NO853397L - Nye monoklonale antistoffer til glykokonjugater, fremgangsmaate til fremstilling derav og anvendelser av antistoffene. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører nye, monoklononale antistoffer mot cellemembran glykokonjugater, derivater derav, fremgangsmåte til fremstilling av disse antistoffene og derivater derav, hybridoma cellelinjer som utskiller disse antistoffene, en fremgangsmåte til fremstilling av slikt hybridoma, farmasøytiske preparater som inneholder de monoklonale antistoffene eller derivater derav, og anvendelsen av monoklonale antistoffer og derivater derav, til diagnose og behandling av kreft.

Glykokonjugater er bio-molekyler som inneholder en karbohydrat funksjon, f.eks. glykolopider som glykosfingolipider, glykoproteiner, enten N- eller O-glykosylerte,

og proteoglykaner. Glykosfingolipider (GSL) og glykoproteiner er farlige for noen av de mange funksjonene av biologiske membraner.

Glykosfingolipider er sammensatt av tre grunnleggende strukturelle enheter: en base, en fettsyre, og et karbohydrat. Lipiddelen av GSL inneholder en langkjedet amino-alkohol, den vanligste er sfingosin, hvor til det er bundet en fettsyre, via en amid binding. Denne strukturen holdes ceramid. Den hydrofile karbohydrat-

delen er bundet til den primære hydroksylgruppen

i sfingosin ved hjelp av en glykosidbinding. Karbo-hydratet er et mono- eller vanligvis et oligosakkarid bestående av D-glukose, D-galaktose, D-mannose, L-

fukose, N-acetyl-D-glukosamin, N-acetyl-D-galaktosamin, og/eller N-acetylneuramin (sial) syre. Slike karbohydrat ■ residuer finnes også ofte som komponenter av membranblykoproteiner.

Glykosfinoglipider er vanligvis lokalisert i det

ytre laget av plasma membranen. Flere funksjoner tilskrives dessuten: De gir membranene en strukturell fasthet,

deltar i ionetransporten gjennom membraner, viser reseptorfunksjoner for glykoprotein hormoner, lymfo-

kiner, bakterielle toksiner og liknende, og er celle-overflate antigener og merker involvert i cellevekst og cellevekselvirkning. Den sistnevnte egenskapen har vært studert i forbindelse med tumorigeneser og metastase. Endringer i GSL sammensetningen assosieres med ondartethet, og noen unike GSL antigener finnes bare i tumorer.

Det har vært dyrket antistoffer mot tumor celle overflate - strukturer innbefattet disse antigeniske glykosfingolipidene med det mål forøyet å finne fram til verdifulle redskaper til diagnose av tumorer og immunoterapi.

Hakomori (Bulletin du Cancer, Paris, 70, 118 (1983))

gir en oversikt over glykolipid forandringene som er blitt forbundet med onkogene omvandli nger og anvendelse av monoklonale antistoffer i denne sammenhengen.

Tysk OLS 32 28 233 beskriver f.eks. anvendelsen av

et antistoff R-24, til behandling av tumorer hos mennesker. Dette antistoffet er dyrket mot ondartede melanome celler og er spesifikt for et antigen, som

identifiseres som et ganglioside, dvs. et cialsyre-holdig glykosfingolipid. Noen av antistoffene som er beskrevet i US patent nr. 4 444 744, som er dyrket mot karcino-embryonisk antigen, eller i Europeisk patent søknad nr. 37 953, som er rettet mot ondartede nyre:^celler, kan også være spesifikke overfor glykosfingolipider som er vist å være hele komponenter av celle-overflatemembranen. På grunn av relasjonen mellom karbonhydratresiduet av glykosfingolipider og membran glykoproteiner, kan antistoffer som er dyrket mot glykolipider gjenkjenne også glykoproteiner og vice versa.

Hybridoma teknikken ifølge Kohler og Milstein (Nature 256, 495 (1975)) tillater fremstilling av homogene populasjoner av meget spesifikke antistoffer, såkalte monoklonale antistoffer, reproduserbart og i teoretisk ubegrensede mengder fra celle-kulturer. Sammensmeltingen av myelome celler med antistoff-utskillende lymfocytter tatt fra milten av et pattedyr som på forhånd er immunisert med et spesielt antigen gir hybridceller, disse kombinerer evnen til ubegrenset replikasjon og vekst in vitro, med de antistoff-produserende egenskapene for miltcellen. Det er derfor mulig å isolere og spre immun svaret av en individuell organisme overfor et spesifikt antigen, og å fremstille monoklonale antistoffer ved permanent kultur av hybridceller m vitro.

Selv om den generelle teknikken konsepsjonelt er

godt kjent, oppstår mange problemer og variasjoner påkrevet for hvert spesifikt tilfelle. I virkeligheten har man ingen forsikring om at de ønskede hybridoma-cellene oppnås, at de er genetisk stabile, utskiller antistoffer, eller at antistoffene som fremstilles

på denne måten har denønskede spesifisiteten. I

hvilken grad dette faller heldig ut, påvirkes hovedsakelig av typen og renheten av antigenet som benyttes ved immuniseringen, fremgangsmåten for immuniseringen, teknikken for cellefusjonen, og først og fremst, fremgangsmåten for seleksjon av spesielle hybridoma celle kloner.

Foreliggende oppfinnelse vedrører nye monoklonale antistoffer og derivater derav, kjennetegnet ved at de bindes til nøytrale glykosfingolipider dannet av epitel-celler.

Spesielt vedrører foreliggende oppfinnelse monoklonale antistoffer og derivater derav, kjennetegnet ved at de bindes til glykosfingolipider dannet av ondartede epitel-celler, som f.eks. bryst-, lunge- eller tykktarms-karcinom-celler, spesielt bryst-karcinom-celler. Foretrukket er også monoklonale antistoffer og derivater derav, som bindes til nøytrale glykosfingolipider fra mekonium.

Mest foretrukket er de monoklonale antistoffene med betegnelsene 1018S19.il, 1018S69.4, 1021S11.28,

1022S25.17 og 1022S23.24, og derivater derav, men spesielt de monoklonale antistoffene selv.

Derivater av monoklonale antistoffer ifølge oppfinnelsen, er f.eks. antistoffragmenter, radioaktivt merkede monoklonale antistoffer, og konjugater av de monoklonale antistoffene med celletoksiner, radionuklide kompleks-danningsmidler, eller enzymer.

Fragmenter av monoklonale antistoffer ifølge oppfinnelsen, er f.eks. Fab, Fab', eller F(ab')^ fragmenter, som beholder sin spesifisitet for antigen determinantene, dvs. at de beholder det karakteristiske bindings-mønsteret for det monoklonale utgangsantistoffet overfor glykosfingolipidblandinger.

Radioaktivt merket monoklonale antistoffer inneholder f.eks. radioaktivt jod (^3I, ^^1, ^^1), karbon

(<14>C), svovel (<35>S), tritium (<3>H) elierliknende. Foretrukket er monoklonale antistoffer som er merket med radioaktivt jod.

Antistoff konjugater ifølge oppfinnelsen er f.eks. konjugater av monoklonale antistoffer eller fragmenter derav med cytotoksiske og karcionostatiske midler som f.eks. A kjeden av ricin eller beslektede pepsider, adriamycin, metotrexat, vinkristin, daunomycin, 6-merkaptopurin, cytosin, arabinosid, cyklofosfamid,

og liknende, eller konjugater med metallocener eller metall chelater som f.eks. dekstran-amin, polyalkylen-imin som inneholder karboksyl- eller fosfonsyreresiduer, f.eks. dietylentriaminpentaeddiksyre, og liknende, hvor metallchelatet danner kompleksene et radionuklid, , , 113, 111, 207D. 460 195D, 57M. 57„ f.eks. In, In, Bi, Sc, Pt, Ni, Co,

97 99 99

Ru, Ru eller Tc, eller konjugater med enzymer

som f.eks. pepperrotperoksydase, alkalisk fosfatase, 3-D-galaktosidase, glykose.oksydase, glukoamylase, karboanhydrase, acetylkolinesterase, lysozym, malat dehydrogenase eller glykose-6-fosfat dehydrogenase.

I slike konjugater er antistoffet bundet til celle-toksinet, det radionukleotidet kompleksdanningsmidlet eller enzymene direkte eller ved hjelp av en romdannende eller forbindende gruppe. Foretrukket er konjugater av monoklonale antistoffer med cytotoksiske midler forbundet via en binding eller via en forbindelses-

gruppe som kan spaltes av et av de, komplementære serumenzymene som beskrevet i Europeisk patentsøknad nr. 88 695.

De monoklonale antistoffene og deres derivater ifølge oppfinnelsen, bindes til nøytrale glykosfingolipider som dannes av epitel-celler. Slike glykosfingolipider kan være innbefattet i cellemembranen av epitelcellene eller kan frigjøres fra disse inn i kropsvæskene.

De monoklonale antistoffene ifølge oppfinnelsen analyseres med hensyn til bindingsmønsteret ovenfor glykosfingolipidblandinger av forskjellige sammensetninger, bindingsevnen ovenfor vevsdeler og celletypene som inneholdes deri, i normale og ondartede vevsprøver fra forskjellige organer, bindingsevnen overfor hele celler avledet fra etablerte tumorcellelinjer, bindingsevnen overfor caliva fra forskjellige donorer, og deres immunoglobulin-klasse eller underklasse.

Bindingsmønsteret for monoklonale antistoffer til glykosfingolipid (GSL) blandinger kan bestemmes f.eks.

ved den såkalte GSL-trekkpapirteknikken. Glykosfingolipid-blandingene oppnås ved kjente fremgangsmåter, f.eks.

ved oppløsningsmiddel ekstraksjon, oppløsningsmiddel for deling og. kromatografiske fremgangsmåter, fra forskjellige vev, som bryst-, lever-, nyre-, milt-, tonsilvev, og så tumorvev, f.eks. brystkassetumorer, lungetumorer og liknende, fra eurytrocytter og andre cellulære kilder, f.eks. mekonium, dvs. ekskrementer fra nyfødte. GSL-blandingen separerer ved tynnsjiktkromatografi, og hele det hromatografiske mønsteret overføres til nitrocellulose. For å oppnå dette, fuktes en tynnsjiktsplate

med et egnet oppløsningsmiddel, som f.eks. en vandig laverealkanol og presses på et lag av porøst nitrocellulose. Det oppnåde replica på nitrocellulose kuttes eventuelt til bånd og inkuberes med oppløsninger som inneholder monoklonale antistoffer, og enhver immunologisk reaksjon av antistoffer med glykosfingolipidene som er absorbert på nitrocellulosen detekteres ved kjente fremgangsmåter, f.eks. ved utvikling med andre antistoffkonjugater, til et enzym, etterfulgt av ett enzym substrat eller utvikling med et radioaktivt merket andre antistoff.

De monoklonale antistoffene ifølge oppfinnelsen analyseres ved GSL-trekkpapir med hensyn til bindingsmønster overfor GSL-blandinger fra biopsi-materialet fra brysttumorer

fra 19 personer. De monoklonale antistoffene ifølge oppfinnelsen bindes til nøytralt GSL i de fleste av de undersøkte GSL-blandingene, men bindes ikke til gangliosider, dvs. sialsyre-holdog GSL. Det tilnærmede antall monosakkaride enheter i karbohydrat-kjeden av det antigeniske nøytrale GSL er vist i tabellen.

Bindingsevnen av monoklonale antistoffer ifølge oppfinnelsen overfor forskjellige vevsdeler og celletyper som inneholdes i disse, bestemmes ved kjente fremgangsmåter, f.eks. ved immunohistokjemisk farging. For dette formålet inkuberes kryoseksjoner av normalt bryst-, lever-, nyre-, milt-, lunge-, tykktarm- og tonsil-vev,

og av kolorektalt-, bryst-, lunge- og epitel-cyste tumorvev med monoklonale antistoffer ifølge oppfinnelsen,

og utvikles, f.eks. med et enzym-konjugert andre antistoff, som gjenkjenner og bindes til det monoklonale antistoffet ifølge oppfinnelsen. En egnet fargereaksjon av et enzym-

substrat synliggjør så immunreaksjonen for de mono-

klonale antistoffene med glykokonjugatene som inneholdes i vev-celle-overflatemembranen. Uten unntak, er bindingen begrenset til epitelcellemembraner, dvs. ikke observert med membraner av andre celletyper som f.eks. fibroblaster, endotelium, erytrocytter, lymfocytter, muskelceller, og liknende. Resultatene er samlet i

tabellen.

Bindingsevnen for de monoklonale antistoffene ifølge oppfinnelsen overfor hele celler av etablerte tumorcellelinjer av bryst-, kolorektalt- og lungekarcinom opphav bestemmes på tilsvarende måte, dvs. ved immunohistokjemisk farging.

Bindingsevnen for de monoklonale antistoffene ifølge oppfinnelsen overfor saliva fra forskjellige donorer med kjente A, B, 0 og Lew blodgrupper medvirker til å avsløre enhver formodet relasjon mellom antigeniske glykokonjugater som finnes på ondartede epitelceller og kjente blodgruppemarkører som uttrykkes på salvia,

og er videre en enkel fremgangsmåte til å påvise ikke-identitet av de undersøkte antistoffene. Analysen er basert på en kjent punkt-immunobindingsanalyse med salvia punkter på nitrocellulose lag, ved å benytte et andre enzym-konjugert antistoff, som gjenkjenner og binder det monoklonale antistoffet ifølge oppfinnelsen.

Immunoglobulinklassen og underklassen for de monoklonale antistoffene ifølge oppfinnelsen, bestemmes ved velkjente fremgangsmåter, f.eks. immuno-diffusjons Quchterlony teknikken ved å benytte klasse-spesifikke andre antistoffer.

De monoklonale antistoffene ifølge oppfinnelsen og

derivater derav, oppnås ved i og for seg kjente frem-gamgsmåter, kjennetegnet ved at hybridomcellene som utskiller de nevnte monoklonale antistoffene a) kultiveres in vitro og de monoklonale antistoffene isoleres fra kultorovervæskene, eller b) formeres in vivo i et egnet pattedyr og de monoklonale antistoffene utvinnes fra kroppsvæskene fra det

nevnte pattedyret, og, om ønsket

c) de oppnådde monoklonale antistoffene overføres til

et derivat derav.

Egnede kulturmedier for in vitro kultiveringen ifølge fremgangsmåte a) er standard kulturmedier som f.eks. "Dulbecco'sModified Eagle Medium" eller "RPMI 1640 Medium", eventuelt forsterket med serum fra pattedyr, f.eks.

fetalt kalveserum. Isoleringen av de monoklonale antistoffene

oppnås ved utfelling av proteinet som inneholdes i kulturovervæsken ved hjelp av ammoniumsulfat eller liknende, etterfulgt av rensing av immunoglobulinene med standardkromatografiske fremgangsmåter,

som f.eks. gelfiltrering, ionevekslingskromatografi, kromatografi på DEAE cellulose, eller immunoaffinitetskromatografi.

Store mengder av de ønskede monoklonale antistoffene

kan oppnås ved dyrkingen av hybridomaceller ifølge fremgangsmåten b). Cellekloner injiseres i syngenetiske pattedyr, dette forårsaker at antistoff-produserende tumorer vokser. Etter en til tre uker utvinnes de monoklonale antistoffene fra kroppsvæsker i pattedyret. Som et eksempel injiseres hybridomaceller avledet fra Balb/c mus intraperitonealt i Balb/c mus som eventuelt

er forbehandlet med hydrokarbon som f.eks. pristan,

og etter en til to uker samles bukvæskene fra disse musene. De ønskede monoklonale antistoffene isoleres fra kroppsvæskene ved i og for seg kjente fremgangsmåter, f.eks. ved utfelling av proteinene med ammoniumsulfat - eller liknende, etterfulgt av rensing av immunoglobulinene i standardkromatografiske fremgangsmåter, som f.eks. gelfiltrering, ioneveksler-kromatografi, kromatografi på DEAE cellulose, eller immunoaffinitetskromatografi.

Fragmenter av monoklonale antistoffer, f.eks. Fab,

Fab' eller F(ab')2 fragmenter, som beholder sin spesifisitet overfor antigendeterminantene av glykosfingolipidene, kan oppnås fra de monoklonale antistoffene fremstilt ifølge fremgangsmåte a) eller b) ved i og for seg kjente fremgangsmåter, f.eks. ved nedbrytning med enzymer som f.eks. pepsin eller pappain og/eller spalting av de sulfidbindinger ved kjemisk reduksjon.Monoklonale antistoffer merket med radioaktivt jod fremstilles ved kjente jodinerings-fremgangsmåter, f.eks. ved å merke monoklonale antistoffer med radioaktivt natrium- eller kaliumjodid, og et kjemisk oksydasjonsmiddel som f.eks. natriumhypokloritt, kloramin T

eller liknende, eller et enzymatisk oksydasjonsmiddel som f.eks. laktoperoksydase eller glukose oksydase og glukose. Radioaktivt merkede monoklonale antistoffer ifølge oppfinnelsen fremstilles også ved å tilsette radioaktivt merkede næringsmidler til kulturmediet for in vitro kultiveringen i trinn a). Slike merkede næringsstoffer kan f.eks. inneholde radioaktivt karbon,

14 3 3 5

( C), tritium ( H), svovel ( S), eller liknende,

og er f.eks. L-(<14>C)-leucin, L-(<3>H)-leucin eller L-(<35>S)-metionin.

Konjugater av monoklonale antistoffer ifølge oppfinnelsen fremstilles ved kjente fremgangsmåter, f.eks. ved å omsette et monoklonalt antistoff fremstilt ifølge fremgangsmåte a) eller b) eller et fragment derav fremstilt som beskrevet ovenfor, med den ønskede konjugerings-partneren, dvs. den cytotoksiske eller karcinostatiske forbindelsen, det kompleksdannende metallgelatet,

eller enzymet, i nærvær av et koblingsmiddel, f.eks. glutaraldehyd, periodat, N,N<1->o-fenylendimaleimid, N-(m-maleimidobenzoyloksy)-suksinimid, N-(3-(21 - pyridylditio)-propionoksy)-suksinimid, N-etyl-N<1->(3-dimetylaminopropyl)-karbodiimid eller liknende.

For å fremstille de foretrukne konjugatene av monoklonale antistoffer med cytotoksiske midler forbunder ved hjelp av en forbindelsesgruppe som er i stand til å spaltes,

av ett av de komplementære serumenzymene, benyttes en av fremgangsmåtene beskrevet i den Europetiske patent søknaden nr. 88 695.

Oppfinnelsen vedrører videre hybridomcellelinjer,karakterisert vedat de utskiller monoklonale antistoffer som bindes til nøytrale glykosfingolipider som dannes av epitelcellene.

Spesielt vedrører oppfinnelsen cellelinjer som er hybrider av myeloma celler og B lymfocytter av et pattedyr som er immunisert ved glykosfingolipider. Fortrinnsvis er disse cellelinjene hybrider av mus eller rottemyeloma-celler og B lymfocytter fra en syngenisk mus eller rotte immunisert med glykosfingolipider.

Spesielt foretrukket er hybridoma cellelinjer med betegnelsene 1018S19.il, 1022S25.17, 1021S11.28

og 1018S69.4, som 16. august, 1984, ble deponert,

og hybridoma cellelinjen 1022S23.24, deponert

31. mai, 1985, ved "Collection Nationale de Cultures

de Microorganismes", Institut Pasteur, Paris, under betegnelsen 1-331, 1-332, 1-333, 1-334, og 1-453... Disse hybridoma cellelinjene er hybrider av muse myeloma cellelinjen Sp2/0-Agl4 og av B lymfocytter f mmilten av Balb/c mus immunisert med glykosfingolipider. De er stabile cellelinjer som utskiller de monoklonale antistoffene med betegnelsene henholdsvis 1018S19.11, 1022S25.17, 1021S11.28, 1018S69.4 og 1022S23.24. Cellelinjene kan holdes i dypfrosne kulturer og reaktiveres ved opptining og eventuelt re-kloning.

Oppfinnelsen vedrører også en fremgangsmåte til fremstilling av hybridoma cellelinjer som utskiller monoklonale antistoffer som bindes til nøytrale glykosfingolipider dannet av epitelceller, kjennetegnet ved at et egnet pattedyr immuniseres med en glykosfingolipid blanding eller antigeniske derivater derav, antistoff-produserende celler fra dette pattedyret smeltes sammen med myeloma celler, hybrid-cellene som oppnås ved sammensmeltingen klones, og cellekloner som utskiller de ønskede antistoffene utvelges.

Egnede antigener for immuniseringen av pattedyr

ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse er glykosfingolipid (GSL) blandinger og/eller konjugater av disse GSL blandingene med immunogene bærere.

GSL blandinger oppnås ved kjente fremgangsmåter, f.eks. ved oppløsningsmiddelekstraksjon med oppløsningsmiddel-blandinger som inneholder en lavere alkanol, som f.eks. metanol, og et halogenert lavere alkan, som f.eks. kloroform, eventuelt i nærvær av vann, fra forskjellige vev, som f.eks. bryst-, lever-, nyre-, milt-, tonsil-vev, også tumorvev, f.eks. brystkasseinoma, lungetumorer og liknende, fra erytrocytter og andre cellulære kilder, f.eks. mekonium, dvs. ekskrementer fra nyfødte, eventuelt forbehandlet med et organisk oppløsningsmiddel som f.eks. aceton, for å fjerne opplagret fett. Foretrukne kilder for GSL-

blandinger er vev av menneskelig opphav, spesielt ondartet vev, f.eks. biopsimateriale fra brystkasseinoma eller mekonium. Eventuelt kan det rå GSL-ekstraktet anrikes og renses ved oppløsningsmiddel-fordeling mellom vann som eventuelt inneholder uorganiske salter, som natrium- eller kaliumklorid,

og organiske oppløsningsmiddelblandinger som inneholdt en lavere alkanol som f.eks. metanol, og et halogenert lavere alkan, som f.eks. kloroform, og/eller ved kromatografiske fremgangsmåter, f.eks.

ved kolonne-kromatograf i på normalt eller reversert

fase silikagel, ionevekslerharpiks, og liknende.

Foretrukket er GSL blandinger fremstilt fra brystkasseinoma forbehandlet med aceton, eller fra mekonium ved ekstraksjon med metanol/kloroform/vann-blandinger, oppløsningsmiddelfordeler mellom vann og metanol/ kloroform, og kromatografi over reversert fase silikagel.

Antigeniske konjugater av GSL-blandinger med

immunogene bærere er konjugater med f.eks. polypeptider av høy molekylvekt, som serumalbumin, latex-partikler, hele celler eller bakterier. De fremstilles ved i og for seg kjente fremgangsmåter, enten ved absorbsjon av GSL på bæreren eller ved kobling ved å benytte karbodiimider, periodat, glutaraldehyd, N,N'-o-fenylendimaleimid, N-(m-maleimidobenzoyloksy)-suksinimid, N-(3-(2'-pyridylditio)-propionoksy)-suksinimid eller liknende. Foretrukne antigener er GSL-blandinger absorbert på bakterier, spesielt på bakterier med en lipofil overflate, som f.eks. Salmonella minnesota R595 grove mutant bakterier. Forholdet mellom den tørre vekten av Salmonella minnesota R595 og vekten av GSL-blandinger er fortrinnsvis mellom 2:1 og 10:1.

Foretrukne pattedyr for immuniseringen er mus eller rotter. Spesielt foretrukket er Balb/c mus. Immuniseringen utføres f.eks. ved å injisere GSL-konjugater tre til åtte ganger parenteralt, som f.eks. intraperitonealt og/eller.subkutant, ved intervaller på en til 10 dager, i mengder på fra ca. 100 yg til ca. 500 yg, beregnet på basis av ren GSL-blanding, etterfulgt av en forsterkningsinjeksjon på ca. 300 yg til ca. 600 ug GSL etter to til åtte uker. Injeksjonene inneholdt eventuelt en adjuvans som stimulerer lymfocytt-produksjonen som f.eks. fullstendig eller ufullstendig Freund's adjuvans, og en slik adjuvans er uvurderlig dersom ukonjugerte GSL-blandinger injiseres isteden for GSL-konjugater. For injeksjoner av GLS-blandinger som er absorbert på bakterier, gis ingen ekstra adjuvans.

Antistoff-produserende celler fra det immuniserte pattedyret, fortrinnsvis miltceller, tett to til fem dager etter den siste forsterkningsinjeksjonen, sammensmeltes med myelomaceller fra en egnet cellelinje,

i nærvær av en sammensmeltningspromoter. Flere egnede myeloma cellelinjer er kjente. Foretrukket er myeloma cellelinjer som mangler enzymet hypoksantin guanin fosforibosyl transferase (HGPRT) eller enzymet tymidin kinase (TK), som derfor ikke overlever i et selektivt kulturmedium som inneholder hypoksatin, aminopterin og tymidin (HAT medium). Spesielt foretrukket er myeloma celler og avledede cellelinjer som ikke overlever i HAT medium og som ikke utskiller immunoglobuliner eller fragmenter derav, som cellelinjene X63-Ag8.653 eller Sp2/0-Agl4.

Aktuelle sammensmeltingspromotorer er f.eks. Sendai virus eller andre paramykso viruser, eventuelt i UV-inaktivert form, kalsium ioner, overflateaktive lipider som f.eks. lysolecitin, eller polyetylen glykol. Fortrinnsvis sammensmeltes myeloma cellene med et overskudd på 3 til 20 ganger av miltceller fra immuniserte pattedyr, i en oppløsning som inneholder ca. 30 % til ca. 60 % polyetylenglykol med en molekylvekt mellom 1000 og 4000.

Etter fusjonen, resuspenderes og kultiveres cellene iselektivt HAT medium. Derved vil bare hybridoma cellene overleve fordi de kombinerer evnen til vekst og replikasjon in vitro nedarvet fra myeloma cellene og de fraværende HGPRT eller TK genene som er essensielle for overlevelsen i HAT mediet nedarvet fra de antistoff-produserende miltcellene fra de immuniserte pattedyrene.

Egnede kulturmedier for ekspansjonen av hybridoma cellene er standard kulturmediueme, som f.eks. "Dulbecco's modified Eagle medium", det minimum essensielle medium "RPMI 1640 medium" og liknende, eventuelt anriket med serum, f.eks. 10 til 15%

totalt kalveserum. Fortrinnsvis tilsettes foringsceller ved begynnelsen av celleveksten, f.eks.

normale peritoneale eksudatceller for mus, miltceller, benmargmakrofager, eller liknende. Kulturmediene suppleres med selektivt HAT medium med regelmessige intervaller for å forhindre at normale myeloma-celler overgror hybridoma cellene.

Oyervæskene fra hybridoma cellekulturene undersøkes med hensyn på de ønskede monoklonale antistoffene, fortrinnsvis ved en enzymimmunoanalyse eller en radio-immunoanalyse, f.eks. ved GSL trekkpapir. Positive hybridoma celler klones, f.eks. ved begrenset fortynning, fortrinnsvis to eller flere ganger. De klonede cellelinjene kan nedfryses på konvensjonell måte.

De monqklonale antistoffene ifølge oppfinnelsen, og/eller deres derivater er nyttige for kvalitativ og kvantitativ bestemmelse og/eller rensing av glykokonjugater fra epitelcellemembraner.

F.eks. kan de monoklonale antistoffene eller derivater derav, som f.eks. enzymkonjugater, eller radioaktive derivater, benyttes ved en hvilken som helst av de kjente immunoanalysene, som bygger på bindingsveksel-virkningen mellom den antigeniske determinanten, f.eks.

av et glykosfingolipid, og de monoklonale antistoffene. Eksempler på slike analyser er fadioimmunoanalyser, enzymimmunoanalyser, immunofluoressens, latex-agglutinering, og hemagglutinering. Slike immuno-analyser er nyttige f.eks. ved diagnose av onkogene transformasjoner, som resulterer i en kvalitativ og kvantitativ forandring av glykokonjugatinnholdet av epitelcellemembraner.

Glukokonjugater, som f.eks. glykoproteiner, fra epitelcellemembraner kan renses ved immunoaffinitetskromatografi ved hjelp av monoklonale antistoffer ifølge oppfinnelsen. De monoklonale antistoffene eller fragmentene derav, bindes til en egnet bærer av organiske eller uorganiske opphav, som f.eks. kryss-bundet agarose, dekstran eller polyakrylamid i egnet funksjonalisert form, eventuelt etter aktivering, ved å benytte kjente, generelle fremgangsmåter.

F.eks. suspenderes en bærer som inneholder aktiverte esterfunksjoner i en vandig bufferoppløsning, blandes med en oppløsning av et monoklonalt antistoff, eller et fragment derav, filtreres, resuspenderes og vaskes for å fjerne overskudd av monoklonalt antistoff, og behandles med en oppløsning av irrelevante proteiner for å blokkere frie reaktive posisjoner på bæreren. Denne antistoff-belagte bæreren benyttes til selektivt å binde glykokonjugater fra epitelcellemembraner.Desorpsjon med forskjellige bufferoppløsninger

som eventuelt inneholder tilsatte uorganiske salter,

gir så fraksjoner som inneholder glykokonjugaten^

av interesse i renset form.

De monoklonale antistoffene ifølge oppfinnelsen og/eller deres derivater er videre nyttige ved diagnose og behandling av kreft.

F.eks . kan radiomerkede derivater av de monoklonale antistoffene ifølge oppfinnelsen benyttes til å

detektere de primære og metastatiske tumorer i bryst ved radioscannings-teknikker. For dette formålet, injiseres det radioaktive antistoffet f.eks. intravenøst, og brystet scannes med en gamma billed danner med regelmessige mellomrom. Tumorer som eksprimerer antigenisk GSL vil ta opp flere radioaktive antistoffer enn annet vev og vil klart kunne gjenkjennes ved hjelp av kameraet som bygger på radioaktiv billeddannelse. Fortrinnsvis anvendes monoklonale antistoffer merket

med<131>I til radioscanning i mengder på 3 til 8 yg som representerer 15 til 30 yCi pr. kg legemsvekt.

Videre kan de monoklonale antistoffene selv, og

spesielt derivater derav, som f.eks. konjugater med cytotoksiske og carcinostatiske forbindelser, benyttes til behandling av kreft, spesielt brystkasseinoma som eksprimerer det antigeniske GSL. Den terapeutiske dosen for pattedyr er mellom ca. 1 mg og 10 mg pr. kg kroppsvekt, for de monoklonale antistoffene selv,

og mellom 0,1 mg og 10 mg pr. kroppsvekt for konjugater med cytotoksiske legemidler, avhengig av pasientens tilstand og administreringsfremgangsmåten.

De monoklonale antistoffene og/eller derivater derav, er også nyttige ved den immunologiske fjernelsen av kreftceller i benmargsautoplastikk. For dette formålet inkuberes benmargsaspirater fra pasienter som mottar store doser av legemidler og/eller stråle-behandling, med de monoklonale antistoffene ifølge oppfinnelsen, i nærvær av supplement, inkuberes med konjugater av monoklonale antistoffer med cytotoksiske legemidler, eller behandles med monoklonale antistoffer konjugert til magnetiske mikrosfærer som beskrevet av J.G. Treleaven et al. (Lancet, 1984, 70).

Denne behandlingen lyse eller fjerne tumorceller som eksprimerer antigenisk GSL uten å ødelegge benmargs-stavcellene, som så kan benyttes til autologe transplantasjoner.

Oppfinnelsen vedrører også farmasøytiske preparater

som inneholder monoklonale antistoffer som bindes til nøytrale glykosfingolipider dannet av epitelceller, eller derivater derav, i en terapeutisk effektiv mengde som en farmasøytisk bærer, fast eller flytende, av organisk eller uorganisk opphav.

Foretrukket er farmasøytiske preparater for parenteral administrering. Preparater for intramuskulær, subkutan eller intravenøs administrering, er f.eks. isotomiske vandige oppløsninger eller suspensjoner, eventuelt fremstilt kort tid før anvendelse fra lyofiliserte eller konsentrerte preparater. De farmasøytiske preparatene kan være steriliserte og inneholde adjuvanser, f.eks. for konservering, stabilisering, fukting, emulgering eller oppløsning av bestanddelene, salter til regulering av det osmotiske trykket, buffere og/eller forbindelser som regulerer viskositeten, f.eks. natriumkarboksycellulose, dekstran, polyvinylpyrrolidon eller gelatin. De fremstilles ved kjente fremgangsmåter, f.eks. ved konvensjonell blanding, oppløsning eller lyofilisering, og inneholder fra ca. 0,01% til ca.

50% av aktive bestanddeler. Preparatene for injeksjoner bearbeides, fylles i ampuller eller medisinflasker,

og forsegles under aseptiske betingelser ved kjente fremgangsmåter.

Eksemplene som følger illustrerer oppfinnelsen

nærmere.

Forkortelsene som er benyttet i eksemplene har

følgende betydninger:

AEC 3-amino-9-etylkarbazol

GSL glycosfingolipider

HAT hypoksantin/aminopterin/tymidin

HPTLC høy presisjons tynnsjikts-kromatografi

PBS fosfat bufret saltvannsoppløsning

TBS tris-(hydroksymetyl)-aminometan bufret saltvanns-oppløsning

Tris tris-(hydroksymetyl)-aminoetan

EKSEMPLER

Eksempel 1: Isolering og rensing av polare glykosfingolipider fra biopsi- materiale a v brystkassecinoma

1.1 Ekstraksjon

Cellulære sedimenter avlevert fra biopsi-vevsprøver

tatt med henblikk på østrogenreseptor-bestemmelser fås fra et stort antall pasienter med histologisk bekreftet diagnose på brystkasseinoma.

I et typisk forsøk avkjøles 190 individuelle prøver mottatt som nedfrosne klumper i polystyrenrør videre på tørr is, og plasten ødelegges med en hammer.

De samlede sedimentene (169 g våtvekt) lyofiliseres

og gir 33 g tørrvekt. Lagret fett fjernes fra det tørre materialet ved gjentatt homogenisering i aceton i 4°C ved å benytte en "Sorval" vevsblander og etter-følgende filtrering. Det residuelle faste materialet inneholder fremdeles hoveddelen av polare lipider som f.eks. fosforlipider og glykosfingolipider. Disse ekstraheres ved romtemperatur tre ganger ved å benytte 200 ml kloroform:metanol 2:1 (v/v) og to ganger med 200 ml kloroform:metanol:vann 1:0,2 (v/v/v).

1.2 Folch_ fordeling

Bulken av fosfolipider og de glykosfingolipidene som inneholder mindre enn fire sukker i oligosakkarid-kjeden separeres fra polare glykosfingolipider ved en modifisert fordelingsfremgangsmåte ifølge Folch (T. Saito og S. Hakomori, J. Lipid Res. 1^2, 257 (1971)).

De samlede ekstraktene fra eksempel 1.1 inndampes

under redusert trykk ved 40°C og gjenoppløses i 90 ml kloroform:metanol 2:1 (v/v) i en glass-

sylinder med kork. 15 ml vann tilsettes og opp-løsningene rystes kraftig. Etter henstand i 15 minutter har fasene separert. Den lavere kloroformarike fasen ekstraheres tre ganger med kloroform:metanol:

0/1% vandig KC1 1:10:10 (v/v/v).

1.3 Reversert fase kromatografi

For å fjerne salt og andre vann-oppløselige forurensninger inndampes de kombinerte øvrefåsene fra eksempel 1.2,

tas opp i vann, og plasseres i en glasskolonne som inneholder 7 ml av "Lichroprep RP18".

Etter omhyggelig vasking med vann elueres den polare glykosfingolipid-fraksjonen med 10 ml metanol og deretter med 10 ml kloroform:metanol 2:1 (v/v). Utbyttet er ca. 30 mg, dvs. 0,1% av den tørre vekten av vevet.

1.4 Tynnsj iktkromatografi

Renheten av GSL preparatet undersøkes ved silika gel tynnsjiktkromatografi og etterfølgende spraying av platene med enten orkinol/svovelsyre-reagens, som synliggjør sukkerholdige forbindelser (L. Svennerholm,

J. Neurochem. 1, 42 (1956)) eller "Phospray", (se

J.C. Dittmer og R.L. Lester, J. Lipid Res. 5, 126 (1964)) for å detektere fosfolipider. "Silikca gel 60" HPTLC- plater benyttes (størrelse 5x5 cm, tykkelse av sorbent lag på 0,24 mm). Lipidprøvene oppløses i 10-20 yl kloroform:metanol 2:1 (v/v) og påføres platene som en strek med 4 cm lengde ved å benytte en automati-sert prøveapplikator av modell "Linornat III". Oppløsningsmiddelsystemet er kloroform:metanol:vann 55:45:10 (v/v/v) som inneholder 1 mM CaCl2- De utviklede platene viser det typiske mønsteret for GSL-blandinger med karbohydrat residuer av varierende monosakkarid-innhold. Bare spor av ikke-glykosfingolipid-

materiale er tilstede.

Eksempel 2: Isolering og rensing av glykosfingolipider

fra mekonium

Ekskrementer fra forskjellige nyfødte individer

skrapes fra bleier og behandles på nøyaktig samme måte som beskrevet i eksempel 1 bortsett fra aceton-ekstraksjonstrinnet i eksempel 1.1 utelates.

Utbyttet er ca. 0,2% av tørrvekten. Sammensetningen

og renheten av glykosfingolipid (GSL) blandingen bestemmes som beskrevet i eksempel 1.4.

Eksempel 3: Fremstilling av hybridoma- celler

3.1 Fremstilling av immunogenet

Renset GSL fra eksempel 1 eller 2 absorberes på frysetørket og eddiksyre-behandlede Salmonella minnesota R-595 bakterier (C. Galanos, 0. Luderitz og 0. Westphal,

Eur. J. Biochem. 2_4, 116 (1971).) for å øke immuno-genisiteten av lipidantigenene• For dette formålet suspanderes 50 mg bakterier (tørrvekt) i en 250 ml rundbundet flaske i 100 ml kloroform:metanol 2:1

(v/v) som inneholder 10 ml GSL. Oppløsningsmidlet inndampes ved romtemperatur ved å benytte en rotasjonsfordamper som roterer med full hastighet.

GSL dekkede bakterier skrapes fra glassveggen og suspenderes i fosfatbufret saltvannsoppløsning

(PBS) ved en konsentrasjon på 2,4 mg/ml.

Ved mikroskopisk undersøkelse observeres både uregelmessig formede klumper og enkelte bakterier.

3.2 Immuniseringsfremgangsmåte

4 Balb/c hunmus injiseres intraperitonealt med prøver av GSL-dekkede bakterier som inneholder 100 yg GSL på dag 0, 200 yg på dag 4, 300 yg på dag 7,

og 400 yg på dag 11. På dag 19 tas det blodprøver fra musene orbitalt og disse undersøkes vedrørende anti-GSL serumaktivitet ved å benytte GSL-trekkpapir-systemet beskrevet i eksempel 6. På dag 36 gis det en forsterkningsinjeksjon av en prøve som inneholder 400 yg GSL, og musene avlives fire dager senere.

3.3 Cellesammensmelting

Alle sammensmeltingsforsøkene utføres ifølge fremgangsmåten angitt av G. Kohler og C. Milstein (Nature 256, 495 (1975)) ved å benytte den ikke-utskillende Sp 2/0-Agl4 myelomalinjen (M. Shulman, CD. Wilde og G. Kohler, Nature 276, 269 (1978)). IO<8>miltceller blandes med

10' myeloma-celler i nærvær av 1 ml 50% polyetylen-

glykol ("PEG 1500"). Etter vasking resuspenderes cellene i 48 ml standard "Dulbecco's minimum essential medium" (Gibco No. 0422501). 15% fetalt kalveserum og 3 x 10 6 normale peritoneale eksudatceller fra mus pr. sammensmelting, tilsettes som foringsceller.

Cellene fordeles i 48 x 1 ml costar brønner og

fores tre til fire ganger pr. uke med standard HAT seleksjonsmedium i 3 til 6 uker. Når veksten av hybridome celler blir synlig, undersøkes overvæsken medhenblikk på binding til GSL (eksempel 6).

Kloningen av hybridoma-celler gjøres ved begrenset fortynning i mikrotiter-plater. Overvæsken undersøkes med hensyn på binding til GSL i en enzym-immuno-

analyse i fast fase, beskrevet i eksempel 7.

Alle hybridoma linjer klones minst en gang.

Eksempel 4: Isolering og rensing av monoklonale antistoffer

8-10 uker gamle Balb/c mus (dyrefarm Sisseln, Sveits) forbehandles intraperitonealt med 0,3 ml pristan.

2-3 uker senere, inokkuleres 2-5x10^ klonede hybridoma-celler og 0,2 ml pristan intraperitonealt.

Etter 8-10 dager samles bukvæsken, det sentrifugeres

med 800 x g og lagres ved -20°C.

Opptint bukvæske sentrifugeres ved 50000 x g i 60 minutter.

Et fettlag som flyter på overflaten fjernes omhyggelig, og proteinkonsentrasjonen reguleres til en konsentrasjon på 10-12 mg/ml. Rå immunoglobulin utfelles ved dråpevis tilsats av 0,9 volum-ekvivalenter mettet ammoniumsulfat ved 0°C, deretter oppløses i 20 mM tris-HCl/50 mM NaCl (pH 7,9) og dialyseres mot den samme bufferen. En immunoglobulin G fraksjon oppnås ved "DEAE-D52 cellulose" kromatografi ved å benytte et buffer gradient-system bestående av 20 mM tris-HCl/25-400 mM NaCl, pH 7,9. Immunoglobulin G utfelles igjen med ammoniumsulfat og oppløses i PBS ved en konsentrasjon på 10 mg/ml.

Natriumdodekyl sulfat polyakrylamid gel elektroforese (SDS-PAGE) viser en renhetsgrad på mer enn 95% for

de monoklonale antistoffene 1018S19.il, 1018S69.4, 1021S11.28, 1022S25.17 og 1022S23.24.

Eksempel 5: Bestemmelse av klasse og underklasse for

monoklonale antistoffer

Klassen og underklassen for monoklonale antistoffer dannet av klonede hybridoma celler bestemmes i en enzym immunoanalyse. Mokrotiter plater belegges med 1<y>g pr. brønn av et kanin-immunoglobulin preparat av et klasse- eller underklasse-spesifikt serum i 50yl PBS. Fri bindingskapasitet av platen mettes med en buffer av 1% bovint serum albumin i PBS som inneholder 0,2% NaN^(v/v), pH 7,4. 100 yl prøver som inneholder monoklonale antistoffer inkuberes i brønnene ved 37°C i 1 time. Platene vaskes med PBS, inkuberes deretter ved 37°C i 1 time med ett fosfatase-konjugert kanin-immunoglobulinpreparat av den spesifisiteten som ble benyttet for belegging av platene. Det fikserte enzymet utvikles ved inkubering (37°C, 30 minutter) med en oppløsning av enzymsubstratet p-nitrofenyl fosfat (1 mg/ml i dietanolamin buffer 10% som inneholder 0,5 mM MgCl2og 0,02% (v/v) NaN3,

pH 9,8) og måling av den optiske tettheten ved 405 nm.

Eksempel 6: Karakterisering av spesifisiteten for monoklonale antistoffer mot GSL ved GSL- trekkpapir- teknikken

GSL-blandingen separeres ved tynnsjiktskromatografi

på HPTLC plater som beskrevet i eksempel 1.4, deretter fremstilles en replika fra platen ved å overføre hele mønsteret av separert GSL til nitrocellulose.

Denne GSL-trekkpapir-analysen er spesielt hensiktsmessig for sorteringsformål. Spesifikt påføres 100 ug menneskelig brystbiopsy GSL fremstilt ifølge eksempel 1, som en 10 cm lang strek på en HPTLC plate av størrelse 5 x 10 cm. Etter separering i oppløsningsmiddel-systemet fra eksempel 1.4, tørkes platen. Ved å

benytte en myk blyant, trekkes det linjer som markører for senere orientering. Platen sprayes med en oppløsning av isopropanol/vann (2:1) inntil den er synlig fuktet uten dannelse av dråper på overflaten. Platen presses øyeblikkelig i 1 minutt på en noe større nitrocellulose

plate ("HAWPOO") båret på et lag av polyetylen.

Overskudd av nitrocellulose tørkes av og replicaen får tørke. Platen rehydreres i et buffer som inneholder 20 mM tris-HCl/150 mM NaCl/5 mM MgCl2/0,15 mM CaCl2, pH 7,4 (TBS). Laget inkuberes med 10% hesteserum i TBS i 1 time ved 40°C for å blokkere overskytende bindingskapasitet.

Laget kuttes i bånd av 2 mm bredde, hvert inneholder

det samme mønsteret av separert GSL. Båndene inkuberes i 2 timer, f.eks. med hybridomaovervæskene fra eksempel 3.3 i multipipette reservoir fordypninger som tjener som egnede inkuberingsbrett. Båndene vaskes tre ganger i 5 minutter med TBS og inkuberes i ytterligere 1 time med et konjugat av pepperrotperoksydase og sau immunoglobulin rettet mot mus IgG (Cappel Laboratories Inc., Chochranville, USA), fortynnet 500 ganger med 10%

(v/v) hesteserum i TBS. Etter vasking i TBS som ovenfor, kommer det bundne konjugatet tilsyne ved den peroksydase katalyserte oksydasjonen av 4-klor-1-naftol som en blå uoppløselig avsetning.

Substrat 4-klor-l-naftolen fortynnes 50 ganger i TBS

fra en 1% (v/v) oppløsning i dimetylformamid, og hydrogenperoksyd tilsettes til en endelig konsentrasjon på 0,006% (v/v). Etter 20 minutter stoppes reaksjonen ved vasking med vann. I tilfelle en positiv reaksjon sees ett eller flere bånd. Forskjellige fargemønstre antyder tilstedeværelsen av forskjellige antistoffer.

For GSL-trekkpapiranalysen benyttet ved karakterisering

av individuelle antistoffer, påføres 5 yg av humant brystbiopsi GSL fra en vevsprøve fra enkelte pasienter på en HPTLC plate og bearbeides som beskrevet ovenfor.

Eksempel 7; Undersøkelse av antistoffer mot GSL ved fast fase immunbundet immunosorbent-analyse ( ELISA)

En 96-brønns polyvinylklorid mikrotiter plate belegges med 200 ng pr. brønn, av et GSL ekstrakt fra biopsid-materialet av brystkarcinoma, fremstilt som i eksempel 1, oppløst i 25 fil etanol. Brønnene får tørke og fylles fullstendig med 1% (v/v) hesteserum i TBS

(for sammensetningen av TBS se eksempel 6). Etter 1 time vaskes platen med TBS, og 50 \ il av en oppløsning som skal (undersøkes med henblikk på monoklonale antistoffer tilsettes. Denne reagensen består av alkalisk fosfatase konjugerte geiteantistoffer mot musimmuno-globuliner i en 1000 gangers fortynning i 1% (v/v) hesteserum i TBS. Etter 1 time vaskes platen fire ganger med TBS og utvikles med enzymsubstratet p-nitrofenyl fosfat i 10% dietanolamin buffer som beskrevet i eksempel 5.

Eksempel 8; Immunohistokjemisk farging med monoklonale

antistoffer mot GSL

Kryoseksjoner av 5 til 10 um fremstilles på vanlig

måte fra kryopreservert eller formalin-fiksert normalt bryst-, lever-, nyre-, milt-, lunge-, tykktarm- eller tonsil-vev, og vev fra kolorektal-, bryst- og lunge-karcinoma eller epitelcystetumorer. Parafin neddykket vev er ikke egnet på grunn av faren for å miste GSL under inkuberinger i oppløsningsmidler som inneholder alkohol. Kryoseksjonene tørkes ved 50°C i 5 minutter, avfettes i iskald aceton i 5 minutter, tørkes igjen og

forinkuberes med 10% (v/v) hesteserum i PBS. Etter 30 minutter vaskes skivene med PBS i 5 minutter.

Hybridoma overvæske eller annen prøve som skal under-søkes med henblikk på monoklonale antistoffer tilsettes (ca. 400 yl, tilstrekkelig til å dekke vevseksjonen). Etter 1 time vaskes skivene tre ganger med PBS, og det peroksydasekonjugerte andre antistoffet beskrevet i eksempel 6 tilsettes. Etter 30 minutter vaskes skivene som ovenfor, og utvikles med 3-amino-9-etylkarbazol (AEC) slik at man får en rød avsetning. Enzymsubstratoppløsningen består av en ny fremstilt

og filtrert oppløsning av 4 mg/ml AEC i dimetylformamid fortynnet 20 ganger med natriumacetatbuffer fremstilt ved å blande 100 deler 0,1 M vandig natriumacetat og 40 deler 0,1 M vandig eddiksyre. Hydrogenperoksyd-konsentrasjonen reguleres til 0,014% (v/v). Skivene inkuberes i 15 minutter i mørke, vaskes 3 ganger med acetatbuffer og tørkes. Delene monteres i glycerol-gelatin, pH 5,0, og undersøkes med et mikroskop. Egnede kontrollprøver må tas med, bestående av seksjoner inkubert med bare det andre antistoffet, i relevant første antistoff, og ikke noe antistoff i det hele tatt, slik at man kan fastslå den endogene peroksydase aktiviteten.

Eksempel 9: Celleoverflatefarging på levende celler

Adherente karcinome cellelinjer fra bryst-, kolorektalt- og lunge-vev gros i vevskulturplater med 96 brønner ifølge standard teknologi for vev-kulturer. Cellene inkuberes med 100 yl hybridoma overvæske eller andre prøver som

skal undersøkes vedrørende monoklonale antistoffer,

vaskes så, inkuberes med et peroksydasekonjugert andre antistoff, og utvikles med AEC som beskrevet i eksempel 8. For å unngå misteceller, må vasketrinnene utføres omhyggelig uten å fjerne væsken fullstendig.

De fargede cellene undersøkes med et invertert mikroskop umiddelbart etter det siste vasketrinnet som følger utviklingen med AEC.

Detaljer vedrørende cellelinjene som er undersøkt,

kan finnes i følgende litteraturreferanser:

BT-20: E.Y. Lasfargues og L. Ozzello, J. Nati. Cancer Inst. 21, 1131 (1958); MCF-7:H.D. Soele et al., J. Nati. Cancer Inst. 51, 1409 (1973); ZR-75-1: R. Cailleau et al.,

J. Nati. Cancer Inst. 53, 661 (1974); MDA-MB 231:

L.W. Engel et al. , Cancer Res. 3<_>8, 3352 (1978);

SW 1222 NU og SW 948 NU: A. Leibovi-z i "Human tumor

cells in vitro" (J. Fogh, red.), Plenum Press,

New York, 1975, side 23; A 549: M. Lieber et al., Int.

J. Cancer 17, 62 (1976); MBA 9812: G.J. Todaro, C. Fryling og J.E. DeLarco Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 11_,

5258 (1980).

Eksempel 10: Saliva punktanalyse

Fremgangsmåten er en tilpassing av den velkjente punkt-immunobindingsanalysen beskrevet i Europeisk patentsøknad nr. EP 63 810 på saliva som antigen. Individuelt samlede salivaprøver fra donorer fra kjente A,B,0 og Lewis blodgrupper oppvarmes i 10 minutter til 100°C, og sentrifugeres ved 10 000 x g i 10 minutter. Overvæsken (ufortynnet, fortynnet 1:3 og 1:10 i PBS) påføres i 0,2 yl porsjoner fra nitrocellulose (med et påtrykket gitter, Millipore, Bedford, MA). Laget blokkeres med 10% hesteserum

i PBS i 1 time ved 40°C, kuttes til bånd på en slik måte at det inneholder hele panelet av salivaprøver, inkuberes med de monoklonale antistoffene (bukvæske fra eksempel 4 fortynnet med 1:500 eller kultur-overvæske fra eksempel 3.3) i 3 timer, vaskes, og inkuberes med et peroksydase, koblet geitantistoff dyrket mot mus immunoglobulin (Nordic Laboratories, Tillburg, Nederland, fortynnet 1:500) i 1 time. Peroksydasen detekteres med 4-klor-l-naftol og ^ 2^ 2

som beskrevet i eksempel 6.

Eksempel 11: Fremstilling av et konjugat av monoklonalt antistoff 1018S19. il med ricin A

Til en omrørt oppløsning av 3,0 mg monoklonalt antistoff 1018S19.il i 1,5 ml PBS ved romtemperatur, tilsettes det en oppløsning av 0,187 mg N-suksin-i idyl 3-(2-pyridylditio)propionat. Etter 30 minutter dialyseres blandingen mot PBS ved 4°C. Det aktiverte antistoffet blandes med 0,5 ml av en PBS oppløsning som inneholder 3,0 mg recin A renset med gelkromatografi på "Sephadex G 100", og holdes ved romtemperatur i 20 timer. Reaksjonsblandingen kromatograferes på en "Sephadex G 100" gelkolonne. Fraksjonene analyseres vedrørende antistoffinnhold ved å måle den optiske tettheten ved 280 nm, og vedrørende ricin A ved dens inhiberende evne for protein syntese målt i et acellulært system, og identiske fraksjoner samles slik at man får 1 mg konjugat med et gjennomsnitt på ca. 1,5 mol ricin A pr. mol antistoff i konjugatet.

125

Eksempel 12: F remstilling av I merket antistoff 1018S19. il

125 40 ug antistoff 1018S19.il lodineres med 0,5 mCi I natriumjodid og kloramin T ved å følge den generelle fremgangsmåten ifølge F.C. Greenwood et a_l., Biochem.

J. 89, 114 (1963). Reaksjonsproduktet renses med kromatografi på ionevekslerharpiks "Bio Rad AG 1 x 8".

Eksempel 13: Lokalisering av humane tumorer i barberte

mus med radiomerkede monoklonale antistoffer 13.1 Scintigrafi

Transplanterbare humane brystkassecinomer gros

subkutant i barberte mus som beskrevet av H.H. Fiebig ogG.W. Lohr, Medwelt 1/1, 92-106 (1984). Kaliumjodid (0,05%) tilsettes til drikkevannet for musen.

Etter to dager, administreres 30 yCi (ca. 4 ug)

<125>I-merket antistoff, 1018S19.il (eksempel 12)

intravenøst, og to til ti dager senere utføres scinti-

grafi ved å benytte et gammakamera ifølge Anger.

Under scintigrafien bedøves dyret med "Nembutal" i en mengde på 0,0 4 mg/g legemsvekt. Det radiomerkede antistoffet akkumuleres distinkt på scintigrammet i området ved den makroskopisk synlige tumoren.

Denne akkumuleringen sammenliknes med områder på

musen som man vet er tumorfrie og med dyr som er behandlet med et irrelevant radiomerket antistoff som man vet ikke bindes til tumoren.

13.2 Radioaktivitet av uttatte organer

Lokaliseringsgraden for det radiomerkede antistoffet bestemmes ved direkte telling av radioaktiviteten av tumoren og sammenlikning med radioaktiviteten av annet vev. Den spesifikke radioaktiviteten (radioaktivitet pr. vekt vev i cpm/mg) funnet i organene og væskene av et dyr behandlet som beskrevet i eksempel 13.1, er 10 50 (brystkassecinoma tumor), 70 (milt), 10 7 (nyrer), 182 (lunge), 58 (tarm), 106 (lever), og 488 (blod).

Disse tallene sammenliknes også med den spesifikke radioaktiviteten som finnes i organer og blod fra dyr som er behandlet med ett irrelevant radiomerket antistoff.

13.3 Autoradiografi av kryoseksjoner av uttatt vev

Kryoseksjoner av uniform tykkelse (10 til 40 ym)

prepareres fra de uttatte organene og tumorene.

Skivene tørkes ved 50°C i 5 minutter, vaskes i 5 minutter

i PBS, tørkes og bringes i kontakt med røntgenfilm, ("Ultrofilm 3H"). Lokaliseringsgraden for tumoren bedømmes fra svertingen på den utviklede filmen sammenliknet med film som er eksponert mot normalt vev og vev fra dyr behandlet med irrelevant radiomerket antistoff. Typisk observeres en uniform svak sverting på film eksponert mot normalt vev, og intens, ofte flekket sverting sees på film som er eksponert mot tumorvev fra dyr behandlet som beskrevet i eksempel 13.1.

Eksempel 14: Injeksjonsoppløsning

120 mg monoklonal antistoff 1018S19.il fremstilt ifølge eksempel 4 oppløses i 5 ml fysiologisk saltvanns-oppløsning. Oppløsningen føres gjennom et bakteriologisk filter, og filtratet fylles igjennom ampulle under aseptiske betingelser. Ampullen lagres fortrinnsvis nedkjølt, f.eks. ved -20°C.

Ampuller som inneholder monoklonale antistoffer 1018S69.4, 1021S11.28, 1022S25.17, 1022S23.24 og konjugatet av antistoff 1018S19.il med ricin A (eksempel 11) fremstilles på tilsvarende måte.

Claims (18)

1. Monoklonale antistoffer og derivater derav, karakterisert ved at de bindes til nøytrale glykosfingolipider dannet av epitelceller.

2. Monoklonale antistoffer og derivater derav, ifølge krav 1, karakterisert ved at de bindes til nøytrale glykosfingolipider dannet av ondartede epitelceller.

3. Monoklonale antistoffer og derivater derav, ifølge krav 1, karakterisert ved at de bindes til nøytrale glykosfingolipider dannet av brystkassecinomaceller.

4. Monoklonale antistoffer og derivater derav, ifølgekrav 1, karakterisert ved at de bindes til nøytrale glykosfingolipider fremstilt fra mekonium.

5. Monoklonale antistoffer med betegnelsene 1018S19.il, 1018S69.4, 1021S11.28, 1022S25.17 og 1022S23.24 og derivater derav, ifølge krav 1.

6. Monoklonale antistoffer med betegnelsene 1018S19.il, 1018S69.4, 1021S11.28, 1022S 25.17 og 1022S23.24 ifølge krav 1.

7. Fremgangsmåte til fremstilling av monoklonale antistoffer og derivater derav, ifølge krav 1, karakterisert ved at hybridoma-celler som utskiller de monoklonale antistoffene a) kultiveres in vitro og de monoklonale antistoffene isoleres fra kulturovervæsken, eller b) dyrkes in vivo i et egnet pattedyr og de monoklonale antistoffene utvinnes fra kroppsvæskene til pattedyret, og, om ønsket, c) overføres de monoklonale antistoffene til et derivat derav.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 7, karakterisert ved at hybridoma-cellene avledet fra Balb/c mus som utskiller de ønskede antistoffene, injiseres intraperitonealt i Balb/c mus som eventuelt er forbehandlet med hydrokarbon, etter en til to uker, samles bukvæskene fra disse musene, og de monoklonale antistoffene isoleres ved utfelling med ammoniumsulfat og/eller ved standard kromatografiske fremgangsmåter.

9. Hybridoma cellelinjer, karakterisert ved at de utskiller monoklonale antistoffer ifølge krav 1.

10. Hybridoma cellelinjer ifølge krav 9, karakterisert ved at de er hybrider av mus-eller rottemyelomaceller og B lymfocytter fra en syngenetisk mus eller rotte immunisert med glykosfingolipider.

11. Hybridoma cellelinjer ifølge krav 9, karakterisert ved at de er hybrider av mus-myelomacellelinjen Sp2/0-Agl4 og B lymfocytter fra milten av Balb/c mus immunisert med glykosfingolipider.

12. Hybridoma cellelinjer med betegnelsene 1018S19.il, 1022S25.17, 1021S11.28, 1018S69.4 og 1022S23.24, som er deponert ved "Collection Nationale de Cultures de Microorganismes", Institut Pasteur, Paris, under betegnelsene 1-331, 1-332, 1-333, 1-334, og 1-453.

13. Fremgangsmåte til fremstilling av hybridoma cellelinjer ifølge krav 9, karakterisert ved at et egnet pattedyr immuniseres med en glykosfingolipidblanding eller antigeniske derivater derav, antistoff-produserende celler fra dette pattedyret smeltet sammen med myeloma-celler, hybrid-cellene som oppnås ved sammensmeltingen klones, og celleklonene som utskiller de ønskede antistoffene utvelges.

14. Fremgangsmåte ifølge krav 13, karakterisert ved at Balb/c mus immuniseres med glykosfingolipidblandinger absorbert på Salmonella minnesota R 595 grovmutant ved tre til åtte parenterale injeksjoner som inneholder fra 100 yg til 500 yg glykosfingolipidblanding ved intervaller på 1 til 10 dager, miltceller fra de immuniserte musene tas 2 til 5 dager etter den siste forsterkningsinjeksjonen, og disse cellene smeltes sammen med myelomaceller av en egnet cellelinje i nærvær av en sammensmeltings-promotor.

15. Fremgangsmåte ifølge krav 13, karakterisert ved at antistoff-produserende celler avledet fra immuniserte Balb/c mus smeltes sammen med myeloma-celler for cellelinjene X63-Ag8.653 eller Sp2/0-Agl4.

16. Fremgangsmåte ifølge krav 14, karakterisert ved at myeloma-cellene smeltes sammen med et tre til tyve gangers overskudd av miltceller fra immuniserte pattedyr, i en oppløsning som inneholder ca. 30% til ca.

60% polyetylenglykol av en molekylvekt på mellom 1000 og 4000.

17. Fremgangsmåte ifølge krav 13, karakterisert ved at overvæsker fra hybridoma cellekulturer undersø kes med henblikk på monoklonale antistoffer som bindes til glykosfingolipider ved hjelp av glykosfingolipid trekkpapir og teknikken og positive hybridoma celler klones en eller flere ganger ved begrenset fortynning.

18. Anvendelse av monoklonale antistoffer og/eller derivater derav, ifølge krav 1, til kvalitativ og kvantitativ bestemmelse og/eller rensing av glykokonjugater fra epitelcellemembraner.