PT81040B

PT81040B - Process for preparing new monoclonal antibodies to glycoconjugates

Info

Publication number: PT81040B
Application number: PT81040A
Authority: PT
Original assignee: Ciba Geigy Ag
Priority date: 1984-08-30
Filing date: 1985-08-28
Publication date: 1987-06-24
Also published as: GR852099B; DK391785A; ES8800845A1; EP0173648A2; HUT38391A; NZ213293A; ES555613A0; ES546564A0; FI853283A7; EP0173648A3; IL76247A0; AU4688785A; PT81040A; ES8703895A1; NO853397L; FI853283A0; DK391785D0; FI853283L

Description

Descrição do invento

0 invento diz respeito a novos anticorpos monoclonais e seus derivados, caracterizados por se ligarem a glicoesfingolípidos neutros produzidos por células epiteliais.

Em particular o invento está

relacionado com anticorpos monoclonais e seus derivados, caracterizados por se ligarem a glicoesfingolípidos neutros produzidos por células epiteliais malignas, como sejam células de carcinoma da mama, do pulmão ou colo-rectal, especial mente células do carcinoma da mama. São também preferidos os anticorpos monoclonais e seus derivados que se liguema glicoesf ingol ipidos neutros obtidos de mecónio.

São mais preferidos os anticorpos monoclonais com a designação 1018519.11, 1018569.4 j

1021511.28, 1022525.17 e 1022523.24 e seus derivados, mas |

I

particularmente os próprios anticorpos monoclonais. |

os derivados dos anticorpos

monoclonais deste invento são e.g. fragmentos de anticorpos anticorpos monoclonais marcados radioactivamente e conjugados dos anticorpos monoclonais com toxinas celulares, ageni;

ji tes complexantes de radionucleidos ou enzimas.

fí

; Os fragmentos de anticorpos

monoclonais deste invento são e.g. fragementos Fab, Fab¹ ou F(ab‘ os quais retêm a sua especificodade para os deterί minantes antigénicos, i.e., mantêm o padrão de ligação

í|

ii caracteristico do aiticorpo monoclonal parenteral a misturas

ij de glicoesfingolipidos.

il

jl

fl Os anticorpos monoclonais mar!

ÉTOÈOO

cados radioactivamente contêm e.g. iodo (¹²³I,¹²⁵I, ¹³¹I), carbono (¹^C), enxofre (³³S), tritio (³H) radioactivos ou similares. São preferidos os anticorpos monoclonais marcados com iodo radiocativo.

Os conjugados de anticorpos

do invento são e.g. conjugados de anticorpos monoclonais

ou seus fragmentos com agentes citotóxicos e carcinostáticos

como sejam a cadeia A do ricino ou peptídeos relacionados,

adriamicina, metotrexato, vincristina, daunomicina, 6-mercaptopurina citosina, arabinosideo, ciclofosfamida e similares

ou conjugados com metalocenos ou quelatos de metais como

sejam dextran-amina polialquilemeimina possuindo resíduos

de ácidos carboxílico ou fosfónico, e.g., ácido dietilenotriaminopentacético e similares nos quais o quelato de me113 111 207

tais complexa um radionuclido, e.g., In, In, Bi, ^Sc, ^Pt, ⁵?Ni, 5?co, ⁹6ru, ⁹⁹Ru ou ⁹⁹Tc, ou conjugados com enzimas tais como peroxidase de rábano silvestre, fosfatas alcalina, -D-galactosidade, glucose-oxidase, gliucoamila se, anidrase carbónica, acetilcolinesterase, lisózima, malato (fesidrogenase ou glucose-6-fosfato desidrogenase. Em tais conjugados o anticorpo ê ligado a uma toxina de células ao agente complexante de radionuclidos ou âs enzimas directamente ou por meio de um grupo espaçador ou ligante.

São preferidos os conjugados de anticorpos monoclonais com agentes citotóxicos ligados via uma ligação ou via num ligante susceptível de ser clivado por uma das equipas de enzimas do complemento do soro como descrito no Pedido de Patente Europeia 88695.

Os anticorpos monoclonais e

seus derivados deste invento ligam-se a glicoesfingolipidos podem ser incorporados na membrana celular de células epiteliais ou podem ser libertados por elas para os fluidos do corpo.

ί

-8-

Os anticorpos monoclonais do

invento são analisados em relação ao seu padrão de ligação a misturas de glicoesfingolipidos de composição varia, â sua capacidade de ligação a secções de tecidos e tipos ce| lulares neles contidos de amostras de tecido maligno e normal de vários orgãos, à sua capacidade de ligação a células totais derivadas de linhas de células tumorais estabelecidas â sua capacidade de ligação a saliva de diferentes dadores e â sua classe ou subclasse de imunoglobulina.

0 padrão de ligação de anticorpo:; monoclonais a misturas de glicoesfingolipidos (GSL) pode ser determinado e.g. pela chamada técnica de transferência de GSL. As misturas de glicoesfingolipidos são obtidas por métodos conhecidos, e.g. por extracção com solventes, distribuição de solvente e métodos cromatográficos, a partir de vários tecidos, tais como mama, fígado, rim, baço, tecido da amígdala, também tecidos tumorais, e.g. carcinoma da mama, tumores do pulmão e similares, a partir de eritrócitos e outras fontes celulares, por exenplo mecónio, i.e., as fezes de recém-nascidos. A mistura de GSL é separada por cromatografia em camada fina e a totalidade do padrão de cromatografia transferido para nitrocelulose. 0 duplicado obtido na nitrocelulose é facultativamente cortado em tiras e incubado com soluções contendo anticorpos monoclonais e qualquer

I reacção imunológica dos anticorpos cõm os g1icoesfingo1ipiH i

;í dos adsorbvidos na nitrocelulose detectada por métodos conhe-i í: eidos na matéria, e.g. por revelação com um segundo anti- I

| corpo conjugado com uma enzima seguido de um substracto da *

, enzima ou revelação com um segundo anticorpo marcado radioII activamente.

li

íi

h Os anticorpos monoclonais deste

ι invento são analisados por transferência de GSL relativamente | ao seu padrão de ligação a misturas de GSL de material da biopsia de tumor da mama derivado de 19 indivíduos humanos.

í i

-9Os anticorpos monoclonais do invento ligam-se a GSL neutros na maior parte das misturas de GSL testadas, mas não se ligam a gangliosídeos, i.e., GSL contendo ácido siálico. Na Tabela está apresentado o numero aproximado de unidades de monossacarideo da cadeia de açúcar do GSL neutro antigénico.

A capacidade de ligação dos anticorpos monoclonais do invento a diferentes secções de tecido e aos tipos celulares nelas contidos é determinada por métodos conhecidos, e.g., por coloração imuno-histoquimica. Para tal, crio-secções de tecido normal da mama, figado, rim, baço, pulmão, cólon e amígdala e de tecido tumoral colo-rectal da mama, do pulmão e quistos epiteliais são incubadas com anticorpos monoclonais do invento e reveladas e.g. com um segundo anticorpo conjugado com enzima, o qual reconhece e se liga ao anticorpo monoclonal do invento.

Uma reacção corada de um substracto enzimãtico torna visivel a reacção imune dos anticorpos monoclonais com os glicoconjugados contidos na membrana celular dos tecidos. Sem excepção, a ligação é limitada a membranas de células epiteliais i.e., não se observa com membranas de outros tipos celulares tais como fibroblastos, endotélio, eritrócitos, linfócitos, células do musculo e similares. Os resultados estão reunidos na Tabela.

A capacidade de ligação dos anticorpos monoclonais do invento a células totais de linhas celulares tumorais estabelecidas com origem em carcinoma da mama, colo-rectal, e do pulmão é determinado de modo idêntico, i.e., por coloração imuno-histoquimica.

A capacidade de ligação dos anticorpos monoclonais do invento a saliva de diferentes dadores com grupos sanguíneos de Lewis e A, B, 0 conhecidos ajuda a revelar qualquer relação putativa entre glicoconjugados antigénios encontrados em células epiteliais malignas

-10e marcas de grupo sanguíneo conhecidas expressas na saliva e é ainda um meio simples de mostrar a não-identidade dos anticorpos testados. 0 ensaio baseia-se num ensaio conhecido de imunoligação de pontos ("dots") com "pontos" de saliva em folhas de nitrocelulose usando um segundo anticorpo conjugado com enzima, o qual reconhece e se liga ao anticorpo monoclonal do invento.

A classe e sub-classe de imunoglobulina dos anticorpos monoclonais do invento é determinada por métodos bem conhecidos, e.g., a técnica de Ouchterlony de imuno-difusão usando segundos anticorpos específicos de classe.

,í

í

1

i

I

Tabela: Caracterização de anticorpos monoclonais

Designação do anti-	1018S	1018S	1021S	1O22S .	1022S
corpo ·.;	19.11	69.4	11.28	25.17	23.24
Fonte do antigénio usado para imunização	__carei	ioma da m	ama _{_}___	—mecón	io---
(Ex. 1 e 2)
Classe do anti- (Ex. 5) rnrnn '	IgGi	IgG₃		íg^G2_b
Ligação a GSL de diferentes biópsias da mama (Εχ.δ)	11/19	17/19	11/16	n · t ·	15/16
Número aproximado de monossacarideos no		6
GSL neutro antigénio 1	5	5	5	5
Ligação a células epiteliais de secções de tecido normal (Ex.8)
mama	3/5	4/5	3/5	5/5	5/5
fígado	0/1	1/1	n.t.	n.t	n.t.
rim	0/1	1/1	n.t.	n.t.	n.t.
baço	0/1	0/1	n.t.	n.t.	n.t.
pulmão	1/1	1/1	1/2	1/2	2/2
cólon	4/5	3/5·	4/5	5/5	5/5
amígdala	1/1,	1/1	n.t.	n.t.	n.t.
Ligação a células epiteliais de secções de
tecido tumoral (Ex.8)		•
colo-rectal	11/12	1/3	2/5	5/5	4/4
mama	4/6	2/4	1/5	2/4	4/4
pulmão	4/11	1/1	n.t.	n.t.	n.t.
quisto epitelial	1/1	1/1	n.t.	n.t.	n.t.
Ligação a linhas de célul^ tutora is				•
mama · bt-20 -	***	-	+	-
MCF-7	-	+	, -	-
ZR-?5-1	fx\ \ · z	·(+)	X	X	<+}
MDA-MB 231		-	+	(+)	(+)
colo-rectal sw 1222 nu	++	++	-	(+)	++
SW 948 NU	++	-	(+)	++	++
pulmão ^{A 5Z}*9 MBA 9812	(+)	-		+	+

.12.·

Designação do anticorDo	1018S 19.11	1018S 69.4	1O21S 11-28	1O22S 25.17	1O22S 23.24
Ligação a saliva(Ex. 10) Grupo sanguíneo Α,Β,Ο dos dadores de saliva	A,0	A		Α,Β,Ο	Α,Β,Ο
Grupo de Lewis dos dadores de saliva	a,b	b		a,b	a,b

> ! 11/19 = 11 positivos de um total de 19

n.t. = não testado

= não hã reacção .

(+) = duvidoso + = fraco

! -H- = bem definido

I

i!

il

-13-

Os anticorpos monoclonais do invento e seus derivados são obtidos por processos conhecidos per se, caracterizados por as células de hibridoma que secretam os referidos anticorpos monoclonais.

a) serem cultivadas in vitro e os anticorpos monoclonais isolados a partir do sobrenadante de cultura, ou

b) serem propagadas in vivo num mamífero adequado e os anticorpos monoclonais recuperados dos fluidos corporais do referido mamífero, e, caso se pretenda,

c) os anticorpos monoclonais obtidos são transformados em seus derivados.

meios de cultura adequados para a cultura in vitro de acordo com o processo:

a) são os meios de cultura convencionais tais como Dulbecco's Modified Eagle Médium ou RPHI 1640 Médium, facultativamente complementares com um soro de mamífero, e.g., soro fetal de vitela. 0 isolamento dos anticorpos monoclonais é conseguido por precipitação da proteína contida nos sobrenadantes de culturas com sulfato de amónio ou similares, seguido de purificação das imunoglobulinas por métodos de cromatografia padronizados, tais como filtração em gel, cromatografia de permuta iónica, cromatografia em DEAE celulose ou cromatografia de imunoafinidade.

Podem-se obter grandes quantidades dos anticorpos monoclonais pretendidos por propagação das células de hibridoma de acordo com o processo b). Ciones de células são injectados em mamíferos singeneicos os quais provocam o crescimento de tumores produtores de

anticorpos. Após uma a três semanas os anticorpos monoclonais pretendidos são recuperados dos fluidos corporais do referido mamifero. Como exemplo células de hibridoma derivadas de ratinhos Balb/c são injectadas intraperitoneal mente em ratinhos Balb/c facultativamente pré-tratados com um hidrocarboneto como seja o pristano e após uma a duas semanas é colhido o liquido ascilico destes ratinhos. Os anticorpos monoclonais pretendidos são isolados dos fluidos corporais por métodos conhecidos per se, e.g. por precipita ção das proteínas com sulfato de amónio ou similares, seguido de purificação das imunoglobulinas, por métodos de cromatografia padronizados, tais como filtração em gel, cromatografia de permuta iónica, cromatografia em DEAE-celulose ou cromatohgrafia de imunoafinidade.

Fragmentos de anticorpos monoclonais, por exemplo os fragmentos Fab, Fab¹ ou F(ab' que mantêm a sua especificidade contra os determinantes antigénicos dos glicocofingolípidos, podem ser obtidos a partir dos anticorpos monoclonais preparados de acordo com o processo a) ou b) por métodos conhecidos per se, e.g. por digestão com enzimas tais como pepsina ou papaína e/ou clivagem de pontes dissulfureto por redução química.

Os anticorpos monoclonais marcados com iodo radioactivo são preparados por métodos de iodinação conhecidos na especialidade, e.g. por marcação dos anticorpos monoclonais com iodeto de sódio ou potássio radioactivo e um oxidante químico como seja hipoclorito de sódio, cloramina T ou similares, ou um oxidante enzimático como seja lactoperoxidase ou glucose-oxidase e glucose Os anticorpos monoclonais do invento marcados radiocativamente são também preparados pela adição de nutrientes marcados radioactivamente ao meio de cultura das culturas in vitro do passo a). Tais nutrientes marcados contêm e.g.

-15carbono (¹⁴C)_S tritio (³H), enxofre (³⁵S) radioactivos ou j similares e são por exemplo L-(^⁴C)-leucina, L-(³H)-leucina

ou L-(³³S)-metionina.

Os conjugados de anticorpos

monoclonais do invento são preparados por métodos conhecidos na especial idade, e.g. por reacção com um anticorpo monodonal preparado de acordo com o processo a) ou b) ou um seu fragmento preparado como aqui foi descrito com o parI ceiro de conjugação pretendido, i.e., o composto citotóxico

ou carcinostático, o quelato de metais complexante, ou a

• enzima, na presença de um agente de acoplamento, e.g.

| glutaraldeido, periodato, N,N¹-o-fenilenodimaleimida,

| N-(m-meleimidobenzoiloxi)-succinimida, N-(3-/2¹-piridi1I "

ditio7~propionoxi)-succinimida, N-eti1-N¹ -(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida ou similares. Para preparar os conjuI gados preferidos de anticorpos monoclonais com agentes

; citotóxicos ligados via um ligante susceptível de clivagem

por uma das enzimas do complemento do soro, usa-se um dos

I

métodos descritos no Pedido de Patente Europeia 88 695.

I

i

I

i 0 invento relaciona-se ainda

f

, com linhas celulares de hibridoma, caracterizadas por ι secretarem anticorpos monoclonais que se ligam a glicoesfingolipidos neutros produzidos por células epiteliais.

I

j Em particular o invento diz

j respeito a linhas celulares que são híbridos de células *! de mieloma e linfócitos B de um mamífero imunizado com

glicoesfingolípidos. De preferência estas linhas celulares

fi

i; são híbridos de células de mieloma de ratinho ou rato e ;i linfócitos B de um ratinho ou rato singeneico imunizado ι com glicoesfingolípidos.

-16São particularmente preferidos

as linhas celulares de hibridoma com a designação 1018519.11 1022525.17, 1021511.28 e 1018569.4, as quais foram depositadas em 16 de Agosto ,1984, e a linha celular de hibridoma 10225.23.24, depositada em 31 de Maio, 1985, na "Collection Nationale de Cultures de Microorganisms", Instituto Pasteur I Paris, com 0 numero 1-331, 1-332, 1-333, 1-334 e 1-453, respectivamente. Estas linhas celulares de hibridoma da linha celular da mieloma de ratinho Sp2/0-Ag 14 e de linfócitos B do baço de ratinhos Balb/c imunizados com glicoesfingolipidos. Elas são linhas celulares estáveis que secretam os anticorpos monoclonais com a designação 1018519.11, 1022525.17, 1021511.28, 1018569.4 e 1022523.24 respectivamente. As linhas celulares podem ser mantidas em culturas congeladas e reactivadas por descongelação e nova clonagem facultativa.

0 invento também se relaciona com um processo para a produção de linhas celulares de hibridoma secretando anticorpos monoclonais que se ligam a glicoesfingolipidos neutros produzidos por células epiteliais, caracterizada por um mamifero adequado ser imunizado com uma mistura de glicoesfingolipidos ou seus derivados antigénicos,as células deste mamifero produtoras de anticorpos fundidas com células de mieloma, as células híbridas obtidas na fusão clonadas seleccionadas e os clones de células secretoras dos anticorpos pretendidos.

São antigénios adequados para a imunização de mamíferos no processo do invento misturas de glicoesfingolipidos (GSL) e/ou conjugados destas misturas de GSL com veículos imunogénicos. As misturas de GSL são obtidas por métodos conhecidos e.g., por extracção com solventes usando misturas de solventes contendo um alcanol inferior, como seja metanol e um alcano inferior halogenado

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tal como clorofórmio, faeultativamente na presença de água a partir de tecidos vários, tais como tecidos da mama, fígado, rim, baço e amígdalas, também de tecido tumoral, e.g. carcinoma da mama, tumores dos pulmões e similares, de eritrócitos e outras fontes celulares, e.g. mecónio, i.e., as fezes dos recém-nascidos, faeultativamente pré-tratadas com um solvente orgânico como seja acetona para remover a gordura de reserva. As fontes preferidas de mistura de GSL são tecidos de origem humana, especialmente tecidos malignos, tais como material de biópsia de carcinoma da mama ou mecónio. Faeultativamente os extractos brutos de GSL são enriquecidos e purificados por distribuição em solventes entre água faeultativamente contendo sais inorgânicos, como seja cloreto de sódio ou potássio e misturas contendo um álcool inferior como seja metanol, e um aleano inferior halogenado, como seja clorofórmio e/ou por métodos de cromatografia, e.g. cromatografia em coluna em gel de silica normal ou de fase reversa, resina de permuta iónica e similares.

São preferidas as misturas de GSL obtidas a partir de carcinoma da mama pré-tratado com acetona ou de mecónio por extracção com misturas de metanol/ /clorofórmio/água, partição de solvente entre água e metanol/ /clorofórmio e cromatografia sobre gel de silica de fase reversa.

Os conjugados antigénicos das misturas de GSL com veículos imunogénicos são conjugados com e.g. polipeptideos de alto peso molecular tais como albumina de soro, particulas de latex, células totais ou bactérias. Eles são preparados por métodos conhecidos per se, tanto por adsorção de GSL ao veiculo como por acoplamento usando carbodiimidas, periodato, glutaraldeido N, N¹-o-fenilenodimaleimida, N-(m-maleimidobenzoiloxi)-succinimida, N-(3-/2¹ -piridi11i0/-propionoxi)-succinimida ou

similares. São antigénios preferidos misturaste GSL adsorvidas a bactérias, em particular a bactérias com uma superfície lipofílica, como seja a bactéria mutante rugosa R595 de Salmonella minnesota. A proporção de Salmonella minnesota R595 peso seco para o peso das misturas de GSL é de preferência entre 2:1 e 10:1.

Os mamiferos preferidos para a

imunização são ratinhos ou ratos. São particularmente preferidos os ratinhos Balb/c. As imunizações são feitas e.g. por injecção de conjugados de GSL três a oito vezes parenteralmente, como seja intraperitonealmente e/ou subcutaneamente com intervalos de um a dez dias, em quantidades de cerca de 100 yg a cerca de 500 yg calculado na mistura pura de GSL,

ι seguido de uma injecção de chamada ("Cooster") de cerca de 300 yg a cerca de 600 yg de GSL apôs duas a oito semanas.

As injecções contêm facultativamente um adjuvante estimulador da produção de linfôcitos como seja o adjuvante de Freund completo ou incompleto a este adjuvante é indispensável se forem injectadas misturas de GSL não conjugadas em vez de conjugados de GSL. Para injecções de misturas de GSL adsorvidas a bactérias não é dado adjuvante adicional.

As células produtoras de anticorpos dos mamiferos imunizados, de preferência células de baço, removidas a cinco dias após a injecção de chamada

! ("Cooster") final, são fundidas com células de mieloma de uma linha celular adequada na presença de um promotor de fusão.

I

ι

! Várias linhas celulares de mie! loma adequadas são conhecidas na especialidade. São prefei!

ridas as linhas celulares de mieloma sem a enzima lipoxantina guanina fosforibosil transferase (HGPRT) ou a enzima timidina cinase (TK), as quais não sobrevivem num meio de cultura

! selectivo contendo hipoxantina, aminopterina e timidina

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(meio HAT). São particularmente preferidas as células de mieloma e linhas celulares derivadas que não sobrevivem em meio HAT e que não secretam imunoglobulinas ou seus fragmentos, como sejam as linhas celulares X63-Ag 8.653 ou Spa/o-Ag14. Os promotores de fusão considerados são e.g. virus Sendai ou outros paramixovírus, facultativamente na forma inactivada por UV, iões cálcio, lipidos tensoactivos tais como lisolecitina ou poiietilenoglicol. De preferência as células de mieloma são fundidas com um excesso de três a vinte vezes de células de baço de mamíferos imunizados numa solução contendo cerca de 30% a cerca de 60% de polietilenoglicol de peso molecular entre 1000 e 4000.

Após a fusão as células são

ressuspensas e cultivadas em meio sélectivo HAT. Deste modo apenas as células de hibridoma sobreviverão pois combinam a capacidade de crescerem e replicarem-se in vitro herdadada das células de mieloma e a ausência dos genes HGPRT e TK essenciais â sobrevivência em meio HAT herdada das células de baço produtoras de anticorpos dos mamíferos imunizados.

São meios de cultura adequados â expansão das células de hibridoma os meios de cultura convencionais, tais como meio mínimo essencial de Eagle

í modificação de Dubbecco, meio RPMI 1640 e similares, faculli

|i tativamente suplementados com soro e.g., 10 a 15% de soro ! fetal de vitela. De preferência adiciona-se células de maI nutenção no inicio do crescimento celular, e.g. células ' normais do exsudato peritoneal de ratinho, células de baço

macrófagos de medula óssea, e simileres. Os meios de cultura são suplementados com meio selectivo HAT em intervalos regulares de modo a evitar um sobrecrescimento de células normais de mieloma relativamente âs células de hibridoma.

Os sobrenadantes das culturas

-20de células de hibridoma são testados relativamente aos anticorpos monoclonais pretendidos, de preferência com um imunoensaio com enzima ou radioimunoensaio, e.g. por transferência de GSL. As células de hibridoma positivas são clonadas, e.g. por diluição limite de preferência duas ou mais vezes. As linhas celulares clonadas podem ser congeladas de modo convencional.

Os anticorpos monoclonais do invento e/ou os seus derivados são úteis na determinação qualitativa e quantitativa e/ou purificação dos glicoconjugados de membranas celulares epiteliais.

Por exemplo, os anticorpos monoclonais ou seus derivados, tais como conjugados com enzimas ou derivados radiocativos, podem ser usados em qualquer um dos imunoensaios conhecidos, os quais se baseiam na interacção de ligação entre o determinante antigénico, e.g. de um glicoesfingolípido, e os anticorpos monoclonais. Exemplos de tais ensaios são radioimunoensaios, imunoensaios com enzimas, imunofluorescência, aglutinação com latex e hemaglutinação. Tais imunoensaios são úteis e.g. no diagnóstico de transformações oncogénicas resultando numa alteração qualitativa e quantitativa de teor em glicoconjugados das membranas de células epiteliais.

Glicoconjugados, tais como

glicoproteinas, de membranas de células epiteliais podem ser purificados por cromatografia de imunoafinidade com a ajuda de anticorpos monoclonais do invento. Os anticorpos monoclonais ou seus fragmentos são ligados a um veiculo adequado de origem orgânica ou inorgânica, como seja agarose inter-1igada, dextrano ou poliacrilamida numa forma adequadamente funcionalizada, facultativamente após activação, aplicando métodos gerais conhecidos na especialidade. Por exemplo, um veiculo tendofunções éster activadas é suspenso

numa solução aquosa tamponada, misturado com uma solução de um anticorpo monoclonal ou um seu fragmento, filtrado ressuspenso e lavado para remover o excesso de anticorpo monoclonal e tratado com uma solução de proteínas irrelevantes para bloquear posições reactivas, livres do veiculo.

Este veiculo revestido com anticorpo ê usado para ligar selectivamente glicoconjugados de membranas de células epiteliais. Eluição com várias soluções tampão facultativamen te contendo sais inorgânicos adicionais dá então fracções contendo os glicoconjugados de interesse na forma purificada.

Os anticorpos monoclonais do

invento e/ou seus derivados são ainda úteis no diagnóstico e tratamento de cancro.

Por exemplo, derivados dos

anticorpos monoclonais do invento marcados radioactivamente podem ser usados para detectar tumores primários e com metástases em mamíferos por técnicas de "radioscaming". Para tal o anticorpo radiocativo é injectado e.g. intravenosamente e o mamífero é varrido com um detector de raios gama em intervalos regulares. Os tumores que expressem GSL antigénio capturarão mais anticorpos radiocativos do que os outros tecidos e serão claramente reconhecidos pela câmara de imagens de gama. Preferencialmente os anticorpos monoclonais

1 31

marcados com I são usados no "radioscaming" em quantidades de 3 a 8 y g representando 15 a 30 yli por kg de peso do corpo.

Ainda, os próprios anticorpos

monoclonais e particularmente seus derivados tais como conjugados com compostos citotóxicos e carcinostáticos podem ser usados no tratamento de cancro, especialmente carcinoma da mama que expresse o GSL antigénio. A dose terapêutica

-22-

para mamíferos varia entre aproximadamente 1 mg e 10 mg

por kg de peso de corpo para os próprios anticorpos monoclonais e entre 0,1 mg e 10 mg por kg de peso do corpo

para conjugados com drogas citotóxicas dependendo do es| tado do paciente e do modo de aplicação.

Os anticorpos monoclonais e/ou seus derivados são também úteis na remoção imunológica de células de cancro em enxertos de medula óssea. Para esse fim aspirados de medula óssea de pacientes recebendo doses elevadas de drogas e/ou tratamento com radiações são incubados com os anticorpos monoclonais do invento na presença de complemento, incubados com conjugados de anticorpos monoclonais com drogas citotóxicas, ou tratados com anticorpos monoclonais conjugados con microesferas magnéticas como descrito por J.G. Treleavem et al (Lancet, 1984, 70). este tratamento lisará ou removerá as células tumorais que expressem GSL antigénio sem atingirem as células da medula óssea, as quais podem ser então usadas para transplantação autóloga.

0 invento relaciona-se também com preparações farmacêuticas contendo os anticorpos monoclonais que se ligam a glicoesfingolípidos neutros produzidos por células epiteliais, ou seus derivados, numa quantidade terapêuticamente eficaz juntamente com um veiculo farmacêutico, sólido Ou liquido, de origem orgânica ou inorgânica.

São preferidas as preparações farmacêuticas para aplicação parenteral. Preparações para aplicação intramuscular, subcutâneo ou intravenosa são e.g. soluções ou suspensões aquosas isotónicas, facultativamente preparadas imediatamente antes de usar a partir de preparações liofilizadas ou concentradas. As preparações farmacêuticas podem ser esterilizadas e conterem aditivos

23e.g. para conservar, estabilizar, molhar, emulsionar ou solubilizar os ingredientes, sais para a regulação da pressão osmótica, tampões e/ou compostos para regular a viscosidade, e.g. carboxicelulose sódica, dextrano, polivinilpirrolidona ou gelatina. Elas são preparadas por métodos conhecidos na especialidade, e.g. por mistura dissolução ou liofilização convencionais e contêm entre aproximadamente 0,01% e aproximadamente 50% de ingredientes activos. As preparações para injecções são processadas, introduzidas em ampolas ou frascos fechados em condições assépticas de acordo com métodos conhecidos na especialidade.

Os exemplos que se seguem ilustram o invento mas não o limitam em qualquer grau.

As abreviaturas usadas nos exemplos têm os seguintes signi ficados:

AEC 3-amino-9-etilcarbazol

GSL glicoesfingolipido

HAT 1 ipoxantina/aminopterina/timidina

HPTLC cromatografia em camada fina de alta resolução

PBS tampão fosfato salino

TBS tampão tris-(hidroximeti1)aminometano salino

Tris tris-(hidroximeti 1)-aminometano.

-24EXEMPLO 1

Isolamento e purificação de glicoesfingolípidos polares partir de material de biópsia de carcinoma da mama

1.1 Extracção

Sedimentos celulares derivados de amostra de biópsia de tecido retirador para determinações do receptor de estrigénios são obtidos de um grande número de pacientes com diagnóstico histológicamente confirmado de carcinoma da mama.

Numa experiência típica, amostras de 190 indivíduos obtidas como coágulos congelados em tubos de polistireno são arrefecidos ainda a temperaturas mais baixas com neve carbónica e o plástico é quebrado com um martelo. Os sedimentos colhidos (169 g peso molhado) são liofilizados e dão 33 g de peso seco. 0 material seco é liberto da gordura de reserva por homogeneização repetida em acetona a 4⁹C usando um homogeneizador de tecidos Sorvai e subsequente filtração. 0 material sólido residual ainda contém a grande parte dos lípidos polares tais como fosfolípidos e glicoesfingolípidos. Estes são extraídos â temperatúra ambiente três vezes usando 200 ml de clorofórmio:

: metanol 2:1 (v/v) e duas vezes com 200 ml de clorofórmio: :metanol:água 1:1:0,2 (v/v/v).

-25-

1.2 Partição de Folch

0 grosso dos fosfolipidos e os gl icossf ingol ipidos com menos de quatro açucares na sua

} cadeia oligossacaridea são separados dos glicoesfingolipidos polares por um processo de partição modificado de acordo com Folch (T. Saito and S. Hakomori, J. Lipid Res. 12, 257 (1971)). Os extractos colhidos do exemplo 1.1 são evaporados sob pressão reduzida a 40²C e redissolvidos em 90 ml de clorofórmio:metanol 2:1 (v/v) num cilindro de vidro rolhado. Adiciona-se 15 ml de água e as soluções são agitadas vigorosamente. Apõs 15 minutos de repouso as fases estão separadas. A fase inferior rica em clorofórmio é extraida três vezes com clorofórmio:metanol:0,1% de HCl aquoso 1:10: 10 (v/v/v).

1.3 Cromatografia de fase reversa

Para remover o sal e outros contaminantes solúveis em água, as fases superiores combinadas do exemplo 1.2 são evaporadas, suspensas em água e aplicadas

D

a uma coluna de vidro contendo 7 ml de Lichroprep RP18 (Merck, F.R.G.). Após lavagem abundante com água a fraeção

íi de gl icoesf ingol ipidos polares é eluida com 10 ml de metanol |í seguido de 10 ml de cloroftfmio:metanol 2:1 (v/v). 0 rendimenll

í to é de cerca de 30 mg, i.e. 0,1% de peso seco de tecido.

261.4 Cromatografia em camada fina

A pureza da preparação de GSL é testada por cromatografia em camada fina de gel de silica e subquente vaporização das placas com o reagente orcinol/ãcido sulfúrico para se visualizar os compostos contendo açúcar (L. Svennerholm, J. Neurochem. 1, 42 (1956)) ou

n ““

Phospray (supelco Inc., Bellefonte, Pa., USA, ver J.

C. Dittner e R.L. Lester, J. Lipid Res. 5, 126 (1964)) para detectar fosfolipirdos. Usam-se placas de silica gel 60 KPTLC (tamanho 5x5 cm, espessura da camada solvente 0,24 mm, Merck F.R.G.). As amostras de lipidos são dissolvidas em 10-20 yl de cloro.fórmio:metanol 2:1 (v/v) e aplicadas as placas como uma listra de 4 cm de comprimento usando em aplicador de amostras automático modelo Linomat III (Camag, Switzerland). 0 sistema solvente é clorofórmio:metanol:água 55:45:10 (v/v/v) contendo Cacl₂ 1 mM. As placas reveladas apresentam o padrão tipico das misturas de GSL com residuos de açúcar de teor variável em monossacarídeos. Estão presentes apenas quantidades mínimas de material não-esfingolípido.

EXEMPLO 2

Isolamento e purificação de glicoesfingolipidos a partir de mecónio

As fezes de vários indivíduos recem-nascidos são raspadas da fralda e tratadas exactamente da mesma maneira descrito no exemplo 1, com excepção da omissão do passo de extracção com acetona do exemplo

1.1. 0 rendimento é de cerca de 0,2% de peso seco. A composição e pureza da mistura de glicoesfingolipidos (GSL) de-27termina-se como descrito no exemplo 1.4.

EXEMPLO 3

Produção de células de hibridoma

3.1 Preparação do imunogénio

GSL purificados do exemplo 1 ou 2 são adosrvidos a bactérias Salmonella minnesota R-595 liofilizadas e tratadas com ácido acético (C. Galanos, 0. Ltideritz e 0. Westphal. Eiur. J. Biochem. 24, 1 16 ( 1971 )) para aumentar a imunogenicidade dos antigénios lipfdicos. Para tal, 60 mg de bactérias (peso seco) são suspensas num balão de fundo redondo de 250 ml em 100 ml de clorofórmio: :metanol 2:1 (v/v) contendo 10 mg de GSL. 0 solvente é evaporado a temperatura ambiente usando um evaporador rotativo rodando a velocidade máxima. As bactérias cobertas de GSL são raspadas da parede de vidro e suspensas em tampão fosfato salino (PBS) a uma concentração de 2,4 mg/ml. Numa avaliação ao microscópio observam-se agregados de forma irregular assim como bactérias isoladas.

I 3.2 Protocolo de imunização

4 ratinhos fêmea Balb/c são | injectados intraperitonealmente cada um com amostras de

bactérias cobertas com GSL contendo 100 yg de GSL no dia 0, 200 yg no dia 4, 300 yg no dia 7 e 400 yg no dia 11. No dia 19 os ratinhos foram sangraohs no olho e testados

QÈOQ

28·

quanto a_; actividade do soro anti-GSL usando o sistema de transferência de GSL descrito no exemplo 6. No dia 36 foi dada uma injecção booster de uma amostra contendo 400 y g de GSL e os ratinhos foram mortos quatro dias mais tarde.

3.3 Fusão celular

Todas as experiências de fusão são efectuadas de acordo com o processo de G. KOhler e C. Milstein (Nature 256, 495 (1975)) usando a linha de mieloma não secretora Sp 2/0 -Ag 14 (M. Shulman, C.D.

Wilde e G. KOhler, Nature 276, 269 (1978)). 10⁸ células de baço são misturadas com 10⁷ células de mieloma na presença de 1 ml de polietilenoglicol a 50% (PEG 1500, Serva). Apôs lavagem as células são ressuspensas em 48 ml de meio minimo essencial de Dulbeco (Gibco N² 0422501). 15% de soro fetal de vitela e 3x10 células normais de exsudato peritoneal de ratinho por fusão são adicionados como células de manutenção. As células são distribuídas por poços costar 48x1 ml e alimentados 3 a 4 vezes por semana com meio de selecção HAT padronizado durante 3 a 6 semanas. Quando se torna visivel o crescimento das células de hibridoma, os sobrenadantes são testados quanto a ligação a GSL (exoiplo

6). A clonagem das células de hibridoma é feita por diluição limite em placas de microtitulação. Os sobrenadantes são testados quanto a ligação a GSL num imunoensaio com enzima em fase sólida descrito no exemplo 7. Todas as linhas de hibridoma são clonadas pelo menos uma vez.

-29-EXEMPLO 4

Isolamento e purificação de anticorpos monoclonais

Ratinhos Balb/c com 8-10 semanas de idade (Tierfarm Sisseln, Switzerland) são pré-tratados intraperitonealmente com 0,3 ml de pristano fi

(Aldrich), 2-3 semanas mais tarde, 2-5x10 células de hibridoma cionado e 0,2 ml de pristano são inoculados intraperitonealmente. Após 8-10 dias colhe-se o liquido ascitico, centrifuga-se a 800xg e guarda-se a -20²C.

0 fluido ascítico descongelado é centrifugado a 50 000xg durante 60 min. Uma camada de gordura flutuando a superficie é cuidadosamente removida e a concentração proteica ajustada a uma concentração de 10-12 mg/ml. A imunoglobulina bruta é precipitada por adição gota a gota de 0,9 equivalentes de volume de sulfato de amónio saturado a 0²C, em seguida dissolvida em Tris-HC1 20 MM/NaCl 50 mM (pH 7,9) e dialisado contra o mesmo tampão. Obtem-se uma fracção de imunoglobulinas G por cromatografia em DEAE-D52 celulose (Whatman) usando um sistema de gradiente de tampão de Tris-HCl 20mM/NaCl 25-400 mM, pH 7,9. A imunoglobulina G é de novo precipitada com sulfato de amónio e dissolvida em PBS a uma concentração de 10 mg/ml.

Electroforese em gel de poliacrilamida e dodecilsulfato de sódio (SDS-PAGE) demonstra um grau de pureza de mais de 95 por cento para os anticorpos monoclcrais 1018519.11, 1018569.4, 1021511.28, 1022525.17 e 1022523.24.

-30-

EXEMPLO 5

Determinação da classe e subclasse dos anticorpos monoclonais

A classe e subclasse dos anticorpos monoclonais produzidos por células de hibridoma clonadas é determinado num imunoensaio com enzimas. Placas de microtitulação são revestidas com 1 yg por poço de uma preparação de imunoglobulina de coelho de um soro especifico de classe ou subclasse em 50 yl de PBS. A capacidade de ligação livre da placa é saturada com um tampão de 1% de albumina de soro bovina em PBS contendo 0,2% de NaNg (p/v) pH 7,4. Amostras de 100 yl contendo anticorpos monoclonais são incubados nos poços a 37^SC durante 1 h. As placas são lavadas com PBS, depois incubadas a 37^SC durante 1 hora com uma preparação de imunoglobul ina de ooelho conjugada com fosfatase da especificidade usada para revestir as placas.

A enzima fixada é revelada por incubação (37⁹C, 30 min) com uma solução de substracto da enzima p-nitrofenilfosfato (1 mg/ml em tampão dietanolamina a 10% contendo MgCl₂ 0,5 mM e 0,02% (p/v) de NaN₃, pH 9,8) e medição da densidade óptica a 405 mm.

-31EXEMPLO 6

Caracterização da especificidade dos anticorpos monoclonais contra GSL por transferência de GSL

A mistura de GSL é separada por cromatografia em camada fina em placas de HPTLC como descrito no exemplo 1.4, em seguida prepara-se um duplicado da placa por transferência de todo o padrão de GSL separado para nitrocelulose. Este ensaio de transferência de GSL é espeeialmente conveniente para fins de rastreio. Especificamente, 100 yg de GSL de biópsia de mama humana preparado de acordo com o Exemplo 1 são aplicados como uma listra de 10 cm de comprimento a uma placa de HPTLC de tamanho 5x10 cm. Após separação no sistema solvente do exemplo 1.4 a placa é seca. Usando um lápis macio, desenham-se marcas para posterior orientação. A placa é vaporizada com uma solução de isopropanol/água (2:1) até estar visivelmente molhada sem formação de gotas na superficie. A placa é imediatamente pressionada durante 1 min sobre uma folha

D

de nitrocelulose ligeiramente maior (HAWPOO , Millipore) suportada põr uma folha de polietileno. 0 excesso de nitrocelulose é cortado e o duplicado deixado secar. A folha é hidratada de novo num tampão contendo Tris-HCl 20 mM/NaCl 5 mM/CaCl₂ 0,15 mM, pH 7,4 (TBS). A folha é então incubada com 10% de soro de cavalo em TBS durante 1 h a 40^sC para bloquear o excesso de capacidade de ligação.

A folha é cortada em tiras de 2 mm de largura, cada uma tendo o mesmo padrão de GSL separado. As tiras são incubadas durante 2 h e.g. com sobrenadantes de hibridomas do exemplo 3.3 em reservatórios de inserção de várias pipetas (Dynatech Laboratoires Inc. Alexandria, VA. USA) servindo de tabuleiros de incubação adequados. As tiras são lavadas três vezes durante 5 min

.-32com TBS e incubadas durante mais 1 h com um conjugado de peroxidase de rábano silvestre e imunoglobulina de carneiro dirigida contra IgG de ratinho (Cappel Laboratoires Inc., Chochranvi1le USA) diluido 500 vezes com 10% (v/v) de soro de cavalo com TBS. Após lavagem em TBS como acima, o conjugado ligado é visualizado pela oxidação do 4-cloro-1-naftol catalisada pela peroxidase para dar um depósito insolúvel azul. 0 substracto 4-cloro-1-naftol ê diluido 50 vezes em TBS a partir de uma solução a 1% (p/v) em dimetilformamida e adiciona-se peróxido de hidrogénio para uma concentração final de 0,006% (p/v). Após 20 min a reacção é parada por lavagem com água. No caso de uma reacção positiva observa-se uma ou mais bandas. Diferentes padrões de coloração sugere a ocorrência de diferentes anticorpos.

Para o ensaio de transferência de GSL usado na caracterização de anticorpos individuais, 5 yg de GSL de biópsia de mama humana de uma amostra de tecido de pacientes isolados ê aplicado a uma placa de HPTLC e processado como descrito acima.

EXEMPLO 7

Rastreio de anticorpos contra GSL por ensaio de imunosorvente ligado a enzima em fase sólida (ELISA)

Uma placa de microtitulação de 96 poços de cloreto polivinílico é revestida com 200 yg por poço de um extracto de GSL de material de biópsia de carcinoma da mama preparado como no exemplo 1 dissolvido em 25 yl de etanol. Deixa-se os poços secar e enchem-se completamente com 1% (v/v) de soro de cavalo em TBS (composição do TBS ver exemplo 6). Após 1 hora a placa é lavada com TBS e adicionado 50 yl de uma solução a ser testada

33quanto a anticorpos monoclonais. Após 3 h a placa é lavada e adicionado 50 yl de um reagente contendo um segundo anticorpo ligado a enzima. Este reagente consiste em anticorpos de cabra contra imunoglobulinas de ratinho conjugados com fosfatase alcalina numa diluição de 1000 vezes em 1% (v/v) de soro de cavalo em TBS. Após 1 h a placa é lavada 4 vezes com TBS e revelada com o substracto da enzima p-nitrofenilfosfato em tampão dietanolamina a 10% como descrito no exemplo 5.

EXEMPLO 8

Coloração imuno-histoquimica com anticorpos monoclonais contra G-SL Crio-secções de 5 a 10 ym são preparadas como é habitual a partir de tecido normal de mama, fígado, rim, baço, pulmão e cólon e amígdala e tecido de carcinoma colo· -rectal, da mama e do pulmão ou tumores de quistos epiteli· ais fixados em formalina e preservados pelo frio. 0 tecido embebido em parafina não ê adequado devido ao perigo de se perder G-SL durante as incubações em solventes contendo álcool. As crio-secções são secas a 50^sC durante 5 min., desengorduradas em acetona arrefecida em gelo durante 5 min., secas de novo e pre-incubadas com 10% (v/v) de soro de cavalo em PBS. Após 30 min., as lâminas são lavadas com PBS durante 5 min. 0 sobrenadante de hibridomas ou uma outra amostra a ser testada quanto a anticorpos monoclonais (cerca de 400 yl) suficiente para cobriria secção de tecido) é adicionada. Após 1 h a lâmina ê lavada três vezes com PBS e adicionado o segundo anticorpo conjugado com peroxidase descrito no Exemplo 6. Após 30 min., as lâminas são lavadas como acima e reveladas com 3-amino-9-etilcarbazol (AEC) dando um depósito vermelho. A solução de substracto da enzima consiste numa solução recente-34-

mente preparada e filtrada de 4 mg/ml de AEC em dimetilformamida diluida 20 vezes com tampão acetato de sódio preparado pela mistura de 100 partes de acetato de sódio aquoso 0,1 M e 40 partes de ácido acético aquoso 0,1 M.

) A concentração de peróxido de hidrogénio ê ajustada a

0,014% (p/v). As lâminas são incubadas durante 15 min., no escuro, lavadas 3 vezes com tampão acetato e secas.

As secções são montadas em glicerol-gelatina, pK 5,0 e observadas ao microscópio. Testemunhas adequadas têm de ser incluídas consistindo em secções incubadas com um segundo anticorpo apenas, primeiro anticorpo irrevelante e sem qualquer anticorpo para testar a actividade de peroxidase endógena.

EXEMPLO 9

Coloração da superfície celular de células vivas

, Linhas celulares aderentes com

j| origem em carcinoma da mama, colo-rectal, e do pulmão são

|| crescidas em placas de cultura de tecidos de 96 poços de

| acordo com os processos normalizados da tecnologia de cultui ra de tecidos.

í

As células são incubadas com 100 yl de sobrenadante de cada um dos hibridomas ou outras amostras a serem testadas quanto a anticorpos monoclonais, depois lavadas, incubadas com um segundo anticorpo conju| gado com peroxidase e reveladas com AEC como descrito no

-35exemplo 8. Para evitar perda de células, os passos de lavagem têm de ser feitos cuidadosamente sem completa remoção do liquido. As células coradas são observadas com um microscópio invertido imediatamente após o último passo de lava) gem após a revelação com AEC.

Detalhes sobre as linhas celulares testadas podem ser encontrados nas seguintes referências da literatura:

BT-20: E.Y. Lasfargues e L. Ozzello, J. Natl. Câncer Inst. 2b 1 131 ( 1958); MCF-7: H.D. Soele et aj_., J. Natl. Câncer Inst. 51, 1409 ( 1973); ZR-75-1: R. Cailleau et al.,

J. Natl. Câncer Inst. 53, 661 (1974); MDA-MB 231: L.W.

Engel et a 1., Câncer Res. 38, 3352 ( 1978); SW 1222 NU e SW 948 NU: A. Leibovitz em "Human tumor cells in vitro"

(J. Fogh, ed.,), Plenum Press, New York, 1975, p. 23; A 549; M. Lieber et al., Int. J. Câncer 17, 62( 1976); MBA 9812: :G.J. Todaro, C. Fryling e J.E. DeLarco, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 77, 5258 (1980).

EXEMPLO 10

Ensaio em pontos ("dots") de saliva

íi

0 processo é uma adaptação

do conhecido ensaio imunoligação em pontos descrito no Pedido de Patente Europeia EP 63 810 para a saliva como antigénio. Amostras de saliva colhidas individualmente de

dadores de grupos sanguíneos conhecidos Α,Β,Ο e de Lewis ί são aquecidas durante 10 min a 100^sC e centrifugadas a

! 10 000xg durante 10 min. 0 sobrenadante (não diluido, diluido a 1:3 e a 1:10 em PBS) é aplicado em quantidaders de 0,2 yl a nitrocelulose (com uma grelha nela impressa,

Millipore, Bedford, MA). A folha é bloqueada com 10% de soro de cavalo em PBS durante 1 hora a 40^sC, cortada em tiras de modo a conterem todo o painel de amostras de saliva incubadas com os anticorpos monoclonais (liquido ascitico do exemplo 4 diluido a 1:500 ou sobrenadante de culturas do exemplo 3.3) durante 3 horas, lavadas e incubadas com um anticorpo de cabra conjugado com peroxidase induzido contra imunoglobulina de ratinho (Nordic Laboratoires, Tillburg, Netherlands, diluido a 1:500).idurante 1 hora. A peroxidase é detectada com 4-cloro-1-naftoi e H₂0₂ como descrito no exemplo 6.

EXEMPLO 11

Preparação de um conjugado de anticorpo monoclonal 1018519.11 com ricino A

ι A uma solução em agitação de

! 3,0 mg de anticorpo monoclonal 1018519.11 em 1,5 ml de PBS

| â temperatura ambiente, adiciona-se uma solução de 0,187 mg

lí

ji de N-succinimidi 1 -3-(2-piridiltio)-propionato (Pharmacia).

·: Após 30 min, a mistura ê dialisada contra PBS a 4^SC. 0 anil ticorpo activado é misturado com 0,5 ml de uma solução de

PBS contendo 30 mg de ricino A purificado por cromatografia

n

ij em gel em Sephadex G25 e mantido â temperatura ambiente

'í durante 20 hr. A mistura de reacção é cromatografada numa

ji n

ji coluna de gel Sephadex G 100. As fracções são analisadas ij quanto ao teor em anticorpos por medição da densidade óptica

ji a 280 nm e quanto ao ricino A pelo seu^poder inibidor da

! sintese proteica medido num sistema celular e fracções idên! ticas são combinadas para dar cerca de 1 mg de conjugado com

í uma média de cerca de 1,5 moles de ricino A por mole de anti-

-37corpo no conjugado.

EXEMPLO 12

Preparação do anticorpo 1018519.11 marcado com ^$1

40 yg de anticorpo 1018519.11

são iodinados com 0,5 mli de iodeto de sódio marcado com 125

I e cloramina T seguindo processo geral de F.C. Greenwood et al., Biochem. J. 89, 1 14 ( 1953). 0 produto da reacção é purificado por cromatografia na resina de permuta iónica Bio Rad AG 1 χ 8^β.

EXEMPLO 13

Localização de tumores humanos em ratinhos labro com antiI corpos monoclonais marcados radioactivamente

13.1 Cintigrafia

Carcinomas da mama humanos

transplantáveis são crescidos subcutâneamente em ratinhos glabro como descrito por H.H. Fiebrig & G.W. Lõhr, Medwelt ¹/2 92-106 ( 1984). Adiciona-se iodeto de potássio (0,05%) á água de beber dos ratinhos. Após dois dias, 30 yli (ca.

I 4 yg) do anticorpo 1018S19.11 (exemplo 12) marcado com j & administrado intravenosamente e dois a dez dias mais

! tarde, faz-se cintigrafia usando uma câmara de gama de acori

! do com Anger. Durante a cintigrafia o animal ê anestesiado

-38com Nembutal (Abbott) a 0,04 mg/g de peso do corpo.

0 anticorpo marcado radiocativamente acumula-se distintamente no cintigrama na região do tumor visivel macroscópicamente. Esta acumulação é comparada com regiões do ratinho que se sabe não possuírem tumores e com animais tratados com um anticorpo irrelevante marcado radioactivamente que se sabe não se ligar ao tumor.

13.2 Radioactividade de orgãos removidos

0 grau de localização do anticorpo marcado radioactivamente é determinado por contagem directa da radioactividade do tumor e comparação com a radioactividade de outros tecidos. A radioactividade especifica (radioactividade por peso de tecido em cpm/mg) encontrada nos orgãos e fluidos de um animal tratado como descrito no exemplo 13.1 é 1050 (tumor de carcinoma da mama)

70 (baço), 107 (rim), 182 (pulmão), 58 (intestino), 106 (figado) e 488 (sangue). Estes números são comparados também com a radioactividade especifica encontrada em orgãos e sangue de animais tratados com um anticorpo irrelevante marcado radioactivamente.

13.3 Auto-radiografia de crio-secções de tecidos removidos

Crio-secções de espessura uniforme (10 a 40 ym) são preparadas a partir de orgãos e tumores removidos. As lâminas são secas a 50²C durante 5

min., lavadas durante 5 min., em PBS secas e postas em 3 Θ

contacto com um filme de raios X (Ultrofilme - H , LKB Bromma, Sweden). 0 grau de localização do tumor é claculado a partir do escurecimento do filme revelado comparado com o filme exposto a tecidos normais e a tecidos de animais

11¾¾¾¾]

tratados com anticorpo irrelevante marcado radioactivamente. Tipicamente observa-se um escurecimento ligeiro uniforme no filme exposto a tecidos normais e um escurecimento intenso muitas vezes âs manchas no filme exposto a tecidos tumorais de animais tratados como descrito no exemplo

13.1.

EXEMPLO 14

Solução de injecção

120 mg do anticorpo monoclonal 1018S19.11 preparado de acordo com o exemplo 4 são dissolvidos em 5 ml de soro fisiológico. A solução é passada através de um filtro bacteriológico e o filtrado usado para encher ampolas em condições assépticas. A ampola é preferencialmente guardada no frio, e.g. a -20⁹C.

Ampolas contendo os anticorpos monoclonais 1018S69.4, 1021S11.28, 1022S25.17, 1022S23.24 e o conjugado do anticorpo 1018S19.11 com ricino A (exemplo 11) são preparadas de modo idêntico.

Claims

REIVINDICAÇÕES:

1^â. - Processo para a preparação de anticorpos monoclonais e seus derivados, que se liguem a glicoesfingolipidos produzidos por células epiteliais, caracterizado por as células de hibridoma secretoras dos referidos anticorpos monoclonais:

ι a) serem cultivadas in vitro e os anticorpos monoclonais

I -isolados do sobrenadante da cultura, ou

b) serem propagadas in vivo num mamífero adequado e os anticorpos monoclonais recuperados dos fluidos corporais do referido mamífero, e, se se pretender.

ί

fl c) os anticorpos monoclonais obtidos serem transformados

ii

í num seu derivado.

í

• 2^â. - Processo de acordo com

i a reivindicação 1, caracterizado por as células de hibrido| ma derivadas de ratinhos Balb/c que secretam os anticorpos

pretendidos serem injectadas intraperitonealmente em ra! tinhos Balb/c faeultativamente pré-tratados com um hidrocar!

boneto, após uma ou duas semanas, o fluido de ascites destes ratinhos ser colhido e os anticorpos monoclonais serem isoI lados a partir dele por precipitação com sulfato de amónio

e/ou por métodos padronizados de cromatografia.

í

; 3^â. - Processo de acordo com

; a reivindicação 1 ou 2 para a preparação de anticorpos i monoclonais e seus derivados, caracterizado por os referii dos anticorpos se ligarem a glicoesfingolipidos neutros í produzidos por células malignas epiteliais.

43. - Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2 para a preparação de anticorpos monoclonais e seus derivados caracterizado por os referidos anticorpos se ligarem a glicoesfingolipidos neutros produzidos por células de carcinoma da mama.
5^â. - Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2 para a preparação de anticorpos monoclonais e seus derivados caracterizado por os referidos

I anticorpos se ligarem a glicoesfingolipidos neutros a

partir de mecónio.
6^â. - Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2 caracterizado por se preparar os anticorpos monoclonais com a designação 1018S19.11, 1018S69.4

1021S11.28 e 1022S25.17 e seus derivados.

1

; 73. - Processo de acordo com

s a reivindicação 1 ou 2 caracterizado por se preparar os

anticorpos monoclonais com a designação 1018S19.11,

' 1018S69.4, 1021S11.28 e 1022S25.17.

I
8^â. - Processo de acordo com

' a reivindicação 1 ou 2 caracterizado por se preparar 0 ’ anticorpo monoclonal com a designação 1022S23.24 e seus

derivados.

í.

I

ι

I í 93. - Processo de acordo com

ι

I a reivindicação 1 ou 2 caracterizado por se preparar 0 anticorpo monoclonal com a designação 1022S23.24.

(

[

IO⁵. - Linhas celulares de

¹ hibridoma, caracterizadas por secretarem anticorpos mono! clonais que se ligam a glicoesfingolipidos neutros produ¹ zidos por células epiteliais.

δΟφΟΟ

-4211^a. - Linhas celulares de

hibridoma de acordo com a reivindicação 10, caracterizadas

por serem híbridos de células de mieloma de ratinho ou rato

e linfócitos B de um ratinho ou rato singeneico imunizado

ί com glicoesfingolípidos.

! 12^a. - Linhas celulares de

hibridoma de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizadas por serem híbridas da linha de mieloma de ratinho Sp2/0-Ag 14 e linfócitos B do baço de ratinhos Balb/c imunizados com glicoesfingolípidos.
13^a. - Linhas celulares de hibridoma de acordo com a reivindicação 10, 11 ou 12, caracterizadas por secretarem anticorpos monoclonais que se ligam a gl icoesf ingolípidos neutros produzidos por células de

i carcinoma da mama.

I

ί 14^a. - Linhas celulares de

ι hibridoma de acordo com a reivindicação 10, 11 ou 12, ca| racterizado por secretarem anticorpos monoclonais que se

í loigam a glicoesfingolípidos neutros obtidos de mecónio.

í

í
15^a. - Linhas celulares de

ji hibridoma com a designação 1018S19.1 1 , 1022S25.17,

1021S11.28 e 1018S69.4, caracterizadas por terem sido dej positadas na "Collection Nationale de Cultures de Microorganismes", Instituto Pasteur, Paris, sob o numero 1-331,

j! 1-332, 1-333 e 1-334 respectivamente.

P 16^a. - Linha celular de hibridoma com a designação 1022S23.24, caracterizado por

: ter sido depositada na "Collection Nationale de Cultures

í de Microorganismes", Instituto Pasteur, Paris, sob p numero ! 1-453.

-43-

.......
17^a. - Processo para a preparação de linhas celulares de hibridoma de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por um mamífero adequado ser imunizado com uma mistura de glicoesfingolípidos ou seus derivados antigénicos células deste mamífero produtoras de anticorpos serem fundidas com células de miéloma, as células híbridas obtidas na fusão serem clonadas e os clones de células secretores dos anticorpos pretendidos serem seleccionados.
18^a. - Processo de acordo com

a reivindicação 17, caracterizado por ratinhos Balb/c serem imunizados com misturas de glicoesfingolípidos adsorvidos ao mutante rugoso R 595 de Salmonella minnesota por três a oito injecções parenterais contendo entre 100 Gg e 500 y g da mistura de glicoesfingolípidos com intervalos de um a dez dias, células de baço dos ratinhos imunizados serem colhidas dois a cinco dias após a última injecção de reforço e estas células serem fundidas com células de mieloma de uma linha celular adequada na presença de um promotor de fusão.
19^a. - Processo de acordo com a reivindicação 17 ou 18, caracterizado por células produtoras de anticorpos derivados de ratinhos Balb/c imunizados serem fundidas com células de mieloma das linhas celulares X63 - Ag 8.653 ou Sp2/0-Ag14.
20^a. - Processo de acordo

com a reivindicação 17, 18 ou 19, caracterizado por as células de mieloma serem fundidas com um excesso de três a vinte vezes de células de baço de mamíferos imunizados numa solução contendo cerca de 30% a cerca de 60% de polieti lenogl icol de peso molecular entre 1000 e 4000.

-4421³. - Processo de acordo com a reivindicação 17, 18, 19 ou 20, caracterizado por os sobrenadantes das culturas celulares de hibridoma serem testados relativamente a anticorpos monoclonais que se liguem a glicoesfingolípidos por transferência de glicoesfingolípidos e as células de hibridoma positivas serem clonadas uma ou mais vezes por diluição limite.