JPH05176791A - 抗糖脂質糖鎖モノクローナル抗体 - Google Patents
抗糖脂質糖鎖モノクローナル抗体Info
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- JPH05176791A JPH05176791A JP3314981A JP31498191A JPH05176791A JP H05176791 A JPH05176791 A JP H05176791A JP 3314981 A JP3314981 A JP 3314981A JP 31498191 A JP31498191 A JP 31498191A JP H05176791 A JPH05176791 A JP H05176791A
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- cell
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- C07K—PEPTIDES
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- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
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- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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-
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- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
- C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
-
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- C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
Abstract
(57)【要約】
【構成】ＩｇＧ３に属し、少なくとも１種のガングリオ
シドＧＤ３および３’，８’−ＬＤ１に反応するモノク
ローナル抗体 【効果】本発明のモノクローナル抗体は、ガングリオシ
ドＧＤ３および３’，８’−ＬＤ１に反応し、殺細胞活
性を有することから、神経外胚葉系由来の癌の治療上有
用である。
シドＧＤ３および３’，８’−ＬＤ１に反応するモノク
ローナル抗体 【効果】本発明のモノクローナル抗体は、ガングリオシ
ドＧＤ３および３’，８’−ＬＤ１に反応し、殺細胞活
性を有することから、神経外胚葉系由来の癌の治療上有
用である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ＩｇＧ３に属し、少な
くとも１種のガングリオシドＧＤ３および３’，８’−
ＬＤ１に反応性を有するモノクローナル抗体に関する。
くとも１種のガングリオシドＧＤ３および３’，８’−
ＬＤ１に反応性を有するモノクローナル抗体に関する。
【０００２】
【従来の技術】ガングリオシドは細胞膜を構成している
糖脂質の１種で、親水性側鎖である糖鎖と、疎水性側鎖
であるスフィンゴシン、脂肪酸とから構成される分子で
ある。ガングリオシドの発現は、細胞、臓器、動物種に
よって異なることが知られているが、さらに細胞が癌化
する過程で発現しているガングリオシドが量的、質的変
化を起こすことが次第に明らかとなってきた〔キャンサ
ー・リサーチ(CancerRes.) 45, 2405(1985)〕。
糖脂質の１種で、親水性側鎖である糖鎖と、疎水性側鎖
であるスフィンゴシン、脂肪酸とから構成される分子で
ある。ガングリオシドの発現は、細胞、臓器、動物種に
よって異なることが知られているが、さらに細胞が癌化
する過程で発現しているガングリオシドが量的、質的変
化を起こすことが次第に明らかとなってきた〔キャンサ
ー・リサーチ(CancerRes.) 45, 2405(1985)〕。
【０００３】例えば、悪性度が高いといわれている神経
外胚葉系腫瘍である神経芽細胞腫、肺小細胞癌、グリア
細胞腫およびメラノーマでは、正常細胞にはほとんど認
められないガングリオシドＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２など
が癌抗原として異常発現していることが報告されている
〔ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン
（J.Exp.Med.) 155 , 1133(1982), ジャーナル・オブ・
バイオロジカル・ケミストリー(J.Biol.Chem) 257 ,127
52(1982), キャンサー・リサーチ(Cancer Res.) 47, 22
5(1987),同 47 , 1098(1987), 同 45 , 2642(1985), プ
ロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・
オブ・サイエンス・ユー・エス・エー(Proc.Natl.Acad.
Sci.U.S.A.) 80, 5392(1983)〕。
外胚葉系腫瘍である神経芽細胞腫、肺小細胞癌、グリア
細胞腫およびメラノーマでは、正常細胞にはほとんど認
められないガングリオシドＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２など
が癌抗原として異常発現していることが報告されている
〔ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン
（J.Exp.Med.) 155 , 1133(1982), ジャーナル・オブ・
バイオロジカル・ケミストリー(J.Biol.Chem) 257 ,127
52(1982), キャンサー・リサーチ(Cancer Res.) 47, 22
5(1987),同 47 , 1098(1987), 同 45 , 2642(1985), プ
ロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・
オブ・サイエンス・ユー・エス・エー(Proc.Natl.Acad.
Sci.U.S.A.) 80, 5392(1983)〕。
【０００４】またこれらの腫瘍を解析、治療する目的
で、ガングリオシドＧＤ2 に反応するモノクローナル抗
体〔キャンサー・リサーチ(CancerRes.) 47, 1098(198
7), 同45, 2642(1985), プロシーディング・オブ・ザ・
ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユー・エ
ス・エー(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.) 79, 7629(198
2)〕およびガングリオシドＧＭ２に反応するモノクロー
ナル抗体〔キャンサー・リサーチ(Cancer Res.) 46, 41
16(1986), 同48, 6154(1988), プロシーディング・オブ
・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユ
ー・エス・エー(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.) 80, 5392
(1983)〕が作製されている。
で、ガングリオシドＧＤ2 に反応するモノクローナル抗
体〔キャンサー・リサーチ(CancerRes.) 47, 1098(198
7), 同45, 2642(1985), プロシーディング・オブ・ザ・
ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユー・エ
ス・エー(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.) 79, 7629(198
2)〕およびガングリオシドＧＭ２に反応するモノクロー
ナル抗体〔キャンサー・リサーチ(Cancer Res.) 46, 41
16(1986), 同48, 6154(1988), プロシーディング・オブ
・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユ
ー・エス・エー(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.) 80, 5392
(1983)〕が作製されている。
【０００５】ガングリオシドＧＤ３は非還元末端に、Ｎ
ｅｕＡｃα２→８ＮｅｕＡｃα２→３Ｇａｌ糖鎖、Ｎｅ
ｕＡｃα２→８ＮｅｕＧｃα２→３Ｇａｌ糖鎖、Ｎｅｕ
Ｇｃα２→８ＮｅｕＡｃα２→３Ｇａｌ糖鎖またはＮｅ
ｕＧｃα２→８ＮｅｕＧｃα２→３Ｇａｌ糖鎖の結合し
たガングリオシドであり、神経外胚葉系腫瘍の中でも特
にメラノーマにおいてその発現が多く認められ、これま
でにＩｇＭおよびＩｇＧ３に属する抗ガングリオシドＧ
Ｄ３モノクローナル抗体５種が作製され、該抗体がガン
グリオシドＧＤ３と反応を示すことが報告されている
〔インターナショナル・ジャーナル・オブ・キャンサー
（Int.J.Cancer) 29, 269(1982),ジャーナル・オブ・バ
イオロジカル・ケミストリー(J. Biol.Chem)257 , 1275
2(1982),キャンサー・リサーチ(Cancer Res.) 47, 225
(1987),アクタ・ニューロパソロジカ(Acta Neuropatho
l.) 79, 317(1989),プロシーディング・オブ・ザ・ナシ
ョナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユーエス・エ
ー(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.) 77, 6114(1980), ジャ
ーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン (J.E
xp.Med.) 155, 1133(1982), プロシーディング・オブ・
ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユー
・エス・エー(Proc.Natl.Acad. Sci.U.S.A.) 81, 5767
(1984)〕。
ｅｕＡｃα２→８ＮｅｕＡｃα２→３Ｇａｌ糖鎖、Ｎｅ
ｕＡｃα２→８ＮｅｕＧｃα２→３Ｇａｌ糖鎖、Ｎｅｕ
Ｇｃα２→８ＮｅｕＡｃα２→３Ｇａｌ糖鎖またはＮｅ
ｕＧｃα２→８ＮｅｕＧｃα２→３Ｇａｌ糖鎖の結合し
たガングリオシドであり、神経外胚葉系腫瘍の中でも特
にメラノーマにおいてその発現が多く認められ、これま
でにＩｇＭおよびＩｇＧ３に属する抗ガングリオシドＧ
Ｄ３モノクローナル抗体５種が作製され、該抗体がガン
グリオシドＧＤ３と反応を示すことが報告されている
〔インターナショナル・ジャーナル・オブ・キャンサー
（Int.J.Cancer) 29, 269(1982),ジャーナル・オブ・バ
イオロジカル・ケミストリー(J. Biol.Chem)257 , 1275
2(1982),キャンサー・リサーチ(Cancer Res.) 47, 225
(1987),アクタ・ニューロパソロジカ(Acta Neuropatho
l.) 79, 317(1989),プロシーディング・オブ・ザ・ナシ
ョナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユーエス・エ
ー(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.) 77, 6114(1980), ジャ
ーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン (J.E
xp.Med.) 155, 1133(1982), プロシーディング・オブ・
ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユー
・エス・エー(Proc.Natl.Acad. Sci.U.S.A.) 81, 5767
(1984)〕。
【０００６】また、ＩｇＧ３に属する抗ガングリオシド
ＧＤ３モノクローナル抗体を用いたメラノーマの治療も
試みられている〔ヨーロビアン・ジャーナル・オブ・キ
ャンサー・アンド・クリニカル・オンコロジー（Eur.J.
Cancer Clin.Oncol.) 24, suppl 2, S65(1988)、プロシ
ーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ
・サイエンス・ユー・エス・エー(Proc.Natl.Acad.Sci.
U.S.A.) 82, 1242(1985)〕が、現在まだ十分な治療効果
は得られていない。
ＧＤ３モノクローナル抗体を用いたメラノーマの治療も
試みられている〔ヨーロビアン・ジャーナル・オブ・キ
ャンサー・アンド・クリニカル・オンコロジー（Eur.J.
Cancer Clin.Oncol.) 24, suppl 2, S65(1988)、プロシ
ーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ
・サイエンス・ユー・エス・エー(Proc.Natl.Acad.Sci.
U.S.A.) 82, 1242(1985)〕が、現在まだ十分な治療効果
は得られていない。
【０００７】一方、神経外胚葉系腫瘍の一つであるグリ
ア細胞腫において非還元末端にＧＤ３と同じ糖鎖を持つ
３’，８’−ＬＤ１が発現していること、また３’，
８’−ＬＤ１と反応するＩｇＭクラスのモノクローナル
抗体について報告されており〔アクタ・ニューロパソロ
ジカ(Acta Neuropathol.) 79, 317 (1989)〕、３’，
８’−ＬＤ１も癌抗原の一つとして重要なものと考えら
れる。
ア細胞腫において非還元末端にＧＤ３と同じ糖鎖を持つ
３’，８’−ＬＤ１が発現していること、また３’，
８’−ＬＤ１と反応するＩｇＭクラスのモノクローナル
抗体について報告されており〔アクタ・ニューロパソロ
ジカ(Acta Neuropathol.) 79, 317 (1989)〕、３’，
８’−ＬＤ１も癌抗原の一つとして重要なものと考えら
れる。
【０００８】またガングリオシドＧＤ３および３’，
８’−ＬＤ１の両抗原に交差反応を示すＩｇＭクラスの
モノクローナル抗体は知られている〔アクタ・ニューロ
パソロジカ（Acta Neuropathol) 79, 317(1989) 〕が、
ＩｇＧクラスのモノクローナル抗体は知られていない。
８’−ＬＤ１の両抗原に交差反応を示すＩｇＭクラスの
モノクローナル抗体は知られている〔アクタ・ニューロ
パソロジカ（Acta Neuropathol) 79, 317(1989) 〕が、
ＩｇＧクラスのモノクローナル抗体は知られていない。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】ガングリオシドＧＤ３
および３’，８’−ＬＤ１に反応し、かつＩｇＧクラス
に属するモノクローナル抗体が得られれば、神経外胚葉
系由来の癌治療に有用である。
および３’，８’−ＬＤ１に反応し、かつＩｇＧクラス
に属するモノクローナル抗体が得られれば、神経外胚葉
系由来の癌治療に有用である。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明者は、ガングリオ
シドＧＤ３またはＧＤ３発現細胞を免疫原として樹立し
たハイブリドーマが生産するＩｇＧクラスのモノクロー
ナル抗体が、ガングリオシドＧＤ３および３’，８’−
ＬＤ１に反応し、殺細胞活性を有することから、癌の治
療上有用であることを見いだし本発明を完成させた。
シドＧＤ３またはＧＤ３発現細胞を免疫原として樹立し
たハイブリドーマが生産するＩｇＧクラスのモノクロー
ナル抗体が、ガングリオシドＧＤ３および３’，８’−
ＬＤ１に反応し、殺細胞活性を有することから、癌の治
療上有用であることを見いだし本発明を完成させた。
【００１１】本発明は、ＩｇＧ３に属し、少なくとも１
種のガングリオシドＧＤ３および３’，８’−ＬＤ１に
反応するモノクローナル抗体を提供する。本発明におけ
るガングリオシドＧＤ３は、ＮｅｕＡｃα２→８Ｎｅｕ
Ａｃα２→３Ｇａｌ糖鎖、ＮｅｕＡｃα２→８ＮｅｕＧ
ｃα２→３Ｇａｌ糖鎖、ＮｅｕＧｃα２→８ＮｅｕＡｃ
α２→３Ｇａｌ糖鎖またはＮｅｕＧｃα２→８ＮｅｕＧ
ｃα２→３Ｇａｌ糖鎖を有するガングリオシドＧＤ３か
ら選ばれる。
種のガングリオシドＧＤ３および３’，８’−ＬＤ１に
反応するモノクローナル抗体を提供する。本発明におけ
るガングリオシドＧＤ３は、ＮｅｕＡｃα２→８Ｎｅｕ
Ａｃα２→３Ｇａｌ糖鎖、ＮｅｕＡｃα２→８ＮｅｕＧ
ｃα２→３Ｇａｌ糖鎖、ＮｅｕＧｃα２→８ＮｅｕＡｃ
α２→３Ｇａｌ糖鎖またはＮｅｕＧｃα２→８ＮｅｕＧ
ｃα２→３Ｇａｌ糖鎖を有するガングリオシドＧＤ３か
ら選ばれる。
【００１２】本発明のモノクローナル抗体は、ガングリ
オシドＧＤ３またはガングリオシドＧＤ３を発現した癌
細胞で免疫したマウスの脾細胞とマウス骨髄腫細胞株と
を融合させてハイブリドーマを作製し、ガングリオシド
ＧＤ３および３’，８’−ＬＤ１に反応性を有するモノ
クローナル抗体を生産するハイブリドーマを選択し、該
ハイブリドーマを培地中に培養するか、マウスに投与し
て該マウスを腹水癌化し、該培養物または腹水より採取
することにより得られる。
オシドＧＤ３またはガングリオシドＧＤ３を発現した癌
細胞で免疫したマウスの脾細胞とマウス骨髄腫細胞株と
を融合させてハイブリドーマを作製し、ガングリオシド
ＧＤ３および３’，８’−ＬＤ１に反応性を有するモノ
クローナル抗体を生産するハイブリドーマを選択し、該
ハイブリドーマを培地中に培養するか、マウスに投与し
て該マウスを腹水癌化し、該培養物または腹水より採取
することにより得られる。
【００１３】本発明のモノクローナル抗体を生産するハ
イブリドーマの具体例としては、ハイブリドーマＫＭ−
６４１、ＫＭ−６４３およびＫＭ−６４４（平成２年９
月27日付で工業技術院微生物工業技術研究所にFERM BP-
3116, FERM BP-3117およびFERM BP-3118 としてそれぞ
れ寄託してある) があげられ、それぞれのハイブリドー
マが生産するモノクローナル抗体をＫＭ−６４１，ＫＭ
−６４３およびＫＭ−６４４と称する。
イブリドーマの具体例としては、ハイブリドーマＫＭ−
６４１、ＫＭ−６４３およびＫＭ−６４４（平成２年９
月27日付で工業技術院微生物工業技術研究所にFERM BP-
3116, FERM BP-3117およびFERM BP-3118 としてそれぞ
れ寄託してある) があげられ、それぞれのハイブリドー
マが生産するモノクローナル抗体をＫＭ−６４１，ＫＭ
−６４３およびＫＭ−６４４と称する。
【００１４】以下に本発明のモノクローナル抗体の製造
法を詳細に説明する。 (1) 動物の免疫と抗体産生細胞の調製 ３〜２０週令のマウスにガングリオシドＧＤ３抗原を免
疫して、その動物の脾、リンパ節、末梢血中の抗体産生
細胞を調製する。免疫の方法は、動物の皮下あるいは静
脈内あるいは腹腔内に、ガングリオシドＧＤ３を大腸菌
などの菌体などの担体に担持させて投与する方法、ガン
グリオシドＧＤ３を発現した癌細胞を投与する方法また
はガングリオシドＧＤ３をリピッドＡと共に、リン脂
質、コレステロールなどの脂質から成るリポソームに保
持させて投与する方法などがある。これらの投与は、１
回目の投与の後１〜２週間おきに５〜10回行う。各投与
後３〜７日目に眼底静脈叢より採血し、その血清がガン
グリオシドＧＤ３と反応することを以下に示す酵素免疫
測定法〔酵素免疫測定法（ELISA): 医学書院刊1976年〕
などで調べる。
法を詳細に説明する。 (1) 動物の免疫と抗体産生細胞の調製 ３〜２０週令のマウスにガングリオシドＧＤ３抗原を免
疫して、その動物の脾、リンパ節、末梢血中の抗体産生
細胞を調製する。免疫の方法は、動物の皮下あるいは静
脈内あるいは腹腔内に、ガングリオシドＧＤ３を大腸菌
などの菌体などの担体に担持させて投与する方法、ガン
グリオシドＧＤ３を発現した癌細胞を投与する方法また
はガングリオシドＧＤ３をリピッドＡと共に、リン脂
質、コレステロールなどの脂質から成るリポソームに保
持させて投与する方法などがある。これらの投与は、１
回目の投与の後１〜２週間おきに５〜10回行う。各投与
後３〜７日目に眼底静脈叢より採血し、その血清がガン
グリオシドＧＤ３と反応することを以下に示す酵素免疫
測定法〔酵素免疫測定法（ELISA): 医学書院刊1976年〕
などで調べる。
【００１５】酵素免疫測定法(ELISA法):９６穴のＥＩＡ
用プレート〔フロー・ラボラトリーズ（Flow Laborator
ies)社製〕にガングリオシドＧＤ３、リン脂質およびコ
レステロールを含むエタノール溶液を２０μl ／穴（ガ
ングリオシドとして２０pmol／穴) ずつ分注し、風乾
後、１％ＢＳＡ（牛血清アルブミン）を含むＰＢＳ（リ
ン酸二ナトリウム1.８３ｇ、リン酸一カリウム0.21ｇ、
塩化ナトリウム7.６５ｇ、蒸留水１ｌ、ｐＨ7.２）溶液
（ＢＳＡ−ＰＢＳ）を１００〜２００μl ／穴分注し、
４℃で１〜２晩放置して、プレート上に残った蛋白質と
の結合残基をブロック（ブロッキング）した。その後、
ＢＳＡ−ＰＢＳを捨て、レジン水あるいはＰＢＳでよく
洗浄した後、第１抗体として、ＢＳＡ−ＰＢＳで希釈し
た試料（マウス血清、ハイブリドーマ培養上清、精製モ
ノクローナル抗体）を１００μl ／穴分注し、４℃で１
晩放置する。レジン水で１回、２Ｍ塩化ナトリウム溶液
で６回洗浄した後、第２抗体としてウサギの抗マウスイ
ムノグロブリン抗体−ペルオキシダーゼ結合物〔ダコ
（ＤＡＫＯ）社製〕の４００倍希釈液を１００μl ／穴
分注し、室温で２時間放置する。
用プレート〔フロー・ラボラトリーズ（Flow Laborator
ies)社製〕にガングリオシドＧＤ３、リン脂質およびコ
レステロールを含むエタノール溶液を２０μl ／穴（ガ
ングリオシドとして２０pmol／穴) ずつ分注し、風乾
後、１％ＢＳＡ（牛血清アルブミン）を含むＰＢＳ（リ
ン酸二ナトリウム1.８３ｇ、リン酸一カリウム0.21ｇ、
塩化ナトリウム7.６５ｇ、蒸留水１ｌ、ｐＨ7.２）溶液
（ＢＳＡ−ＰＢＳ）を１００〜２００μl ／穴分注し、
４℃で１〜２晩放置して、プレート上に残った蛋白質と
の結合残基をブロック（ブロッキング）した。その後、
ＢＳＡ−ＰＢＳを捨て、レジン水あるいはＰＢＳでよく
洗浄した後、第１抗体として、ＢＳＡ−ＰＢＳで希釈し
た試料（マウス血清、ハイブリドーマ培養上清、精製モ
ノクローナル抗体）を１００μl ／穴分注し、４℃で１
晩放置する。レジン水で１回、２Ｍ塩化ナトリウム溶液
で６回洗浄した後、第２抗体としてウサギの抗マウスイ
ムノグロブリン抗体−ペルオキシダーゼ結合物〔ダコ
（ＤＡＫＯ）社製〕の４００倍希釈液を１００μl ／穴
分注し、室温で２時間放置する。
【００１６】ＰＢＳでよく洗浄後、ＡＢＴＳ基質液
〔２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン
−６−スルホン酸）−２−アンモニウム５５０mgを0.１
Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ4.２）１ｌに溶かした溶液に、
使用直前に過酸化水素１μl ／mlを加えた溶液〕を用
い、発色をＯＤ415nm の吸光度で測定する。細胞融合に
供するにあたって、最終抗原物質投与の３〜４日後に免
疫化マウスより脾臓細胞を摘出し、脾細胞を調製する。
脾臓をＭＥＭ（日水製薬社製）中で細断し、ピンセット
でほぐし、遠心分離（1200rpm 、５分) した後、上清を
捨て、トリス−塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ7.６５）
で１〜２分間処理し赤血球を除去し、ＭＥＭで３回洗浄
して融合用脾細胞として提供する。
〔２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン
−６−スルホン酸）−２−アンモニウム５５０mgを0.１
Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ4.２）１ｌに溶かした溶液に、
使用直前に過酸化水素１μl ／mlを加えた溶液〕を用
い、発色をＯＤ415nm の吸光度で測定する。細胞融合に
供するにあたって、最終抗原物質投与の３〜４日後に免
疫化マウスより脾臓細胞を摘出し、脾細胞を調製する。
脾臓をＭＥＭ（日水製薬社製）中で細断し、ピンセット
でほぐし、遠心分離（1200rpm 、５分) した後、上清を
捨て、トリス−塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ7.６５）
で１〜２分間処理し赤血球を除去し、ＭＥＭで３回洗浄
して融合用脾細胞として提供する。
【００１７】(2) 骨髄腫細胞の調製 骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞を使
用する。たとえば、８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡ
ＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８−Ｕ１
（Ｐ３−Ｕ１）〔カレント・トピックス・イン・ミクロ
バイオロジィ・アンド・イムノロジィ（Current Topics
in Microbiology and Immunology)81,1−7(1987) 〕
〔ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロジィ（Eu
ropeanJ.Immunology) 6 , 511 −519(1976) 〕、ＳＰ２
／０−Ａｇ１４（ＳＰ−２）〔ネイチャー（Nature) 27
6 , 269−270 (1978)〕、P3−X63 −Ag8653 (653)
〔ジャーナル・オブ・イムノロジィ（J.Immunology) 12
3,1548−1550(1979)〕、P3−X63 −Ag8(X63)〔ネイチャ
ー(Nature) 256 ,495 −497(1975) 〕などが用いられ
る。これらの細胞株は、８−アザグアニン培地〔RPMI-1
640 培地にグルタミン(1.5mM) 、２−メルカプトエタノ
ール（５×10-5M)、ジェンタマイシン(10 μl ／ml) お
よび牛胎児血清（ＦＣＳ）（ＣＳＬ社製、10%)を加えた
正常培地に、さらに８−アザグアニン（15μg ／ml）を
加えた培地〕で継代するが、細胞融合の３〜４日前に正
常培地に継代し、融合当日２×107 個以上の細胞数を確
保する。
用する。たとえば、８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡ
ＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８−Ｕ１
（Ｐ３−Ｕ１）〔カレント・トピックス・イン・ミクロ
バイオロジィ・アンド・イムノロジィ（Current Topics
in Microbiology and Immunology)81,1−7(1987) 〕
〔ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロジィ（Eu
ropeanJ.Immunology) 6 , 511 −519(1976) 〕、ＳＰ２
／０−Ａｇ１４（ＳＰ−２）〔ネイチャー（Nature) 27
6 , 269−270 (1978)〕、P3−X63 −Ag8653 (653)
〔ジャーナル・オブ・イムノロジィ（J.Immunology) 12
3,1548−1550(1979)〕、P3−X63 −Ag8(X63)〔ネイチャ
ー(Nature) 256 ,495 −497(1975) 〕などが用いられ
る。これらの細胞株は、８−アザグアニン培地〔RPMI-1
640 培地にグルタミン(1.5mM) 、２−メルカプトエタノ
ール（５×10-5M)、ジェンタマイシン(10 μl ／ml) お
よび牛胎児血清（ＦＣＳ）（ＣＳＬ社製、10%)を加えた
正常培地に、さらに８−アザグアニン（15μg ／ml）を
加えた培地〕で継代するが、細胞融合の３〜４日前に正
常培地に継代し、融合当日２×107 個以上の細胞数を確
保する。
【００１８】(3) 細胞融合 (1) で免疫した抗体産生細胞と(2) で得られた骨髄腫細
胞をＭＥＭ培地またはＰＢＳでよく洗浄し、細胞数が、
抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝５〜１０：１になるよう混
合し、遠心分離（1,200rpm、5 分) した後、上清を捨
て、沈澱した細胞群をよくほぐした後、攪拌しながら、
３７℃で、ポリエチレングライコール−1,０００（ＰＥ
Ｇ−1,000)２ｇ、ＭＥＭ２mlおよびジメチルスルホキシ
ド0.７mlの混液0.2 〜１ml／103 抗体産生細胞を加え、
１〜２分間毎にＭＥＭ１〜２mlを数回加えた後、ＭＥＭ
を加えて全量が５０mlになるようにする。遠心分離（90
0rpm、５分) 後、上清を捨て、ゆるやかに細胞をほぐし
た後、正常培地（FCS 10% を含むRPMI1640培地）１００
mlを加え、メスピペットによる吸込み、吹出しでゆるや
かに細胞を懸濁する。
胞をＭＥＭ培地またはＰＢＳでよく洗浄し、細胞数が、
抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝５〜１０：１になるよう混
合し、遠心分離（1,200rpm、5 分) した後、上清を捨
て、沈澱した細胞群をよくほぐした後、攪拌しながら、
３７℃で、ポリエチレングライコール−1,０００（ＰＥ
Ｇ−1,000)２ｇ、ＭＥＭ２mlおよびジメチルスルホキシ
ド0.７mlの混液0.2 〜１ml／103 抗体産生細胞を加え、
１〜２分間毎にＭＥＭ１〜２mlを数回加えた後、ＭＥＭ
を加えて全量が５０mlになるようにする。遠心分離（90
0rpm、５分) 後、上清を捨て、ゆるやかに細胞をほぐし
た後、正常培地（FCS 10% を含むRPMI1640培地）１００
mlを加え、メスピペットによる吸込み、吹出しでゆるや
かに細胞を懸濁する。
【００１９】この懸濁液を９６穴培養用プレートに１０
０μl ／穴ずつ分注し、５％ＣＯ2 インキュベーター
中、３７℃で２４時間培養する。培養プレートに100 μ
l ／穴のＨＡＴ培地〔正常培地にヒポキサンチン（１０
-4M)、チミジン（1.５×１０-5M)およびアミノプテリン
（４×１０-7M)を加えた培地〕を加え、さらに２４時間
培養する。以後２日間、２４時間毎に、培養上清１００
μl を捨て、新たに同量のＨＡＴ培地を加え、５％ＣＯ
2 インキュベーター中、３７℃で１０〜１４日間培養す
る。
０μl ／穴ずつ分注し、５％ＣＯ2 インキュベーター
中、３７℃で２４時間培養する。培養プレートに100 μ
l ／穴のＨＡＴ培地〔正常培地にヒポキサンチン（１０
-4M)、チミジン（1.５×１０-5M)およびアミノプテリン
（４×１０-7M)を加えた培地〕を加え、さらに２４時間
培養する。以後２日間、２４時間毎に、培養上清１００
μl を捨て、新たに同量のＨＡＴ培地を加え、５％ＣＯ
2 インキュベーター中、３７℃で１０〜１４日間培養す
る。
【００２０】コロニー状に生育してきた融合細胞の認め
られる穴について、上清１００μlを捨て、ＨＴ培地
（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた培地）を同量
加え、以後２日間、２４時間毎にＨＴ培地への変換を行
う。ＨＴ培地で３〜４日間培養後、培養上清の一部をと
り上記の酵素免疫測定法または、免疫組織学的判定法
（ＡＢＣ法）（酵素抗体法、学際企画刊、100 頁、1985
年) により、ガングリオシドＧＤ３に対する抗体価を測
定する。このとき、同様の方法でガングリオシドＧＭ３
などの他のガングリオシドとの反応性も測定し、ガング
リオシドＧＤ３に特異的に反応するものを選択する。ガ
ングリオシドＧＤ３に強く反応し、ガングリオシドＧＭ
３などの他のガングリオシドに反応しない穴について、
限界希釈法によりクローニングを２回繰り返し、安定し
てガングリオシドＧＤ３に強い抗体価の認められたもの
を抗ガングリオシドＧＤ３モノクローナル抗体産生ハイ
ブリドーマ株として選択する。
られる穴について、上清１００μlを捨て、ＨＴ培地
（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた培地）を同量
加え、以後２日間、２４時間毎にＨＴ培地への変換を行
う。ＨＴ培地で３〜４日間培養後、培養上清の一部をと
り上記の酵素免疫測定法または、免疫組織学的判定法
（ＡＢＣ法）（酵素抗体法、学際企画刊、100 頁、1985
年) により、ガングリオシドＧＤ３に対する抗体価を測
定する。このとき、同様の方法でガングリオシドＧＭ３
などの他のガングリオシドとの反応性も測定し、ガング
リオシドＧＤ３に特異的に反応するものを選択する。ガ
ングリオシドＧＤ３に強く反応し、ガングリオシドＧＭ
３などの他のガングリオシドに反応しない穴について、
限界希釈法によりクローニングを２回繰り返し、安定し
てガングリオシドＧＤ３に強い抗体価の認められたもの
を抗ガングリオシドＧＤ３モノクローナル抗体産生ハイ
ブリドーマ株として選択する。
【００２１】(4) モノクローナル抗体の調製 (3) で得られた抗ガングリオシドＧＤ３モノクローナル
抗体産生ハイブリドーマを、１０％ＦＣＳ添加 RPMI-16
40培地あるいは無血清培地で培養し、細胞がコンフルエ
ントになった時点で培養上清を回収する。この培養上清
を水酸化ナトリウムでpHを8.９に調整した後、カラムに
通塔する方法あるいはバッチ法によりプロティンＡ−セ
ファロース４Ｂ（ファルマシア社製）に吸着させる。前
者はｐＨ調整した培養上清をプロティンＡ−セファロー
ス４Ｂを充填したカラムに通塔し、バッチ法の場合は、
培養上清中にプロティンＡ−セファロース４Ｂを加えて
得られるゲルをカラムに充填する。このカラムを結合バ
ッファー（1.５Ｍグリシン、３Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ
8.９）で洗浄し、溶出バッファー（0.１Ｍクエン酸、ｐ
Ｈ4.０）で溶出して、ＩｇＧ画分を集め、水酸化ナトリ
ウムでpHを７〜８に調整後、２Ｍ塩化ナトリウム−ＰＢ
Ｓで透析して精製モノクローナル抗体とする。
抗体産生ハイブリドーマを、１０％ＦＣＳ添加 RPMI-16
40培地あるいは無血清培地で培養し、細胞がコンフルエ
ントになった時点で培養上清を回収する。この培養上清
を水酸化ナトリウムでpHを8.９に調整した後、カラムに
通塔する方法あるいはバッチ法によりプロティンＡ−セ
ファロース４Ｂ（ファルマシア社製）に吸着させる。前
者はｐＨ調整した培養上清をプロティンＡ−セファロー
ス４Ｂを充填したカラムに通塔し、バッチ法の場合は、
培養上清中にプロティンＡ−セファロース４Ｂを加えて
得られるゲルをカラムに充填する。このカラムを結合バ
ッファー（1.５Ｍグリシン、３Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ
8.９）で洗浄し、溶出バッファー（0.１Ｍクエン酸、ｐ
Ｈ4.０）で溶出して、ＩｇＧ画分を集め、水酸化ナトリ
ウムでpHを７〜８に調整後、２Ｍ塩化ナトリウム−ＰＢ
Ｓで透析して精製モノクローナル抗体とする。
【００２２】抗体のサブクラスの決定は、マウスモノク
ローナル抗体タイピングキット（ザイメット社製）を用
いて行う。蛋白量の定量は、フォーリン法および２８０
nmでの吸光度〔1.０（OD280)≒イムノグロブリン１mg／
ml〕より算出する。本発明の抗ガングリオシドＧＤ３モ
ノクローナル抗体は、高い反応特異性を有しているため
ガングリオシドＧＤ３の検出、解析などに有用な抗体で
ある。さらに該モノクローナル抗体は、それ自体で補体
依存的細胞障害活性（ＣＤＣ活性）および抗体依存的細
胞媒介障害活性（ＡＤＣＣ活性）を有し、ガングリオシ
ドＧＤ３および３’，８’−ＬＤ１を発現している腫瘍
細胞に結合することにより正常細胞を傷つけることなく
腫瘍細胞に対して殺細胞活性などの抗腫瘍効果を示すこ
とが期待される。
ローナル抗体タイピングキット（ザイメット社製）を用
いて行う。蛋白量の定量は、フォーリン法および２８０
nmでの吸光度〔1.０（OD280)≒イムノグロブリン１mg／
ml〕より算出する。本発明の抗ガングリオシドＧＤ３モ
ノクローナル抗体は、高い反応特異性を有しているため
ガングリオシドＧＤ３の検出、解析などに有用な抗体で
ある。さらに該モノクローナル抗体は、それ自体で補体
依存的細胞障害活性（ＣＤＣ活性）および抗体依存的細
胞媒介障害活性（ＡＤＣＣ活性）を有し、ガングリオシ
ドＧＤ３および３’，８’−ＬＤ１を発現している腫瘍
細胞に結合することにより正常細胞を傷つけることなく
腫瘍細胞に対して殺細胞活性などの抗腫瘍効果を示すこ
とが期待される。
【００２３】以下本発明の実施例を示す。
【００２４】
実施例１ (1) 抗原の調製 非還元末端にＮｅｕＡｃα２→８ＮｅｕＡｃα２→３Ｇ
ａｌ糖鎖の結合したガングリオシドＧＤ３（ヤトロン社
製）５μg 、ジパルミトイルフォスファチジルコリン
（シグマ社製）0.５μmol 、コレステロール（ナカライ
テスク社製）0.５μmol 、ジパルミトイルフォスファチ
ジリック酸（シグマ社製）0.０５μmol およびリピッド
Ａ（フナコシ薬品社製）2.５μg をクロロホルム／メタ
ノール （２／１）溶液３０mlに溶解し、４５℃に加温
して溶媒除去し、均一な脂質薄膜を形成させた。さらに
真空ポンプで１時間吸引して完全に溶媒を除き、0.５ml
のＰＢＳを加え４５℃で攪拌し抗原溶液を得た。
ａｌ糖鎖の結合したガングリオシドＧＤ３（ヤトロン社
製）５μg 、ジパルミトイルフォスファチジルコリン
（シグマ社製）0.５μmol 、コレステロール（ナカライ
テスク社製）0.５μmol 、ジパルミトイルフォスファチ
ジリック酸（シグマ社製）0.０５μmol およびリピッド
Ａ（フナコシ薬品社製）2.５μg をクロロホルム／メタ
ノール （２／１）溶液３０mlに溶解し、４５℃に加温
して溶媒除去し、均一な脂質薄膜を形成させた。さらに
真空ポンプで１時間吸引して完全に溶媒を除き、0.５ml
のＰＢＳを加え４５℃で攪拌し抗原溶液を得た。
【００２５】(2) 抗体産生細胞の調製 (1) で調製した抗原溶液0.５mlをマウスの尾静脈に１週
に１回、計７回投与し免疫した。さらにガングリオシド
ＧＤ３陽性細胞 SK-MEL-28(ATCC HTB 72) (1×107 個）
を１週に１回計３回腹腔内投与し免疫した。最終投与後
の３日目にマウスよりそれぞれ脾細胞を調製して、細胞
融合に供した。
に１回、計７回投与し免疫した。さらにガングリオシド
ＧＤ３陽性細胞 SK-MEL-28(ATCC HTB 72) (1×107 個）
を１週に１回計３回腹腔内投与し免疫した。最終投与後
の３日目にマウスよりそれぞれ脾細胞を調製して、細胞
融合に供した。
【００２６】(3) マウス骨髄腫細胞の調製 ８−アザグアニン耐性マウス骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｕ１を
正常培地で培養し、細胞融合時に２×107 以上の細胞を
得、細胞融合に親株として供した。
正常培地で培養し、細胞融合時に２×107 以上の細胞を
得、細胞融合に親株として供した。
【００２７】(4) ハイブリドーマの作製 (2) と(3) で得られた脾細胞と骨髄腫細胞とを１０：１
の割合で用い、前述した方法で融合させ、ＨＡＴ培地で
３７℃、１４日間ＣＯ2 ５％下で培養した。融合細胞を
選択し、ＨＴ培地に変えてさらに培養した後、ガングリ
オシドＧＤ３に対する抗体価を測定して、活性な穴を選
び、さらに正常培地に変え、２回クローニングを繰り返
して、酵素免疫測定法または、免疫組織学的判定法（AB
C 法) により、ガングリオシドＧＤ３に特異的に反応す
るハイブリドーマを選択した。すなわち、ガングリオシ
ドＧＭ３｛犬の赤血球よりノーレス(Nores) 等の方法
〔ジャーナル・イミュノロジー(J.Immunol.)139 , 3171
(1987)〕に従って精製したもの｝およびガングリオシド
ＧＤ３（ヤトロン社製）それぞれ２ngを５ngのフォスフ
ァチジルコリン（シグマ社製）と2.５ngのコレステロー
ル（シグマ社製）とを含む２mlのエタノール溶液に溶解
した。このうち２０mlを９６穴マイクロタイタープレー
ト( フローラボラトリーズ社製) の各穴にそれぞれ分注
し、風乾後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液でブロッキングを
行った。ハイブリドーマの培養上清をガングリオシドＧ
Ｄ３を吸着させたプレートとガングリオシドＧＭ３を吸
着させたプレートに各５０μl ずつ分注し、１８時間、
４℃で反応させた。
の割合で用い、前述した方法で融合させ、ＨＡＴ培地で
３７℃、１４日間ＣＯ2 ５％下で培養した。融合細胞を
選択し、ＨＴ培地に変えてさらに培養した後、ガングリ
オシドＧＤ３に対する抗体価を測定して、活性な穴を選
び、さらに正常培地に変え、２回クローニングを繰り返
して、酵素免疫測定法または、免疫組織学的判定法（AB
C 法) により、ガングリオシドＧＤ３に特異的に反応す
るハイブリドーマを選択した。すなわち、ガングリオシ
ドＧＭ３｛犬の赤血球よりノーレス(Nores) 等の方法
〔ジャーナル・イミュノロジー(J.Immunol.)139 , 3171
(1987)〕に従って精製したもの｝およびガングリオシド
ＧＤ３（ヤトロン社製）それぞれ２ngを５ngのフォスフ
ァチジルコリン（シグマ社製）と2.５ngのコレステロー
ル（シグマ社製）とを含む２mlのエタノール溶液に溶解
した。このうち２０mlを９６穴マイクロタイタープレー
ト( フローラボラトリーズ社製) の各穴にそれぞれ分注
し、風乾後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液でブロッキングを
行った。ハイブリドーマの培養上清をガングリオシドＧ
Ｄ３を吸着させたプレートとガングリオシドＧＭ３を吸
着させたプレートに各５０μl ずつ分注し、１８時間、
４℃で反応させた。
【００２８】以下公知の方法〔キャンサー・リサーチ
（Cancer Res.)46 ,4438(1986)〕に従い反応を行い、ガ
ングリオシドＧＭ３に反応せず、ガングリオシドＧＤ３
に特異的に反応するマウスモノクローナル抗体を産生す
るハイブリドーマ株を選択した。ここで、該マウスモノ
クローナル抗体をマウスモノクローナル抗体ＫＭ−６４
１、ＫＭ−６４３およびＫＭ−６４４とする。
（Cancer Res.)46 ,4438(1986)〕に従い反応を行い、ガ
ングリオシドＧＭ３に反応せず、ガングリオシドＧＤ３
に特異的に反応するマウスモノクローナル抗体を産生す
るハイブリドーマ株を選択した。ここで、該マウスモノ
クローナル抗体をマウスモノクローナル抗体ＫＭ−６４
１、ＫＭ−６４３およびＫＭ−６４４とする。
【００２９】(5) モノクローナル抗体の精製 (a) プロティンＡ−セファロース４Ｂの調製 ブロムシアン活性化セファロース４Ｂ（ファルマシア社
製）１５ｇ（乾燥粉末）を１ｍＭ塩酸１００ml中で１５
分間膨潤させ、１ｍＭ塩酸３ｌで洗浄して得られたゲル
を結合バッファー〔0.５Ｍ塩化ナトリウム、0.１Ｍ炭酸
水素ナトリウム、ｐＨ8.３〕７５mlで洗浄し、ゲル懸濁
液とした。
製）１５ｇ（乾燥粉末）を１ｍＭ塩酸１００ml中で１５
分間膨潤させ、１ｍＭ塩酸３ｌで洗浄して得られたゲル
を結合バッファー〔0.５Ｍ塩化ナトリウム、0.１Ｍ炭酸
水素ナトリウム、ｐＨ8.３〕７５mlで洗浄し、ゲル懸濁
液とした。
【００３０】一方、あらかじめ上記と同じ組成の結合バ
ッファーに溶解しておいたプロティンＡ（ファルマシア
社製）５００mgを上記ゲル懸濁液にすばやく混ぜ、室温
で２時間穏やかに攪拌した。攪拌後、ゲルとブロッキン
グ試薬（0.２Ｍグリシン、ｐＨ8.０）２００mlとを室温
で２時間反応させ、残りの活性基をブロックした。さら
に過剰の吸着タンパクを除去するため、１００mlの0.５
Ｍ塩化ナトリウム−0.１Ｍ酢酸緩衝液（pH4.０）と１０
０mlの0.５Ｍ塩化ナトリウム−結合バッファーとで交互
に５回洗浄して５０mlのプロティンＡ−セファロース４
Ｂ（ゲル）を得た。
ッファーに溶解しておいたプロティンＡ（ファルマシア
社製）５００mgを上記ゲル懸濁液にすばやく混ぜ、室温
で２時間穏やかに攪拌した。攪拌後、ゲルとブロッキン
グ試薬（0.２Ｍグリシン、ｐＨ8.０）２００mlとを室温
で２時間反応させ、残りの活性基をブロックした。さら
に過剰の吸着タンパクを除去するため、１００mlの0.５
Ｍ塩化ナトリウム−0.１Ｍ酢酸緩衝液（pH4.０）と１０
０mlの0.５Ｍ塩化ナトリウム−結合バッファーとで交互
に５回洗浄して５０mlのプロティンＡ−セファロース４
Ｂ（ゲル）を得た。
【００３１】(b) 細胞培養上清の取得 ＫＭ−６４１、ＫＭ−６４３およびＫＭ−６４４ハイブ
リドーマをそれぞれ無血清培地〔培地１ｌ中、RPMI-164
0 （日水製薬社製）１0.４ｇ、7.５％炭酸水素ナトリウ
ム２０ml、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−
Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ) １０ｍＭ、
グルタミン0.２９ｇ、インシュリン（シグマ社製）３m
g、トランスフェリン（シグマ社製）５μl 、ピルビン
酸ナトリウム１５ｍＭ、アセレン酸ナトリウム125 ｎ
Ｍ、ガラクトース１ｇおよびペポールＢ−１８８（東邦
千葉化学社製）0.１％を含む〕で３７℃で培養し、細胞
がコンフルエントになった時点で培養上清を回収し、−
２０℃に冷凍保存した。
リドーマをそれぞれ無血清培地〔培地１ｌ中、RPMI-164
0 （日水製薬社製）１0.４ｇ、7.５％炭酸水素ナトリウ
ム２０ml、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−
Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ) １０ｍＭ、
グルタミン0.２９ｇ、インシュリン（シグマ社製）３m
g、トランスフェリン（シグマ社製）５μl 、ピルビン
酸ナトリウム１５ｍＭ、アセレン酸ナトリウム125 ｎ
Ｍ、ガラクトース１ｇおよびペポールＢ−１８８（東邦
千葉化学社製）0.１％を含む〕で３７℃で培養し、細胞
がコンフルエントになった時点で培養上清を回収し、−
２０℃に冷凍保存した。
【００３２】(c) 細胞培養上清からの抗体の精製 冷凍保存した培養上清（各々ＫＭ−６４１ ６０ｌ、Ｋ
Ｍ−６４３ １８ｌ、ＫＭ−６４４ ３３ｌ）を解凍
し、水酸化ナトリウムでｐＨを8.９に調整し、それぞれ
にフェニルメチルスルフォニルフルオライド（ＰＭＳ
Ｆ，ナカライテスク社製）およびエチレンジアミン四酢
酸−２ナトリウム（ＥＤＴＡ、和光純薬社製）を、最終
濃度が0.１ｍＭおよび５ｍＭとなるよう加え、よく混合
した後ろ過して細胞片を除去した。これらの培養上清に
(a) で調製したプロティンＡ−セファロース４Ｂ（ゲ
ル）４０mlを各々加え、４℃で１２〜２０時間攪拌し
た。培養上清中よりゲルを回収してカラムに充填し、結
合バッファー（1.５Ｍグリシン、３Ｍ塩化ナトリウム、
ｐＨ8.９）６００mlで洗浄し、溶出バッファー（0.１Ｍ
クエン酸、ｐＨ4.０）２００mlで溶出した。それぞれ溶
出液１０mlを１画分とし、その吸光度（ＯＤ280nm ) を
測定することによりＩｇＧ画分の確認を行った。さらに
ＩｇＧ画分を集め、水酸化ナトリウムでｐＨを７〜８に
調整後、２Ｍ塩化ナトリウム−ＰＢＳで透析を行い、精
製モノクローナル抗体とした。
Ｍ−６４３ １８ｌ、ＫＭ−６４４ ３３ｌ）を解凍
し、水酸化ナトリウムでｐＨを8.９に調整し、それぞれ
にフェニルメチルスルフォニルフルオライド（ＰＭＳ
Ｆ，ナカライテスク社製）およびエチレンジアミン四酢
酸−２ナトリウム（ＥＤＴＡ、和光純薬社製）を、最終
濃度が0.１ｍＭおよび５ｍＭとなるよう加え、よく混合
した後ろ過して細胞片を除去した。これらの培養上清に
(a) で調製したプロティンＡ−セファロース４Ｂ（ゲ
ル）４０mlを各々加え、４℃で１２〜２０時間攪拌し
た。培養上清中よりゲルを回収してカラムに充填し、結
合バッファー（1.５Ｍグリシン、３Ｍ塩化ナトリウム、
ｐＨ8.９）６００mlで洗浄し、溶出バッファー（0.１Ｍ
クエン酸、ｐＨ4.０）２００mlで溶出した。それぞれ溶
出液１０mlを１画分とし、その吸光度（ＯＤ280nm ) を
測定することによりＩｇＧ画分の確認を行った。さらに
ＩｇＧ画分を集め、水酸化ナトリウムでｐＨを７〜８に
調整後、２Ｍ塩化ナトリウム−ＰＢＳで透析を行い、精
製モノクローナル抗体とした。
【００３３】(6) サブクラスの決定 マウスモノクローナル抗体タイピングキット（ザイメッ
ト社製）を用いて、ＥＬＩＳＡ法によりマウスモノクロ
ーナル抗体ＫＭ−６４１、ＫＭ−６４３およびＫＭ−６
４４のサブクラスをＩｇＧ３と決定した。
ト社製）を用いて、ＥＬＩＳＡ法によりマウスモノクロ
ーナル抗体ＫＭ−６４１、ＫＭ−６４３およびＫＭ−６
４４のサブクラスをＩｇＧ３と決定した。
【００３４】(7) ＫＭ−６４１、ＫＭ−６４３およびＫ
Ｍ−６４４の特異性の検定 ＫＭ−６４１、ＫＭ−６４３およびＫＭ−６４４の特異
性の検定に用いる標準としてのガングリオシド Ｎ−ア
セチルガラクトサミン( Ｇａ１ＮＡｃ）ＧＭ１ｂ、ＧＤ
１ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ｂはシグマ社製（ガングリオシ
ド タイプＶ）、ガングリオシドＧＤ３、Ｎ−アセチル
ＧＭ２はヤトロン社製のものをそれぞれ用いた。ガング
リオシドＧＭ３、ＧＭ１、Ｎ−グリコリルＧＭ２、ＧＤ
２は、それぞれ犬赤血球、ウシ脳、マウス肝、培養細胞
株 ＩＭＲ32（ＡＴＣＣ ＣＣＬ１２７）より公知の方
法〔ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー
（Journal of Biological Chemistry) 263 ,10915, 20
79(1988)〕に準じて作製した。
Ｍ−６４４の特異性の検定 ＫＭ−６４１、ＫＭ−６４３およびＫＭ−６４４の特異
性の検定に用いる標準としてのガングリオシド Ｎ−ア
セチルガラクトサミン( Ｇａ１ＮＡｃ）ＧＭ１ｂ、ＧＤ
１ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ｂはシグマ社製（ガングリオシ
ド タイプＶ）、ガングリオシドＧＤ３、Ｎ−アセチル
ＧＭ２はヤトロン社製のものをそれぞれ用いた。ガング
リオシドＧＭ３、ＧＭ１、Ｎ−グリコリルＧＭ２、ＧＤ
２は、それぞれ犬赤血球、ウシ脳、マウス肝、培養細胞
株 ＩＭＲ32（ＡＴＣＣ ＣＣＬ１２７）より公知の方
法〔ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー
（Journal of Biological Chemistry) 263 ,10915, 20
79(1988)〕に準じて作製した。
【００３５】ＫＭ−６４１、ＫＭ−６４３およびＫＭ−
６４４の特異性は、以下のＴＬＣ（薄層クロマトグラフ
ィー）免疫染色および酵素免疫測定法で調べた。 (a) ＴＬＣ免疫染色 ＴＬＣ免疫染色は、公知の方法〔ジャーナル・オブ・バ
イオロジカル・ケミストリー（J.Biol. Chem.) 257, 14
365(1982) 〕に準じＴＬＣレソシノール（メルク社製）
染色法により行った。すなわち、ガングリオシドＧＭ
３、ＧＭ２、ＧＭ１、ＧＤ３、ＧＤ１ａ、ＧａｌＮＡｃ
ＧＭ１ｂ、３’，８’−ＬＤ１およびＧＴ１ｂをＨＴＰ
ＬＣプレート（ワットマン社製）にスポットし、クロロ
ホルム：メタノール：0.２５％塩化カルシウム水溶液
( ５０：４０：１０) の展開溶媒で展開し、0.５％ポリ
イソブチルメタクリレイト（アルドリッチ社製）エタノ
ール溶液に浸潤、乾燥後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液で１
時間ブロッキングした。次いで第１抗体として各々ＫＭ
−６４１、ＫＭ−６４３およびＫＭ−６４４（１０μg
／ml）の１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液で１８時間室温で反応
させ、ＰＢＳ溶液で洗浄後、第２抗体としてビオチン化
抗マウスイミュノグロブリン抗体（ダコ社製）を加えて
１時間反応させた。さらにＰＢＳ溶液で洗浄後、アビジ
ン・ペルオキシダーゼ（ダコ社製）を１時間反応させ、
ＨＲＰカラーデベロプメント試薬（バイオラット社製）
を用いて発色させた。
６４４の特異性は、以下のＴＬＣ（薄層クロマトグラフ
ィー）免疫染色および酵素免疫測定法で調べた。 (a) ＴＬＣ免疫染色 ＴＬＣ免疫染色は、公知の方法〔ジャーナル・オブ・バ
イオロジカル・ケミストリー（J.Biol. Chem.) 257, 14
365(1982) 〕に準じＴＬＣレソシノール（メルク社製）
染色法により行った。すなわち、ガングリオシドＧＭ
３、ＧＭ２、ＧＭ１、ＧＤ３、ＧＤ１ａ、ＧａｌＮＡｃ
ＧＭ１ｂ、３’，８’−ＬＤ１およびＧＴ１ｂをＨＴＰ
ＬＣプレート（ワットマン社製）にスポットし、クロロ
ホルム：メタノール：0.２５％塩化カルシウム水溶液
( ５０：４０：１０) の展開溶媒で展開し、0.５％ポリ
イソブチルメタクリレイト（アルドリッチ社製）エタノ
ール溶液に浸潤、乾燥後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液で１
時間ブロッキングした。次いで第１抗体として各々ＫＭ
−６４１、ＫＭ−６４３およびＫＭ−６４４（１０μg
／ml）の１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液で１８時間室温で反応
させ、ＰＢＳ溶液で洗浄後、第２抗体としてビオチン化
抗マウスイミュノグロブリン抗体（ダコ社製）を加えて
１時間反応させた。さらにＰＢＳ溶液で洗浄後、アビジ
ン・ペルオキシダーゼ（ダコ社製）を１時間反応させ、
ＨＲＰカラーデベロプメント試薬（バイオラット社製）
を用いて発色させた。
【００３６】ＫＭ−６４１、ＫＭ−６４４はＧＤ３およ
び ３’，８’−ＬＤ１に反応した。また、ＫＭ−６４
３はＧＤ３、３’，８’−ＬＤ１、ＧＤ１ｂおよびＧＴ
１ｂに反応した。
び ３’，８’−ＬＤ１に反応した。また、ＫＭ−６４
３はＧＤ３、３’，８’−ＬＤ１、ＧＤ１ｂおよびＧＴ
１ｂに反応した。
【００３７】(b) 酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法） ガングリオシドＮ−アセチルＧＭ３、Ｎ−グリコリルＧ
Ｍ３、Ｎ−アセチルＧＭ２、Ｎ−グリコリルＧＭ２、Ｇ
Ｍ１、ＧＤ３、ＧＤ１ａ、ＧＤ２、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ｂ
およびＧＱ１ｂをそれぞれ抗原として９６穴のＥＩＡ用
プレート〔フロー・ラボラトリーズ（Flow Laboratorie
s)社製〕の各穴に吸着させ、前述のＥＬＩＳＡ法で各種
ガングリオシドとＫＭ−６４１、ＫＭ−６４３およびＫ
Ｍ−６４４との反応性を調べた。
Ｍ３、Ｎ−アセチルＧＭ２、Ｎ−グリコリルＧＭ２、Ｇ
Ｍ１、ＧＤ３、ＧＤ１ａ、ＧＤ２、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ｂ
およびＧＱ１ｂをそれぞれ抗原として９６穴のＥＩＡ用
プレート〔フロー・ラボラトリーズ（Flow Laboratorie
s)社製〕の各穴に吸着させ、前述のＥＬＩＳＡ法で各種
ガングリオシドとＫＭ−６４１、ＫＭ−６４３およびＫ
Ｍ−６４４との反応性を調べた。
【００３８】コントロールとしてＥＩＡ用プレートにホ
スファチジルコリンおよびコレステロールを含むエタノ
ール溶液を２０μl ／穴分注し、以下上記と同様の方法
により行い吸光度を測定した。結果を第１表に示す。
スファチジルコリンおよびコレステロールを含むエタノ
ール溶液を２０μl ／穴分注し、以下上記と同様の方法
により行い吸光度を測定した。結果を第１表に示す。
【００３９】
【表１】
【００４０】ＫＭ−６４１はガングリオシドＧＤ３にの
み強く反応した。上記と同様の方法でＫＭ−６４３およ
びＫＭ−６４４と各種ガングリオシドとの反応性を調べ
た。また、コントロールも、上記と同様の方法により行
い、吸光度を測定した。結果を第２表および第３表に示
す。
み強く反応した。上記と同様の方法でＫＭ−６４３およ
びＫＭ−６４４と各種ガングリオシドとの反応性を調べ
た。また、コントロールも、上記と同様の方法により行
い、吸光度を測定した。結果を第２表および第３表に示
す。
【００４１】
【表２】
【００４２】
【表３】
【００４３】ＫＭ−６４３はガングリオシドＧＤ３およ
びＧＤ１ｂに強く反応を示した。またＫＭ−６４４はガ
ングリオシドＧＤ３に強く反応を示した。
びＧＤ１ｂに強く反応を示した。またＫＭ−６４４はガ
ングリオシドＧＤ３に強く反応を示した。
【００４４】実施例２ 蛍光抗体法によるＫＭ−６４１、ＫＭ−６４３およびＫ
Ｍ−６４４の反応性 ヒト悪性黒色腫培養細胞株ＳＫ−ＭＥＬ−２８（ＡＴＣ
Ｃ ＨＴＢ７２）、ＷＭ２６６−４（ＡＴＣＣ ＣＲＬ
１６７６）、ＫＨｍ−１／４〔ジャーナル・オブ・ナシ
ョナル・キャンサー・インスチテュート(J.of Natl.Can
cer Inst.), 59, 775(1977) 〕およびヒト神経芽細胞腫
培養細胞株IMR32 （ＡＴＣＣ ＣＣＬＫ１２７）をそれ
ぞれ１×106 個をマイクロチューブ（トレフ社製）にと
りＰＢＳで遠心分離（1200rpm 、５分）して細胞を洗浄
後、ＫＭ−６４１、ＫＭ−６４３またはＫＭ−６４４を
それぞれ５０μl （１０μl／ml）加えて攪拌し、４
℃、３０分間反応させた。反応後、ＰＢＳで３回遠心分
離（1200rpm 、５分）して洗浄した後、フルオレッセイ
ンイソチアシアネートで蛍光標識した抗マウスＩｇＧ抗
体およびＩｇＭ抗体（カッペル社製、２０倍希釈）２０
μl を加えて攪拌後、４℃、３０分間反応させた。反応
後、ＰＢＳで３回遠心分離（1200rpm 、５分）して洗浄
した後、さらにＰＢＳに懸濁し、フローセルソーターＦ
ＣＳ−１( 日本分光社製) で解析を行った。
Ｍ−６４４の反応性 ヒト悪性黒色腫培養細胞株ＳＫ−ＭＥＬ−２８（ＡＴＣ
Ｃ ＨＴＢ７２）、ＷＭ２６６−４（ＡＴＣＣ ＣＲＬ
１６７６）、ＫＨｍ−１／４〔ジャーナル・オブ・ナシ
ョナル・キャンサー・インスチテュート(J.of Natl.Can
cer Inst.), 59, 775(1977) 〕およびヒト神経芽細胞腫
培養細胞株IMR32 （ＡＴＣＣ ＣＣＬＫ１２７）をそれ
ぞれ１×106 個をマイクロチューブ（トレフ社製）にと
りＰＢＳで遠心分離（1200rpm 、５分）して細胞を洗浄
後、ＫＭ−６４１、ＫＭ−６４３またはＫＭ−６４４を
それぞれ５０μl （１０μl／ml）加えて攪拌し、４
℃、３０分間反応させた。反応後、ＰＢＳで３回遠心分
離（1200rpm 、５分）して洗浄した後、フルオレッセイ
ンイソチアシアネートで蛍光標識した抗マウスＩｇＧ抗
体およびＩｇＭ抗体（カッペル社製、２０倍希釈）２０
μl を加えて攪拌後、４℃、３０分間反応させた。反応
後、ＰＢＳで３回遠心分離（1200rpm 、５分）して洗浄
した後、さらにＰＢＳに懸濁し、フローセルソーターＦ
ＣＳ−１( 日本分光社製) で解析を行った。
【００４５】またＫＭ−６４１、ＫＭ−６４３およびＫ
Ｍ−６４４の代わりにＩｇＧ３に属する抗ガングリオシ
ドＧＤ３抗体Ｒ２４（ＭＥＬ−１、シグネット社）を用
いる以外は上記と同様の操作により解析を行った。対照
としてＫＭ−６４１、ＫＭ−６４３およびＫＭ−６４４
無添加で以下上記と同様の操作により解析を行った。
Ｍ−６４４の代わりにＩｇＧ３に属する抗ガングリオシ
ドＧＤ３抗体Ｒ２４（ＭＥＬ−１、シグネット社）を用
いる以外は上記と同様の操作により解析を行った。対照
としてＫＭ−６４１、ＫＭ−６４３およびＫＭ−６４４
無添加で以下上記と同様の操作により解析を行った。
【００４６】結果を図１および図２に示す。ＫＭ−６４
１、ＫＭ−６４３およびＫＭ−６４４の蛍光強度は、対
照のそれと比較するとピークの位置が右側（蛍光強度
強）に移動しており、抗体により若干反応性が異なる
が、これらの抗体はそれぞれ種々の細胞の表面に発現し
ている糖脂質糖鎖と直接反応していることが示された。
またＫＭ−６４１、ＫＭ−６４３およびＫＭ−６４４
は、抗ガングリオシドＧＤ３抗体Ｒ２４よりも強い反応
性を示した。
１、ＫＭ−６４３およびＫＭ−６４４の蛍光強度は、対
照のそれと比較するとピークの位置が右側（蛍光強度
強）に移動しており、抗体により若干反応性が異なる
が、これらの抗体はそれぞれ種々の細胞の表面に発現し
ている糖脂質糖鎖と直接反応していることが示された。
またＫＭ−６４１、ＫＭ−６４３およびＫＭ−６４４
は、抗ガングリオシドＧＤ３抗体Ｒ２４よりも強い反応
性を示した。
【００４７】実施例３ 補体依存的細胞障害活性(Complement Dependent Cytoto
xicity : CDC) (a) 標的細胞の調整 １０％ＦＣＳ添加RPMI-1640 培地に浮遊させた標的細胞
ガングリオシドＧＤ３陽性細胞Ｇ３６１（ＪＣＲＢ社
製）およびＳＫ−ＭＥＬ−２８をそれぞれ１×10 7 個／
mlに調整し、Ｎａ2 51 ＣｒＯ4 を１００μＣｉ／１×10
7個になるように加え、３７℃で１時間反応後、培地で
３回洗浄した。次いで４℃、３０分間培地中に放置し、
自然解離させ、遠心分離（1200rpm 、５分) 後、培地を
加えて４×106 個／mlに調整した。
xicity : CDC) (a) 標的細胞の調整 １０％ＦＣＳ添加RPMI-1640 培地に浮遊させた標的細胞
ガングリオシドＧＤ３陽性細胞Ｇ３６１（ＪＣＲＢ社
製）およびＳＫ−ＭＥＬ−２８をそれぞれ１×10 7 個／
mlに調整し、Ｎａ2 51 ＣｒＯ4 を１００μＣｉ／１×10
7個になるように加え、３７℃で１時間反応後、培地で
３回洗浄した。次いで４℃、３０分間培地中に放置し、
自然解離させ、遠心分離（1200rpm 、５分) 後、培地を
加えて４×106 個／mlに調整した。
【００４８】(b) 補体の吸収 ウサギ補体の凍結乾燥品（セダーレーンラボラトリー社
製）を水に溶かし、(a) で調整した標的細胞２×107 個
を加え、４℃、３０分間反応させた。これを遠心分離
（1200rpm 、５分) し、再び標的細胞２×107 個を加
え、上記と同様にして反応させた後、フィルターに通し
て細胞を除き、補体溶液とした。
製）を水に溶かし、(a) で調整した標的細胞２×107 個
を加え、４℃、３０分間反応させた。これを遠心分離
（1200rpm 、５分) し、再び標的細胞２×107 個を加
え、上記と同様にして反応させた後、フィルターに通し
て細胞を除き、補体溶液とした。
【００４９】(c) ＣＤＣ活性の測定 ９６穴Ｕ字底プレートにＫＭ−６４１、ＫＭ−６４３ま
たはＫＭ−６４４を各最終濃度0.０５μg ／ml〜５０μ
l ／mlの範囲でそれぞれ加え、各々に標的細胞２×105
個／穴を添加した。室温で１時間反応させ、遠心分離
（1200rpm 、５分) 後、上清を除去し、(b) で得られた
補体溶液５０μl を添加し、３７℃、１時間反応させ
た。遠心分離（1200rpm 、５分) 後、上清の51Ｃｒ量を
γ−カウンターにて測定した。自然解離51Ｃｒ量は、標
的細胞に抗体、補体溶液の代わりに培地のみを添加し、
上記と同様に上清の51Ｃｒ量を測定することにより求め
た。全遊離51Ｃｒ量は、補体溶液の代わりに５規定水酸
化ナトリウムを添加し、上記と同様に行い、上清の51Ｃ
ｒ量を測定することにより求めた。ＣＤＣ活性は、下式
により求めた。
たはＫＭ−６４４を各最終濃度0.０５μg ／ml〜５０μ
l ／mlの範囲でそれぞれ加え、各々に標的細胞２×105
個／穴を添加した。室温で１時間反応させ、遠心分離
（1200rpm 、５分) 後、上清を除去し、(b) で得られた
補体溶液５０μl を添加し、３７℃、１時間反応させ
た。遠心分離（1200rpm 、５分) 後、上清の51Ｃｒ量を
γ−カウンターにて測定した。自然解離51Ｃｒ量は、標
的細胞に抗体、補体溶液の代わりに培地のみを添加し、
上記と同様に上清の51Ｃｒ量を測定することにより求め
た。全遊離51Ｃｒ量は、補体溶液の代わりに５規定水酸
化ナトリウムを添加し、上記と同様に行い、上清の51Ｃ
ｒ量を測定することにより求めた。ＣＤＣ活性は、下式
により求めた。
【００５０】
【数１】
【００５１】対照として補体溶液の代わりに培地を添加
し、上記と同様に行い、対照の51Cr量を測定しＣＤＣ活
性を求めた。結果を第４表に示す。
し、上記と同様に行い、対照の51Cr量を測定しＣＤＣ活
性を求めた。結果を第４表に示す。
【００５２】
【表４】
【００５３】ＫＭ−６４１、ＫＭ−６４３およびＫＭ−
６４４はＧＤ３陽性細胞であるＧ３６１およびＳＫ−Ｍ
ＥＬ−２８に対して強い細胞障害活性を示した。
６４４はＧＤ３陽性細胞であるＧ３６１およびＳＫ−Ｍ
ＥＬ−２８に対して強い細胞障害活性を示した。
【００５４】実施例４ 抗体依存的細胞媒介障害活性（Antibody Dependent Cel
l mediated Cytotoxicity: ADCC) (a) 標的細胞の調整 １０％ＦＣＳ添加 RPMI-1640培地に浮遊させた標的細胞
ＳＫ−ＭＥＬ−２８およびＧ３６１をそれぞれ１×106
個／0.5 mlに調整し、Na2 51CrO4 を５０μＣｉ／１×10
6 個になるように加え、37℃、１時間反応後、培地で３
回洗浄した。次いで４℃、３０分間培地中に放置し、自
然解離させ、遠心分離(1200rpm、５分)後、培地を加え
て２×105 個／mlに調整した。
l mediated Cytotoxicity: ADCC) (a) 標的細胞の調整 １０％ＦＣＳ添加 RPMI-1640培地に浮遊させた標的細胞
ＳＫ−ＭＥＬ−２８およびＧ３６１をそれぞれ１×106
個／0.5 mlに調整し、Na2 51CrO4 を５０μＣｉ／１×10
6 個になるように加え、37℃、１時間反応後、培地で３
回洗浄した。次いで４℃、３０分間培地中に放置し、自
然解離させ、遠心分離(1200rpm、５分)後、培地を加え
て２×105 個／mlに調整した。
【００５５】(b) エフェクター細胞の調製 ヒト静脈血５０mlを採血し、ヘパリンナトリウム（武田
薬品、1000単位／ml)0.５mlを加え穏やかに混ぜる。こ
れをLeuko-PREP (日本ベクトンデッキンソン社製) を用
いて遠心分離(1500 〜1800ｇ、１５分）して細胞層を採
取した後、RPMI-1640 培地で３回遠心分離 (1500〜1800
ｇ、１５分）して洗浄後１０％ＦＣＳ添加RPMI-1640 培
地に懸濁 (５×106 細胞／ml) し、エフェクター細胞
（リンパ球）とした。
薬品、1000単位／ml)0.５mlを加え穏やかに混ぜる。こ
れをLeuko-PREP (日本ベクトンデッキンソン社製) を用
いて遠心分離(1500 〜1800ｇ、１５分）して細胞層を採
取した後、RPMI-1640 培地で３回遠心分離 (1500〜1800
ｇ、１５分）して洗浄後１０％ＦＣＳ添加RPMI-1640 培
地に懸濁 (５×106 細胞／ml) し、エフェクター細胞
（リンパ球）とした。
【００５６】(c) ＡＤＣＣ活性の測定 ９６穴Ｕ字底プレートにＫＭ−６４１、ＫＭ−６４３ま
たはＫＭ−６４４を各最終濃度0.０５μg ／ml〜５０μ
g ／mlの範囲でそれぞれ５０μl 加え、各々に標的細胞
１×104 個／穴（５０μl ）およびエフェクター細胞５
×105 個／穴（１００μl ）を添加した。３７℃、４時
間反応させた後、遠心分離（1200rpm 、５分）し、上清
の51Ｃｒ量をγ−カウンターにて測定した。自然解離51
Ｃｒ量は、標的細胞に抗体、エフェクター細胞の代わり
に培地のみを添加し、上記と同様に上清の51Ｃｒ量を測
定することにより求めた。全遊離51Ｃｒ量は、抗体、エ
フェクター細胞の代わりに５規定水酸化ナトリウムを添
加し、上記と同様に行い、上清の51Ｃｒ量を測定するこ
とにより求めた。ＡＤＣＣ活性は下式により求めた。
たはＫＭ−６４４を各最終濃度0.０５μg ／ml〜５０μ
g ／mlの範囲でそれぞれ５０μl 加え、各々に標的細胞
１×104 個／穴（５０μl ）およびエフェクター細胞５
×105 個／穴（１００μl ）を添加した。３７℃、４時
間反応させた後、遠心分離（1200rpm 、５分）し、上清
の51Ｃｒ量をγ−カウンターにて測定した。自然解離51
Ｃｒ量は、標的細胞に抗体、エフェクター細胞の代わり
に培地のみを添加し、上記と同様に上清の51Ｃｒ量を測
定することにより求めた。全遊離51Ｃｒ量は、抗体、エ
フェクター細胞の代わりに５規定水酸化ナトリウムを添
加し、上記と同様に行い、上清の51Ｃｒ量を測定するこ
とにより求めた。ＡＤＣＣ活性は下式により求めた。
【００５７】
【数２】
【００５８】対照として、エフェクター細胞の代わりに
培地を添加し、上記と同様に行い、対照の51Ｃｒ量を測
定しＡＤＣＣ活性を求めた。結果を第５表に示す。
培地を添加し、上記と同様に行い、対照の51Ｃｒ量を測
定しＡＤＣＣ活性を求めた。結果を第５表に示す。
【００５９】
【表５】
【００６０】ＫＭ−６４１、ＫＭ−６４３およびＫＭ−
６４４は、ガングリオシドＧＤ３陽性細胞であるＳＫ−
ＭＥＬ−２８およびＧ３６１に対して抗体依存的に細胞
媒介障害活性を示した。
６４４は、ガングリオシドＧＤ３陽性細胞であるＳＫ−
ＭＥＬ−２８およびＧ３６１に対して抗体依存的に細胞
媒介障害活性を示した。
【００６１】実施例５ 移植腫瘍に対する治療効果 ヒトメラノーマ細胞Ｃ24・22の２×１０7 個を１群７匹
のBalb/c nu/nuマウス腹部皮内に移植した。移植後、Ｋ
Ｍ−６４１の200 μg を腫瘍移植当日からか、または、
腫瘍移植後７日目から５回静脈内に投与した。また、対
照群として、抗Sialyl Le a モノクローナル抗体ＡＭＣ
−４６２(ECACC86050801) を同様にして投与した。移植
腫瘍に対する治療効果を、下記式により算出した腫瘍体
積および生存日数により表した。
のBalb/c nu/nuマウス腹部皮内に移植した。移植後、Ｋ
Ｍ−６４１の200 μg を腫瘍移植当日からか、または、
腫瘍移植後７日目から５回静脈内に投与した。また、対
照群として、抗Sialyl Le a モノクローナル抗体ＡＭＣ
−４６２(ECACC86050801) を同様にして投与した。移植
腫瘍に対する治療効果を、下記式により算出した腫瘍体
積および生存日数により表した。
【００６２】
【数３】
【００６３】また、抗体投与量による効果の比較は、腫
瘍移植当日からＡＭＣ−４６２を200 μg/匹またはＫＭ
−６４１をそれぞれ200 μg/匹または100 μg/匹投与す
ることにより行った。結果を図３および図４に示す。Ａ
ＭＣ−４６２を投与した対照群においては、著しい腫瘍
の増殖が認められたが、ＫＭ−６４１を移植と同時に20
0μg/匹投与することにより腫瘍の増殖は有意に抑制さ
れ（図３）、また、生存日数の延長も認められた（図
４）。また、移植後７日目からＫＭ−６４１を投与した
群においては、生存日数の延長は認められなかった（図
４）が、対照群に比べ有意な腫瘍の増殖抑制が認められ
た（図３）。移植100 日後における腫瘍の生着例数は対
照群7/7 、ＫＭ−６４１の200 μg/匹の腫瘍移植後７日
目投与群7/7 、ＫＭ−６４１の200μg/匹の腫瘍移植同
時投与群4/7 となり、ＫＭ−６４１投与の有効性が示さ
れた。また、ＫＭ−６４１の投与量の検討の結果を図５
に示した。図５に示すように200 μg/匹のみならず、10
0 μg/匹でも有意な腫瘍増殖抑制効果が認められた。
瘍移植当日からＡＭＣ−４６２を200 μg/匹またはＫＭ
−６４１をそれぞれ200 μg/匹または100 μg/匹投与す
ることにより行った。結果を図３および図４に示す。Ａ
ＭＣ−４６２を投与した対照群においては、著しい腫瘍
の増殖が認められたが、ＫＭ−６４１を移植と同時に20
0μg/匹投与することにより腫瘍の増殖は有意に抑制さ
れ（図３）、また、生存日数の延長も認められた（図
４）。また、移植後７日目からＫＭ−６４１を投与した
群においては、生存日数の延長は認められなかった（図
４）が、対照群に比べ有意な腫瘍の増殖抑制が認められ
た（図３）。移植100 日後における腫瘍の生着例数は対
照群7/7 、ＫＭ−６４１の200 μg/匹の腫瘍移植後７日
目投与群7/7 、ＫＭ−６４１の200μg/匹の腫瘍移植同
時投与群4/7 となり、ＫＭ−６４１投与の有効性が示さ
れた。また、ＫＭ−６４１の投与量の検討の結果を図５
に示した。図５に示すように200 μg/匹のみならず、10
0 μg/匹でも有意な腫瘍増殖抑制効果が認められた。
【００６４】
【発明の効果】本発明によれば、神経外胚葉系由来の癌
の治療に有用なガングリオシドＧＤ３および３’，８’
−ＬＤ１に反応するＩｇＧクラスのモノクローナル抗体
が供給される。
の治療に有用なガングリオシドＧＤ３および３’，８’
−ＬＤ１に反応するＩｇＧクラスのモノクローナル抗体
が供給される。
【図１】実施例２の蛍光抗体法によるガングリオシドＧ
Ｄ３陽性細胞ＫＨｍ−1／４およびＩＭＲ３２に対する
反応性を示した図である。縦軸は細胞数を、横軸は蛍光
強度をそれぞれ示す。(a) 列はＫＭ−６４１、(b) 列は
ＫＭ−６４３、(c) 列はＫＭ−６４４、(d) 列はＲ２４
の反応性をそれぞれ示す。点線は抗体無添加での反応性
を示す。
Ｄ３陽性細胞ＫＨｍ−1／４およびＩＭＲ３２に対する
反応性を示した図である。縦軸は細胞数を、横軸は蛍光
強度をそれぞれ示す。(a) 列はＫＭ−６４１、(b) 列は
ＫＭ−６４３、(c) 列はＫＭ−６４４、(d) 列はＲ２４
の反応性をそれぞれ示す。点線は抗体無添加での反応性
を示す。
【図２】実施例２の蛍光抗体法によるガングリオシドＧ
Ｄ３陽性細胞ＳＫ−ＭＥＬ−２８およびＷＭ２６６−４
に対する反応性を示した図である。縦軸は細胞数を、横
軸は蛍光強度をそれぞれ示す。(a) 列はＫＭ−６４１、
(b)列はＫＭ−６４３、(c) 列はＫＭ−６４４、(d) 列
はＲ２４の反応性をそれぞれ示す。点線は抗体無添加で
の反応性を示す。
Ｄ３陽性細胞ＳＫ−ＭＥＬ−２８およびＷＭ２６６−４
に対する反応性を示した図である。縦軸は細胞数を、横
軸は蛍光強度をそれぞれ示す。(a) 列はＫＭ−６４１、
(b)列はＫＭ−６４３、(c) 列はＫＭ−６４４、(d) 列
はＲ２４の反応性をそれぞれ示す。点線は抗体無添加で
の反応性を示す。
【図３】実施例５の移植腫瘍に対するＫＭ−６４１の効
果を腫瘍体積で示した図である。縦軸は腫瘍体積、横軸
は腫瘍移植後の日数をそれぞれ示す。白丸はＡＭＣ−４
６２の200 μg ／匹を腫瘍移植と同時に投与した群、黒
丸はＫＭ−６４１の200μg ／匹を腫瘍移植と同時に投
与した群、白四角はＫＭ−６４１の200 μg ／匹を腫瘍
移植後７日目から投与した群をそれぞれ示す。
果を腫瘍体積で示した図である。縦軸は腫瘍体積、横軸
は腫瘍移植後の日数をそれぞれ示す。白丸はＡＭＣ−４
６２の200 μg ／匹を腫瘍移植と同時に投与した群、黒
丸はＫＭ−６４１の200μg ／匹を腫瘍移植と同時に投
与した群、白四角はＫＭ−６４１の200 μg ／匹を腫瘍
移植後７日目から投与した群をそれぞれ示す。
【図４】実施例５の移植腫瘍に対するＫＭ−６４１の効
果を生存日数で示した図である。縦軸は生存率、横軸は
腫瘍移植後の日数をそれぞれ示す。白丸はＡＭＣ−４６
２の200 μg ／匹を腫瘍移植と同時に投与した群、黒丸
はＫＭ−６４１の200 μg ／匹を腫瘍移植と同時に投与
した群、白四角はＫＭ−６４１の200 μg ／匹を腫瘍移
植後７日目から投与した群をそれぞれ示す。
果を生存日数で示した図である。縦軸は生存率、横軸は
腫瘍移植後の日数をそれぞれ示す。白丸はＡＭＣ−４６
２の200 μg ／匹を腫瘍移植と同時に投与した群、黒丸
はＫＭ−６４１の200 μg ／匹を腫瘍移植と同時に投与
した群、白四角はＫＭ−６４１の200 μg ／匹を腫瘍移
植後７日目から投与した群をそれぞれ示す。
【図５】実施例５の移植腫瘍の腫瘍体積に対するＫＭ−
６４１の投与量の効果を示した図である。白丸はＡＭＣ
−４６２の200 μg ／匹を腫瘍移植と同時に投与した
群、黒丸はＫＭ−６４１の200 μg ／匹を腫瘍移植と同
時に投与した群、白四角はＫＭ−６４１の100 μg ／匹
を腫瘍移植と同時に投与した群をそれぞれ示す。
６４１の投与量の効果を示した図である。白丸はＡＭＣ
−４６２の200 μg ／匹を腫瘍移植と同時に投与した
群、黒丸はＫＭ−６４１の200 μg ／匹を腫瘍移植と同
時に投与した群、白四角はＫＭ−６４１の100 μg ／匹
を腫瘍移植と同時に投与した群をそれぞれ示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ１２Ｎ 15/06 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (7)
- 【請求項１】 ＩｇＧ３に属し、少なくとも１種のガン
グリオシドＧＤ３および３’，８’−ＬＤ１に反応する
モノクローナル抗体。 - 【請求項２】 ガングリオシドＧＤ３が、ＮｅｕＡｃα
２→８ＮｅｕＡｃα２→３Ｇａｌ糖鎖、ＮｅｕＡｃα２
→８ＮｅｕＧｃα２→３Ｇａｌ糖鎖、ＮｅｕＧｃα２→
８ＮｅｕＡｃα２→３Ｇａｌ糖鎖またはＮｅｕＧｃα２
→８ＮｅｕＧｃα２→３Ｇａｌ糖鎖を有するガングリオ
シドＧＤ３から選ばれる請求項１記載のモノクローナル
抗体。 - 【請求項３】 ハイブリドーマＫＭ−６４１（FERM BP-
3116）、ハイブリドーマＫＭ−６４３（FERM BP-3117)
またはハイブリドーマＫＭ−６４４（FERM BP-3118) に
より生産される請求項１記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項４】 ＩｇＧ３に属し、少なくとも１種のガン
グリオシドＧＤ３および３’，８’−ＬＤ１に反応する
モノクローナル抗体を生産する能力を有するハイブリド
ーマ。 - 【請求項５】 ハイブリドーマＫＭ−６４１（FERM BP-
3116) 、ハイブリドーマＫＭ−６４３（FERM BP-3117)
およびハイブリドーマＫＭ−６４４（FERM BP-3118) か
ら選ばれる請求項４記載のハイブリドーマ。 - 【請求項６】 請求項１〜３記載のモノクローナル抗体
を有効成分とする神経外胚葉系由来の癌に有効な抗腫瘍
剤。 - 【請求項７】 神経外胚葉系由来の癌が悪性黒色腫であ
る請求項６記載の抗腫瘍剤。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2-334659 | 1990-11-30 | ||
| JP33465990 | 1990-11-30 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05176791A true JPH05176791A (ja) | 1993-07-20 |
| JP3006943B2 JP3006943B2 (ja) | 2000-02-07 |
Family
ID=
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| GR3023290T3 (en) | 1997-07-30 |
| EP0493686A1 (en) | 1992-07-08 |
| DE69124683D1 (de) | 1997-03-27 |
| DK0493686T3 (da) | 1997-03-10 |
| ATE148922T1 (de) | 1997-02-15 |
| DE69124683T2 (de) | 1997-09-11 |
| EP0493686B1 (en) | 1997-02-12 |
| ES2098304T3 (es) | 1997-05-01 |
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