Антианти-Id може да бъде епитопно идентично с изходното моноклонално антитяло, което индуцира анти-Id. Следователно, чрез използване на антитела към идиотипни детерминанти на МаЬ, е възможно да се идентифицират други клонове, експресиращи антитела с идентична специфичност.

Съотаетно, Mabs създадени срещу⁷ LDLR, негови изоформи, аналози, фрагменти или производни от настоящото изобретение, могат да се използват за индуциране на анти-Id антитела в подходящи животни, такива като BALB/c мишки. Клетки от далак на такива имунизирани мишки се използват за получаване на анти-М-хибридоми, секретиращи анти-Id Mabs. Освен това, анти-Id Mabs могат да се свързват с носител, такъв като keyhole limpet hemocyanin (KLH) и да се използват за да се имунизират допълнително BALB/c мишки. Серумът от тези мишки ще съдържа анти-анти-Id антитела, които имат свързващите свойства на изходния МаЬ, специфични за епитопа на по-горния LDLR белтък, или негови производни фрагменти и аналози.

Следователно моноклоналните анти-Id антитела имат своите собствени идиотипни епитопи, или “идиотипи”, структурно сходни с епитопа, който се оценява. Терминът “моноклонално антитяло”, означава също така, че включва както интактни молекули, а също така и техни фрагменти, например такива като Fab, и Fab (ab’)2, които са способни да се свързват с антиген. Fab, Fab (ab’)2 фрагментите не притежават

Fc фрагмента на интактното антитяло, освобождават се много бързо в циркулацията и могат да имат по-слабо неспецифично тъканно свързване, отколкото интактното антитяло (Wahl et al., J. Nucl. Med., 24:316-325 (1983)).

Подразбира се, че Fab и F (ab’)2 и други фрагменти от антителата, полезни в настоящото изобретение, могат да се използват за детекция и количествено определяне на LDLR белтъка, съгласно методите описани тук за интактни антитяло молекули. Такива фрагменти се получават обикновено чрез протеолитично разграждане, като се използват ензими, такива като папаин (за получаване на Fab фрагменти), или пепсин (за получаване на F (ab’)2 фрагменти).

Съобщава се, че моноклоналното антитяло е “способно да свързва” молекула, ако то е способно да взаимодейства специфично с молекулата, като по този начин свързва молекулата с антитялото. Използваният тук термин “епитоп”, означава тази част от която и да е молекула, способна да се свързва с антитяло, която също така може да се разпознава от това антитяло. Епитопите или “антигенните детерминанти” обикновено са съставени от химически активни повърхностни групи от молекули, такива като страничните вериги на аминокиселини или захари и които имат специфични пространствени структурни характеристики, така както и специфични характеристики от заряди.

“Антнигенът” е молекула или част от молекула, способна да се свързва с антитяло, като в допълнение, антигенът е способен да индуцира в животното продукция на антитяло, способно да се свързва с епитопа на този антиген. Антигенът може да има един или повече от един епитоп. По-горе споменатата специфична реакция означава, че антигенът ще реагира по силно селективен начин с епитоп от съответното му антитяло, а не с множество други антитела, които могат да бъдат произведени от други антигени.

Антителата, включващи фрагменти от антитела, полезни в настоящото изобретение, могат да се използват за количествена или качествена детекция на LDLR белтъци в проба, или за откриване на присъствието на клетки, които експресират LDLR белтъци от настоящото изобретение. Това може да се осъществи с помощта на имунофлуоресцентни техники, използващи ** флуоресцентно белязано антитяло (виж по-долу) с флуоресцентен микроскоп, поточна цитометрия или флуорометрична детекция.

Антителата (или техни фрагменти) прилагани в настоящото изобретение, могат да се използват хистологично, както при имунофлуоресцентна така и при имуноелектронна микроскопия, за in situ детекция на LDLR белтъци от настоящото изобретение. In situ детекцията може да се осъществи чрез отделяне на хистологична проба от пациент и осигуряване на белязаното антитяло от настоящото изобретение за този вид. За предпочитане е антитялото (или фрагмента) да се осигури чрез прилагане или чрез нанасяне на белязаното антитяло (или фрагмент) върху биологичната проба. Чрез използването на такъв метод е възможно да се определи не само присъствието на LDLR белтъци, но също така и тяхното разпределение в изследваната тъкан. За специалистите в областта е ясно, че като използват настоящото изобретение могат да модифицират всеки един от многото хистологични методи (такива като методите за оцветяване), за да постигнат такава in situ детекция.

Такива анализи за LDLR белтъци от настоящото изобретение включват по същество биологична проба, например като биологична течност, тъканен екстракт, свежо събрани клетки, такива като лимфоцити или левкоцити, или клетки, които се инкубират в тъканна култура, в присъствие на белязано антитяло, способно да открие LDLR белтъците и детектиране на антитялото чрез които и да са техники, известни на специалистите в областта.

Биологичната проба може да бъде свързана с твърдо фазова подложка или носител, като нитроцелулоза или друга твърда подложка или носител, който е способен да имобилизира клетки, клетъчни частици или разтворими белтъци. След това подложката или носителя могат да се измият с подходящи буфери, последвано от третиране с белязано антитяло съгласно настоящото изобретение, както е отбелязано по-горе. След това твърдата фазова подложка или носител могат да се измият повторно с буфер, за да се отстрани несвързаното антитяло. След това, чрез стандартните средства може да се детектира количеството на свързания белег върху споменатата твърда подложка или носител.

Термините “твърда фазова подложка”, “твърдо фазов носител”, “твърда подложка”, “твърд носител”, “подложка” или “носител” имат предвид всяка подложка или носител, способни да свързват антиген или антитела. Добре известните подложки или носители включват стъкло, полистирен, порипропилен, полиетилен, декстран, найлонови амилази, естествени и модифицирани целулози, полиакриламиди, gabbros и магнетит. По природа носителят може да бъде или разтворим до известна степен или неразтворим за целите на настоящото изобретение. Материалът за подложка може да има всъщност всяка една възможна структурна конфигурация, така че свързаната молекула е способна да се свързва с антиген или антитяло. Следователно, конфигурацията на подложката или на носителя може да е сферична като зърно, цилиндрична като вътрешната повърхност на епруветка за анализ или като външна повърхност на пръчка. Съответно, повърхността може да е плоска като на лист, лента за анализ и други. Предпочитани подложки или носители включват полистиренови зърна. Специалистите в областта могат да познават много други подходящи носители за ^w свързване на антитяло или антиген, или биха могли да констатират същите чрез използване на рутинни експерименти.

Свързващата активност за дадена партида от антитела от изобретението, както е отбелязано по-горе, може да се определи съгласно добре познатите методи. Специалистите в областта ще могат да определят условията за ефикасен и оптимален анализ за всяко определяне, като използват рутинни експерименти.

Към анализа могат да се добавят и други такива етапи като измиване, разбъркване, разклащане и други подобни, ако е г·» обичайно или необходимо за отделната ситуация.

w

Един от начините чрез които антитялото съгласно настоящото изобретение може да бъде белязано, е чрез свързване на същото с ензим и използването на имуноензимен анализ (EIA). От своя страна, когато този ензим се изложи покъсно на действието на подходящ субстрат, той ще взаимодейства със субстрата по такъв начин, че да се получи химична група, която може да се детектира, например чрез спектрофотометър, флуорометър или чрез видими средства. Ензимите, които могат да се използват за детектиране на белязано антитяло включват, но не се ограничават само до, малат дехидрогеназа, стафилококова нуклеаза, делта-5-стероид изомераза, алкохолна дехидрогеназа от дрожди, алфаглицерофосфат дехидрогеназа, триозо фосфат изомераза, пероксидаза от хрян, алкална фосфатаза, аспаргиназа, глюкозо оксидаза, бета-галактозидаза, рибонуклеаза, уреаза, каталаза, глюкозо-6-фосфат дехидрогеназа, глюкоамилаза и ацетилхолинестераза. Детекцията може да се осъществи чрез колориметрични методи, които използват хромогенен субстрат за ензима. Детекцията може също така да се осъществи чрез визуално сравняване на степента на ензимната реакция на субстрата в сравнение с приготвените по същия начин стандарти.

Детекцията може да се осъществи, като се използва широк набор от други имунологични анализи. Например, чрез радиоактивно белязане на антителата или фрагменти от антителата, е възможно да се детектора R-PTPase чрез използване на радиоимунологичен анализ (RIA). Добро описание за RIA може да се намери в Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology, by Work, T. S. et al., North Holland Publishing Company, NY (1978), c отделна справка към главата, със заглавие “An Introduction to Radioimmune Assay and Related Techniques” by Chard, T., включена тук в справката. Радиоактивният изотоп може да се открие чрез такива начини, като използването на брояч или сцинтилационен брояч или чрез автора диограф ия.

Съгласно настоящото изобретение, е възможно също така да се бележи антитяло с флуоресцентно съединение. Когато флуоресцентно белязаното антитяло се изложи на действието на светлина с подходяща дължина на вълната, след това неговото присъствие може да се открие поради флуоресценцията. Сред най-често използваните флуоресцентно белязани съединения са флуоресцеин изотиоцианат, родамин, фикоеритрин, фикоцианин, алофикоциапин, о-фталдехид и флуорескамин.

Белязаното антитяло може да се открие също така като се използват флуоресцентно излъчващи метали, такива като ¹⁵²Е или други от серията лантаниди. Тези метали могат да се прикрепят към антитялото, като се използват такива мегал хелатиращи групи, като диетилентриамин пентаоцетна киселина (ЕТРА).

Белязаното антитяло може да се открие също така чрез свързването му с хемилуминесцентно съединение. Присъствието на хемилуминесцентно-маркирано антитяло след това се определя чрез детектиране присъствието на луминесценция, която се получава по време на химичната реакция. Примери за особено полезни хемилуминесцентно белязани съединения са луминол, изолуминол, тероматен акридинов естер, имидазол, акридинова сол и оксалатен естер.

По подобен начин за белязане на антитялото от настоящото изобретение може да се използва биолуминесцентно съединение. Биолуминесценцията е вид хемилуминесценция, открита в биологичните системи в които каталитичен белтък повишава ефикасността на хемилуминесцентната реакция. Присъствието на биолуминесцентен белтък се определя чрез откриване присъствието на луминесценция. Важни биолуминесцентни съединения за целите на белязане са луциферин, луцифераза и акорин.

Молекулата на антитялото от настоящото изобретение, може да бъде адаптирана за използване при имунометричен анализ, известен също така като “двустранен” или “сандвич” анализ. При типичния имунометричен анализ, количество от небелязано антитяло (или фрагмент от антитяло) се свързва с твърда подложка или носител и се добавя количество от белязано разтворимо антитяло, за да се осъществи детекция и/или за количествено определяне на тройния комплекс, образуван между твърдо-фазово антитяло, антиген и белязано антитяло.

Типично и за предпочитане е имунометричният метод да включва “прав” анализ, при който свързаното с твърда фаза антитяло, най-напред контактува с пробата за анализ, за да се екстрахира антигена от пробата, чрез образуване на двоен твърдо-фазов антитяло-антиген комплекс. След подходящ инкубационен период, твърдата подложка или носител се измива, за да се отстранят остатъците от течната проба, включващи не реагирал антиген, ако има такъв и след това тя контактува с разтвора, съдържащ неизвестно количество от белязано антитяло (което функционира като “молекула репортер”). След втори инкубационен период, който дава възможност на белязаното антитяло да образува комплекс с антигена, свързан с твърдата подложка или носител чрез небелязаното антитяло, твърдата подложка или носител се измиват повторно, за да се отстрани нереагиралото белязано антитяло.

При друг вид “сандвич” анализ, който също така може да се използва с антигените от настоящото изобретение, се използват така наречените “едновременни” или “обратни” анализи. Едновременният анализ включва еднократен инкубационен етап, тъй като антитялото, свързано с твърдата подложка или носител и белязаното антитяло се добавят към пробата за анализ по едно и също време. След като завърши инкубацията, твърдата подложка или носител се измиват, за да се отстранят остатъците от течната ггроба и несвързаното в комплекс белязано антитяло. След това се определя присъствието на белязано антитяло, свързано с твърдата подложка или носител като при стандартния “прав” сандвич анализ.

При “обратния” анализ се използва постепенно добавяне най-напред на разтвор от белязано антитяло към течната проба, последван от добавяне на небелязано антитяло, свързано с твърда подложка или носител, след подходящ инкубационен период. След повторна инкубация, твърдата фаза се измива по стандартен начин, за да се освободи от остатъка от пробата която се анализира и от разтвора с нереагирало белязано антитяло. След това се определя белязаното антитяло, свързано с твърда подложка или носител, както при “едновременния” или “правия” анализ.

Сега изобретението ще бъде илюстрирано със следните неограничаващи примери

ПРИМЕРИ ЗА ИЗПЪЛНЕНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Пример 1

Получаване на СНО r-hs LDLR

Стабилни рекомбинантни СНО клетки, експресиращи човешки разтворим LDLR, се получават чрез ко-трансфекция на CHO-DUKX клетки, в които липсва дихидрофолат редуктазен (DHFR) ген (Urlaub, G. et al., 1980), с два експресионни вектора: ps LDLR01, съдържащ N-краен лиганд-свързващ домен от LDLR, започващ с аминокиселинен остатък Asp (+ 4) до Glu 291

(+ 291) и pDHFR, съдържащ мишия ген за DHFR, като и двата се контролират от промотора и транскринционно терминалните елементи на SV40 ранна област. Трансфекцията се извършва чрез катионни липозоми, като се използва LypofectAmine (Gibco BRL), съгласно протокола, описан от производителя. Седемдесет и два часа след трансфекцията, клетките се пренасят в селективна среда, в която липсват дезокси и рибонуклеозиди и която е снабдена с 10 % диализиран FCS. Клетките експресиращи DHFR активност, са способни да формират колонии, които се изолират чрез отделяне на клетките чрез напоени с трипсин хартиени дискове. Клетките растат и се скринират за г-hs LDLR активност. След това трансфекгираните клетки се подлагат на генна амплификация чрез МТХ, последвана от субклониране и селекция на стабилно продуциращите клонове.

r-hs LDLR (+ 291 форма) се получава с клетки от стабилен СНО продуциращ клон, означен като #33-10-29-21, в 5 литров CelliGen биореактор в свободна от серум среда (Gibco СНО-АSFM, Кат. № 95-0091DJ). Суровият извлек се избистря чрез филтруване през 0.8-0.2 μ патронен филтър (Gelman Кат № CSS92DSCCK) и се концентрира 100 пъти върху 5-kDa мембрана. Формата +291 от r-hs LDLR, използвана за първата имунизация се пречиства, като се използва ниско мащабен метод за пречистване. При този метод се използва DEAESepharose катионно обменна колона, последвана от етап на хидрофобно взаимодействие върху Butyl-TSK колона, последвана от НТР колона и разделящ по размер на молекулите хроматографски етап (SEC) върху Sephacryl 100 колона. Избрана е фракция #27 от SEC, тъй като тя съдържа специфична антивирусна активност от 780 единици/р§, детектирана чрез антивирусния анализ, описан в Пример 9 по-долу. Белтъкът в тази фракция е идентифициран като r-hs LDLR, чрез N-краен анализ.

Пречиства се втора партида от СНО +291 r-hs LDLR и се използват като подсилващи инжекции за мишките. Тя се пречиства чрез метод за рафиниране, при който има подобрен добив, който включва следните етапи: а) избистряне и концентриране х 100 на суровия извлек; б) HQ POROS анионно обменна колона и в) два етапа на хидрофобно взаимодействие (HIC): улавяне чрез Butyl-TSK колона и изтичане през Phenyl 5PW колона. Несвързаната фракция от последния HIC етап се диализира и пречиства върху HS-POROS катионно обменна колона. Последният етап е Хидроксиапатит (НТР) колона. Полученият по този начин r-hs LDLR, се пречиства до около 90 %, и се елуира като единичен основен пик при RP-HPLC.

Пример 2

Имунизиране на мишки pg от пречистеният r-hs LDLR от фракция 4 27 от SEC колоната, от Пример 1 по-горе, с концентрация 100 pg/ml се хомогенизират с пълен адювант на Freund (CFA, 50 % v/v) и се инжектират в лапата на всяка от петте Balb/C женски мишки на възраст 7 седмици.

Четири седмици след първата имунизация, мишките се инжектират интрамускулно с 10 pg от същата фракция с пречистения r-hs LDLR, в 50 % (v/v) разтвор от CFA.

Две седмици след втората инжекция мишият серум се анализира за антитела към r-hs LDLR, като се използва директна ELISA, описана в Пример 3 по-долу.

Двете мишки М-1 и М-2, които показват най-голяма специфична имунореактивност с r-hs LDLR, се стимулират допълнително 10 седмици след втората инжекция, с 10 pg от пречистения r-hs LDLR, получен чрез метода за рафинирано пречистване, описан в Пример 1 по-горе.

Четиринадесет седмици по-късно, от мишките се взема кръв и се анализира за антитела срещу r-hs LDLR . След това на тях им се дават две допълнителни подсилващи инжекции от 50 pg r-hs LDLR в PBS: първата интраперитонеално, а втората два дена по-късно, както инраперитонеално, така и интравенозно.

След втората инжекция, две седмици по-късно, от мишките се взема отново кръв и аггтисерумът се анализира за анти-r-hs LDLR активност, чрез директна ELISA от Пример 3 по-долу. Всеки антисерум се разрежда серийно 1:100-1:32,000 и се прилага двукратно в 96 ямкови плаки, покрити с lOU/ямка от r-hs LDLR, пречистен чрез използване на метода за рафинирано пречистване, описан в по-горния Пример 1. В първата ямка от всяка редица като контроли се използва буфер за анализ и DMEM + 10 % HS, съдържащ PBS + 1 % BSA или желатин + 0.05 % Tween 20 + 0.05 % Thimerosal. Като негативни контроли в последните два реда се поставя нормален миши серум (NMS), със същия обхват на разреждане. Абсорбцията на ензимната реакция се измерва с ELISA апарат при 492 и 405 пш.

Резултатите от теста показват, че серумът от мишка М-1 има по-висока специфична имунореактивност с r-hs LDLR и следователно тя беше убита и от нея бяха събрани клетките от далак за сливане с миеломни клетки (Eshhar Ζ., 1985).

Пример 3

Директна ELISA за анализ на антисерум и скриниране на хибридомни клонове

Директната ELISA за скриниране на позитивен антисерум се провежда по следния начин: 96 ямкови плаки се покриват с 100 μΐ r-hs LDLR (пречистен чрез метода за рафинирано пречистване в Пример 1), 100 единици/ml (lOU/ямка) в PBS + 1 % Gelatine (Sigma, Cat. No G-7765) + 0.9 mM Ca⁺² и 0.5 mM Mg , pH 5.6, споменаван по-долу тук като буфер за анализ, за 90 минути, при 37° С с разбъркване. Плаките се измиват шест пъти с BPS + 0.05 % Tween 20 (Polyoxyethylene-Sorbitan Monolaurate - Sigma P-1379), споменаван тук по-долу като разтвор за измиване.

Пробите от антисерума от имунизираните мишки, разредени серийно 1:100-1:32,000, или супернатантата от хибридомните клетъчни култури, се добавят към ямките и се инкубират в продължение на 90 минути, при 37° С, при разбъркване, последвано от шест кратно измиване с разтвора за измиване.

Към всяка ямка се добавят 100 μΐ конюгирано с пероксидаза от хрян (HRP)-APA козе антитяло срещу миши Fab (Sigma - Cat No. 4601-1), разредено 1:1,200 и се инкубира в продължение на 90 минути, при 37° С, при разбъркване и след това се измива шест пъти с разтвора за измиване.

Към всяка ямка се добавят 100 μΐ от субстратния разтвор (приготвен чрез разтваряне на една таблетка от OPD и една таблетка от Н₂О₂ в 20 ml вода) и те се инкубират в продължение на 30 минути, при стайна температура. Ензимната реакция се спира чрез добавяне на 100 μΐ/ямка от 4 N НС1.

Абсорбцията в 96 ямковите плаки се измерва като се използва ELISA апарат при 492 и 405 nm и резултатите се изчисляват, като се използват четирите параметъра на логистичен алгоритъм, чрез MultiCalc софтуер от PC компютър, свързан с апарата за отчитане ELISA.

Пример 4

Сливане, получаване на хибридома, селекция на клонове и пречистване на антитела от асцитни течности

Методът на сливане и клетъчна хибридомна селекция се провежда съгласно протокола на Eshhar Z., 1985. Накратко, клетките от далак на мишка М-1, подсилени 2-4 дена преди сливането, се сливат с миеломни клетки, чрез кратка инкубация с PEG. Най-напред PEG се разрежда бавно с DMEM и след това се отстранява напълно чрез центрофугиране. Клетките се ресуспендират в среда DMEM-HAT, разпределят се в 96 ямковите плаки с концентрация от около 3.4 χ 10'⁴ клетки/на ямка и се инкубират в продължение на 10-14 дена, в инкубатор с 8% СО₂, при 37° С. Средата във всички хибридомни ямки се сменя с DMEM, в която има 10 % конски серум (HS), в рамките на 10 дни. Пробите от супернатантата на хибридомната култура се скринират за присъствие на моноклонални антитела (Mabs) към r-hs LDLR, чрез директна ELISA, описана в Пример 3 погоре. Като контроли се използва буфер за анализ и DMEM + 10 % HS, Mab С7 (наличен в търговската мрежа от Amersham) и ΜΙ миши антисерум се използват като положителни контроли, докато моноклонално антитяло към разтворимия р55 TNF рецептор, се използва като отрицателна контрола. Клетките от ямките, в които се детектира присъствието на антитела в културалната супернатанта, се пренасят в 24 ямкови плаки и след това в 25 cm² Т-матраци. Увеличеният брой култури се проверяват за секреция на Mabs към r-hs LDLR . Ампулите с клетки от положителните култури се замразяват и се съхраняват в течен азот.

Общо, приблизително около 1000 култури се скринират за детекция на антитела към г-hs LDLR . 54 култури, с най-висока имунна активност се анализират отново няколко пъти. Пет култури (12, 28, 29, 30 и 50) с най-висока активност, се клонират чрез крайно разреждане в 96 ямковите плаки. Супернатантите от растящите клонове се анализират няколко пъти за антитела към r-hs LDLR , чрез директна ELISA.

Клетките от положителните хибридомни клонове се отглеждат в матраци за тъканни култури в DMEM, съдържаща 15 % конски серум и част от културите се замразяват в ампули. Успоредно, клетки от различни хибридомни клонове се инжектират във всяка от 2^1 мишки, за да се получи асцитна течност. Антителата се пречистват от асцитната течност или чрез преципитация с амониев сулфат, или чрез протеин G колона. Накратко, 7.5 ml от асцитната течност се разрежда 1:3 с 20 тМ фосфатен буфер, pH 7 и се нанася върху 5 ml протеин G колона (С10/10). Колоната се измива с 20 тМ фосфатен буфер, pH 7 и моноклоналните антитела се елуират с 100 шМ глицинов буфер, pH 2.7. pH на елуираната фракция се коригира до 7-7.5 с 1 М Трие буфер, pH 9.3.

Пример 5

Скриниране за двойки от Mabs, за използването им в ELISA и оптимизиране на ELISA параметрите

Моноклоналните антитела, пречистени от асцитните течности, както в Пример 4 по-горе, се използват за провеждане на серия от експерименти в матриксен формат, за да се избере най-подходящата двойка от моноклонални антитела, за да се използват като първи и втори антитела при ELISA сандвич за гhs LDLR, описан в Пример 6 по-долу. Накратко, 96 ямковите плаки се покриват с асцитни течности, получени от пет хибридоми (# 12, 28.28, 29.08, 30 и 50.05), пречистени или чрез преципитация с амониев сулфат или чрез протеин G колона. Антителата се скринират, като се използва формата + 291, така както и + 292 (от аминокиселинен остатък Asp + 4 до Cys + 292) и + 331 (от аминокиселинен остатък Asp + 4 до Cys + 331) форми от r-hs LDLR, получени в СНО клетки като антигени. По един милилитьр от всяко от по-горе частично пречистените Mabs се бележат с биотин, за по-бърз скрининг на тяхната възможност за използването им като втори антитела при ELISA сандвич Накратко, 1.5 mg от пречистените чрез преципитация с амониев сулфат Mabs, се коригират до pH 8.5 с 30 μΐ от 0.5 М NaHCO₃. 0.75 mg от Биотин-OSu N-ХидроксисукцинимидоБиотин (Biotin-OSu, Sigma, Cat. # Hl759, от разтвор от 5 mg в 200 μΐ DMSO), се добавят към разтвора от антитяло и се инкубират в продължение на два часа, на стайна температура с леко разбъркване, последвано от инкубация в продължение на една нощ при 2-8° С. След реакцията, разтворът се нанася върху Sephadex G-25M (Pharmacia Cat. # 17-0851-01) PD10 колона, за разделяне на биотинилираните Mabs и излишъка на нереагиралия биотин-Osu.

Първите предварителни експерименти показват, че моноклоналните антитела 29.08 и 30, произвеждат най-висок сигнал над фона, когато се използват като втори антитела при ELISA.

Реакцията на тези два клона се анализира отново като втори антитела с антитела 12, 28 29.08 и 50, използвани за покриване на плаките. Резултатите от този експеримент ясно показват, че МаЬ 28 е антитялото най-подходящо за покриване.

Най-добри резултати по отношение на сигнален интензитет и специфичност, са получени с МаЬ 28, използван за покриване на микротитьрната плака и МаЬ 29.08, белязано с биотин, като второ антитяло. Като се използват тези моноклонални антитела са получени добри резултати със всичките три форми (+ 291, + 292 и + 331) от г-hs LDLR. С всичките форми, абсорбцията при 492/405 nm е около 1.3 OD.

Трите форми на г-hs LDLR антигена са анализирани в серия от разреждания с концентрации в обхвата от 0.9-1000 ng/ml. Получена е дозо зависима крива с МаЬ 28, използвано за покритие и биотинилираното МаЬ 29.08, като второ антитяло. Тази комбинация дава линеен отговор при концентрации в обхвата от 1-10 ng/ml от r-hs LDLR .

Различните параметри, които могат да повлияят на ELISA теста, такива като концентрация на реагентите, инкубационни периоди, избор на буфери и плаки, са оптимизирани чрез анализ на следните параметри:

• Покриване на микротитьрната ямкова плака с 5-10 pg/ml от МаЬ 28 в PBS.

• Състав на буфера:

а) PBS + Tween 20

б) Трие + Ca⁺² + NaCl + Tween 20 • Блокиращи разтвори:

а) 1% Gelatine в PBS, 0.05 % Tween, 0.005 % Thimerosal

б) 1 % BSA в PBS, 0.05 % Tween, 0.005 % Thimerosal

в) 1 % FBS в PBS, 0.05 % Tween, 0.005 % Thimerosal

г) 1 % Milk в PBS, 0.05 % Tween, 0.005 % Thimerosal

д) I Block, Hy Pep и Hy Yeast • Второ Mab 29.08, белязано c биотин, при концентрации от 1:500, 1:1000, 1:2000, 1:4000, 1:8000, 1:10,000, еквивалентни на концентрационния обхват от 10.74-0.537 pg/ml.

• Концентрации на екстравидин: 1:500, 1:1000, 1:2000,

1:4000, 1:8000, 1:10,000, еквивалентни на концентрационен обхват от 4-0.2 pg/ml.

Въз основа на тези експерименти е създаден окончателният метод за анализ със сандвич ELISA, описан в Пример 6 по-долу.

Пример 6

Създаване на Сандвич ELISA за r-hs LDLR

Създаването на сандвич ELISA за r-hs LDLR се провежда, като се използват моноклонални антитела 28 и 29.08. Накратко, 96 ямкови плаки се покриват с 100 μΐ Mab 28 (5 pg/ml), пречистено през протеин G колона, в продължение на една нощ, при 2-8° С, или в продължение на 3 часа при 37° С. След това плаките се измиват пет пъти с PBS + 0.05 % Tween 20. Плаките се инкубират с 200 μΐ от блокиращия разтвор (PBS + 1 % BSA или Gelatin + 0.05 % Tween 20 + Thimerosal 0.05 %), в продължение на 1 час при 37° С, или в продължение на една нощ, при 4° С и се измиват пет пъти с PBS + 0.05 % Tween 20. По 100 μΐ от пробите или от калибрираната с антиген крива (СНО + 291 r-hs LDLR, 0.5-32 ng/ml, разреден в блокиращ разтвор), се добавят към ямките и се инкубират в продължение на 90 минути, при 37° С, с леко разбъркване. След това плаките се измиват пет пъти с PBS + 0.05 % Tween 20.

Добавят се 100 μΙ/на ямка биотинилирано МаЬ 29.08 (0.67 pg/ml) в блокиращ разтвор и се инкубират при разбъркване в продължение на един час, при 37° С. Плаките се измиват пет пъти с PBS + 0.05 % Tween 20. Към всяка ямка се добавят 100 μΐ от търговския екстравидин, конюгиран с пероксидаза (ExtrAvidin ТМ-Peroxidase BioMakor, Cat # 0645-1), разреден 1:10,000 и се инкубира при разбъркване в продължение на един час, при 37° С. След това плаките се измиват пет пъти с PBS + 0.05 % Tween 20. Към всяка ямка се добавят по 125 μΐ от по-горе споменатият субстратен разтвор и се инкубират за около 10 минути, докато се получи оцветяване с желания интензитет. Реакцията се спира чрез добавяне на 125 μΐ 4Ν НС1. Абсорбцията в 96 ямковите плаки се отчита чрез използване на ELISA апарат, при дължина на вълната 492 и 405 пт и резултатите се изчисляват чрез MultiCalc софтуер с PC компютър, свързан с ELISA апарат.

Пример 7

Изотипни моноклонални антитела

Изотипните Ig моноклонални антитела се определят като се използва търговски кит за изотипове (PharMingen International), съгласно процедурата за анализ от производителя. Клонове 12.6, 28, 29.8 и 30 са идентифицирани като IgGj, докато е намерено, че клон 50.30 е от IgM клас.

Пример 8

SDS-PAGE Western блот анализ

Формата + 291 от пречистения r-hs LDLR и нативният LDLR, пречистен от човешка урина, се анализират чрез western блот анализ с моноклонални антитела, получени срещу r-hs LDLR. Накратко, 12 % SDS полиакриламиден гел се нанася с 100 ng/старт от СНО + 291 форма от r-hs LDLR, или нативен, изолиран от урина hs LDLR, или ТВР-1 суров извлек (като отрицателна контрола), при редуциращи условия (40 mM DTT). В един старт са нанесени маркери с ниски молекулни тегла (LMW). Този набор от проби се пускат пет пъти. Белтъците, разделени в гела се пренасят чрез електроелуция върху нитроцелулозни мембрани. Мембраните се инкубират в PBS, съдържащ 10 % мляко с ниско съдържание на мазнини, 0.1 % Tween 20 в продължение на 16 часа. След това мембраните се нарязват на лентички и всяка лентичка се инкубира в продължение на два часа, на стайна температура с едно от петте избрани моноклонални антитела: 12.6, 30, 50.30, 28 или 29.08 (асцитните течности са разредени 1:4000).

Мембранните лентички се измиват с PBS, съдържащ 1 % Tween 20 (3 х 15 минути) и се инкубират в продължение на един час с второто антитяло-козе анти-мишо, конюгирано с пероксидаза от хрян-алкална фосфатаза (разреждане 1:10,000, BioMakor), за два часа на стайна температура.

Лентичките се измиват с PBS, съдържаш 0.1 % Tween 20 (3 х 15 минути). Положителните ивици се детектират чрез повишена хемилуминесценция (ECL, Amersham).

Моноклоналните антитела # 12.6 и # 29.8, разпознават както уринарната, така също и + 291 формата на пречистения гhs LDLR при western блот анализ (Фигура 2). Моноклоналните антитела 28 и 30 разпознават + 291 формата на пречистения r-hs LDLR.

Пример 9

Подтискане на антивирусната активност на r-hs LDLR чрез моноклонални антитела

Моноклоналните антитела, които реагират специфично с r-hs LDLR се анализират за способността им да блокират антивирусната активност на r-hs LDLR (+ 291 форма) in vitro, като се използва анализ за подтискане на цитопатичния ефект (СРЕ) във VSV/WISH система.

WISH клетките (с произход от човешки амнион) се култивират в МЕМ, с добавка на 10 % FBS и 4 тМ глутамин, в 5 % СО₂ инкубатор при 37° С. Клетките, които са в експоненциален растеж се засяват в 96 ямкови плаки за тъканно култивиране, с плътност от 40, 000 клетки/на ямка, двадесет и четири часа преди да започне анализа. Пробите, които ще се анализират както и стандарта се разреждат и се разпределят в ямките, съдържащи клетките. В ямките се добавя веднага VSV с множествена инфекция (MOI) от 0.5 pfu/на клетка. Плаките се

инкубират в продължение на 16-18 часа при 37° С и след това се измиват с етанол. Монослоят от преживелите клетки се наблюдава чрез оцветяване по Gram с кристал виолет. Количественото определяне на цитопатичния ефект по отношение на стандарта се извършва чрез графика, в която е нанесена плътността на оцветяване срещу стандартната концентрация.

За да се анализира неутрализиращият ефект на антителата, r-hs LDLR се инкубира предварително в продължение на 30 минути, при 37° С, като се повишават концентрациите на асцитната течност от МаЬ за анализ. След това тези разтвори се добавят към културите от WISH клетки в 96 ямкови микротитърни плаки, последвано от добавяне на везикуларен стоматитен вирус (VSV). 18 часа след инкубацията, VSV медиирания клетъчен лизис се определя чрез оцветяване на останалите клетки с кристал виолет. Полу-количественото определяне на цитопатичният ефект по отношение на стандарта се провежда чрез графика, в която е нанесен интензитета на оцветяване (определен чрез ELISA апарат за отчитане) срещу стандартната концентрация.

Ефектът на моноклоналните антитела се анализира като се повишават концентрациите на r-hs LDLR. Както е показано на Таблица 1 се вижда, че две моноклонални антитела Mabs (12.6 и 50.30) притежават неутрализираща активност.

В експеримента показан на таблица 1, инхибиторният ефект на двете моноклонални антитела се анализира при разреждане на асцитните течности 1 : 40. При това разреждане, моноклонално антитяло 12.6 показва малко по-висока активност, отколкото моноклонално антитяло 50.30. Това може да е резултат от свойствата на моноклоналните антитела, така както и от различията в тяхната концентрация в асцитната течност.

Инхибиторният ефект на Mabs може да бъде преодолян чрез повишаване на г-hs LDLR по отношение на концентрацията на Mabs. Фактически, при концентрации на r-hs LDLR от 62.5 U/ml, нито едно моноклонално антитяло няма какъвто и да е ефект върху активността на г-hs LDLR, при анализираната концентрация на антитялото.

Таблица 1

Подтискане на r-hs LDLR антивирусната активност от клонове 12.6 и 50.30 *

VSV/Mab	LDLR Концентрация (U/ml)
0	2.5	12.5	62.5
-VSV	1.5	1.2	1.6	1.5
+ VSV	(0.25)	1	7(1.7)	1.7
+ VSV + Клон 50.30	6 (0.4)	0.88	(1.25)	1.62
+ VSV + Клон 12.6	5 (0.5)	0.77	7 (0.7)	1.67

♦Подтискане на r-hs LDLR антивирусна активност спрямо VSV медииран клетъчен лизис на WISH клетки. Инхибиторният ефект на моноклоналните антитела е определен при разреждане на асцитната течност 1:40. Броят на живите клетки е представен в таблицата с OD стойности. Цифрите в скоби показват проведените повторения при концентрации на LDLR 0 и 12.5 U/ml.

Подтискането на антивирусната активност на r-hs LDLR е определена чрез увеличаване на концентрациите на моноклонални антитела 12.6 и 50.30. Mab 12.6 подтиска антивирусната активност на r-hs LDLR с - 60 %, при разреждане 1:40 (на асцитната течност) и с ~ 35 % при разреждане 1:20, 500. Клон 50.30 подтиска активността на r-hs LDLR с ~ 45 % при разреждане 1:40 и с ~ 15 % при разреждане 1:20, 500.

Дозо-зависимата крива получена с двете моноклонални антитела и наблюдението, че техният инхибиторен ефект е намален при излишък на r-hs LDLR допуска, че моноклоналните антитела упражняват своят ефект чрез свързването си с r-hs LDLR.

Пример 10

Подтискане на репликацията на HCV от моноклонални антитела с

Моноклоналните антитела, специфични за r-hs LDLR се анализират за способността им да инхибират репликацията на HCV в първична култура от човешки хепатоцити. Клетъчната култура FT 167 е получена от пациент, 57 годишен мъж нуждаещ се от лобоктомална ресекция с медицинска цел (метастази от тумор на дебелото черво, десен лоб).

Първичните култури от човешки хепатоцити се приготвят чрез метода на колагеназна перфузия два етапа (Maurel Р. Adv. Drug Del. Rev., 22:105-132 (1996), Pichard L et al., Mol. Pharmacol., 41:1047-1055 (1992), Ferrini JB et al., Chem-Biol Interactions 107:31-45 (1997)). Жизнеността на клетките преди да се засеят се определя чрез използване на тест с трипаново синьо. Четири милиона клетки в 3 ml културална среда се поставят в пластмасови петрига с диаметър 60 mm, предварително покрити с колаген. Свободната от серум културална среда за дълготрайно отглеждане на клетките е със съставките на Williams’E, с добавки, както са публикувани в (Lanford R. et al., In Vitro Cell Dev. Biol., 25:174-182 (1989)). След това тази среда се подменя на всеки 48 часа. Културите се поддържат при 37° С, при влажност на въздуха и 5 % въглероден диоксид. При тези условия на култивиране, човешките хепатоцити запазват своя диференциран фенотип поне за около 35 дни (Ferrini JB et al., Chem-Biol Interactions 107:31-45 (1997)) и са чуствителни към HCV инфекция и дават възможност да се реплицира вирусния геном (Fournier С. et al., J. Gen. Virol., 79:2367-2374 (1998)).

Положителна HCV серумна проба: Създава се банка от човешки серум от пациенти, тестувани с анти-HCV антигялопозитивни чрез EIA HCV 3.0 и Chiron RIBA HCV 3.0 SIA. Нито един от тези пациенти не е ко-инфектиран с HBV или HIV. Във всяка серумна проба се определя количеството на HCV РНК чрез Roche монитор и се генотипира чрез анализ на линейна проба (Inno-Lipa HCV II, Innogenetics). Серумните проби се съхраняват при - 80° С, като малки аликвоти, с цел да се избегнат етапите на замразяване-размразяване. В тези експерименти се използва проба S42 (генотип lb; заразяване с 410,000 копия/ml).

За инфектиране и последващо лечение, хепатоцитните култури се пренасят при стерилни условия в РЗ-лаборатория (специално предназначена за човешки-инфекциозни микроорганизми). Три дни след засяването, когато клетките вече са преодоляли травмата от изолиране, се провежда in vitro заразяване на хепатоцитите, чрез инкубиране за една нощ с 25 μΐ от позитивна-HCV серумна проба (S42) в 3 ml среда. След инфекцията, клетките се измиват три пъти с 3 ml свежа среда и култивирането продължава при нормални условия в средата за култивиране на клетките за дълъг период от време.

Клетките се третират с три различни моноклонални антитела срещу r-hs LDLR, Mab 12.6, Mab 28 и Mab 29.8. Трийсет минути преди заразяването клетките се инкубират с 2 или 8 pg/ml, от различните моноклонални антитела. След това клетките се заразяват както е описано по-горе.

Културите от контролата се заразяват при сходни условия, но в отсъствие на антивирусно третиране. В паралелни експерименти, същите култури се третират с 5000 U/ml EFN-a, при същите условия за сравнение (IFN-a инхибира силно репликацията на HCV в споменатите клетки). Всички третирания се провеждат двукратно.

На петия ден след заразяването, средата се сменя и културите се измиват 3 пъти със студен солеви фосфатен буфер. РНК се пречиства от 4 х 10⁶ хепатоцити, като се използва метода гуанидин изотиоцианат-кисела фенолна екстракция (Chomczynski PN., and Sacchi N., Analyt. Biochem., 162:156-159 (1987)). Преципигираната РНК се разтваря в 50 μΐ диетилпирокарбонат (ПЕРС)-третирана вода и се определя количеството и. Един pg от клетъчната РНК се анализира чрез стандартен верижно-специфичен rTth RT-PCR анализ.

За да се избегне възможна контаминация, верижноспецифичния RT-PCR анализ се провежда последователно, като се използват три различни стаи: предхождаща-PCR стая, PCR стая и пост-PCR стая. РНК разтворена в 10 pl DEPC-третирана вода се покрива с минерално масло и се нагрява при 95° С за 1 минута. Температурата се понижава до 70° С и се добавя предварително нагрятата реакционна смес с кДНК. След това температурата се понижава до 60° С в продължение на 2 минути за да стане хибридизация и се провежда кДНК реакция в продължение на 20 минути, при 70° С, като се използва rTth ДНК полимераза (Perkin-Elmer). Температурата се поддържа при 70° С, докато не се добавят 40 pl от предварително нагретия буфер, съдържащ EGTA като хелатен агент за Мп²⁺, за да подтисне активността на rTth RT. Епруветките с реакционната смес се държат на 70° С, докато не се добави 40 μΐ от предварително нагрятата PCR смес. PCR условията, провеждани с Gene Amp ® PCR-System 9600 (Perkin-Elmer), включват начален цикъл при 94° С за 1 минута, 50 цикъла при 94° С за 15 секунди, 58° С за 30 секунди, 72° С за 30 секунди и накрая продължителен етап при 72° С за 7 минути. За положително верижен HCV РНК анализ, нуклеотидната секвенция на обратния праймер РЗ е:

5’ - TGG/ATGCACGGTCTACGAGACCTC - 3’ (nt 342320), а на праймера Р4 за правата реакция е:

5’ - CACTCCCCTGTGAGGAACT - 3’, (nt: 38-56), (Laskus Т et al., J. Gen. Virol., 78:2747-2750 (1997)). Същите праймери се използват в обратен ред за детектиране на отрицателната верига. Една десета от амплифицирания продукт се анализира чрез гел електрофореза в агароза (2 %), последвана от оцветяване с ВЕТ и фотографиране под UV светлина. Във всички серии експерименти, се правят разреждания на синтетичните HCV РНК (+) и (-) вериги и се добавя 1 pg тотална РНК от черен дроб, за да наподобяват условията за анализ на култивирани хепатоцити. Тези смеси се използват като положителни контроли за RT-PCR опита и анализа.

Фигура 3 показва, че продукцията на отрицателна HCV верига, в присъствие на моноклонални антитела срещу LDLr, е напълно подтисната във FT 167 култура. Следователно, репликацията на вирусния геном е силно подтисната. Резултатите са съвместими с представата, че LDLR може да е рецептор за HCV.

Пример 11

Получаване на химерни антитела за LDLR

От хибридомна линия, произвеждаща моноклонално антитяло гпАЬ за LDLR, се пречиства иРНК.

Като се използва пречистената иРНК като матрица, се синтезира специфична кДНК с олигонуклеотиди, комплиментарни на 5’ края на екзон СН1 от тежката верига на вариабелния домен (олиго 1) и от 5 ’ края на Ckhexon от леката верига на вариабелния домен (олиго 2).

Получават се две кДНКи, една от които кодира вариабелната област (специфична за LDLR) от тежката верига, а другата, вариабелната област (специфична за LDLR) от леката верига. Тези кДНК-и се клонират и се секвенират.

За конструирането на химерната тежка верига, вариабелната област на клонирания човешки Ig ген за тежката верига се заменя (като се използват генетични манипулации) с клонирана ДНК, кодираща мишия вариабелен домен (специфичен за LDLR) от тежката верига. Генетичните манипулации включват изрязване на вариабелната област от човешкия Ig, като се използват специфични рестриктазни ензими и лигиране на мишата вариабелна област. Същата процедура се провежда за получаване на химерната лека верига.

Конструират се два експресионни плазмида от бозайник, един включващ химерния тежко верижен ген и друг, включващ химерния леко верижен ген. И двата вектора се използват за котрансфекция на хибридомната клетъчна линия (SP6).

Продукцията на LDLR специфичен Ig се анализира чрез ELISA или western блот, като се използва културална среда от трансфектирани клетки като второ антитяло. Афинитетът на химерното антитяло към неговия лиганд се контролира чрез Biacore.

Пример 12

Получаване на трансгенни мишки, които са създадени да съдържат човешки имуноглобулинов генен локус (xenomice) и получаване на човешко mAb срещу h LDLR

Получаването на xenomice е описано във WO 98/24893 и Mendez М, J. et al.„ Nature genetics, 15:146-56 (1997).

Скринира се библиотека от изкуствена човешка-дрождева хромозома (YAC) за YACs, съдържащи тежката верига от човешката вариабелна област (около 1000 kb) (методът за клониране на YAC е предпочитан метод, когато е необходимо да се вмъкне фрагмент по-голям от 100 kb).

YACs се характеризират чрез Southern блот анализ и чрез пулсова електрофореза (PFGE). YACs трябва да включват Ср С8, Dh и Vh области в конфигурацията на зародишната линия.

Чрез използване на припокриващи се секвенции съдържащи се във YACs, YACs се рекомбинират в дрожди чрез стъпаловидна рекомбинантна стратегия. Преди рекомбинация, 3’ края на YAC (с V областта) се лигира с HPRT селективен маркер. Структурата на рекомбинантпият YAC се потвърждава чрез PFGE и Southern блот анализ (присъствие на локус от човешката тежка верига от С област до Vh област в зародишна конфигурация).

Ацентричното YAC рамо е прицелно място за вектор, носещ пълната γ2 константна област, миши енхансер, неомицин устойчив ген, за да се получи крайната тежка верига, съдържаща цялата вариабелна област, т.е. 82 Vh гена, 6 Лт гена и 3 различни константни области Ср С5 Су, съотвегно с техните регулаторни секвенции. Този YAC е означен като уН2. Този конструкт се използва за получаване на X enomouse.

Сходна стратегия като тази използвана по-горе се използва за реконструкция на kappa локуси, само че: селективният неомицинов маркер се лигира с реконструирания YAC, съдържащ целите kappa локуси. Този YAC се означава като уК2.

YACs съдържащи уН2 се въвеждат в ES клетка чрез сливане на YAC, съдържащ дрождеви сферопласти с дефицитни по HPRT, E14.TG3B миши ES клетки. Избират се HPRT позитивни клетки. Позитивните клонове се размножават и се анализират чрез Southern блот и CHEF блот анализ. Избират се клоновете съдържащи интактен уН2 YAC.

Въвеждането и селекцията на уК2 YAC в ES клетки се провежда по подобен начин, както е описан за уН2 YAC.

YH2 съдържащите ES клетки се инжектират в миши C57BL/6J бластоцити. Получените мъжки химери се оценяват за предаване по зародишен път на потомството.

уН2 и или уК2-трансгенните мишки се кръстосват с DI мишки (хомозиготни за прицелния инактивиран ген за миши локуси за тежката и kappa вериги). Всяка от yH2;DI трансгенниге линии се кръстосва с yK2;DI трансгенна линия, за да се получат Xenomouse линии.

Реконструирането в развитието на В-клетки и получаване на антитяло в Xemmoise, се оценява чрез поточна цитометрия и ELISA.

Имунизацията на xenomouse се провежда както е описано в Пример 2.

Методите за получаване на хибридома и скриниране на позитивни клонове са сходни с тези, описани в Примери 3 и 4.

Хибридомните клонове 12.6, 28, 29.8, 30 и 50.30 са депозирани в Collection Nationale de Culture de Microorganismes (CNCM), Институт Пастьор, Париж, съгласно Договора от Будапеща и са предложени респективно с депозитарни №-ра I2390,1-2391,1-2392,1-2393 и 1-2394.

Claims

ПАТЕНТНИ ПРЕТЕНЦИИ

1) Моноклонално антитяло, химерно антитяло, наподобяващо напълно човешкото антитяло, анти.анти-ID антитяло или техни фрагменти, които разпознават специфично и се свързват с човешки LDL рецептор и негови фрагменти, освен моноклонално антитяло С7.
2. Моноклонално антитяло съгласно Претенция 1, което разпознава специфично и се свързва с човешкия разтворим LDL рецептор.
3. Моноклонално антитяло съгласно Претенция 1, което е МаЬ, експресирано от хибридомен клон 12.6, депозиран в CNCM под №1-2390.
4. Моноклонално антитяло съгласно Претенция 1, което е МаЬ, експресирано от хибридомен клон 28, депозиран в CNCM под № 1-1291.
5. Моноклонално антитяло съгласно Претенция 1, което е МаЬ, експресирано от хибридомен клон 29.8, депозиран в CNCM под №1-2392.
6. Моноклонално антитяло съгласно Претенция 1, което е МаЬ, експресирано от хибридомен клон 30, депозиран в CNCM под №1-2393.
7. Моноклонално антитяло съгласно Претенция 1, което е МаЬ, експресирано от хибридомен клон 50.30, депозиран в CNCM под №1-2393.
8. Моноклоналните антитела съгласно която и да е от Претенции от 3 - 7, спадат към имуноглобулинов изотип IgGj или IgM.
9. Метод за детекция и/или количествено определяне на човешки LDLR, характеризиращ се с това, че включва използването на моноклонално антитяло, съгласно всяка една от предишните претенции.
10. Моноклонални антитела съгласно Претенция 1, които могат да се използват като двойка при ELISA.
11. Моноклонални антитела съгласно Претенция 10, които са моноклонални антитела, получени от хибридомен клон 28 или от клон 29.8.
12. Моноклонални антигена съгласно Претенция 1, способни да идентифицират LDLR чрез Western блот анализ.
13. Моноклонални антигена съгласно Претенция 12, които са моноклонални антитела, получени от хибридомен клон 12.6, клон 28, клон 29.8 или от клон 30.
14. Моноклонални антитела съгласно Претенция 1, способни да неутрализират антивирусната биологична активност на r-hs LDLR.
15. Моноклонални антитела съгласно Претенция 14, които са моноклонални антитела, получени от хибридомен клон 12.6 или от клон 50.30.
16. Моноклонални антитела съгласно Претенция 1, способни да подтискат репликацията на хепатит С вирус.
17. Моноклонални антитела съгласно Претенция 16, които са моноклонални антитела, получени от хибридомен клон 12.6, клон 28 или от клон 29.8.
18. Хибридомният клон 12.6 е депозиран в CNCM под № 1-2390.
19. Хибридомният клон 28 е депозиран в CNCM под № I2391.
20. Хибридомният клон 29.8 е депозиран в CNCM под № 1-2392.
21. Хибридомният клон 30 е депозиран в CNCM под № I2393.
22. Хибридомният клон 50.30 е депозиран в CNCM под №

1-2393.
23. Метод за получаване на моноклонално антитяло съгласно Претенция 1, характеризиращ се с това, че включва растеж на клонирана хибридома, включваща клетка от далак на бозайник, имунизиран с hs LDL и хомогенна или хетерогенна лимфоидна клетка в течна среда или в корем на бозайник, за да може хибридомата да произвежда и акумулира моноклоналното антитяло.
24. Метод съгласно Претенция 21, характеризиращ се с това, че имуногенът LDLR е силно пречистен човешки LDLR.
25. Метод за пречистване на човешки LDLR, характеризиращ се с това, че включва контактуване на материала съдържащ човешки LDLR с моноклонално антитяло, съгласно която и да е от Претенции от 1 - 8.