KR20230123066A - 구제역바이러스 구조단백질 vp0 부위에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 이들의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 구제역바이러스 VP0 단백질 및 이에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 본 발명의 구제역바이러스 VP0 단백질을 이용하는 경우, 구제역바이러스 VP4 및 VP2 구조단백질에는 결합하지 않고, 구제역바이러스의 조립 과정과 복제에 중요한 역할을 하는 VP0 전구체 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제조할 수 있으므로, 구제역의 예방 또는 치료와 구제역바이러스의 검출에 유용하게 사용될 수 있고, VP0의 절단 메커니즘, 숙주세포 내 이동 경로 등 구제역바이러스의 분자생물학적 메커니즘을 분석하는 데 유용하게 적용될 수 있다.

Description

구제역바이러스 구조단백질 VP0 부위에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 이들의 용도 {Antibody or antigen binding fragment thereof specifically binding to structural protein VP0 site of foot-and-mouth disease virus and uses thereof}
본 발명은 구제역바이러스의 외피를 구성하는 단백질들 중 VP0 부위에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 이들의 용도에 관한 것이다.
구제역(foot-and-mouth disease)은 우제류 동물에서 바이러스 감염으로 고열, 수포 등의 증상을 나타내며 어린 가축에서는 폐사를 일으키는 국내 제1종 법정 가축전염병이다. 국내에서는 2000년 이후로 8회 발생하였으며 2010년-2011년 발생 시에는 무려 약 3조원의 직접적인 경제적 피해를 초래하기도 하였다.
구제역바이러스(foot-and-mouth disease virus, FMDV) 입자는 총 4개의 단백질(VP1, VP2, VP3, VP4)로 구성되어 있고, 통상적으로 구조 단백질로 명칭한다. 바이러스가 세포에서 증식할 때 생성되는 상기 4개의 단백질들이 1개씩 모여서 프로토머(protomer, 기본단위체)를 형성하였다가 프로토머 5개가 모여서 펜타머(pentamer, 오량체)를 형성한다. 그 후, 펜타머 12개가 모여서 미성숙 단계의 구제역바이러스 입자를 형성하고, 구제역바이러스 RNA가 외피 안으로 들어가는 단계에서 VP0 전구체가 VP2와 VP4로 절단되면 완전한 형태의 구제역바이러스 입자가 만들어지는 것이다.
그러나, 이렇게 VP0가 VP2와 VP4로 절단되는 메커니즘은 여전히 불분명하다. 바이러스 조립 과정에서의 구조적 역할 외에도, VP0는 구제역바이러스의 특정 유전자에 결합하는 단백질(PCBP2, poly (rC) binding protein 2)과 세포 내 인터페론 신호전달체계를 조절하여 구제역바이러스 복제를 증가시키는 역할을 수행하기도 한다.
이러한 세포 내 구제역바이러스의 복제 과정에서 VP0의 정확한 역할을 규명하거나 바이러스 외피 조립단계에서 VP0가 VP4 및 VP2로 절단되는 기전을 밝히려면, VP0에 결합하는 항체가 필수적인데 현재까지는 VP2 항체만을 사용해서 간접적으로 VP0의 존재 유무를 확인할 뿐, VP2 및 VP4에는 결합하지 않고 VP0에만 선택적으로 결합하는 항체는 아직까지 전 세계적으로 개발된 바 없다. 또한, 구제역바이러스가 속하는 피코르나바이러스 계열(Picornaviridae family)의 다른 바이러스들에서도 마찬가지로 VP0에 특이적으로 결합하는 항체를 개발한 사례가 보고된 바 없다.
등록특허 제10-0737446호(등록일자 2007년 07월 03일)
본 발명자들은 구제역바이러스의 조립 과정에서 구조적 역할을 하는 동시에 숙주세포 내 인터페론 신호전달체계 조절을 통해 구제역바이러스 복제를 촉진하는 역할을 하는 VP0 전구체를 표적으로 한 구제역의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 구제역바이러스 VP4 구조단백질의 카르복실 말단 아미노산 잔기와 VP2 구조단백질의 아미노 말단 아미노산 잔기를 연결한 VP0 펩타이드를 합성하고, 이를 에피토프로 포함하는 신규한 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 구제역바이러스 VP4 및 VP2 구조단백질에는 결합하지 않고 구제역바이러스 VP0 단백질에 특이적으로 결합함을 규명함으로써, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 구제역바이러스 VP0 단백질을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 구제역바이러스 VP0 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 구제역의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 구제역바이러스 검출용 조성물 또는 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체를 생산하는 하이브리도마 세포, 또는 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 구제역바이러스 VP0 단백질을 제공한다.
본 발명자들은 구제역바이러스의 조립 과정에서 구조적 역할을 하는 동시에 숙주세포 내 인터페론 신호전달체계 조절을 통해 구제역바이러스 복제를 촉진하는 역할을 하는 VP0 전구체를 표적으로 한 구제역의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 구제역바이러스 VP4 구조단백질의 카르복실 말단 아미노산 잔기와 VP2 구조단백질의 아미노 말단 아미노산 잔기를 연결한 VP0 펩타이드를 합성하고, 이를 에피토프로 포함하는 신규한 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 구제역바이러스 VP4 및 VP2 구조단백질에는 결합하지 않고 구제역바이러스 VP0 단백질에 특이적으로 결합함을 규명하였다.
본 명세서에서, 용어 "구제역 (foot-and-mouth disease, FMD)"은 반추동물 및 돼지를 포함하는 발굽이 갈라진 동물 또는 우제류 동물에서 발생하는 수포성 질환을 의미한다.
본 명세서에서, 용어 "구제역바이러스 (foot-and-mouth disease virus, FMDV)"는 피코르나바이러스과 (Picornaviridae family) 아프타바이러스속 (Aphthovirus genus)에 속하는 양성 단일-가닥 RNA 바이러스로, 구제역의 발병 원인이 되는 병원체를 의미한다.
구제역바이러스의 양성 단일-가닥 RNA는 단일의 다단백질(polyprotein)을 암호화하며, 다단백질은 세 개의 바이러스 단백질분해효소 L, 2A 및 3C에 의해 폴리펩타이드 산물인 P1, P2 및 P3로 가공된다. 폴리펩타이드 P1은 구조단백질인 VP1 내지 VP4로 구성되고, 폴리펩타이드 P2는 비구조단백질인 2A, 2B 및 2C, 폴리펩타이드 P3는 비구조단백질인 3A, 3B, 3C 및 3D로 구성된다.
구제역바이러스 입자는 4개의 구조단백질(VP1, VP2, VP3, VP4)로 구성된 외피에 약 8,500개 염기의 단일가닥 RNA가 들어있는 형태이다. 바이러스 외피는 단계적 과정으로 조립되는데 단백질 VP0, VP3 및 VP1이 각각 1개씩 모여서 프로토머가 되고 5개의 프로토머가 모여서 펜타머를 구성하며 마지막으로 12개의 펜타머가 모여서 바이러스 외피를 구성한다. 구제역바이러스 입자가 만들어지는 최종 단계에서 구제역바이러스 RNA가 바이러스 외피 안으로 들어가는 단계와 동시에 VP0 전구체가 VP2 및 VP4로 절단되면서 최종적으로 온전한 형태의 구제역바이러스 입자를 이룬다. 그러나, VP0 전구체가 VP2와 VP4로 절단되는 메커니즘은 여전히 불분명하다.
위에서 살펴본 VP0의 바이러스 조립 과정에서의 구조적 역할 외에도 VP0는 구제역바이러스의 특정 유전자에 결합하는 단백질(PCBP2)과 세포 내 인터페론 신호전달체계를 조절하여 구제역바이러스의 세포 내 증식을 상승시킨다는 효과가 보고된 바 있다.
이러한 세포 내 구제역바이러스의 복제 과정에서 VP0의 정확한 역할을 규명하거나 바이러스 외피 조립 단계에서 VP0가 VP4 및 VP2로 절단되는 기전을 밝히기 위해, 세포 내 VP0 단백질의 이동 경로 분석 등에 대한 심층 있는 연구를 진행하려면 VP0에 특이적으로 결합하는 항체가 필요하다.
그러나, 현재까지는 VP0에만 특이적으로 결합하는 단일클론 항체는 전 세계적으로 개발된 바가 없고, VP2에 대한 항체만이 알려져 있어, VP2에 대한 항체만을 사용해서 간접적으로 VP0의 존재 유무를 유추하고 있는 실정이다. 따라서, 본 발명자들은 이에 착안하여 VP2와 VP4에는 결합하지 않고/반응하지 않고 VP0에만 선택적으로/특이적으로 결합하는 항체를 성공적으로 제작하여 본 발명을 완성하였다.
본 명세서에서, 용어 "VP0 단백질"은 VP2 및 VP4의 절단 전구체를 의미한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 VP0 단백질은 구제역바이러스 VP4 구조단백질의 카르복실 말단 아미노산 잔기 및 VP2 구조단백질의 아미노 말단 아미노산 잔기가 연결된 것이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 VP0 단백질은 아미노 말단에 KLH 펩타이드를 추가로 포함한다.
상기 KLH 펩타이드는 면역능을 향상시키기 위해서 상기 VP0 단백질의 아미노 말단에 결합된다. 상기 KLH 펩타이드는 Lys-Leu-His 펩타이드이다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 VP0 단백질의 아미노 말단 및 상기 KLH 펩타이드는 시스테인(Cys)으로 연결된다.
상술한 아미노산 잔기들 사이의 연결은 펩타이드 결합에 의해 이루어지며, 당업계에 공지된 분자생물학적 방법, 화학적 합성 방법 등에 따라 실시될 수 있다(Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85: 2149-54(1963); Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd. ed., Pierce Chem. Co.: Rockford, 111(1984)).
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 구제역바이러스 VP0 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
본 명세서에서, 상기 구제역바이러스 VP0 단백질에 특이적으로 결합하는 항체는 항-VP0 항체 (anti-VP0 antibody)로 약칭될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 구제역바이러스 i) VP2, ii) VP4, 또는 iii) VP2 및 VP4 구조단백질에 결합하지 않는다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 구제역바이러스는 O, A, Asia1, C, SAT1, SAT2 및 SAT3로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 혈청형(serotype)이다.
본 명세서에서, 용어 "혈청형(serotype, serovar)"은 다른 개체와 교차-반응을 나타내지 않거나, 또는 16 이상의 동종 또는 이종 역가 비율을 나타내는, 특정 항원 또는 항체에 대하여 독특하게 반응하는 성질을 의미한다.
구제역바이러스는 7종의 혈청형인 O, A, Asia1, C, SAT1, SAT2 및 SAT3으로 구성되며, 혈청형간 상호 방어 면역이 형성되지 않는다.
그러나, 본 발명에 따른 구제역바이러스 VP0 단백질은 상이한 혈청형에서도 상동성이 높은 아미노산 서열로 이루어져 있으므로, 상술한 구제역바이러스 VP0 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 이용하는 경우, 구제역바이러스 혈청형 7종의 VP0 단백질을 표적으로 할 수 있다.
본 발명의 다른 일 구현예에 있어서, 상기 구제역바이러스는 O1, A12, A22 및 A24으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 하위혈청형 (subserotype)이다.
본 명세서에서, 용어 "하위혈청형 (subserotype)"은 위에서 정의된 혈정형의 하위 구성을 의미한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 수탁번호 KCLRF-BP-00517인 하이브리도마 세포에서 생산된다. 상기 하이브리도마 세포는 한국세포주연구재단(KCLRF)에 기탁하였다(기탁일: 2022년 1월 26일, 기탁번호: KCLRF-BP-00517).
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 항체의 중쇄 불변 영역은 IgG1 또는 IgG2b이나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 항체의 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다이다. 바람직하게는 상기 항체의 경쇄 불변 영역은 카파이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 중 1개 내지 16개의 아미노산을 에피토프로 포함하는 단일클론 항체, 다중클론 항체, scFv, Fab, F(ab), F(ab)2, scFv-Fc, 미니바디, 다이아바디, 트리아바디, 테트라바디, 이중항체, 다중특이적 항체, 인간항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편이다.
본 명세서에서, 용어 “항체(antibody)”는 구제역바이러스 VP0 단백질에 대한 특이 항체로서, 완전한 항체 형태뿐만 아니라 항체 분자의 항원 결합 단편(antigen binding fragment)을 포함한다.
본 발명의 항체는 당업계에 알려져 있는 다양한 파지 디스플레이(phage display) 방법을 사용하여 생성될 수 있고, [Brinkman et al., 1995, J. Immunol. Methods, 182:41-50]; [Ames et al., 1995, J. Immunol. Methods, 184, 177-186]; [Kettleborough et al. 1994, Eur. J. Immunol, 24, 952-958]; [Persic et al., 1997, Gene, 187, 9-18]; 및 [Burton et al., 1994, Adv. Immunol., 57, 191-280]; WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; 및 WO 95/20401; 및 US 5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780,225; 5,658,727; 5,733,743; 및 5,969,108에 개시된 것을 포함한다.
완전한 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드(이황화) 결합으로 연결되어 있다. 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄 불변 영역은 카파(kappa) 및 람다(lambda) 타입을 가진다(Cellular and Molecular Immunology, Wonsiewicz, M. J., Ed., Chapter 45, pp. 41-50, W. B. Saunders Co. Philadelphia, PA(1991); Nisonoff, A., Introduction to Molecular Immunology, 2nd Ed., Chapter 4,pp. 45-65, sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA (1984) 참조).
본 명세서에서, 용어 “항원 결합 단편(antigen binding fragment)”은 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2, 화학적으로 연결된 F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변 영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 다이설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변 부위 및 경쇄 가변 부위만을 가지고 있는 최소의 항체 조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 PCT 국제 공개특허출원 WO 88/10649, WO 88/106630, WO 88/07085, WO 88/07086 및 WO 88/09344에 개시되어 있다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변 부위와 경쇄 가변 부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chain Fv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 단쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수 분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 또는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.
본 발명에서 항체는 구체적으로 scFv (single-chain variable fragment) 형태이거나 완전한 항체 형태이다. 또한, 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 또는 엡실론(ε) 중의 어느 한 아이소타입으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 불변 영역은 감마1(IgG1), 감마 2(IgG2), 감마 3(IgG3) 및 감마 4(IgG4)이고, 가장 구체적으로는 감마 4(IgG4) 이소타입이다. 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 형일 수 있으며, 바람직하게는 카파 형이다. 따라서, 본 발명의 구체적인 항체는 카파(kappa) 경쇄와 감마 1(gamma 1) 중쇄 또는 감마 2 중쇄를 가지는 scFv 형태 또는 IgG1 또는 IgG2 형태이다.
본 명세서에서, 용어 “중쇄(heavy chain)”는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변 영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VH 및 3개의 불변 영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3를 포함하는 전체길이 중쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다. 또한 본 명세서에서, 용어 “경쇄(light chain)”는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변 영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VL 및 불변 영역 도메인 CL을 포함하는 전체길이 경쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다.
본 명세서에서, 용어 “CDR(complementarity determining region)”은 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 고가변 영역(hypervariable region)의 아미노산 서열을 의미한다(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)). 중쇄(CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3) 및 경쇄(CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3)에는 각각 3개의 CDR이 포함되어 있다. CDR은 항체가 항원 또는 에피토프에 결합하는 데 있어서 주요한 접촉 잔기를 제공한다.
본 명세서에서 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 전장 또는 원래 그대로의 다중클론 또는 단일클론 항체뿐만 아니라, 이의 항원 결합 단편들(예를 들어, Fab, Fab′, F(ab′)2, Fab3, Fv 및 이의 변이체들), 하나 또는 그 이상의 항체 부분을 포함하는 융합 단백질, 인간항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 미니바디, 다이아바디, 트리아바디, 테트라바디, 선형 항체, 단일 체인 항체(scFv), scFv-Fc, 이중특이적 항체, 다중특이적 항체, 필요한 특이성의 항원 인식 부위를 포함하는 면역 글로불린 분자의 다른 변형된 배열형태로서 항체의 글리코실화 변이체, 항체의 아미노산 서열 변이체 및 공유결합으로 변형된 항체를 포함한다. 변형된 항체 및 이의 항원 결합 단편의 구체적인 예에는 나노바디, AlbudAbs, DARTs(dual affinity re-targeting), BiTEs(bispecific T-cell engager), TandAbs(tandem diabodies), DAFs(dual acting Fab), two-in-one antibodies, SMIPs(small modular immunopharmaceuticals), FynomAbs(fynomers fused to antibodies), DVD-Igs(dual variable domain immunoglobulin), CovX-bodies(peptide modified antibodies), 듀오바디 및 triomAbs이 포함된다. 이와 같은 항체 및 이의 항원 결합 단편들의 목록은 상기에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서, 용어 “프레임 워크(Framework)” 또는 “FR”은 초가변 영역(hypervariable region, HVR) 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 나타낸다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4개의 FR 도메인 FR1, FR2, FR3 및 FR4로 구성된다. 따라서, HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH (또는 VL/Vk)에서 다음의 순서로 나타난다:
(a) FRH1(Framework region 1 of Heavy chain)-CDRH1(complementarity determining region 1 of Heavy chain)-FRH2-CDRH2-FRH3-CDRH3-FRH4; 및
(b) FRL1(Framework region 1 of Light chain)-CDRL1(complementarity determining region 1 of Light chain)-FRL2-CDRL2-FRL3-CDRL3-FRL4.
본 명세서에서, 용어 “가변 영역(variable region)” 또는 “가변 도메인(variable domain)”은 항체를 항원에 결합시키는 것과 관련되는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 의미한다. Native 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인(각각 VH 및 VL)은 일반적으로 유사한 구조를 가지며, 각 도메인은 4개의 보존된 프레임워크 영역(framework regions, FR) 및 3개의 초가변 영역 (hypervariable regions, HVR)을 포함한다 (Kindt et al., Kuby Immunology, 제6 판, W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)). 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원-결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 또한, 특정 항원에 결합하는 항체는, 항원과 결합하여 각각 상보적인 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 스크리닝하는 항체로부터, VH 또는 VL 도메인을 사용하여 분리될 수 있다.
본 명세서에서, 용어 “특이적으로 결합한다” 또는 이와 같은 것은, 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 scFv와 같은 다른 구성물이 생리적 조건 하에서 비교적 안정한 항원과 복합체를 형성한다는 것을 의미한다. 특이적 결합은 적어도 약 1 x 10-6 M 이하(예컨대, 9 x 10-7 M, 8 x 10-7 M, 7 x 10-7 M, 6 x 10-7 M, 5 x 10-7 M, 4 x 10-7 M, 3 x 10-7 M, 2 x 10-7 M, 또는 1 x 10-7 M), 바람직하게는 1 x 10-7 M 이하(예컨대, 9 x 10-8 M, 8 x 10-8 M, 7 x 10-8 M, 6 x 10-8 M, 5 x 10-8 M, 4 x 10-8 M, 3 x 10-8 M, 2 x 10-8 M, 또는 1 x 10-8 M), 보다 바람직하게는 1 x 10-8 M 이하(예컨대, 9 x 10-9 M, 8 x 10-9 M, 7 x 10-9 M, 6 x 10-9 M, 5 x 10-9 M, 4 x 10-9 M, 3 x 10-9 M, 2 x 10-9 M, 또는 1 x 10-9 M)의 평형 해리 상수(예를 들어, 이보다 작은 KD는 보다 단단한 결합을 나타냄)로 특성화될 수 있다. 2개의 분자가 특이적으로 결합하는지 여부를 결정하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 평형 투석, 표면 플라스몬 공명 등을 포함한다.
본 명세서에서, 용어 “친화도(Affinity)”는 분자(예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 그 결합 파트너(예를 들어, 항원) 사이의 비공유 상호 작용의 총합의 강도를 의미한다. 달리 명시하지 않는 한, 본원에 사용된 바와 같이, “결합 친화력(binding affinity)”은 결합 쌍(예를 들어, 항체 및 항원)의 구성원 간의 1:1 상호 작용을 반영하는 내인성(intrinsic) 결합 친화력을 나타낸다. 분자 Y와 그의 파트너 Y의 친화도는 일반적으로 해리 상수 (Kd)로 나타낼 수 있다. 친화도는 본원에 기술된 것들을 포함하여 당업계에 공지된 통상적인 방법에 의해 측정될 수 있다.
또한 본 명세서에서, 용어 “인간 항체(human antibody)”는 인간 또는 인간 세포에 의해 생성된 항체, 또는 인간 항체 레퍼토리(repertoires) 또는 다른 인간 항체 코딩 서열을 이용하는 비인간 근원으로부터 유래된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 보유한다. 인간 항체의 이러한 정의는 비인간 항원 결합 잔기를 포함하는 인간화(humanized) 항체를 배제한다.
본 명세서에서, 용어 “키메라(chimeric)” 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 근원(source) 또는 종(species)으로부터 유래되고, 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지가 상이한 근원 또는 종에서 유래한 항체를 의미한다.
본 명세서에서, 용어 “인간화 항체”란, 비-인간(예를 들어, 마우스) 항체의 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메릭 면역글로불린, 그의 면역글로불린 쇄 또는 단편(예를 들어 Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 다른 항원-결합 하위서열)이다. 대부분의 경우에, 인간화 항체는 수용자의 상보성-결정 영역(CDR)의 잔기가, 목적하는 특이성, 친화성 및 능력을 갖는 비-인간 종(공여자 항체), 예를 들어 마우스, 랫트 또는 토끼의 CDR의 잔기에 의해 대체된 인간 면역글로불린(수용자 항체)이다. 일부의 경우에, 상기 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역(framework region, FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기에 의해 대체된다. 또한, 인간화 항체는 수용자 항체에서도 또는 수입된 CDR 또는 프레임워크 서열에서도 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 성능을 추가로 개선 및 최적화하기 위해 이루어진다. 일반적으로, 상기 인간화된 항체는 적어도 하나, 및 전형적으로 2개의 실질적으로 모든 가변 도메인을 포함할 것이며, 상기 도메인에서 상기 CDR 영역의 전부 또는 실질적 전부는 비-인간 면역글로불린의 CDR 영역에 상응하고, 상기 FR 영역의 전부 또는 실질적 전부는 인간 면역글로불린의 FR 영역의 서열을 가진다. 상기 인간화 항체는 면역글로불린 불변 영역(Fc region)의 적어도 일부 내지 실질적인 인간 면역글로불린의 불변 영역(Fc region)서열을 포함한다.
상기 변이체는 “실질적 유사성”을 가지는 것으로, 2개의 펩타이드 서열이 디폴트 갭 가중치를 사용하는 프로그램 GAP 또는 BESTFIT에 의해서와 같이 최적으로 정렬되는 경우에 적어도 약 90%의 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 95%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 공유함을 의미한다. 바람직하게는, 동일하지 않은 잔기 위치는 보존적 아미노산 치환에 의해 상이하다. “보존적 아미노산 치환”은 아미노산 잔기가 유사한 화학적 특성(예: 전하 또는 소수성)을 갖는 측쇄(R 기)를 갖는 또 다른 아미노산 잔기에 의해 치환된 것이다. 일반적으로, 보존적 아미노산 치환은 단백질의 기능성을 실질적으로 변화시키지 않는다. 2개 이상의 아미노산 서열이 보존적 치환에 의해 서로 상이한 경우에, 유사성의 퍼센트 또는 정도는 치환의 보존적 성질을 보정하기 위해 상향 조절될 수 있다.
이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 갖으며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.
변이를 도입하는 데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스(hydropathy index)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 아이소루이신(+4.5); 발린(+4.2); 루이신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스타인(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글라이신(-0.4); 쓰레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 타이로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파르테이트(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 라이신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5).
단백질의 상호적인 생물학적 기능(interactive biological function)을 부여하는 데 있어서 소수성 아미노산 인덱스는 매우 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산 사이에서 치환을 한다.
한편, 유사한 친수성 값(hydrophilicity value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 초래한다는 것도 잘 알려져 있다. 미국 특허 제4,554,101호에 개시된 바와 같이, 다음의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌(+3.0); 라이신(+3.0); 아스팔테이트(+3.0± 1); 글루타메이트(+3.0± 1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글라이신(0); 쓰레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5 ± 1); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 루이신(-1.8); 아이소루이신(-1.8); 타이로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 트립토판(-3.4).
친수성 값을 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 친수성 값 차이를 나타내는 아미노산 사이에서 치환을 한다.
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.
본 발명의 구제역바이러스 VP0 단백질에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 상술한 아미노산 서열에 대하여 소폭의 변화, 즉, 3차 구조 및 항체의 기능에 거의 영향을 미치지 않는 변형을 포함하는 항-VP0 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 따라서 어떤 구현예의 경우 상술한 서열과 일치하지 않더라도 적어도 100%, 93%, 95%, 96%, 97%, 또는 98% 이상의 유사성을 가질 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 구제역바이러스 VP0 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 상술한 서열의 CDR을 포함하는 중쇄가변영역 및 경쇄가변영역을 포함하는 단일클론 항체, 이중특이적 항체, 다중특이적 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단일 체인 항체(scFv), Fab 단편, F(ab')단편, 다이설파이드-결합 Fvs(sdFV) 및 항-이디오타입(항-Id) 항체, 그리고 상기 항체들의 에피토프-결합 단편 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 구현예에서 본 발명의 구제역바이러스 VP0 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항-VP0 scFv이다.
상술한 바와 같이, 구제역바이러스 VP2 단백질에 결합하는 항체는 여러 연구자들이 발표하였다. 그러나 VP2나 VP4에는 결합하지 않고 VP0에만 특이적으로 결합하는 항체는 보고된 사례가 없다. VP2와 VP4 아미노산 서열에 대한 면역원성을 분석한 결과에 따르면 면역반응성이 높은 부위가 VP2의 아미노 말단 아미노산 잔기 부위로 알려져 있고, 실제로 대부분의 VP2 결합 항체들이 그 부위에 결합하는 것으로 보고되었다.
또 다른 예로서 휴먼 파레코바이러스(human parechovirus, 피코르나바이러스의 일종)에서 VP0 항체를 개발하고자 VP0 단백질을 마우스에 접종하여 단일클론 항체를 생산하였으나, 실제로는 VP2 부위에 결합하는 항체로 판명난 사례도 있다. 그만큼 VP0에 특이적인 항체를 선발하는 것이 용이하지 않은 상황이었다.
따라서, VP0 전체 단백질을 적용해서는 VP2나 VP4에 결합하지 않고 VP0에만 결합하는 항체를 선발하는 것이 어렵기 때문에 VP4와 VP2가 연결되는 부위의 펩타이드를 합성하여 마우스에 접종하는 방식으로 본 발명자들은 단일클론 항체를 제작하였다. 예상하기로는 본 발명자들이 사용한 펩타이드의 VP2 부위가 면역원성이 매우 놓은 부위로 알려져 있어 VP2 결합 항체가 만들어질 것으로 예상하였으나, 의외로 VP2나 VP4에 결합하지 않고 VP0에만 결합하는 항체를 선발할 수 있었다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 구제역바이러스 VP0 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다.
본 명세서에서, 용어 “핵산 분자”는 DNA (gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).
본 발명의 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 구성하는 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열인 것으로 족하며, 어느 특정 뉴클레오타이드 서열에 한정되지 않는다는 것은 당업자에게 자명하다.
이는 뉴클레오타이드 서열의 변이가 발생하더라도 변이된 뉴클레오타이드 서열을 단백질로 발현하면 단백질 서열에서 변화를 가져오지 않는 경우도 있기 때문이다. 이를 코돈의 축퇴성이라고 한다. 따라서 상기 뉴클레오타이드 서열은 기능적으로 균등한 코돈 또는 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈 (예를 들어, 코돈의 축퇴성에 의해, 아르기닌 또는 세린에 대한 코돈은 여섯 개이다), 또는 생물학적으로 균등한 아미노산을 코딩하는 코돈을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 구성하는 아미노산 서열을 코딩하는 본 발명의 핵산 분자는 이와 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인(align)하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 60% 이상의 상동성(예컨대 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 또는 69%), 보다 구체적으로는 70% 이상의 상동성(예컨대 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 또는 79%), 보다 더 구체적으로는 80% 이상의 상동성(예컨대 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 또는 89%), 보다 더욱더 구체적으로는 90% 이상의 상동성(예컨대 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%), 가장 구체적으로는 95% 이상의 상동성(예컨대 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%)을 나타내는 서열을 의미한다. 상기 60% 이상 100% 이하의 모든 정수 및 이 사이에 존재하는 소수는 % 상동성과 관련하여 본 발명의 범위 내에 포함된다.
서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482(1981); Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp. Appl. BioSci. 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24:307-31(1994)에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10(1990))은 NCBI (National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷상에서 blastp, blastn, blastx, tblastn 및 tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLAST는 NCBI 웹사이트의 BLAST 페이지를 통하여 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 NCBI 웹사이트의 BLAST help 페이지에서 확인할 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 구제역바이러스 VP0 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 명세서에서, 용어 “벡터"는 숙주세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단으로 플라스미드 벡터; 코즈미드 벡터; 그리고 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터같은 바이러스 벡터 등을 포함하나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 벡터에서 중쇄 가변영역을 코딩하는 핵산 분자 및 경쇄 가변영역을 코딩하는 핵산 분자는 프로모터와 작동적으로 결합(operatively linked)되어 있다.
본 명세서에서, 용어 "작동적으로 결합된(operatively linked)"은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 번역을 조절하게 된다.
본 발명의 재조합 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터, beta-액틴 프로모터, 사람 헤로글로빈 프로모터 및 사람 근육 크레아틴 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터, HSV의 tk 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, HIV의 LTR 프로모터, 몰로니 바이러스의 프로모터 엡스타인 바 바이러스(EBV)의 프로모터 및 로우스 사코마 바이러스(RSV)의 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
본 발명의 벡터는 그로부터 발현되는 항체의 정제를 용이하게 하기 위하여, 다른 서열과 융합될 수 있다. 융합되는 서열은 예컨대, 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질(NEB, USA), FLAG(IBI, USA) 및 6x His(hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있으나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 벡터에 의해 발현되는 단백질이 항체이기 때문에, 정제를 위한 추가적인 서열 없이도, 발현된 항체는 단백질 A 컬럼 등을 통하여 용이하게 정제될 수 있다.
한편, 본 발명의 발현 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자, 예를 들어, 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 제네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자를 포함할 수 있다.
선택적으로, 상기 벡터는 리포터 분자(예: 루시퍼라아제 및 -글루쿠로니다아제)를 코딩하는 유전자를 추가적으로 운반할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 발현 벡터는 상기 항-VP0 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 인코딩하는 핵산 분자가 삽입된 벡터로서, 상기 핵산 분자의 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 결합되어 있고, 숙주세포에서 RNA 분자를 형성시키는 프로모터 및 숙주세포에서 작용하여 RNA 분자의 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 폴리 A 시그널 서열을 포함하는 숙주세포 발현용 재조합 벡터이다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 재조합 벡터를 포함하는, 분리된 숙주세포를 제공한다.
본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지되어 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, 상기 벡터의 적합한 진핵세포 숙주세포는 이스트(Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포, 원숭이 신장 세포7(COS7: monkey kidney cells), NSO 세포, SP2/0, 차이니즈 햄스터 난소(CHO: Chinese hamster ovary) 세포, W138, 어린 햄스터 신장(BHK: baby hamster kidney) 세포, MDCK, 골수종 세포주, HuT 78 세포 및 HEK-293 세포를 포함하나, 반드시 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 분리된 숙주세포는 본 발명의 재조합 벡터로 형질전환된 것이다.
본 명세서에서, 용어 "형질전환된", "형질도입된" 또는 "형질감염된”은 외인성 핵산이 숙주세포 내로 전달되거나 도입되는 과정을 지칭한다. "형질전환된”, "형질도입된" 또는 "형질감염된" 세포는 외인성 핵산으로 형질전환, 형질도입 또는 형질감염된 세포이며, 상기 세포는 당해 세포 및 그의 계대 배양으로 인한 자손 세포를 포함한다.
본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법(Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘 포스페이트 침전법(Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 전기 천공법(Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 리포좀-매개 형질감염법(Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)), DEAE-덱스트란 처리법(Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트(Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990)) 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.
본 발명에서 숙주세포 내로 주입된 재조합 벡터는 숙주세포 내에서 재조합된 상기의 항체 또는 폴리펩타이드 복합체를 발현할 수 있으며, 이러한 경우에는 다량의 항체 또는 폴리펩타이드 복합체를 얻게 된다. 예를 들어, 상기 발현 벡터가 lac 프로모터를 포함하는 경우에는 숙주세포에 IPTG를 처리하여 유전자 발현을 유도할 수 있다.
상기 배양은 통상적으로 진탕 배양 또는 회전기에 의한 회전에 의한 것과 같은 호기성 조건하에서 행한다. 배양 온도는 바람직하게는 10℃ 내지 40℃의 범위에서 행하고, 배양시간은 일반적으로 5시간 내지 7일간 행한다. 배지의 pH는 배양 중에서 바람직하게는 pH 3.0 내지 pH 9.0의 범위를 유지한다. 배지의 pH는 무기산 또는 유기산, 알칼리 용액, 우레아, 칼슘 카보네이트, 암모니아 등으로 조절할 수 있다. 배양 중에는 필요한 경우 재조합 벡터의 유지 및 발현을 위해 암피실린, 스트렙토마이신, 클로람페니콜, 카나마이신 및 테트라사이클린과 같은 항생제를 첨가할 수 있다. 유도(induction) 가능한 프로모터를 갖는 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포를 배양하는 경우, 필요하다면 배지에 적합한 유도제(inducer)를 첨가할 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터가 lac 프로모터를 함유하는 경우 IPTG (isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside)를 첨가하고, trp 프로모터를 포함하는 경우 인돌아크릴산(indoleacrylic acid)을 배지에 첨가할 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 구제역바이러스 VP0 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 구제역의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 구제역바이러스의 조립 과정에서 구조적 역할을 하는 동시에 숙주세포 내 인터페론 신호전달체계 조절을 통해 구제역바이러스 복제를 촉진하는 역할을 하는 VP0 전구체를 표적으로 하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하므로, 구제역의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 구제역의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물은 이를 필요로 하는 대상(subject), 구체적으로, 구제역을 앓고 있거나, 앓는 것으로 의심되거나, 또는 무증상이나 예방적 처치를 위해 선제적으로, 소, 돼지, 양, 염소 및 사슴을 포함하는 발굽이 갈라진 동물 또는 우제류에게 투여될 수 있다.
본 발명의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물은 구제역바이러스 VP0 단백질에 특이적으로 결합하는 약제학적 유효량의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
본 명세서의 용어 "약제학적 유효량"은 구제역바이러스에 의해 유발되는 질병 또는 병리학적/임상적 증상에 대한 예방, 경감 또는 치료적 효능을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 구제역의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함한다.
본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 예컨대 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 흉골내 주입, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 이를 필요로 하는 대상의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사/수의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.0001-100 mg/kg이다. 본 명세서에서 용어 “약제학적 유효량”은 상술한 질환을 예방 또는 치료하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 명세서에서, 용어 “예방”은 질환 또는 질환 상태의 방지 또는 보호적인 치료를 의미한다. 본 명세서에서, 용어 “치료”는 질환상태의 감소, 억제, 진정 또는 근절을 의미한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 좌제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 상술한 본 발명의 구제역바이러스 VP0 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 구제역바이러스 VP0 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 구제역바이러스 검출용 조성물을 제공한다.
본 명세서에서, 용어 “검출"은 구제역바이러스의 시료 내 존재 여부, 시료 내 존재량 및/또는 시료 내 분포 양상의 측정 또는 결정을 의미한다.
상기 시료는 대상으로부터 수득한 세포, 조직 또는 조직-유래 추출물, 파쇄물(lysate), 또는 정제물일 수 있고, 혈액, 혈장, 혈청, 림프 또는 복수(ascites)를 포함하나, 반드시 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는 상기 시료는 혀, 발, 주둥이 또는 유두로부터 수득한 세포, 조직, 예컨대 수포성 병변 조직, 또는 조직-유래 추출물이다.
상기 대상은 구제역을 앓고 있거나, 앓는 것으로 의심되거나, 임상적 증상을 나타내거나 또는 무증상인, 소, 돼지, 양, 염소 및 사슴을 포함하는 발굽이 갈라진 동물 또는 우제류일 수 있다.
상기 구제역의 임상적 증상에는 열(fever), 파행(lameness), 및 혀, 발, 주둥이(snout), 유두 등의 수포성 병변을 포함하나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 구제역바이러스 VP0 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 구제역 진단용 조성물을 제공한다.
본 명세서에서, 용어 “진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 구제역의 발병 여부, 구제역의 진행 정도, 또는 구제역 발병 가능성 여부를 확인하는 것이다.
본 발명의 검출용 조성물 또는 진단용 조성물은 상술한 본 발명의 구제역바이러스 VP0 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 구성 성분으로 포함하고, 본 발명의 약제학적 조성물과 동일한 바이러스를 검출하거나, 동일한 질병을 진단하는 바, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 구제역바이러스 검출용 조성물을 포함하는 구제역바이러스 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 구제역 진단용 조성물을 포함하는 구제역 진단용 키트를 제공한다.
상술한 조성물 또는 키트는 본 발명의 항-VP0 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하기 때문에, 기본적으로 다양한 면역분석(immunoassay) 또는 면역염색(immunostaining)에 적합하게 제작될 수 있다. 상기 면역분석 또는 면역염색은 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경쟁 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석(flow cytometry), 면역형광염색 및 면역친화성 정제를 포함하지만, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984; 및 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
예를 들어, 본 발명의 방법이 방사능면역분석 방법에 따라 실시되는 경우, 방사능동위원소(예컨대, C14, I125, P32 및 S35)로 레이블링된 항체가 구제역바이러스 VP0 단백질을 검출하는 데 이용될 수 있다.
본 발명이 ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시예는 (i) 분석하고자 하는 시료를 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ii) 일차 항체로서의 본 발명의 구제역바이러스 VP0 단백질에 특이적으로 결합하는 항체와 상기 시료를 반응시키는 단계; (iii) 상기 단계 (ii)의 결과물을 효소가 결합된 이차 항체와 반응시키는 단계; 및 (iv) 상기 효소의 활성을 측정하는 단계를 포함한다.
상기 고체 기질로 적합한 것은 탄화수소 폴리머(예컨대, 폴리스틸렌 및 폴리프로필렌), 유리, 금속 또는 젤이며, 가장 구체적으로는 마이크로타이터 플레이트이다.
상기 이차 항체에 결합된 효소는 발색반응, 형광반응, 발광반응 또는 적외선 반응을 촉매하는 효소를 포함하나, 반드시 이에 한정되지 않으며, 예를 들어, 알칼린 포스파타아제, beta-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제, 루시퍼라아제 및 사이토크롬 P450을 포함한다. 상기 이차 항체에 결합하는 효소로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트 (BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움 (NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트 (naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF (enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질이 이용되고, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌 (비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약 (10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR (p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB (tetramethylbenzidine), ABTS (2,2-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민 (OPD) 및 나프톨/파이로닌, 글루코스 옥시다아제와 t-NBT (nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS (phenzaine methosulfate)와 같은 기질이 이용될 수 있다.
본 발명이 캡처-ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시예는 (i) 포획항체(capturing antibody)로서 구제역바이러스 VP0 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ii) 포획항체와 시료를 반응시키는 단계; (iii) 상기 단계 (ii)의 결과물을 시그널을 발생시키는 레이블이 결합되어 있는 검출항체(detecting antibody)와 반응시키는 단계; 및 (iv) 상기 레이블로부터 발생하는 시그널을 측정하는 단계를 포함한다.
본 발명의 상기 검출항체는 검출 가능한 시그널을 발생시키는 레이블을 가지고 있다. 상기 레이블은 화학물질(예컨대, 바이오틴), 효소(알칼린 포스파타아제, beta-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제 및 사이토크롬 P450), 방사능물질(예컨대, C14, I125, P32 및 S35), 형광물질(예컨대, 플루오레신), 발광물질, 화학발광물질(chemiluminescent) 및 FRET(fluorescence resonance energy transfer)을 포함하나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 다양한 레이블 및 레이블링 방법은 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있다.
상기 ELISA 방법 및 캡처-ELISA 방법에서 최종적인 효소의 활성 측정 또는 시그널의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 실시될 수 있다. 만일, 레이블로서 바이오틴이 이용된 경우에는 스트렙타비딘으로, 루시퍼라아제가 이용된 경우에는 루시페린으로 시그널을 용이하게 검출할 수 있다.
상기 포획항체 및 검출항체로는 본 발명의 항-VP0 항체 또는 항원 결합 단편의 클론 중 서로 다른 에피토프에 결합하는 2종의 항체 또는 항원 결합 단편을 이용할 수 있다.
본 발명의 키트에 적용될 수 있는 시료는 세포, 조직 또는 조직-유래 추출물, 파쇄물(lysate), 또는 정제물일 수 있고, 혈액, 혈장, 혈청, 림프 또는 복수(ascites)를 포함하나, 반드시 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 항체는 인 비보 또는 인 비트로 이미징에 이용될 수 있다. 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 항체 및 상기 항체에 결합된 검출 가능한 신호를 발생시키는 레이블이 결합된 결합체를 포함하는 이미지용 조성물을 제공한다.
상기 검출 가능한 신호를 발생시키는 레이블은 T1 조영물질(예컨대, Gd 킬레이트 화합물), T2 조영물질(예컨대, 초상자성 물질(예: 마그네타이트, Fe3O4, γ-Fe2O3, 망간 페라이트, 코발트 페라이트 및 니켈 페라이트)), 방사성 동위 원소(예컨대, 11C, 15O, 13N, P32, S35, 44Sc, 45Ti, 118I, 136La, 198Tl, 200Tl, 205Bi 및 206Bi), 형광물질(플루오리신 (fluorescein), 피코에리트린 (phycoerythrin), 로다민, 리사민 (lissamine), 그리고 Cy3와 Cy5), 화학발광단, 자기입자, 매스 표지 또는 전자밀집입자를 포함하나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 구제역바이러스 VP0 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 수탁번호 KCLRF-BP-00517인 하이브리도마 세포를 제공한다. 상기 하이브리도마 세포는 한국세포주연구재단(KCLRF)에 기탁하였다(기탁일: 2022년 1월 26일, 기탁번호: KCLRF-BP-00517).
본 명세서에서, 용어 "하이브리도마(hybridoma)"는 골수종(myeloma) 세포와 항체생산세포와의 세포융합에 의하여 형성된 잡종 세포로 단일클론 항체(monoclonal antibody)를 영속적으로 생산할 수 있는 세포이다.
본 명세서에서, 용어 "골수종 세포(myeloma cell)"는 형질세포(plasma cell)가 종양화한 것으로, 미숙형부터 성숙형까지 형태학적으로는 다양하며, 여러 가지 세포생물학적 특성에서도 그 다양성이 풍부하다. 이들은 임상상(像), 경과, 예후 등에도 밀접하게 관련되어 있으며, 생산하는 면역글로불린은 단일클론성(monoclonal)인 것이 특징적이다.
하이브리도마는 밀스테인(Milstein)과 쾰러(Kohler)에 의해 1975년 최초로 제작되었으며, 하이브리도마 기술은 106 내지 108개 중 한 개의 빈도로 존재하는 항원특이적 항체생산세포를 분리하여 증식시킴으로써 단일클론 항체를 생산하는 방법이다. 세포융합제로서 폴리에틸렌글리콜이 사용됨에 따라 하이브리도마 회수효율도 상승되고 방법도 비교적 간단하게 되었다.
하이브리도마 생산에 사용되는 골수종 세포는 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase, HGPRT), 또는 티미딘키나제 (thymidine kinase, TK)가 없는 것으로, HAT(Hypoxanthine-Aminopterin-Thymine) 배지에서는 DNA 합성을 계속할 수 없어 사멸하게 되지만, HGPRT 유전자를 보유한 비장 세포와 융합된 하이브리도마 세포는 정상세포의 샐비지 경로를 이용하여 DNA 합성을 계속할 수 있고(Arthur and Massey, 1981), HAT 배지에서도 증식하는 HAT-저항성을 지니게 되므로 융합되지 않은 골수종 세포와 선별이 가능하다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 상기 골수종 세포는 포유류 동물 유래의 골수종 세포이며, 구체적으로는 마우스, 랫트, 햄스터, 토끼, 개, 고양이, 염소, 돼지, 소, 양, 영장류, 인간 등에서 유래한 것이며, 이들 유래의 골수종 세포로는 P3X63Ag8, p3-U1, NS-1, MPC-11, SP2/0, F0, P3x63Ag8. V653, R-210 및 S194 등이 있다. 특히, 마우스 골수종 세포의 경우, IgG1을 발현하는 MOPC21 암세포에서 유래되었으며 면역글로불린의 H, L 체인의 발현을 제거시킨 NS0, P3-X63-Ag8.653, SP2/0-Ag14로 변형되어 융합세포주(fusion partner cell)로 많이 사용되고 있다. 본 발명의 일 구체예에 있어서, 마우스 골수종 세포는 SP2/0-Ag14(ATCC, CRL-1581)이다.
예를 들어, 포유동물에 면역 반응을 유발하는 항원을 주입한 후, 비장 또는 림프 조직에서 수득한 항체를 생성하는 B 세포와 암 세포인 골수종 세포를 융합함으로써, 하이브리드 세포주인 하이브리도마를 생산할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 면역 반응을 유발하기 위해 항원으로서 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 구제역바이러스 VP0 단백질을 마우스에 주입한 후, 비장 또는 림프 조직에서 B 세포를 수득하고, 이를 골수종 세포와 융합함으로써, 구제역바이러스 VP0 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 생성는 하이브리도마를 생산할 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, 면역 반응을 유발하기 위해 항원으로서 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 및 이의 아미노 말단에 KLH 펩타이드를 추가로 포함하는 구제역바이러스 VP0 단백질을 마우스에 주입한 후, 비장 또는 림프 조직에서 B 세포를 수득하고, 이를 골수종 세포와 융합함으로써, 구제역바이러스 VP0 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 생성하는 하이브리도마를 생산할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따르면, 면역 반응을 유발하기 위해 항원으로서 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 및 이의 아미노 말단에 시스테인 및 KLH 펩타이드 순서로 구성된 구제역바이러스 VP0 단백질을 마우스에 주입한 후, 비장 또는 림프 조직에서 B 세포를 수득하고, 이를 골수종 세포와 융합함으로써, 구제역바이러스 VP0 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 생성하는 하이브리도마를 생산할 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 구제역바이러스 VP0 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조방법을 제공한다:
본 발명의 일 구현예에 따른 구제역바이러스 VP0 단백질을 피면역 동물에 면역시킨 다음 항체생성세포를 분리하는 단계;
본 발명의 일 구현예에 따른 숙주세포를 배양하고 구제역바이러스 VP0 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 발현시키는 단계; 또는
본 발명의 일 구현예에 따른 하이브리도마 세포를 배양하고 배양상층액에서 구제역바이러스 VP0 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 분리하는 단계.
본 발명의 구제역바이러스 VP0 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조방법을 단계별로 설명한다.
본 발명의 일 구현예에 따른 구제역바이러스 VP0 단백질을 피면역 동물에 면역시킨 다음 항체생성세포를 분리하는 단계
피면역 동물을 면역시키는 방법은 당업계에 이미 공지된 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 마우스를 면역시키는 경우 1회에 1 μg 내지 100 μg의 면역원을 동량의 생리 식염수 및/또는 프로인드 어주번트(Freund's adjuvant) 등의 항원 보조제로 유화시켜, 상기 피면역원 동물의 피하 또는 복강 내에 2주 내지 5주의 간격으로 2회 내지 6회 접종시키는 방법으로 수행될 수 있다.
피면역 동물을 면역시킨 후에는 최종 접종 3일 내지 5일 후 비장 또는 림프절을 적출하여 당업계에서 이미 공지되어 있는 세포 융합법에 따라서, 융합 촉진제의 존재하에 이들의 조직에 포함되어 있는 B 세포를 골수종세포와 융합시키게 된다.
상기 융합 촉진제는, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 물질을 사용할 수 있다. 상기 골수종세포는 예를 들어, P3U1, NS-1, P3x63. Ag 8.653, Sp2/0-Ag14와 같은 마우스 유래 세포, 또는 AG1 및 AG2와 같은 랫트 유래 세포를 사용할 수 있으나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 당업계에 공지된 세포 융합법은, 예를 들어, B세포와 골수종세포를 1:1 내지 10:1의 비율로 혼합시켜, 이에 분자량 1,000 내지 6,000의 PEG를 10 내지 80%의 농도로 첨가하여, 30 내지 37℃에서 1 내지 10분 동안 배양하는 방법으로 수행될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 피면역 동물은 마우스(mouse), 랫트(rat), 염소(goat), 양(sheep), 또는 토끼(rabbit)이나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서, 용어 "항체생성세포(antibody forming cell)"는 항체를 합성하여 분비하는 세포의 총칭을 의미한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 항체생성세포는 비장 또는 림프로부터 분리된 세포이다. 예를 들어, B세포 또는 형질세포일 수 있으나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 따른 하이브리도마 세포를 배양하고 배양상층액에서 구제역바이러스 VP0 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 분리하는 단계
또한, 상기 구제역바이러스 VP0 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체는 하이브리도마로부터 생성될 수 있고, 예를 들어, 하이브리도마만이 생존 가능한 HAT 배지 등의 선택 배지에서 하이브리도마 세포를 배양하고, 하이브리도마 배양 상층액 중의 항체 활성을 ELISA 등의 방법을 이용하여 측정함으로써 상술한 단일클론 항체를 선택할 수 있다.
최종적으로, 구제역바이러스 VP0 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마는, 예를 들어, 상술한 하이브리도마에 대하여 한계 희석 등의 방법을 적용하여 클로닝을 반복함으로써 선별될 수 있다.
상술한 단일클론 항체는 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgA, 또는 IgM 아이소타입일 수 있으며, 예를 들어, IgG1 또는 IgG2a 아이소타입일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따른 숙주세포를 배양하고 구제역바이러스 VP0 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 발현시키는 단계
상술한 구제역바이러스 VP0 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 숙주세포에 형질전환한 후 숙주세포를 배양하고, 배양상층액 또는 세포 파쇄물로부터 항체 또는 폴리펩타이드 복합체를 분리 및/또는 정제하는 단계이다.
재조합 벡터 시스템 구축 방법, 적절한 숙주세포의 선택, 형질전환 방법, 배양 방법, 항체 또는 폴리펩타이드 복합체의 분리 또는 정제 방법은 상술한 다른 일 양태와 공통된 내용이므로 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 중복되는 내용을 원용하며, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 구제역바이러스 VP0 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조방법은 상술한 구제역바이러스 VP0 단백질, 숙주세포, 또는 하이브리도마 세포를 이용하기 때문에, 이들 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 구제역바이러스 VP0 단백질을 제공한다.
(b) 본 발명은 상기 구제역바이러스 VP0 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
(c) 본 발명은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 구제역의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
(d) 본 발명은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 구제역바이러스 검출용 조성물 또는 키트를 제공한다.
(e) 본 발명은 상기 항체를 생산하는 하이브리도마 세포, 또는 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조방법을 제공한다.
(f) 본 발명의 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 구제역바이러스 VP0 단백질을 이용하는 경우, 구제역바이러스 VP4 및 VP2 구조단백질에는 결합하지 않고, 구제역바이러스의 조립 과정과 복제에 중요한 역할을 하는 VP0 전구체 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제조할 수 있으므로, 구제역의 예방 또는 치료와 구제역바이러스의 검출에 유용하게 사용될 수 있고, VP0의 절단 메커니즘, 숙주세포 내 이동 경로 등 구제역바이러스의 분자생물학적 메커니즘을 분석하는 데 유용하게 적용될 수 있다.
도 1은 구제역바이러스 VP4와 VP2 단백질 연결부위의 아미노산 서열 비교 표를 나타낸다. 국내 분리주 7종과 외국 유래 백신주 2종(O1 Manisa, A22 IRQ)의 VP4 카르복실기 말단 아미노산 서열과 VP2 아민기 말단 아미노산 서열을 비교 배열한 표이다. 박스 표시는 최종적으로 펩타이드 합성에 사용한 아미노산 서열을 나타내고, 가로 도트는 동일 아미노산을 나타낸다.
도 2는 본 발명에서 개발한 5종의 단일클론 항체들의 특성을 분석한 결과를 나타낸다. 여기서, ELISA 흡광도는 BSA를 상술한 펩타이드의 아민기 말단에 결합시킨 상태로 항원으로 사용하였다.
도 3은 본 발명에서 생산한 5종의 단일클론 항체들에 대해서 유전자재조합 단백질들과의 반응성을 웨스턴블롯법으로 분석한 결과를 나타낸다. 각 단일클론 항체와의 반응성을 나타내는 그림으로서 첫 번째 레인은 분자량 마커이고, 두 번째 레인은 유전자재조합 VP0 단백질이며, 세 번째 레인은 유전자재조합 VP2 단백질이고, 네 번째 레인은 VP4 단백질이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.
실시예
실시예 1. 펩타이드 항원 합성을 위한 여러 구제역바이러스들에 대한 VP4와 VP2 연결부위의 아미노산 서열 배열 및 선정
구제역바이러스 구조단백질 VP0의 아미노산 서열에는 VP4의 35번 내지 85번째 아미노산과 VP2의 1번 내지 50번째 아미노산이 포함된다. 서열 비교를 위해, 구제역바이러스 국내 분리주 7종(O/SKR/2000, O/SKR/2011, O/SKR/2014, O/SKR/2016, O/SKR/2017, A/SKR/2010 및 A/SKR/2017)과 외국 유래 백신주 2종(O1 Manisa/1969 및 A22/IRQ/1964)의 VP4 카르복실기 말단 아미노산 서열과 VP2 아민기 말단 아미노산 서열을 배열하고, 그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타낸 바와 같이, VP4 단백질의 카르복실 말단 아미노산 서열과 VP2 단백질의 아미노 말단 아미노산 서열은 구제역바이러스 종류에 상관없이 매우 유사하였다. 실제로 VP4는 바이러스 입자에서 외부로 노출되지 않고 내부에 위치하기 때문에 구조단백질들 중에서는 바이러스들 간의 아미노산 유사성이 가장 높은 부위로 알려져 있고, VP2는 아미노 말단 아미노산 서열이 바이러스들 간 상동성이 가장 높은 부위로 알려져 있다. 이러한 유사성을 감안하여 최종적으로 16개(GLFGALLADKKTEETT)의 아미노산 잔기로 구성된 펩타이드 서열을 선정하였다. 즉, 펩타이드 서열, GLFGALLADKKTEETT을 VP0의 에피토프(epitope)로 선정하였다.
실시예 2. 단일클론 항체들의 특성 분석
2-1. 펩타이드 항원 합성
실시예 1에서 선정한 아미노산 서열을 이용해서 16개의 아미노산 잔기로 구성된 펩타이드를 국내 업체(Anygen CO., LTD.)에 의뢰하여 합성하였다. 면역능을 향상시키기 위해서 KLH를 상술한 펩타이드에 결합시켜야 하는데, 이를 위해서 펩타이드의 아미노 말단에 시스테인을 추가한 다음에 KLH를 결합시켰다.
단일클론 항체 선발하기 위해, 상술한 펩타이드 항원에는 BSA(bovine serum albumin)를 결합시키고, 다음과 같은 방법으로 ELISA를 실시하였다.
2-2. 하이브리도마 세포 생성
VP0 영역에 대한 단일클론 항체는 국내 업체(GW Vitek Co.)에 의뢰하여 생성하였다. 도 1에 나타낸 VP0 에피토프, GLFGALLADKKTEETT에 해당하는 KLH-접합 펩타이드를 BALB/c 마우스에게 2회 피하 주사하여 면역화시켰다.
뮤라인 림프 세포와 골수종 세포주를 융합해 VP0에 대한 단일클론 항체(MAb)를 생산하는 하이브리도마(Hybridoma)를 생성하였다.
2-3. 항체 특성분석 - ELISA
하이브리도마 세포는 펩타이드 ELISA에 의해 다음과 같이 스크리닝되었다. BSA-접합 펩타이드(VP0 에피토프, GLFGALLADKKTEETT)를 4℃에서 밤새 인큐베이션하면서, pH 9.6에서 0.1 M 중탄산염 완충액 중 250 ng/웰로 플레이트를 코팅하였다. 코팅 용액을 버린 후, 플레이트에 200 μl의 블로킹 용액(PBS 중 2% 탈지유)을 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. Tween-20이 포함된 Tris-완충 식염수(TBST)로 1회 세척한 후, 플레이트에 50 μl의 1차 항체(세포 배양상층액)를 첨가하고 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. TBST로 3회 세척한 후, 플레이트에 50 μl의 염소 항-마우스 IgG HRP (Thermo Fisher Scientific사, Waltham, MA, USA)를 1:10,000 비율로 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 TBST로 5회 세척하고 플레이트에 50 μl의 TMB(Surmodics사, MN, USA)를 첨가하였다. 색이 파란색으로 변하면, 플레이트에 정지 용액(1 N H2SO4)을 첨가하고 450 nm에서 광학 밀도를 측정하였다. 마지막으로, 래피드 ELISA 마우스 mAb 아이소타이핑 키트의 HRP(rapid ELISA mouse mAb isotyping kit HRP, Thermo Fisher Scientific사, Waltham, MA, USA)를 사용하여 선택된 단일클론 항체의 아이소타입을 확인하고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
2-4. 항체 특성분석 결과
도 2는 본 발명에서 개발한 5종의 단일클론 항체들(8G9, 9A5, 17E6, 23F2, 및 24A12)의 특성을 분석한 결과이다. 최종적으로 5종의 단일클론 항체가 선발되었고 하이브리도마 배양상층액 시료에서 이들 5종의 ELISA 흡광도는 모두 약 2.0 부근의 값을 나타내, 민감도에서는 차이가 없는 것으로 판단된다. 단일클론 항체 3종의 중쇄부위는 IgG1이었고 2종은 IgG2b이었으며, 경쇄부위는 모두 카파(kappa)로 구성되었다.
상술한 구제역바이러스 VP0 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체 중, 중쇄부위가 IgG1이며, 경쇄부위가 카파인, 17E6 클론을 생성하는 하이브리도마(Hybridoma)를 "한국세포주연구재단(Korea Cell Line Research Foundation, KCLRF)"에 기탁번호 "KCLRF-BP-00517"로 2022년 1월 26일자에 기탁하였다.
실시예 3. 단일클론 항체들의 유전자재조합 단백질들과의 반응성
실시예 2에서 생산한 5종의 단일클론 항체들과 유전자재조합 단백질들과의 반응성을 확인하기 위해서, 3종의 유전자재조합 단백질을 아래와 같은 방법으로 제작하였다.
3-1. 유전자재조합 단백질 제작
VP0 (909 bp), VP4 (255 bp), 및 VP2 (654 bp)의 코딩 서열을 국내 업체(Bioneer, Daejeon, Korea)에 의뢰하여 합성하였다. 국내 업체(Enzynomics, Daejeon, Korea)에 의뢰하여 VP0, VP4, 및 VP2의 DNA 절편을 pET28a 플라스미드(Novagen사, Wisconsin, USA)에 클로닝하여 재조합 발현 플라스미드를 제작하고 각각 His-VP0, His-VP4, 및 His-VP2로 지칭하였다. His-VP0, His-VP4, 및 His-VP2 단백질의 발현은 제조사의 지시사항에 따라 수행되었다. 재조합 플라스미드를 100 μg/ml 암피실린(Sigma사)과 함께 BL21(Invitrogen사)에 접종하고, A600 값이 0.7에 도달할 때까지 37℃에서 4시간 동안 교반하면서 인큐베이션하였다. 1 mM의 IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)를 첨가해 단백질 발현을 유도하였다.
3-2. 반응성 조사를 위한 웨스턴블롯 방법
이렇게 만들어진 3종의 유전자재조합 단백질들(유전자재조합 단백질 VP0, VP2 및 VP4)과 본 발명의 단일클론 항체 5종(8G9, 9A5, 17E6, 23F2, 및 24A12)에 대해서 다음과 같은 웨스턴블롯법을 통해 반응성을 조사하였다.
단백질 샘플을 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)에 첨가하였다. 단백질 샘플을 4Х 비-환원성 리튬 도데실 설페이트 샘플 버퍼(4Х non-reducing lithium dodecyl sulfate sample buffer, Invitrogen사, Carlsbad, CA, USA) 및 10Х 환원제(reducing agent, 1M dithiothreitol; Merck KGaA)와 혼합하였다. 전처리된 샘플을 70℃에서 10분 동안 가열하였고 4% 내지 12% Bis-Tris 구배 겔(gradient gels, Invitrogen사)에서 전기영동하였다. 겔을 쿠마시 브릴리언트 블루 R-250 염색 용액(Coomassie Brilliant Blue R-250 staining solution, Biorad사, Hercules, CA, USA)으로 염색하고, 1시간 동안 약하게 교반하였다. 그 다음 염색된 겔에 탈색 용액(destaining solution, Biosesang사, Sungnam, Korea)을 처리하고 단백질 밴드가 보일 때까지 교반하였다. 웨스턴블롯 분석을 위해, 겔을 iBlot 2 겔-트랜스퍼 디바이스(iBlot 2 gel-transfer device, Invitrogen사)를 이용하여 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 트랜스퍼하였다. 멤브레인을 Tween-20을 첨가한 인산염-완충 식염수(phosphate-buffered saline with Tween-20: PBST; 10 mM sodium phosphate, 132 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 및 0.05% Tween-20, pH 7.4) 중 5% 탈지유로 블로킹하였다. 멤브레인을 세척하고 PBST에서 1/10로 희석한 단일클론 항체와 함께 인큐베이션하였다. 멤브레인을 세척한 후, PBST에 1/4000 로 희석한 염소 항-마우스 HRP(horseradish peroxidase)-접합 2차 항체(Invitrogen사)와 함께 인큐베이션하였다. Azure C600 이미징 시스템(Azure Biosystem사, Dublin, CA, USA)을 이용하여 Pierce ECL Substrate HRP (Thermo Fisher Scientific)로 단백질을 가시화하였고, 그 결과는 도 3에 나타내었다.
3-3. 단일클론 항체와 유전자재조합 단백질 VP0, VP2 및 VP4의 반응성 결과
도 3은 실시예 2에 따른 단일클론 항체 5종(8G9, 9A5, 17E6, 23F2, 및 24A12)과 실시예 3-1에 따른 유전자재조합 단백질 3종의 반응성을 나타내는 웨스턴 블롯 그림으로서, 첫 번째 레인은 분자량 마커, 두 번째 레인은 유전자재조합 VP0 단백질, 세 번째 레인은 유전자재조합 VP2 단백질, 네 번째 레인은 VP4 단백질에 대한 결과이다. 유전자재조합 VP0 단백질의 사이즈는 약 30 kDa 내지 72 kDa이고, 유전자재조합 VP2 단백질의 사이즈는 약 29 kDa이며, 유전자재조합 VP4 단백질의 사이즈는 약 14 kDa이다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 두 번째 레인에서 약 30 kDa 내지 72 kDa 사이에서 단백질 밴드가 관찰되었으므로, 본 발명의 단일클론 항체 5종(8G9, 9A5, 17E6, 23F2, 및 24A12)은 모두 유전자재조합 단백질 VP2 또는 VP4에는 결합하지 않았고, 오로지 VP0에만 결합하였음을 확인하였다.
한편, 단일클론 항체 중 8G9 및 23F2 클론의 웨스턴 블롯 그림에서 세 번째 및 네 번째 레인에 비-특이적인(non-specific) 반응이 관찰되었으나, 유전자재조합 VP2 및 VP4 단백질의 사이즈에 해당하지 않으므로, 상기 두 클론 또한 VP2 및 VP4 단백질에 결합하지 않는 것을 확인할 수 있었으며, 상기 비-특이적인 반응은 상술한 실시예 3-2에서 유전자재조합 단백질 제조시 사용한 대장균(BL21)에서 유래한 단백질에 대한 것으로 판단된다.
상기 결과는 본 발명자들이 세계 최초로 VP0에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 개발하였음을 의미하며, 이를 이용한 여러 연구에 매우 유용하게 널리 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
결론
본 발명에 따른 VP0에 특이적으로 결합하는 신규한 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 사용하는 경우, 세포 내에서 VP0의 이동 경로를 포착하려면 VP2 또는 VP4에는 결합하지 않고 VP0에만 선택적으로 결합하는 항체의 활용이 절대적으로 요구된다는 점에서 항원-항체 결합 반응을 통해 VP0가 구조 단백질 VP2 및 VP4로 절단되는 인자들을 탐색하는 데에 매우 유용하게 활용될 수 있다.
또한, 구제역바이러스의 증식과 관련한 여러 기초 연구에 유용하게 활용될 것이다. 더욱이, 구제역 백신을 생산할 때 VP0가 VP4 및 VP2로 원활하게 절단되어야 온전한 형태의 백신을 위한 항원이 만들어지기 때문에, 본 발명의 항체를 적용하여 VP0 단백질의 절단을 조절하는 물질을 규명한다면, 구제역 백신 항원의 생산성을 향상시키는 데에도 기여할 것으로 기대된다.
한국세포주연구재단 KCLRFBP00517 20220126
<110> REPUBLIC OF KOREA(Animal and Plant Quarantine Agency) <120> Antibody or antigen binding fragment thereof specifically binding to structural protein VP0 site of foot-and-mouth disease virus and uses thereof <130> PN210439 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VP0 epitope <400> 1 Gly Leu Phe Gly Ala Leu Leu Ala Asp Lys Lys Thr Glu Glu Thr Thr 1 5 10 15 <210> 2 <211> 101 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <400> 2 Asp Thr Gln Leu Gly Asp Asp Ala Ile Ser Gly Gly Ser Asn Glu Gly 1 5 10 15 Ser Thr Asp Thr Thr Ser Thr His Thr Thr Asn Thr Gln Asn Asn Asp 20 25 30 Trp Phe Ser Lys Leu Ala Ser Ser Ala Phe Ser Gly Leu Phe Gly Ala 35 40 45 Leu Leu Ala Asp Lys Lys Thr Glu Glu Thr Thr Leu Leu Glu Asp Arg 50 55 60 Ile Leu Thr Thr Arg Asn Gly His Thr Thr Ser Thr Thr Gln Ser Ser 65 70 75 80 Val Gly Val Thr Tyr Gly Tyr Ala Thr Ala Glu Asp Phe Val Ser Gly 85 90 95 Pro Asn Thr Ser Gly 100 <210> 3 <211> 101 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <400> 3 Asp Thr Gln Leu Gly Asp Asn Ala Ile Ser Gly Gly Ser Asn Glu Gly 1 5 10 15 Ser Thr Asp Thr Thr Ser Thr His Thr Thr Asn Thr Gln Asn Asn Asp 20 25 30 Trp Phe Ser Lys Leu Ala Ser Ser Ala Phe Ser Gly Leu Phe Gly Ala 35 40 45 Leu Leu Ala Asp Lys Lys Thr Glu Glu Thr Thr Leu Leu Glu Asp Arg 50 55 60 Ile Leu Thr Thr Arg Asn Gly His Thr Thr Ser Thr Thr Gln Ser Ser 65 70 75 80 Val Gly Ile Thr His Gly Tyr Ala Thr Ala Glu Asp Phe Val Ser Gly 85 90 95 Pro Asn Thr Ser Gly 100 <210> 4 <211> 101 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <400> 4 Asp Thr Gln Leu Gly Asp Asn Ala Ile Ser Gly Gly Ser Asn Glu Gly 1 5 10 15 Ser Thr Asp Thr Thr Ser Thr His Thr Thr Asn Thr Gln Asn Asn Asp 20 25 30 Trp Phe Ser Lys Leu Ala Ser Ser Ala Phe Ser Gly Leu Phe Gly Ala 35 40 45 Leu Leu Ala Asp Lys Lys Thr Glu Glu Thr Thr Leu Leu Glu Asp Arg 50 55 60 Ile Leu Thr Thr Arg Asn Gly His Thr Thr Ser Thr Thr Gln Ser Ser 65 70 75 80 Val Gly Ile Thr His Gly Tyr Ala Thr Ala Glu Asp Phe Val 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Claims (16)

  1. 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 구제역바이러스 VP0 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 상기 VP0 단백질은 구제역바이러스 VP4 구조단백질의 카르복실 말단 아미노산 잔기 및 VP2 구조단백질의 아미노 말단 아미노산 잔기가 연결된 것인, 구제역바이러스 VP0 단백질.
  3. 제1항에 있어서, 아미노 말단에 KLH 펩타이드를 추가로 포함하는, 구제역바이러스 VP0 단백질.
  4. 제 1 항의 구제역바이러스 VP0 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  5. 제4항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 구제역바이러스 i) VP2, ii) VP4, 또는 iii) VP2 및 VP4 구조단백질에 결합하지 않는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  6. 제4항에 있어서, 상기 구제역바이러스는 O, A, Asia1, C, SAT1, SAT2 및 SAT3로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 혈청형인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  7. 제4항에 있어서, 상기 항체의 중쇄불변영역은 IgG1 또는 IgG2b인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  8. 제4항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 중 1개 내지 16개의 아미노산을 에피토프로 포함하는 단일클론 항체, 다중클론 항체, scFv, Fab, F(ab), F(ab)2, scFv-Fc, 미니바디, 다이아바디, 트리아바디, 테트라바디, 이중항체, 다중특이적 항체, 인간항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  9. 제4항 내지 제8항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자.
  10. 제9항의 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터.
  11. 제10항의 재조합 벡터를 포함하는, 분리된 숙주세포.
  12. 제4항 내지 제8항 중 어느 한 항의 구제역바이러스 VP0 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 구제역의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  13. 제4항 내지 제8항 중 어느 한 항의 구제역바이러스 VP0 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 구제역바이러스 검출용 조성물.
  14. 제13항의 구제역바이러스 검출용 조성물을 포함하는 구제역바이러스 검출용 키트.
  15. 구제역바이러스 VP0 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 수탁번호 KCLRF-BP-00517인 하이브리도마 세포.
  16. 다음 단계를 포함하는 구제역바이러스 VP0 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조방법:
    제1항의 구제역바이러스 VP0 단백질을 피면역 동물에 면역시킨 다음 항체생성세포를 분리하는 단계;
    제11항의 숙주세포를 배양하고 구제역바이러스 VP0 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 발현시키는 단계; 또는
    제15항의 하이브리도마 세포를 배양하고 배양상층액에서 구제역바이러스 VP0 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 분리하는 단계.
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