DE3783211T2 - Zusammensetzungen zur verhuetung sekundaeren grauen stars. - Google Patents

Zusammensetzungen zur verhuetung sekundaeren grauen stars.

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Description

  • Das Gebiet der Erfindung betrifft Verfahren und Zusammensetzungen zur Verhinderung von Nachstaren unter Verwendung speziischer Rezeptor-zytotoxischer Zusammensetzungen.
  • Die extrakapsuläre Kataraktextraktion ist aufgrund einer bei dieser Technik geringen Häufigkeit post-operativer Komplikationen hinsichtlich zystoider makulärer Ödeme und möglicher Netzhautablösung ein zweckmäßiges Verfahren zur Entfernung von Katarakten. Das Vorhandensein einer verbesserten extrakapsulären Extraktionstechnik, wie der Phacoemulsifikation, und der Bedarf an intakten posterioren Linsenkapseln zur Implantation eines breiten Spektrums intraokularer Linsen hat die Anwendung der extrakapsulären Kataraktextraktion weitergefördert. Dieses chirurgische Verfahren ist jedoch von einem signifikanten Auftreten von posterioren Linsenkapseltrübungen begleitet, was zusätzliche chirurgische Eingriffe (posteriore Kapsulotomie oder Aufpolieren der posterioren Linsenkapsel) erforderlich machen kann, um gutes Sehen zu erhalten. Es wird berichtet, daß die Pathogenese des Trübwerdens der posterioren Linsenkapsel nach einer extrakapsulären Kataraktextraktion auf der Proliferation von Überresten epithelialer Zellen der Linse auf der posterioren Linsenkapsel beruht, die verkümmerte Linsen-"Fasern" und "Blasen"-Zellen (d.h. Elschnig-Perlen) bilden.
  • Es wurde von verschiedenen Techniken berichtet, daß sie die Bildung von Nachstaren oder das Trübwerden der posterioren Linsenkapsel verhindern. Roy et al., Contact and Intraocular Lens Medical Journal (1979) 5:175-178 berichten von der Verwendung von Vincristin und Vinblastin. Bestrahlung wurde ebenfalls versucht, was als vielversprechend berichtet wurde. Es wurde berichtet, daß Methotrexat und Retinoesäure in die anteriore Kammer des Auges eingeträufelt wurden, um das Trübwerden der posterioren Linsenkapsel zu verhindern.
  • Die Herstellung monoklonaler Antikörper wurde bereits beschrieben. Siehe z.B Monoclonal Antibodies, Hrsg. Roger H. Kennett, Thomas J. McKearn, Kathleen B. Bechtol, Plenum Press, New York, 1980, Nature (1975) 256:495-497, U.S. Patent Nr. 4,271,145, 4,196,265, 4,172,124, 4,195,125, 4,262,090 und 4,294,927. Siehe auch U.S Patent Nr. 4,432,751, das die Kombination monoklonaler Antikörper und Komplement zur Verhinderung von Nachstaren beschreibt.
  • Es werden Zusammensetzungen zum Verhindern von Nachstaren bereitgestellt, insbesondere durch Inhibieren der posterioren Linsenkapseltrübung nach extrakapsulärer Kataraktextraktion. Diese werden in Verfahren verwendet, in denen zur spezifischen Bindung an epitheliale Zellen fähige zytotoxische Konjugate in die anteriore Kammer des Auges eingeführt werden, und zwar vor, gleichzeitig mit oder nach der extrakapsulären Kataraktextraktion. Von besonderem Interesse ist die Einführung nicht- zytotoxischer Agenzien in die anteriore Kammer vor der Einführung der zytotoxischen Konjugate, wobei die nicht-zytotoxischen Agenzien und die zytotoxischen Konjugate im wesentlichen diesselbe Bindungsaffinität für epitheliale Zellen aufweisen. Dies verhindert wirksam das Trübwerden der posterioren Linsenkapsel. Die Verwendung der zytotoxischen Konjugate bei der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verhinderung von Nachstaren ist ebenfalls Gegenstand der Erfindung.
  • Das Verfahren zur Anwendung der Zusammensetzungen umfaßt das Einträufeln zytotoxischer Konjugate, die für epitheliale Zellen spezifisch sind, in die anteriore Kammer des Auges, um die Proliferation der epithelialen Zellen der Linse wesentlich zu hemmen. Die zytotoxischen Konjugate sind im wesentlichen spezifisch für die epithelialen Zellen der Linse und weisen eine geringe oder keine Kreuzreaktivität mit anderen Zellen auf, die in der anterioren Kammer gefunden werden, wie Fibroblasten, Melanocyten, corneale endotheliale Zellen, usw., zweckmäßigerweise auch anderen epithelialen Zellen, z.B. cornealen epithelialen Zellen. Vorzugsweise wird vor dem Einträufeln des zytotoxischen Konjugates und vor der extrakapsulären Kataraktextraktion ein nicht-zytotoxisches Agens in die anteriore Kammer eingeträufelt, wobei das nicht- zytotoxische Agens mit dem zytotoxischen Konjugat kreuzreagiert oder im wesentlichen diesselbe Bindungsspezifität wie dieses aufweist, um so an beliebige Zellen in der anterioren Kammer zu binden, die in Kontakt mit der anterioren Kammer stehen, die homologe determinante oder antigene Stellen aufweist.
  • Das zytotoxische Konjugat ist ein Konjugat eines Protein-Makromoleküls, das in der Lage ist, im wesentlichen spezifisch an epitheliale Zellen, insbesondere epitheliale Zellen der Linse, zu binden, im Vergleich zu anderen Zellen, die in der anterioren Kammer des Auges vorhanden sein oder in Kontakt mit dieser stehen können. Zum größten Teil werden die zytotoxischen Konjugate Konjugate eines monoklonalen Antikörpers oder seines Äquivalents mit einem zytotoxischen Agens sein. Der monoklonale Antikörper kann als Ergebnis einer Hybridoma-Bildung und Expression durch das Hybridoma hergestellt werden, ob in Kultur oder als Asciten, ein monoklonales Antikörperfragment, wie Fab, F(ab')&sub2;, Fv, einer rekombinanten variablen Region oder einem T-Zell-Rezeptor vorliegend. Die monoklonalen Antikörper und Rezeptoren können von jeder Säugertierspezies sein, einschließlich Mäusen, Kaninchen oder Menschen, oder Kombinationen davon, wie chimäre Antikörper, die eine humane konstante Region und eine variable Region einer Maus oder einer anderen Säugetierquelle aufweisen. Die Antikörper können jeder Klasse oder Unterklasse angehören, wie IgA, IgD, IgG, IgM und können IgGl, 2a, 2b oder 3, oder das menschliche Äquivalent davon einschließen.
  • Die Verfahren zur Herstellung der monoklonalen Antikörper sind wohlbekannt, wie durch die zahlreichen zuvor beschriebenen Literaturangaben ersichtlich ist. Darüberhinaus können die so erhaltenen monoklonalen Antikörper isoliert werden und durch Abtrennen der konstanten Region durch verschiedene Peptidase- Verdauungen modifiziert werden. Die monoklonalen Antikörper können reduziert werden, um Fab-Fragmente mit verfügbaren Mercaptan-Stellen für die Konjugation mit anderen Zusammensetzungen bereitzustellen. T-Zell-Rezeptoren können. wie in WO85/03947 beschrieben, erhalten werden.
  • Verschiedene epitheliale Zellen können als das Immunogen verwendet werden, insbesondere epitheliale Zellen der Linse, vor allem epitheliale Zellen der menschlichen Linse, obwohl andere Arten Anwendung finden können, z.B. Primaten. Ganze Zellen sind bevorzugt, es können jedoch auch Homogenate, Membranfragmente oder dergleichen, verwendet werden.
  • Die bindenden Zusammensetzungen, die eine Spezifität für die epithelialen Zellen aufweisen, können an ein breites Spektrum toxischer Agenzien, Mikroorganismen oder Pflanzen gebunden werden. Von besonderem Interesse sind die toxischen Untereinheiten natürlich vorkommender Toxine, wie Ricin, Abrin, Diphtherie-Toxin, usw.. Siehe beispielsweise Oeltmann und Heath, J. Biol. Chem. (1979) 254:1022-1027, Yule und Neville Jr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77:5483-5486, Gilliland et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1978) 75:5319-5323, U.S. Patent Nr. 4,379,145, GB2034324 und Masuho et al., Biochem. Biophys. Res. Crnn. (1979) 90:320-326 und Blythman, Nature (1981) 290:145.
  • Beispielhafte Toxin A-Ketten oder ähnlich wirksame Gruppen umfassen Diphtherie Toxin A-Ketten, enzymatisch aktive proteolytische Fragmente von Pseudomonas aeruginosa Exotoxin-A, Ricin Toxin A-Kette, Abrin A-Kette, Modeccin A-Kette, und in verschiedenen Pflanzen gefundene Proteine, die eine ähnliche Aktivität aufweisen, wie z.B. die Pflanzen Gelonium multiflorum, Phytolacca americana, Croton tiglium, Jatropha curcas, Momordic charantia und Weizenkeime. Es können auch mutierte Spezies der Toxine der Spezies verwendet werden, wie CRM45 (Boquet et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1976) 73:4449-4453).
  • Die toxischen Agenzien und der Rezeptor können verknüpft werden, nämlich üblicherweise durch eine Bindung, die zytoplasmatisch spaltbar ist. Zweckmäßige Bindungen enthalten Disulfid, insbesondere, wenn das toxische Agens einen intrinsischen Schwefel aufweist, oder andere Bindungen, wie Peptid-Bindungen, Harnstoff-Bindungen, Thioether, Imine, Amide, Imide oder Amidine. Funktionelle Gruppen, die Anwendung finden können, umfassen Carbonsäuregruppen, Aminogruppen, Imine, Aldehyde, Isocyanate, Mercaptane oder Olefine. Zusätzlich können komplexere Verknüpfungsgruppen angewendet werden, wenn eine Gruppe an einen der Reste in dem Konjugat gebunden werden kann, um eine geeignete Bindung an eine intrinsische Gruppe des anderen Restes herzustellen. Beispielsweise kann der N- Hydroxysuccinimidester der m-Maleimidoylbenzoesäure verwendet werden, um ein Amid des Toxins herzustellen, das dann durch ein verfügbares Schwefelatom auf dem monoklonalen Antikörper gebunden werden kann, um einen Thioether zu bilden.
  • Beispielhafte zytotoxische Konjugate können die folgende Formel aufweisen:
  • (ASn) - (S-X-R)m
  • worin:
  • ASn das toxische Agens angibt, das eine oder mehrere Schwefelgruppen als Teil des Agens aufweist, n die Anzahl der Schwefelgruppen ist, die in dem toxischen Agens vorhanden sind und die als verfügbare Mercaptidgruppen vorliegen und im allgemeinen bis zu etwa 4 beträgt, R ein monoklonaler Antikörper oder Rezeptor oder ein Derivat davon ist, und in gleich 1 bis n, üblicherweise 1 bis 2 ist und X eine Verknüpfungsgruppe und eine Bindung oder eine Gruppe von etwa 1 bis 20, üblicherweise 1 bis 12 Atomen sein kann, die nicht Wasserstoff sind und die Kohlenstoff, Stickstoff, Sauerstoff und Schwefel umfassen. Schwefel wird normalerweise an Kohlenstoff gebunden, insbesondere an aliphatisch gesättigten. X kann aliphatisch, alizyklisch, aromatisch, heterozyklisch oder Kombinationen davon sein, weist im allgemeinen von 0 bis 6, üblicherweise von etwa 0 bis 4 und vorzugsweise etwa 1 bis 4 Heteroatome auf, worin Sauerstoff und Schwefel als Oxo- oder nicht-Oxocarbonyl oder den Thioanalogen davon vorliegen oder als Ether (einschließlich Thioether) und worin Stickstoff als Amino oder Amido vorliegt. Zum größten Teil sind die Heteroatome ausschließlich an Kohlenstoff gebunden.
  • Beispielhafte Gruppen, die Disulfide verknüpfen, umfassen Aminoethylen-3-propanyl-methylen-carbonyl, α-Succinimidyl, 3-Propylenthiocarbonyl. Die Gruppen, die verwendet werden können, sind meist herkömmliche Gruppen, die eine Disulfidbindung herstellen. Die Disulfidverbindung ist eine solche, die in der Lage ist, mit den zellspezifischen Liganden zu reagieren, wobei eine Mercaptidgruppe aus dem Disulfid verdrängt werden kann, was zu einer neuen Disulfidbindung zwischen dem toxischen Agens und dem Liganden führt.
  • Größtenteils sind die Bindungen aliphatisch mit von 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, und stellen eine Amidbindung zu dem Rezeptor bereit, obwohl dies in erster Linie eine Sache der Zweckmäßigkeit ist und nicht notwendig für das Funktionieren der vorliegenden Zusammensetzungen ist.
  • Andere toxische Agenzien können ebenfalls verwendet werden, wie nicht-diffundierbar an die monoklonalen Antikörper oder Rezeptoren verknüpftes Wismut, wie bei Waldman, J. Amer. Med. Assoc. beschrieben.
  • Wahlweise können Liposomen mit den monoklonalen Antikörpern oder Rezeptoren verknüpft werden, wobei die Liposomen verschiedene zytotoxische Agenzien enthalten, wie Methotrexat, 5- Fluoruracil oder eines der zuvor genannten Toxine. Siehe z.B. Szoka und Papahadjopoulos, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1978) 75:4194-4198 und Szoka et al., Biochem. et Biophys. Acta. (1980) 601:559-571 zur Herstellung von Liposomen. Die Verknüpfung von Antikörpern an Liposome wurde in der Literatur ausführlich beschrieben, siehe z.B. Heath et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80:1377-1381 und Leserman et al., Nature (1981) 293:226-228.
  • Andere an den Rezeptor konjugierte zytotoxische Agenzien können ebenfalls in Verbindung mit dem erfindungsgemäßen Verfahren angewendet werden. Das Konjugat reicht aus, um den zytotoxischen Effekt ohne Zugabe von Hilfsstoffen zu erreichen.
  • Das bevorzugte Verfahren der Verwendung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen umfaßt einen initialen Einschnitt um die Cornea herum und Eintröpfeln von etwa 25-200, vorzugsweise etwa 50-150, noch bevorzugter etwa 100 ul eines nicht-toxischen Agens, das in der Lage ist, spezifisch an eine mit dem zytotoxischen Konjugat kreuzreagierende Stelle zu binden. Meistens wird dieses Agens ein monoklonaler Antikörper oder ein spezifisch bindendes Fragment davon sein. Üblicherweise ist die Lösung eine physiologisch verträgliche Lösung, die eine Salzlösung sein kann, eine phosphatgepufferte Salzlösung oder dergleichen und eine Konzentration von 10&sup8;-10¹³, üblicherweise 10&sup9;-10¹² Antikörper/ml, aufweist.
  • Die Antikörper oder Fragmente davon binden an alle Stellen, die mit dem zytotoxischen Konjugat kreuzreagieren können, und sie binden auch nicht-spezifisch an "hot spots", die innerhalb der anterioren Kammer des Auges vorhanden sein können. Auf diese Weise sind die Zellen vor dem zytotoxischen Agens geschützt.
  • Die Verwendung des kreuzreagierenden bindenden Agens ist von besonderer Bedeutung, wenn das zytotoxische Konjugat mit anderen Zellen als den epithelialen Zellen der Linse kreuzreagiert. Bei Anwendung der vorherigen Einträufelung von kreuzreagierendem nicht-zytotoxischem Rezeptor können zytotoxische Konjugate hergestellt werden, die im unterschiedlichen Maße mit Zellen, insbesondere epithelialen Zellen, kreuzreagieren, die von den epithelialen Zellen der Linse verschieden sind.
  • Nach Einträufeln des nicht-zytotoxischen bindenden Agens und ausreichender Inkubationszeit für das bindende Agens, um an sein homologes Antigen zu binden, kann die anteriore Kammer ausgespült werden, um ihren Inhalt zu entfernen.
  • Entweder vor, üblicherweise jedoch nach der extrakapsulären Kataraktextraktion, wird das zytotoxische Konjugat in einem physiologisch verträglichen Medium (siehe oben) in einer Menge von 25-200, üblicherweise von 50-150 ul des zytotoxischen Konjugats in die anteriore Kammer eingeführt, wobei das Konjugat in einer Menge vorhanden ist, die ausreicht, um alle epithelialen Zellen der Linse vollständig oder im wesentlichen vollständig zu töten. Die Anzahl der zytotoxischen Moleküle liegt üblicherweise im Bereich von 10&sup7;-10¹¹ Molekülen/ml. Im allgemeinen wird der zytotoxische Effekt innerhalb einer relativ kurzen Zeit nach der Einträufelung des zytotoxischen Konjugats festgestellt, üblicherweise in etwa 0,5 Stunden oder kurz danach, wenn die Hemmung der Proteinsynthese verwendet wird, um das Einsetzen des zytotoxischen Effektes zu bestimmen. Wird die Lebensfähigkeit jedoch durch andere Mechanismen abgeschätzt, z.B. Vitalfarbstoffe usw., kann es Stunden oder Tage dauern, bevor ein zytotoxischer Effekt (z.B. Zelltod) bemerkt wird.
  • Die vorliegenden Zusammensetzungen können als Kits zur Anwendung bei einer oder mehreren Operationen bereitgestellt werden. Die Kits enthalten das nicht-zytotoxische Agens und das zytotoxische Konjugat, entweder als Konzentrate, die vor der Verwendung weiter verdünnt werden können oder mit der Konzentration, die verwendet wird, wobei die Ampullen eine oder mehrere Dosen enthalten können. Zweckmäßigerweise können Einzeldosen in Spritzen bereitgestellt werden, die in sterilisierten Behältern enthalten sind, so daß der Arzt die Spritzen direkt anwenden kann, wobei die Spritzen die gewünschte Menge und Konzentration des Agens oder Mittels enthalten. Auf diese Weise kann der Kit mehrere Spritzen enthalten, die das zytotoxische Konjugat sowie das nicht-zytotoxische Agens in geeigneten proportionalen Mengen enthalten. Wenn die Spritzen die Formulierung zur direkten Anwendung enthalten, sind normalerweise keine weiteren Reagenzien zur Anwendung bei diesem Verfahren notwendig.
  • Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung veranschaulichen, sie jedoch nicht beschränken.
    • Experimentelles Beispiel 1: Herstellung monoklonaler Antikörper A. Immunisierung
  • Mäuse (BALB/c) wurden mit menschlichen epithelialen Cervixkarzinom-Zellen (ME180) immunisiert, indem i.p. etwa 5x10&sup6; Zellen/200ul dreimal in 2-wöchigen Intervallen und i.v. 3 Tage vor Isolierung der Milz mit 5x10&sup6; Zellen/200ul injiziert wurden. Weitere Mäuse (BALB/c) wurden mit menschlichen epithelialen Linsenzellen immunisiert, die nach einer Kataraktoperation erhalten und in komplettem Freund'schen Adjuvans emulgiert wurden. Für die primäre Injektion wurden pro Tier etwa 5x10&sup5; Zelläquivalente pro 200ul verabreicht. Zusätzliche Injektionen, bestehend aus in äquivalentem inkompletten Freund'schen Adjuvanz emulgierten Zellmaterial, wurden i.m. in einem Abstand von 3 Wochen verabreicht. Diese Mäuse erhielten zwei zusätzliche Injektionen von entweder ME180-Zellen oder menschlichen Amnion-Zellen (WISH), bevor die Milzen zur Verschmelzung geerntet wurden.
    • B. Fusion
  • Die Milzen immunisierter Tiere wurden 3-5 Tage nach der letzten Injektion entfernt und als eine einzige Zellsuspension zubereitet. Die Lymphozyten wurden dann mit P3-X-63/Ag8.653 Mausmyelomzellen unter herkömmlichen Bedingungen verschmolzen. Siehe U.S. Patent Nr. 4,432,751. Nach der Verschmelzung wurden die Zellen in Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin (HAT- Medium) enthaltendem Iscoves-Medium resuspendiert und entsprechend der Anzahl der Myelomzellen in Näpfchen gegeben, um eine Dichte von etwa 10&sup4; Zellen/Näpfchen zu erhalten. Die Zellen wurden an den Tagen 5, 12 und 15 gefüttert, indem die Hälfte des Mediums entfernt und ersetzt wurde. Kulturen, die durch Screeningproben als für die Antikörpersekretion positiv identifiziert wurden, wurden auf Mikrotiterplatten mit 24 Näpfchen übertragen, die 1ml Iscoves-Medium enthalten, das Hypoxanthin und Thymidin (HT) enthält.
    • C. Screening (i) ME180-Immunisierung:
  • Zum Screenen wird der Hybridomüberstand (100ul) und 100ul ME180-Zellen (2x10&sup5; Zellen/ml) bei 4º für eine Std. und dann bei 37º über Nacht in Mikrotiterplatten mit 96 Näpfchen inkubiert. Die Näpfchen wurden dann mikroskopisch untersucht, um Störungen nachzuweisen (gestörte Adhäsion). Zellen, die Anzeichen von Störungen zeigten, wurden isoliert und 3x geklont. Eines der im Test positiven Hybridome wurde als 3D4 bezeichnet. 3D4 produziert einen IgG&sub1; monoklonalen Antikörper, was durch Geldiffusion unter Verwendung eines klassenspezifischen Antiserums (ICN) bestimmt wurde.
    • (ii) HLE/ME180-Immunisierung:
  • Zum Screenen wurden Hybridomüberstände auf ihre Bindung an ME180-Zellen durch ELISA getestet. Gebundenes Maus-Immunglobulin wurde mittels Ziegen- Anti-Maus-IgG-Meerettichperoxidase nachgewiesen. Eines der im Test positiven Hybridome wurde als 4757 bezeichnet. Dieses Hybridom produziert ein IgG&sub1;, was mittels Geldiffusion bestimmt wurde.
    • (iii) HLE/WISH-Immunisierung:
  • Zum Screenen wurde der Hybridomüberstand auf seine Bindung an WISH-Zellen mittels ELISA getestet. Gebundenes Maus-Immunglobulin wurde wie beschrieben nachgewiesen. Eines der im Test positiven Hybridome wurde als 4197 bezeichnet. Dieses Hybridom produziert einen IgG2a Antikörper, was mittels Geldiffusion bestimmt wurde.
    • (iv) Antigen menschlicher epithelialer Zellen der Linse:
  • Hybridomüberstände aus Fusionen, die mit Milzzellen durchgeführt wurden, die aus mit menschlichen epithelialen Zellen der Linse immunisierten Mäusen erhalten wurden, wurden mittels ELISA getestet. Platten mit 96 Näpfchen wurden mit einer Nonidet P-40 löslichen Fraktion menschlicher epithelialer Zellen der Linse, die nach einer Kataraktoperation erhalten wurden, beschichtet. Zu den 96 Näpfchen aufweisenden Platten wurden 50ul pro Näpfchen dieser löslichen Fraktion zugefügt, getrocknet und mit 0,05 % Glutaraldehyd 15 Min. lang bei 25ºC fixiert. Die Platten wurden gewaschen und mit 10 % FBS enthaltendem Zellkulturmedium 60 Min. lang bei Raumtemperatur inkubiert. (Kelleher, et al., Cancer Immunol Immunother (1983) 14:185-190 und Mujoo et al., J. Biol. Chem. (1986) 261:10299-10305). Hybridomüberstände, 50ul/Näpfchen, wurden den Näpfchen zugesetzt und 60 Min. lang inkubiert. Die Näpfchen wurden dann gewaschen und gebundener Antikörper mittels Ziegen-Antimaus- IgG-Meerettichperoxidase nachgewiesen. Im Test positive Kulturen wurden auf 24 Näpfchen aufweisende Platten verteilt und weiter auf ihre zelluläre Bindungsspezifität getestet.
    • D. Zellbindung des monoklonalen Antikörpers
  • Überstände der Hybridome 3D4, 4197 und 4757 wurden mittels ELISA auf ihre Fähigkeit getestet, sowohl an normale als auch an Tumorzellen zu binden. Anhaftende Zellinien wurden zur Konfluenz in Platten mit 96 Näpfchen gezüchtet und dann mit 0,05 % Glutaraldehyd 10 Min. lang fixiert. Suspensionskulturen wurden an Platten geheftet, die mit Poly-L-Lysin beschichtet waren, und es wurde wie zuvor fixiert. Monoklonale Antikörper in Kulturmedium wurden zu den Näpfchen gegeben und bei 37ºC eine Std. lang inkubiert. Die Platten wurden 3 mal gewaschen und gebundenes Maus-IgG mit Ziegen-Antimaus-IgG, das an Meerettichperoxidase konjugiert war, nachgewiesen. Die Bindung der monoklonalen Antikörper an verschiedene Zelltypen ist in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1 Bindung von 3D4-, 4197- und 4757-Antikörpern an verschiedene Zelltypen Absorption* bei 450nm Zellinie Gewebe Zelltyp Human-Cervix Human-Amnion Colon Humanhaut Burkitt-Lymphoid Retinoblastom Melanom Kaninchenlinse epithelial Adenocarcinom Fibroblast Lymphom * Absorption bei 450 nm: steigende Absorption spiegelt gesteigerte Bindung des Antikörpers an Zellen wieder.
  • Die unter Verwendung humaner Cervixkarzinom-Zellen oder anderer epithelialer Zellen als ein Immunogen hergestellten Antikörper sind in der Lage, epitheliale Zellen der Kaninchenlinse zu binden, sowie epitheliale Zellinien, die von einer Vielzahl verschiedener Gewebe stammen. Es gibt nur wenig oder keine Bindung an Zellen nicht-epithelialen Ursprungs. Zusätzlich wurde durch immunozytochemisches Anfärben gezeigt, daß Antikörper aus 3D4, 4197 und 4757 an humane epitheliale Zellen der Linse binden. Diese Ergebnisse sind in Tabelle 2 angegeben. Tabelle 2 Binden an HLE-Zellen* Antikörper Relative Färbung * Medienkontrolle, oder in relevanten Antikörpern keine Färbung humaner epithelialer Zellen der Linse.
  • Gleichzeitige Zugabe von ¹²&sup5;I-3D4 und überschüssigem unmarkierten 3D4 zu den Kulturen verhinderte das Binden von markiertem 3D4 zu 90 %. Diese Ergebnisse sind in Tabelle 3 angegeben. Tabelle 3 Bindungsspezifität von ¹²&sup5;I-3D4 an epitheliale Zellen CPM ¹²&sup5;I Zusatz RLE-Zellen ME180-Zellen ¹²&sup5;I-3D4 in Kontrollpuffer ¹²&sup5;I-3D4 in überschüssigem 3D4IgG % Inhibierung
    • Beispiel 2 Herstellung von Toxin A-Ketten-Antikörper-Konjugaten A. Herstellung der Toxin A-Kette (i) Diphtherie-Toxin:
  • Das Fragment A (DTA) wird aus Diphtherie-Toxin (Connaught Laboratories) wie beschrieben (Chung und Collier, Biochem. Biophys. Acta (1977) 483:248-257) hergestellt und 10 Min. lang auf 80ºC erhitzt, um jegliche Restspuren des Toxins zu inaktivieren. Die Enzymaktivität zu DTA wird mittels ADP-Ribosylierung von Weizenkeim-Elongationsfaktor 2 mit ¹&sup4;C-NAD als Substrat bestimmt. (ii) Ricin-Toxin: Ricin-Toxin wurde aus Castorbohnen (A. H. Hummert Seed Co., St. Louis, Missouri) mittels Affinitätschromatographie auf Sepharose 4B gereinigt (Nicolson und Blaustein, ibid. (1972) 266:543-54 und von Cawley et al., Arch. Biochem. Biophys. ( ) 190:744-755) modifiziert. Die Ricin- Toxin A-Kette (RTA) wurde aus den ganzen Ricin-Toxin durch Reduktion von 2-Mercaptoethanol und Chromatographie auf Cellex-D (Bio-Rad) (Olsnes und Pihl, Biochem. (1973) 12:3121-3126) gereinigt. Das RTA wird von Restspuren von Ricin-Toxin durch wiederholtes Laufenlassen über Sepharose 4B- Säulen befreit.
    • B. Synthese von Toxin-SS-Antikörper-Konjugaten (i) Synthese von (DTA)-SS-Antikörper-Konjugaten:
  • Der Antikörper 3D4 (7,0ml, 2mg/ml) wird gegen Dulbecco's phosphat- gepufferte Salzlösung (DPBS Gibco), pH7,4, die eine antibiotische-antimykotische Lösung (Gibco, 5,0 ml pro Liter) enthält, dialysiert N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)- propionat (SPDP) (0,186ml, 10mM) in absolutem Ethanol wird dem Antikörper unter kräftigem Rühren zugefügt. Die Mischung wird 30 Min. lang bei Raumtemperatur umgesetzt und dann gegen 2-maliges Wechseln von je 1 Liter desselben Puffers dialysiert. Nach der Dialyse wird die Antikörperzubereitung auf ihren 2-Pyridyldisulfid-Gehalt wie beschrieben analysiert (Stuchbury et al., Biochem. J. (1975) 151:417-432). DTA (3,0ml, 2,5mg/ml) wird mittels Zugabe von 0,3ml von 1,0M Dithiothreit, pH 7,0, 30 Min. lang bei Raumtemperatur reduziert und auf Sephadex G-25 (2,6 x 12 cm-Säule), die mit dem oben beschriebenen Puffer äquilibriert wurde, entsalzt. Die Peakfraktionen der Säule werden gesammelt (11,0ml, 0,53mg/ml) und mit PDP-(3D4) Antikörper (7,0ml, 2,1mg/ml) gemischt. Die Endkonzentration von DTA und Antikörper beträgt 1,5 x 10&supmin;&sup5;M bzw. 5,5 x 10&supmin;&sup6;M. Das molare Endverhältnis von DTA zu Antikörper in der Reaktionsmischung beträgt etwa 3. Die rohe Konjugatzubereitung (18,0ml) wird mittels Ultrazentrifugierung auf einer Amicon YM-10 Membran auf ein Endvolumen von 0,9ml konzentriert. Rohes (DTA)-SS-(3D4) (9,0ml) wird auf einer Sephacryl -S-2000-Säule (2,6 x 106cm, 22,1ml/h Fließgeschwindigkeit) mit DPBS-Puffer äquilibriert. Jede Fraktion (6,2ml) wird auf ihre ADP-Ribosylierungsaktivität untersucht und mittels Natriumdodecylsulfat/Polyacrylamid- Gelelektrophorese (SDS/PAGE) analysiert. Die Fraktionen 30-40 werden gesammelt, auf einer Amicon YM-10-Membran konzentriert, und nach Filtersterilisierung in Zytotoxizitätsbestimmungen verwendet.
    • (ii) Synthese von (RTA)-SS-(3D4) Antikörper Konjugat:
  • (RTA)-SS(3D4) wurde wie bei Kernan et al. J. Biol. Chem. (1984) 133:137-146 beschrieben, synthetisiert. 3D4 (1 bis 2mg/ml) wurde gegen 0,1M NaPO&sub4; , 0,1M NaCl, pH 7,7 dialysiert und zu dem Antikörper wurde ein 15- bis 20-facher molarer Überschuß von N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithiopropionat) (SPDP) unter kräftigem Rühren zugegeben. Nach Inkubieren bei Raumtemperatur für 30 Min. wurde die Pyridyldithiopropionat (PDP)-modifizierte Antikörperlösung gegen zweimaliges Wechseln von PBS dialysiert. Nach der Dialyse wurde das Verhältnis der PDP-Gruppe zum Antikörper bestimmt. RTA wurde anfangs durch die Zugabe von Dithiothreit bei einer Endkonzentration von 50mM reduziert und danach bei Raumtemperatur 1 Std. lang inkubiert. Das RTA wurde dann umfassend gegen PBS (4ºC) dialvsiert, um jegliches restliche Reduktionsmittel zu entfernen. Das RTA wurde dann unter Verwendung einer mit einer YM-10-Membran ausgestatteten gerührten Amiconzelle auf eine Endkonzentration von 4mg/ml konzentriert. Ein 5- bis 10-facher molarer Überschuß an RTA wurde dann zu der PDP-Antikörperlösung gegeben und 16 Std. lang bei 4ºC inkubiert. Das RTA-3D4-Konjugat wurde mittels Chromatographie auf Sephacryl S-200 gereinigt.
    • C. Wirkung von 3D4-Ricin A-Konjugaten auf Targetzellen: (i) Zytotoxizität:
  • Targetzellen (ME180, RPMI 7932; epitheliale Zellen von Kaninchenlinsen (RLE)) wurden auf 96 Näpfchen aufweisende Platten übertragen, um 25% Konfluenz zu erreichen. Ricin A-Konjugat (Vorratslösung 1mg Protein/ml) oder Kontrollmedien wurden den angegebenen Verdünnungen zugefügt und 10 Min. lang entweder bei 37ºC oder 25ºC inkubiert. Der Überstand wurde entfernt, die Zellen zweimal gewaschen und frisches Medium ohne Toxinkonjugat wurde den Näpfchen zugegeben. Die Platten wurden bei 37ºC inkubiert, bis die Kontrollnäpfchen konfluent waren. Die Zelldichte wurde dann durch Konversion des gelben Farbstoffes 3-(4,5-Dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium-bromid (MTT) in ein purpurfarbenes Produkt durch lebende Zellen in direktem Verhältnis von Zellenanzahl und metabolischer Aktivität bestimmt. Das Aussehen des Produkts wurde spektrophotometrisch gemessen. Mosmann, J. Immunol. Methods (1983) 65:55. Die prozentuale Reduktion in den Zellen wurde berechnet durch:
  • % Reduktion in den Zellen =
  • 100 - Zelldichte (Absorption) im Test/Zelldichte (Absorption) im Kontrolltest x 100
  • Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 4 angegeben. Tabelle 4 Zytotoxizität von 3D4-Ricin A für Zellen: 10 Min. Inkubation bei 37ºC und 25ºC Prozentuale Reduktion in den Zellen Zelltyp 3D4-Ricin A-Konjugat Verdünnung *NT - nicht getestet
  • Die Proliferation spezifischer epithelialer Targetzellen wurde signifikant verhindert, wenn man diese einer so geringen Menge wie 10ug Protein/ml 3D4-Ricin A-Konjugat aussetzt, einer Konzentration, die bei RPMI 7932-Kontrollzellen keine Wirkung aufwies.
    • (ii) Wachstumshemmung:
  • Aus einer Kataraktoperation erhaltene menschliche epitheliale Zellen der Linse wurden in RPMI 1640, das 10% FBS enthielt, inkubiert. Für das Experiment wurde das Kulturmedium entfernt und durch 3D4-RTA-Immunkonjugat in Medium (20ug/ml) oder Medium alleine 6 Std. lang bei 37ºC ersetzt. Nach dieser Inkubation wurden die Zellen gewaschen und erhielten frische Kulturmedien ohne Konjugat und wurden 48 Std. lang inkubiert. ³H-Leucin wurde allen Kulturen zugefügt, 24 Std. vor dem Ernten des mit TCA ausfällbaren Proteins. Thorpe et al., Eur. J. Biochem. (1981) 116:447, Domingo und Trowbridge, Methods in Enzymology (1985) 112:238, Vitetta et al. Proc Nat. Acad. Sci. USA (1983) 80:6332. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 angegeben. Tabelle 5 Inhibierung des Einbaus von ³H-Leucin in menschliche epitheliale Zellen der Linse durch 3D4-Ricin A Kulturzusatz eingebaute CPM 3D4-Ricin A Medium allein
  • Aufgrund dieser Daten zeigt sich, daß das monoklonale Antikörper-Toxin-Konjugat dort in die epitheliale Zelle der Linse transloziert wird, wo der zytotoxische Teil aktiv ist.
    • Beispiel 3 Inhibierung des zytotoxischen Effektes des Konjugats durch vorherige Inkubation mit unkonjugiertem monoklonalen Antikörper
  • Um den Schutz der kreuzreagierenden Zellen zu demonstrieren, die das Konjugat spezifisch binden, wurden unkonjugiertes 3D4 oder Medium allein 10 Min. vor Zugabe von 3D4-Ricin-Toxin A-Konjugat zu den Kulturen gegeben. Eine Verdünnung des Konjugats (wie in Tabelle 6 angegeben) wurde dann zu den Zellen gegeben und 60 Min. lang bei 37ºC inkubiert. Den Zellen wurde frisches Medium gegeben und 3 Tage bei 37ºC inkubiert. Die Zelldichte wurde mittels MTT wie zuvor beschrieben (siehe Beispiel 2) bestimmt. Tabelle 6 Wirkung der Präinkubation der Zellen mit unkonjugiertem monoklonalen Antikörper* Behandlung * Ausgedrückt als Prozentsatz von nicht mit Konjugat behandelten Kontrollzellen. ¹ Die Zellen wurden 10 Min. lang 3D4 IgG bei 100ug/ml ausgesetzt. Die Zellen wurden 3 mal gewaschen und 3D4 RTA zugefügt.
    • Beispiel 4 Wirkung des Konjugats auf die Proliferation von epithelialen Zellen der Linse in Vivo
  • Weibliche weiße Neuseeland-Kaninchen, 3 kg, wurden unter Vollnarkose einer extrakapsulären Entfernung der Linse unterzogen. (Emery et al., The C.V. Mosby Company, (1983).) Vor dem chirurgischen Eingriff erhielten die Tiere eine Injektion von 3D4 IgG in ausgeglichener Salzlösung (BSS) (Alcon Labs, Fort Worth, TX) in die anteriore Kammer. Eine anteriore Kapsulotomie wurde durchgeführt und die Linse mit einem Kelmann Phacoemulgierer (Cooper Vision, Irvine, CA) extrahiert. Das Linsenmaterial wurde mit BSS aus dem Auge gesaugt/gespült. Gerade vor dem Verschluß wurden 200ul Immunkonjugat oder BSS in die anteriore Kammer injiziert. Die Augen wurden äußerlich mit Breitbandantibiotikasalben oder Steroiden behandelt. Die Augen wurden auf Anzeichen von Proliferation von Überresten epithelialer Zellen der Linse untersucht. Tabelle 7 Inhibierung der Proliferation epithelialer Zellen der Linse nach der Behandlung mit 3D4-RTA-Konjugat Behandlung Konzentration des Konjugats Anzahl der Tiere mit Proliferation der epithelialen Zellen Zahl der behandelten Tiere
  • Durch Einträufeln der erfindungsgemäßen zytotoxischen Agenzien, insbesondere nach Einträufeln des bindenden Agens, kann die Proliferation überbleibender epithelialer Zellen der Linse verhindert werden, wodurch Nachstare vermieden werden. Die vorliegenden Verfahren und Zusammensetzungen stellen ein sicheres und einfaches Verfahren zur Verhinderung von Nachstaren bereit, ohne anderes Gewebe im Auge zu verletzen, und stellen so eine sichere Alternative zu bisherigen zytotoxischen Agenzien dar, die Anwendung gefunden haben und von denen gefunden wurde, daß sie allgemein zytotoxische Wirkungen aufweisen.
  • Alle in dieser Beschreibung erwähnten Veröffentlichungen und Patentanmeldungen zeigen das Kenntnisniveau der Fachleute auf, die diese Erfindung betrifft.
  • Nachdem die Erfindung nun völlig beschrieben ist, ist es für den Durchschnittsfachmann ersichtlich, daß viele Änderungen und Modifizierungen hierzu durchgeführt werden können.

Claims (22)

1. Verwendung eines zur spezifischen Bindung an epitheliale Zellen fähigen Protein-Makromoleküls, das mit einem zytotoxischen Agens konjugiert ist, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verhinderung von Nachstaren.
2. Verwendung nach Anspruch 1, worin das Protein-Makromolekül ein Antikörper oder ein Fragment davon ist.
3. Verwendung nach Anspruch 2, worin der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin das zytotoxische Agens eine Mikroorganismen- oder eine Pflanzentoxin A-Kette ist.
5. Verwendung nach Anspruch 4, worin die A-Kette die Ricin A-Kette, die Abrin A-Kette oder die Diphterietoxin A-Kette ist.
6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin die pharmazeutische Zusammensetzung zusätzlich ein nicht- zytotoxisches Agens enthält, das dieselbe Bindungsspezifität aufweist wie das konjugierte Protein-Makromolekül.
7. Verwendung nach Anspruch 6, worin das nicht-zytotoxische Agens ein monoklonaler Antikörper oder ein Fragment davon ist.
8. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Protein-Makromolekül dazu fähig ist, spezifisch an epitheliale Zellen der Linse zu binden.
9. Zusammensetzung, enthaltend
(1) ein zur spezifischen Bindung an epitheliale Zellen fähiges Protein-Makromolekül, das mit einem zytotoxischen Agens konjugiert ist und
(2) ein nicht-zytotoxisches Agens, das dieselbe Bindungsspezifität wie das konjugierte Protein-Makromolekül aufweist,
zur Verwendung bei der Verhinderung von Nachstaren, wobei das nicht-zytotoxische Agens (2) einzutröpfeln ist, bevor das konjugierte Protein-Makromolekül (1) in dasselbe Auge eingetröpfelt wird.
10. Zusammensetzung nach Anspruch 9, worin das Protein-Makromolekül ein Antikörper oder ein Fragment davon ist.
11. Zusammensetzung nach Anspruch 10, worin der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
12. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 9 bis 11, worin das nicht-zytotoxische Agens ein monoklonaler Antikörper oder ein Fragment eines monoklonalen Antikörpers ist.
13. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 9 bis 12, worin das zytotoxische Agens eine Mikroorganismen- oder eine Pflanzentoxin A-Kette ist.
14. Zusammensetzung nach Anspruch 13, worin die A-Kette die Ricin A-Kette, die Abrin A-Kette oder die Diphterietoxin A-Kette ist.
15. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 9 bis 14, worin das Protein-Makromolekül zur spezifischen Bindung an epitheliale Zellen der Linse fähig ist.
16. Kit, umfassend eine Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 9 bis 15, worin das konjugierte Protein-Makromolekül in einem ersten Behälter und das nicht-zytotoxische Agens in einem zweiten Behälter enthalten ist.
17. Zur spezifischen Bindung an epitheliale Zellen der Linse fähiger Antikörper oder ein Fragment davon, der/das mit einem zytotoxischen Agens konjugiert ist, zur Verwendung bei der Behandlung von Nachstaren.
18. Antikörper oder Fragment davon nach Anspruch 17, worin der Antikörper oder das Fragment davon für epitheliale Zellen der Linse spezifisch ist.
19. Konjugierter Antikörper oder Fragment davon nach Anspruch 17 oder Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß er ein monoklonaler Antikörper ist.
20. Konjugierter Antikörper oder Fragment davon nach Anspruch 17, Anspruch 18 oder Anspruch 19, worin das zytotoxische Agens eine Mikroorganismen oder eine Pflanzentoxin A-Kette ist.
21. Konjugierter Antikörper oder Fragment davon nach Anspruch 20, worin die A-Kette eine Ricin A-Kette, eine Abrin A-Kette oder eine Diphterietoxin A-Kette ist.
22. Konjugierter Antikörper oder Fragment davon nach Anspruch 20, worin das Pflanzentoxin Ricin ist.
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