DE112016004398T5

DE112016004398T5 - Die antikörper, die spezifisch den typ-1-rezeptor des fibroblasten-wachstumsfaktors binden, die verwendung von antikörpern zur behandlung von onkologischen erkrankungen, ein verfahren zur herstellung von den antikörpern

Info

Publication number: DE112016004398T5
Application number: DE112016004398.8T
Authority: DE
Inventors: Ilya Valerievich Tsimafeyeu
Original assignee: "oncomax" (llc "oncomax") LLC; Oncomax LLC Oncomax LLC
Current assignee: Nonprofit Organization "kidney Cancer Research Ru
Priority date: 2015-09-28
Filing date: 2016-09-22
Publication date: 2018-06-14
Also published as: US20180355045A1; RU2015140935A; RU2638457C2; US10358499B2; WO2017058062A1

Abstract

Die Gruppe der Erfindungen bezieht sich auf Biotechnologie und Medizin und bezieht sich auf Antikörper zur Behandlung von onkologischen Erkrankungen.Die Antikörper der Erfindung binden und blockieren spezifisch den Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptor 1 (FGFR1) und sind durch die Aminosäuresequenzen H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3, L-CDR1, L-CDR2 und L-CDR3 gekennzeichnet. Eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung von onkologischen Erkrankungen, umfassend Antikörper der Erfindung, wird bereitgestellt und ein Verfahren zur Behandlung von onkologischen Erkrankungen, umfassend die Verabreichung von Antikörpern der Erfindung an den Patienten. Verfahren zur Herstellung von Antikörpern, die ihre Nukleinsäuren und Zelllinien zur Herstellung von Antikörpern kodieren.Die Verwendung einer Gruppe von Erfindungen ermöglicht es, die Proliferation von Tumorzellen mit hoher Effizienz und Spezifität zu unterdrücken und die Tumorangiogenese zu hemmen, indem der pathologische Weg FGF / FGFR1 blockiert wird, was wiederum eine wirksame Behandlung von onkologischen Erkrankungen ermöglicht.

Description

Die Gruppe der Erfindungen bezieht sich auf Biotechnologie und Medizin, insbesondere auf neue Antikörper, die spezifisch den Typ-1-Rezeptor des Fibroblasten-Wachstumsfaktors binden, die Verwendung von den Antikörpern zur Behandlung von onkologischen Erkrankungen und deren Produktion.
Es ist bekannt, dass die Entwicklung von bösartigen Neubildungen durch eine übermäßige Zellproliferation sowie durch die Bildung von den Blutgefäßen in dem Tumor verursacht wird, durch den seine Nahrung (Angiogenese) auftritt.
Die Bildung neuer Blutgefäße resultiert aus dem bereits vorhandenen Endothel und ist ein wichtiger Bestandteil vieler Krankheiten und Störungen, unter anderem Tumorwachstum und Tumormetastasierung, rheumatoide Arthritis, Psoriasis, Atherosklerose, diabetische Retinopathie, retrolentale Fibroplasie, neovaskuläres Glaukom, Hämangiome, Immunabstoßung von transplantierten Hornhaut und anderen Geweben sowie chronische Entzündung.
Im Fall des Tumorwachstums, ist die Angiogenesebesonders wichtig bei dem Übergang von der Hyperplasie zur Neoplasie und für die Bereitstellung von der Nahrung des wachsenden soliden Tumoren (J. Folkman et al Nature; 339, 58, 1989). Die Angiogenese ermöglicht auch, dass Tumore mit dem Blutgefäßsystem des Wirts in Kontakt stehen, wodurch die Metastasenrichtungen für die Tumorzellen bestimmt werden können. Die Beweise, die die Rolle der Angiogenese bei der Metastasierung von den Tumorzellen bestätigen, wurden insbesondere aus den Studien gewonnen, die den Zusammenhang zwischen der Anzahl und Dichte von den Mikrogefäßen bei invasivem Brustkrebs und dem tatsächlichen Vorhandensein von den Fernmetastasen zeigen (N. Weidner et al. New Eng. J. Med., 324:1, 1991).
Nach zahlreichen verfügbaren Daten kann die Proliferation von den Tumorzellen sowie von den Endothelzellen durch verschiedene Polypeptide verursacht werden, die natürlicherweise in der Natur vorkommen. Eine davon ist die Familie der Fibroblasten-Wachstumsfaktor (von engl. fibroblast growth factor, FGF). FGF wurde erstmals 1973 in den Hypophysenextrakten nachgewiesen (H. Armelin, PNAS 70, 9, 1973).
FGF bezieht sich auf eine Familie von Heparin-bindenden Polypeptiden, die die Funktionen verschiedener Zellen modulieren. FGF hat eine starke Wirkung auf die Proliferation und Differenzierung von Tumor- und Endothelzellen. Gegenwärtig sind 23 Mitglieder der FGF-Familie (FGF 1-23) isoliert. Jedes Mitglied der Familie hat seine eigenen funktionalen Merkmale. Die am besten untersuchten Typen sind FGF 1 und 2 (sauer und basisch). Um die Zellen zu beeinflussen, sollte FGF den Rezeptor auf ihrer Oberfläche kontaktieren. Es gibt 4 Arten von den FGF-Rezeptoren (FGFR 1-4). FGFR1 bindet nicht nur FGF 1 und 2, sondern auch die meisten anderen Mitglieder dieser Familie, daher die Rolle dieses Rezeptors bei der Signalübertragung in die Zelle als am wichtigsten angesehen wird.
FGFR1 besteht aus den Übermembranen, intramembranen und intrazellulären Komponenten. Der Übermembranen Teil des Rezeptors besteht aus 3 Domänen (D I-III), die sich einem Immunglobulin ähnlich. FGF interagieren in der Regel mit D II und III; das Heparansulfat, das an der Bildung des Komplexes von FGF/FGFR1 beteiligt ist, wirkt mit D III zusammen. Alternatives mRNA-Splicing (Spleißen) fördert die Bildung mehrerer Varianten von FGFR1 auf der Zelloberfläche (D Johnson, L. Williams. J Adv. Cancer Res., 60, 1, 1993; McKeehan et al. J Prog Nucleic Acid Res. Mol. Biol., 59, 135, 1998). Der intrazelluläre Teil des Rezeptors wird durch eine Tyrosinkinase repräsentiert, bei deren Autophosphorylierung weiteres Signal in den Kern und die Zellteilung erfolgen.
Die Autoren der vorliegenden Anmeldung haben zuvor das Auftreten und die Erzielung eines hohen Niveaus der FGFR1-Expression sowohl auf den Zellen des primären Nierenzelltumors als auch auf den Metastasen des Nierenzellkrebses (RCC) vorgeschlagen und bestätigt (I. Tsimafeyeu et al. ESMO-ECCO 09, 2009; WO2011000384 ). Darüber hinaus wurde es gezeigt, dass der pathologische Weg von FGF/FGFR1 nicht nur in der Entwicklung von RCC unabhängig ist, sondern auch die Resistenz gegen eine bestehende zielgerichtete Tumortherapie bestimmen kann.
Andere Autoren zeigten auch die Bedeutung von FGF/FGFR1 bei der Entwicklung von den Tumoren wie nicht-kleinzelligem Lungenkrebs, Brustkrebs, Magen-und Speiseröhrenkrebs, Prostatakrebs, Blasenkrebs, Kopf-und-Hals-Tumoren, Melanom (C. Behrens et al. J Clinical cancer research 14, 19, 2008; M. Koziczak et al. J Oncogene, 23, 20 2004; K. Freier J Oral Oncology 43, 1, 2007; E. Shin et al. J Cancer Res Clin Oncol. 126, 9, 2000; K. Sugiura et al. J Oncology reports 17, 3, 2007; E. Devilard et al. J BMC Cancer 6, 272, 2006; G. Lefevre et al. J Investigative Ophthalmology and Visual Science 50, 2009).
Basierend auf dem Vorhergehenden kann es angenommen werden, dass das Blockieren des FGF/FGFR1-Wegs zu einer Störung der Proliferation von den Tumorzellen und der Hemmung der Angiogenese führen kann. Die FGFR1-Antagonisten, einschließlich humaner monoklonaler Antikörper, können verwendet werden, um das Tumorwachstum und seine Metastasen zu unterdrücken.
Das Wesen der Gruppe von Erfindungen
Der Zweck der Gruppe von Erfindungen besteht darin, neue Antikörper zu schaffen, um die Proliferation von den Tumorzellen zu unterdrücken, die Tumorangiogenese zu inhibieren und onkologische Erkrankungen zu behandeln. Der Zweck der Gruppe von Erfindungen besteht auch darin, das Arsenal von den Mitteln zur Unterdrückung der Proliferation von den Tumorzellen zu erweitern, die Tumorangiogenese zu inhibieren und onkologische Erkrankungen zu behandeln.
Der Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Antikörper oder ein funktionelles Fragment davon, das spezifischden Typ-1-Rezeptor des Fibroblasten-Wachstumsfaktors mit einer schweren Kette bindet, umfassend
H-CDR1 mit der Sequenz von SEQ ID NO:1 oder eine Variante der Sequenz von SEQ ID NO: 1, die eine oder zwei konservative Aminosäuresubstitutionen enthält,
H-CDR2 mit der Sequenz von SEQ ID NO:2 oder eine Variante der Sequenz von SEQ ID NO:2, die eine oder zwei konservative Aminosäuresubstitutionen enthält,
und H-CDR3 mit SEQ ID NO:3 oder eine Variante der Sequenz von SEQ ID NO:3, die eine oder zwei konservative Aminosäuresubstitutionen enthält,
und eine leichte Kette umfassend
L-CDR1 mit der Sequenz von SEQ ID NO:4 oder eine Variante der Sequenz von SEQ ID NO:4, die eine oder zwei konservative Aminosäuresubstitutionen enthält,
L-CDR2 mit der Sequenz von SEQ ID NO:5 oder eine Variante der Sequenz von SEQ ID NO:5, die eine oder zwei konservative Aminosäuresubstitutionen enthält,
und L-CDR3 mit SEQ ID NO:6 oder eine Variante der Sequenz von SEQ ID NO:6, die eine oder zwei konservative Aminosäuresubstitutionen enthält.
In einer besonderen Ausführungsform ist ein Antikörper oder ein funktionelles Fragment davon dadurch gekennzeichnet, dass ein Antikörper oder ein funktionelles Fragment davon spezifisch an II- und -IIIc-Domänen des Typ-1-Rezeptors des Fibroblasten-Wachstumsfaktors bindet.
In einer besonderen Ausführungsform bindet ein Antikörper oder ein funktionelles Fragment davon einen Typ-1-Rezeptor des Fibroblasten-Wachstumsfaktors mit einer Dissoziationskonstante Kd von 2x10-9 M oder weniger.
In einer besonderen Ausführungsform bindet ein Antikörper oder ein funktionelles Fragment davon einen Fibroblasten-Wachstumsfaktor Typ 1-Rezeptor mit einer Dissoziationskonstante Kd von 1.59x10-9 M.
In einer besonderen Ausführungsform ist ein Antikörper oder ein funktionelles Fragment davon dadurch gekennzeichnet, dass seine schwere Kette eine variable Domäne mit einer Sequenz umfasst, die zu mindestens 90% von SEQ ID NO:7 homologisch ist.
In einer besonderen Ausführungsform ist ein Antikörper oder ein funktionelles Fragment davon dadurch gekennzeichnet, dass seine schwere Kette eine variable Domäne mit der Sequenz von SEQ ID NO:7 umfasst.
In einer besonderen Ausführungsform ist ein Antikörper oder ein funktionelles Fragment davon dadurch gekennzeichnet, dass seine leichte Kette eine variable Domäne mit einer Sequenz umfasst, die zu mindestens 90% von SEQ ID NO:8 homologisch ist.
In einer besonderen Ausführungsform ist ein Antikörper oder ein funktionelles Fragment davon dadurch gekennzeichnet, dass seine leichte Kette eine variable Domäne mit der Sequenz von SEQ ID NO:8 umfasst.
In einer besonderen Ausführungsform ist ein Antikörper oder ein funktionelles Fragment davon dadurch gekennzeichnet, dass seine schwere Kette eine Sequenz hat, die zu mindestens 90% von SEQ ID NO:9 homologisch ist.
In einer besonderen Ausführungsform ist ein Antikörper oder ein funktionelles Fragment davon dadurch gekennzeichnet, dass seine schwere Kette eine Sequenz von SEQ ID NO:9 aufweist.
In einer besonderen Ausführungsform ist ein Antikörper oder ein funktionelles Fragment davon dadurch gekennzeichnet, dass seine leichte Kette eine Sequenz aufweist, die zu mindestens 90% von SEQ ID NO:10 homologisch ist.
In einer besonderen Ausführungsform ist ein Antikörper oder ein funktionelles Fragment davon dadurch gekennzeichnet, dass seine leichte Kette eine Sequenz von SEQ ID NO:10 aufweist.
In einer besonderen Ausführungsform ist ein Antikörper oder ein funktionelless Fragment davon dadurch gekennzeichnet, dass ein Antikörper monoklonal ist.
In einer besonderen Ausführungsform ist ein Antikörper oder ein funktionelles Fragment davon dadurch gekennzeichnet, dass ein Antikörper chimär, humanisiert oder human ist.
In einer besonderen Ausführungsform ist ein Antikörper oder ein funktionelles Fragment davon dadurch gekennzeichnet, dass dieser Antikörper sich auf den Isotyp von IgA, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 oder IgM bezieh.
In einer besonderen Ausführungsform ist ein Antikörper oder ein funktionelles Fragment davon dadurch gekennzeichnet, dass ein Antikörper an ein zytotoxisches Mittel konjugiert ist.
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung der onkologischen Erkrankung, die den oben beschriebenen Antikörper oder ein funktionelles Fragment davon in einer wirksamen Menge und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.
In einer besonderen Ausführungsform ist die pharmazeutische Zusammensetzung dadurch gekennzeichnet, dass der Nierenzellkrebs die onkologische Erkrankung ist.
Der Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch eine Verwendung eines oben beschriebenen Antikörpers oder eines funktionellen Fragment davon zur Behandlung der onkologischen Erkrankung.
In einer besonderen Ausführungsform ist die Verwendung eines Antikörpers oder eines funktionellen Fragments davon dadurch gekennzeichnet, dass der Nierenzellkrebs onkologische Erkrankung ist.
Der Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zur Behandlung einer onkologischen Erkrankung, das die Eingabe einer wirksamen Menge eines oben beschriebenen Antikörpers oder eines funktionellen Fragments davon oder einer oben beschriebenen pharmazeutischen Zusammensetzung an den Patienten umfasst.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Nukleinsäure, die einen oben beschriebenen Antikörper oder ein funktionelles Fragment davon kodiert.
In einer besonderen Ausführungsform ist die Nukleinsäure dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Sequenz aufweist, die zu mindestens 90% von SEQ ID NO:11 homologisch ist.
In einer besonderen Ausführungsform ist die Nukleinsäure dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Sequenz von SEQ ID NO:11 aufweist.
In einer besonderen Ausführungsform ist die Nukleinsäure dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Sequenz aufweist, die zu mindestens 90% von SEQ ID NO:12 homologisch ist.
In einer besonderen Ausführungsform ist die Nukleinsäure dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Sequenz von SEQ ID NO:12 aufweist.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Ovarienzelllinie des chinesischen Hamsters, die die oben beschriebene Nukleinsäure zur Herstellung eines oben beschriebenen Antikörpers oder eines funktionellen Fragments davon enthält.
In einer besonderen Ausführungsform wurde die Ovarienzelllinie des chinesischen Hamsters in der Allrussischen Sammlung von industriellen Mikroorganismen unter der Registrierungsnummer VKPM H-134 hinterlegt.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers oder eines funktionellen Fragments davon, das das Kultivieren einer Zelllinie gemäß der Erfindung in einem Nährboden und die Absonderung eines Antikörpers oder eines funktionellen Fragments davon aus den obengenannten Zellen und/oder dem obengenannten Boden (Medium).
Das technische Ergebnis der Gruppe von Erfindungen ist das Erreichen einer hohen Effizienz und Spezifität der Unterdrückung der Proliferation von den Tumorzellen und der Hemmung der Tumorangiogenese durch das Blockieren des pathologischen Weges von FGF/FGFR1, der es ermöglicht, onkologische Erkrankungen wirksam zu behandeln.
In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung, die die Erzeugung eines humanisierten Antikörpers ist, wird ein zusätzliches technisches Ergebnis - die unerwartet hohe Affinität und Spezifität eines Antikörpers mit praktisch keinen unerwünschten antigenen (immunogenen) Eigenschaften erzielt.
Ausführliche Erfindungsbeschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft Antikörper, insbesondere als Variante, monoklonale humanisierte Antikörper, die spezifisch und mit hoher Affinität an FGFR1 binden. In einigen Ausführungsformen haben die Antikörper spezifische strukturelle Merkmale, wie z. B. CDR-Regionen, die spezifische Aminosäuresequenzen enthalten. Die vorliegende Erfindung betrifft gesonderte Antikörper, Verfahren zur Herstellung solcher Antikörper, Immunkonjugate, die die Antikörper umfassen, sowie pharmazeutische Zusammensetzungen, die diese Antikörper enthalten. Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zur Verwendung dieser Antikörper, zum Beispiel zur Behandlung von den Krankheiten, die mit der FGFR1-Expression assoziiert sind (z. B. von onkologischen Erkrankungen).
Danach betrifft die vorliegende Erfindung auch Verfahren zur Verwendung von anti-FGFR1-Antikörpern gemäß der Erfindung zur Behandlung verschiedener onkologischen Erkrankungen, zum Beispiel zur Behandlung von Nierenzellkrebs, Lungenkrebs und Brustkrebs.
Um die vorliegende Erfindung besser zu verstehen, sind einige hier verwendete Begriffe nachstehend angegeben.
Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff „Antikörper“ vollständige Antikörper und irgendwelche antigenbindenden (funktionellen) Fragmente (das heißt antigenbindende Teile) oder einzelne Antikörperketten. Der Begriff „Antikörper“ bedeutet ein Glykoprotein, das mindestens zwei schwere (H) Ketten und zwei leichte (L) Ketten umfasst, die durch Disulfidbindungen oder ihren antigenbindenden Teil verbunden sind. Jede schwere Kette besteht aus einer variablen Region der schweren Kette (VH) und einer konstanten Region der schweren Kette. Die konstante Region der schweren Kette besteht aus drei Domänen CH1, CH2 und CH3. Jede leichte Kette besteht aus einer variablen Region der leichten Kette (VL) und einer konstanten Region der leichten Kette. Die konstante Region der leichten Kette besteht aus einer CL-Domäne. Die VH- und VL-Regionen können weiter in hypervariable Regionen unterteilt werden, die als komplementaritätsbestimmende Regionen (H-CDR und L-CDR) bezeichnet werden, die durch konservativere Regionen, die als Framework-Regionen (FR) bezeichnet werden, getrennt sind. Jede VH- und VL-Region besteht aus drei CDR und vier FR, die vom Amino-Terminus (N-Terminus) bis zum Carboxy-Terminus (C-Terminus) in der folgenden Reihenfolge angeordnet sind: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
Die variablen Regionen der schweren und leichten Ketten enthalten eine Bindungsdomäne, die mit dem Antigen zusammenwirkt. Die konstanten Regionen der Antikörpern können die Bindung von den Immunglobulinen an Gewebe oder Wirtsfaktoren vermitteln, einschließlich verschiedener Zellen des Immunsystems (z. B. Effektorzellen) und der ersten Komponente (C1q) des klassischen Komplementsystems.
Der Begriff „funktionelles Antikörper-Fragment“ in dem hier verwendeten Sinne bedeutet ein oder mehrere Antikörperfragmente, die die Fähigkeit zur spezifischen Bindung an ein Antigen beibehalten (z. B. die II- und IIIc-Domänen von FGFR1). Es wurde festgestellt, dass die Fragmente eines nicht prozessierten Antikörpers antigenbindende Funktion eines Antikörpers durchführen können. Die Beispiele der bindenden Fragmente, die in der Definition eines antigenbindenden Teils eines Antikörpers enthalten sind, umfassen (i) ein Fab-Fragment, ein monovalentes Fragment, das aus den VL-, VH-, CL- und CH1-Domänen besteht; (ii) F(ab')2-Fragment, ein bivalentes Fragment, das zwei Fab-Fragmente umfasst, die durch eine Disulfidbrücke in der Gelenkregion gebunden werden; (iii) ein Fd-Fragment, das aus den VH- und CH1-Domänen besteht; (iv) ein Fv-Fragment, das aus den VL- und VH-Domänen eines des Antikörpersarms besteht; (v) ein dAb-Fragment (Ward et al., 1989, Nature 341:544-546), das aus einer VH- oder VL-Domäne besteht; und (vi) eine gesonderte komplementaritätsbestimmende Region (CDR). Obwohl zwei Domänen des Fv-Fragments, VL und VH werden durch verschiedene Gene kodiert, können sie außerdem durch rekombinante DNA-Methoden unter Verwendung eines synthetischen Linkers kombiniert werden, der es ermöglicht, eine einzelne Proteinkette zu erhalten, in der die VL- und VH- Regionen sich unter der Bildung monovalenter Moleküle paaren (als ein einkettiges Fv-Fragment (scFv) bekannt, siehe, zum Beispiel folgende Veröffentlichungen: Bird et al., 1988, Science 242:423-426, und Huston et al., 1988, Proc Natl. Acad., Sci., USA 85:5879-5883 ). Solche einkettigen Antikörper sind ebenfalls in der Definition des Begriffs „antigenbindender Teil eines Antikörpers“ (Antikörper-Fragment) enthalten. Die angegebenen Antikörper-Fragmente werden nach üblichen, dem Fachmann bekannten Methoden hergestellt und ebenso wie intakte Antikörper auf ihre Eignung untersucht. In einer Ausführungsform ist ein Antikörper-Fragment aus der Gruppe bestehend aus Fab, Fd, Fd', einzelkettigem Fv (scFv), scFva und domänenspezifischem Antikörper (dAb) ausgewählt.
Unter anderem kann ein Antikörper oder ein funktionelles Fragment davon (antigenbindender Teil) ein Teil eines größeren immunadhäsiven Moleküls sein, das durch kovalente oder nicht-kovalente Bindung eines Antikörpers oder eines Teils eines Antikörpers an ein oder mehrere andere Proteine oder Peptide gebildet wird. Die angegebenen anderen Proteine oder Peptide können funktionelle Gruppen aufweisen, die es ermöglichen, die Antikörper oder ihre antigenbindenden Teile zu reinigen oder sie aneinander oder an andere Moleküle zu binden. Die Beispiele solcher immunadhäsiven Moleküle umfassen daher die Verwendung der zentralen Region von Streptavidin zur Herstellung von den Molekülen, die ein tetrameres einzelsträngiges variables Fragment (scFv) enthalten (Kipriyanov et al., 1995, Human Antibodies und Hybridomas 6:93-101), und die Verwendung eines Cysteins, Peptid-Marker und C-terminaler Polyhistidin-Markierung zur Erzeugung bivalenter und biotinylierter scFv-Moleküle (Kipriyanov et al., 1994, Mol. Immunol. 31:1047-1058). Die Teile eines Antikörpers, wie Fab- und F (ab')2-Fragmente, können aus vollständigen Antikörpern durch die Standardverfahren erhalten werden, z. B. Spaltung von vollständigen Antikörpern mit Papain oder Pepsin. Unter anderem die Antikörper, die Teile der Antikörper können und immunadhäsive Moleküle durch die Standard-DNA-Rekombinationsmethoden hergestellt werden.
Die Antikörperdomänen sind komplementär, da sie zu einer Familie von Strukturen gehören, die die zugehörigen Paare oder Gruppen bilden oder von solchen Familien getrennt werden und dieses Merkmal behalten. Zum Beispiel sind die VH-Domäne und VL-Domäne eines Antikörpers komplementär; zwei VH-Domänen sind nicht komplementär und zwei VL-Domänen sind nicht komplementär. Die komplementären Domänen können in anderen Mitgliedern der Immunglobulin-Superfamilie gefunden werden, wie ү- und δ-Domänen (oder Gamma und Delta) des T-Zell-Rezeptors.
Der Begriff „Domäne“ bedeutet die gefaltete Struktur eines Proteins, das seine Tertiärstruktur unabhängig vom Rest des Proteins beibehält. In der Regel sind die Domänen für bestimmte funktionelle Eigenschaften von den Proteinen verantwortlich und können in vielen Fällen hinzugefügt, entfernt oder auf andere Proteine übertragen werden, ohne die Funktion des Rests des Proteins und/oder der Domäne zu verlieren. Eine variable Domäne des Antikörpers ist eine gefaltete Polypeptiddomäne, die Sequenzen umfasst, die für die variablen Regionen des Antikörpers charakteristisch sind. Aus diesem Grund umfasst ein Antikörper vollständige variable Domänen und modifizierte variable Domänen, in denen zum Beispiel eine oder mehrere Schleifen durch die Sequenzen ersetzt werden, die für variable Antikörperdomänen nicht charakteristisch sind, oder variable Antikörperdomänen, die verkürzt wurden oder Verlängerungen am N- oder C-Terminus umfassen, und gefaltete Fragmente von variablen Domänen, die zumindest teilweise Bindungsaktivität und Spezifität der nicht prozessierten Domäne beibehalten.
Die variablen Domänen der vorliegenden Erfindung können kombiniert werden, um eine Domänengruppe zu bilden; zum Beispiel können komplementäre Domänen kombiniert werden, insbesondere können die VL-Domänen mit den VH-Domänen kombiniert werden. Die nichtkomplementären Domänen können auch kombiniert werden. Die Domänen können auf viele Arten kombiniert werden, einschließlich der Domänenbindung durch kovalente oder nicht-kovalente Bindungen.
Der Begriff „rekombinanter Antikörper“ bedeutet die Antikörper, die durch die rekombinanten Methoden hergestellt, exprimiert, erzeugt oder gesondert werden, zum Beispiel die Antikörper, die durch einen rekombinanten Expressionsvektor exprimiert werden, der in eine Wirtszelle transfiziert wird; die Antikörper, die aus den kombinatorischen Bibliotheken von den rekombinanten Antikörpern gesondert werden; die Antikörper, die aus einem Tier gesondert werden (z.B. einer Maus), die genmanipuliert für humane Immunglobulingene ist (siehe z.B. Veröffentlichung von Taylor et al., 1992, Nucl. Acids Res. 20:6287-6295) oder die Antikörper, die hergestellt, exprimiert, erzeugt oder auf andere Weise gesondert werden, der das Spleißen von den insbesonderen Immunglobulin-Gensequenzen (z.B. humane Immunglobulin-Gensequenzen) an andere DNA-Sequenzen enthält. Die Beispiele für die rekombinanten Antikörper umfassen chimäre, CDR-implantierte und humanisierte Antikörper.
Der Begriff „humaner Antikörper“ bedeutet die Antikörper mit variablen und konstanten Regionen, die den humanen Keimbahn-Immunglobulin-Sequenzen entsprechen oder daraus gesondert werden, die, zum Beispiel von Kabat et al. beschrieben wurden (siehe Veröffentlichung von Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication 91-3242). Die humanen Antikörper der vorliegenden Erfindung können jedoch die Aminosäurereste umfassen, die nicht durch die humanen Keimbahn-Immunglobulin-Sequenzen, zum Beispiel in der CDR-Region und in insbesondere in CDR3 kodiert werden (z. B. die Mutationen, die durch unspezifische oder ortsspezifische Mutagenese in vitro oder somatische Mutation in vivo eingeführt werden).
Die rekombinanten humanen Antikörper der vorliegenden Erfindung umfassen die variablen Regionen und können auch die konstanten Regionen umfassen, die von den humanen Keimbahn-Immunglobulin-Sequenzen gesondert werden (siehe Veröffentlichung von Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication 91-3242). In einigen Ausführungsformen der Erfindung können solche rekombinanten humanen Antikörper zur Mutagenese in vitro unterzogen (oder somatische Mutagenese in vivo, wenn ein Tier verwendet wird, das zu humanen Ig-Sequenzen genmanipuliert ist) und somit sind die Aminosäuresequenzen der VH- und VL-Regionen der rekombinanten Antikörper die Sequenzen, die wobei die zugeordnet und zugehörige Sequenzen der VH- und VL-Regionen der humanen Keimbahn sind, möglicherweise können nicht natürliche Bedingungen im Spektrum von den Keimbahn-Antikörper-Sequenzen in vivo vorhanden. In einigen Ausführungsformen sind solche rekombinanten Antikörper jedoch das Ergebnis von selektiver Mutagenese, Rückmutation oder beidem.
Der Begriff „Rückmutation“ bedeutet einen Prozess, bei dem einige oder alle der somatisch mutierten Aminosäuren eines humanen Antikörpers durch entsprechende Reste aus einer homologen Keimbahn-Antikörper-Sequenz ersetzt werden. Die Sequenzen der schweren und leichten Ketten des humanen Antikörpers der vorliegenden Erfindung werden getrennt einer Vergleichsanalyse mit den Keimbahn-Sequenzen in der VBASE-Datenbank unterzogen, um die Sequenzen mit der höchsten Homologie zu identifizieren. Die unterschiedlichen Aminosäuren des humanen Antikörpers der vorliegenden Erfindung werden durch die Mutation von den Nukleotiden an spezifischen Positionen, die eine andere Aminosäure kodieren, in die Keimbahn-Sequenz zurückgeführt. Die Rolle jeder so als Kandidat für eine Rückmutation identifizierten Aminosäure sollte auf direkte oder indirekte Bindung eines Antigens untersucht werden, und jede Aminosäure, von der festgestellt wird, dass sie nach die Mutation gegenüber gewünschten Eigenschaften des humanen Antikörpers einwirkt, sollte nicht in einem endgültigen humanen Antikörper enthalten sein. Um die Anzahl von den Aminosäuren zu minimieren, die einer Rückmutation unterzogen werden, können die Aminosäuren an Positionen, die sich von der nächsten Keimbahn-Sequenz unterscheiden, aber identisch mit dem entsprechenden Aminosäure in einer zweiten Keimbahn-Sequenz unter der Bedingung bleiben, dass die zweite Keimbahn-Sequenz ist identisch und sie entspricht die Sequenz des humanen Antikörpers der vorliegenden Erfindung in Bezug auf mindestens 10, vorzugsweise 12 Aminosäuren auf beiden Seiten der betrachteten Aminosäure. Eine Rückmutation kann in jedem Stadium Optimierung eines Antikörpers auftreten.
Der Begriff „chimärer Antikörper“ bedeutet einen Antikörper, der die Sequenzen der variablen Region der schweren und leichten Kette von einer Spezies und eine Sequenz der konstanten Region von einer anderen Spezies enthält, zum Beispiel Antikörper, die die variablen Regionen der schweren und leichten Kette des Nagetieres umfassen, die mit humanen konstanten Regionen assoziiert sind.
Der Begriff „humanisierter Antikörper“ bedeutet die Antikörper, die Sequenzen der variablen Region der schweren und leichten Kette von einer anderen Spezies als einem Menschen (z. B. Maus) umfassen, in der jedoch mindestens ein Teil der Sequenz von den VH- und/oder VL-Regionen verändert wurde, um der humanen Sequenz ähnlicher zu sein, das heißt den variablen Sequenzen der humanen Keimbahn ähnlicher zu machen. Ein Typ eines humanisierten Antikörpers ist ein CDR-implantierter Antikörper, bei dem humanen CDR-Sequenzen in andere Sequenzen der VH- und VL-Regionen als humane Sequenzen eingeführt werden, um entsprechende CDR-Sequenzen zu ersetzen, die nicht humane sind. Die Verfahren zur Humanisierung der Antikörper, die nicht human sind, sind auf diesem Fachgebiet gut bekannt. Der humanisierte Antikörper enthält typischerweise einen oder mehrere Aminosäurereste, die aus einer anderen Quelle, die nicht humane Quelle ist, eingeführt werden. Die angegebenen Aminosäurereste, die nicht humane Reste sind, werden oft als fremde Reste identifiziert, die typischerweise von einer fremden variablen Domäne erhalten werden. Die Humanisierung kann nach einer von Winter und Mitautoren entwickelten Methode durchgeführt werden (Jones et al., Nature, 321: 522-525, 1986; Riechmann et al., Nature, 332: 323-327, 1988; Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536, 1988), die das Ersetzen der entsprechenden Sequenzen des humanen Antikörpers durch die CDR-Regionen oder CDR-Sequenzen, die nicht humane Sequenzen sind (z. B. Nagetiere), umfasst. Solche humanisierten Antikörper sind somit chimäre Antikörper ( US 4816567 ), in denen im Wesentlichen ein Teil der intakten humanen variablen Domäne durch eine entsprechende Sequenz eines Spezies, der nicht humane Spezies ist, ersetzt wird. In der Praxis sind humanisierte Antikörper im Allgemeinen humane Antikörper, in denen einige CDR-Reste und möglicherweise einige Reste der Frame-Region (FR) durch die Reste ähnlicher Orten in den Antikörpern der Nagetier ersetzt werden. Zusätzliche Materialien, die den Prozess der Humanisierung beschreiben, sind Veröffentlichungen von Sims et al., J. Immunol., 151:2296, 1993; Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901, 1987; Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285, 1992; Presta et al., J. Immunol., 151:2623, 1993, die in der vorliegenden Beschreibung der Erfindung als Referenz enthalten werden.
Der Begriff „polyklonale Antikörper“ bedeutet die Antikörper, die typischerweise eine Mischung von den Antikörpern sind, die für ein bestimmtes Antigen spezifisch sind, aber die Antikörper, die an unterschiedliche Epitope auf dem angegebenen Antigen binden. Die polyklonalen Antikörper werden üblicherweise im Körper von den Tieren als Ergebnis mehrerer subkutanen (sc) oder intraperitonealen (ip) Injektionen des zugehörigen Antigens und Adjuvants gebildet. Es kann sinnvoll sein, das zugehörige Antigen an ein Protein zu konjugieren, das in immunisierten Form, wie, zum Beispiel Schnecke-Lymphe-Hämocyanin, Serumalbumin, Rinder-Thyroglobulin oder Sojabohnen-Trypsininhibitor unter Verwendung einen bifunktionellen oder eines derivatsbildenden Mittels, zum Beispiel eines komplexen Maleinimidobenzoylsulfosuccinimidester (Konjugation durch die Cysteinreste), N-Hydroxysuccinimid (an durch die Lysinreste), Glutaraldehyd, Bernstein-Aldehyd, SOCl2 oder R1NCNR immunogen ist, wobei R und R1 verschiedene Alkylgruppen bedeuten. Die Verfahren zur Herstellung von polyklonalen Antikörpern sind in diesem Bereich bekannt und sind zum Beispiel in der Veröffentlichung Antibodies: A Laboratory Manual, Lane und Harlow, 1988, beschrieben, die in der vorliegenden Beschreibung der Erfindung als Referenz enthalten werden.
Der Begriff „monoklonale Antikörper“ in dem hier verwendeten Sinne bedeutet einen Antikörper, der von einem Hybridom erhalten wird (z. B. ein Antikörper, der von einem Hybridom sekretiert wird, das durch eine Hybridom-Technik erhalten wird, wie die Standard-Köhler- und Milstein-Hybridom-Technik). Zum Beispiel können monoklonale Antikörper durch eine Hybridom-Technik hergestellt werden, das zuerst in Kohler et al., Nature, 256:495, 1975 beschrieben wurde, oder können durch rekombinante DNA-Methoden hergestellt werden ( US 4816567 ). Die monoklonalen Antikörper werden aus einer Population im wesentlichen homogener Antikörper erhalten, das heißt, einzelne Antikörper, die eine Population bilden, sind mit Ausnahme von möglichen natürlichen Mutationen identisch, die in kleinen Mengen vorhanden sein können. Der Begriff „monoklonal“ bestimmt somit die Art eines Antikörpers, der keine Mischung einzelner Antikörper ist.
Die hierin verwendete Begriffe wie „ein Antikörper, der das Antigen erkennt“ und „ein Antikörper, der für das Antigen spezifisch ist“ und „ein Antikörper gegen das Antigen“ sind Synonyme mit dem Begriff „ein Antikörper, der spezifisch an das Antigen bindet“.
Der Begriff „Antikörper-Derivate“ bedeutet jede modifizierte Form eines Antikörpers (humanes Antikörpers, humanisiertes Antikörpers, Maus-Antikörpers), zum Beispiel ein Konjugat eines Antikörpers mit einem anderen Mittel oder Antikörper.
Der hier verwendete Begriff „ein Antikörper, der spezifisch den Typ-1-Rezeptor des Fibroblasten-Wachstumsfaktors (FGFR1) bindet“ bedeutet einen Antikörper, der an humanen Fibroblasten-Wachstumsfaktor FGFR1 mit Kd=1×10-7 M oder weniger, noch bevorzugter 1x10-8 M oder weniger, noch mehr bevorzugter 2x10-9 M oder weniger und am meisten bevorzugt 1.59x10-9 M oder weniger bindet.
Der hier verwendete Begriff „hohe Affinität“ eines IgG-Antikörpers bedeutet, dass dieser Antikörper an das Zielantigen mit Kd, von 1×10-7 M oder weniger, noch bevorzugter 1×10-8 M oder weniger, noch mehr bevorzugter 2×10-9 M oder weniger, weniger und am meisten bevorzugt 1.59×10-9 M oder weniger bindet.
Jede der obengenannten Aminosäure- und Nukleotidsequenzen ist in der folgenden Tabelle 1 und im Sequenzprotokoll dargestellt.
Homologische Antikörper
In einigen Ausführungsformen der Erfindung umfasst ein Antikörper gemäß der Erfindung variable Regionen der schweren und leichten Kette, die die Aminosäuresequenzen umfassen, die zu den Aminosäuresequenzen der hierin beschriebenen bevorzugten Antikörper homologisch sind, wobei die Antikörper die gewünschten funktionellen Eigenschaften der anti-FGFR1-Antikörper gemäß der Erfindung beibehalten.
Die homologische Antikörper können durch die Mutagenese (zum Beispiel ortsgerichtete oder PCR-vermittelte (Polymerase-Kettenreaktion-vermittelte) Mutagenese) der entsprechenden Nucleinsäuremoleküle mit anschließenden Prüfungen des kodierten modifizierten Antikörpers erhalten werden, um seine Funktionen in der Übereinstimmung mit den hier beschriebenen funktionellen Analysen zu bewahren.
Der hier verwendete wird Begriff „prozentuale Homologie von zwei Aminosäuresequenzen“ ist zu dem Begriff „prozentuale Identität von zwei Sequenzen“ äquivalent. Die prozentuale Identität der zwei Sequenzen hängt von der Anzahl der Positionen identischer Aminosäuren in diesen zwei Sequenzen ab (das heißt % der Homologie = % der identischen Aminosäuren an gegebenen Positionen/Gesamtzahl der Positionen x 100), wobei die Anzahl der Lücken und die Länge jeder Lücke zur optimalen Anpassung der zwei Sequenzen durch die Ausrichtung berücksichtigt wird.
Die prozentuale Identität der zwei Aminosäuresequenzen kann unter Verwendung des Algorithmus von E. Meyers und W. Miller bestimmt werden (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17, 1988), der in das ALIGN-Programm (Version 2.0) unter Verwendung der Tabelle der „Gewichte“ der PAM120-Reste, der Strafe für eine Lücke-Verlängerung=12 und der Strafe für eine Lücke-leere Stelle=4 eingegeben wurde. Unter anderem kann die prozentuale Identität der zwei Aminosäuresequenzen unter Verwendung des Algorithmus von Needleman und Wunsch (J. Mol. Biol. 48:444-453, 1970) bestimmt werden, der in das GAP-Programm des GCG-Programmpakets eingeführt wurde (verfügbar unter www.gcg.com), wobei entweder die Blossum 62-Matrix oder die PAM250-Matrix und die „Gewichte“ der Lücke-leere Stelle von 16, 14, 12, 10, 8, 6 oder 4 und die „Gewichte“ der Längen (Abschnitte) von 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 verwendet werden.
Zusätzlich oder alternativ können die Proteinsequenzen gemäß der Erfindung auch als eine „angeforderte Sequenz“ verwendet werden, um eine Suche in öffentlichen Datenbanken durchzuführen, zum Beispiel um zugehörige Sequenzen zu identifizieren. Eine solche Suche kann unter Verwendung des XBLAST-Programms (Version 2.0) Altschul, et al., 1990, J. Mol.Biol. 215 403-10 durchgeführt werden. Die Suche nach BLAST-Proteinen kann unter Verwendung des XBLAST-Programms durchgeführt werden, wobei die Aminosäuresequenzen bei einem „Gewichtsfaktor“=50 und einer Länge des „Worts“=3 erhalten werden können, die zu den Sequenzen von den Antikörpermolekülen gemäß der Erfindung homologisch sind. Um die Ausrichtung der Leerzeichen für die Sequenzvergleichszwecke durchzuführen, wird das Gapped BLAST-Programm verwendet, das von Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25 (17):3389-3402 beschrieben wurde. Während der Arbeit mit BLAST- und Gapped-BLAST-Programmen können die in den entsprechenden Programmen (z. B. XBLAST und NBLAST) festgelegten Standardparameter verwendet werden. Siehe www.ncbi.nlm.nih.gov.
Die Nukleinsäuremoleküle, die die Antikörper gemäß der Erfindung kodieren
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die Nukleinsäuremoleküle, die die Antikörper gemäß der Erfindung kodieren. Solche Nukleinsäuren können in ganzen Zellen, in den Zelllysaten oder in teilweise gereinigter oder im Wesentlichen reiner Form vorliegen. Die Nukleinsäure ist „gesondert“ oder „im Wesentlichen rein“, wenn sie von anderen zellulären Komponenten oder anderen Verunreinigungen, zum Beispiel von anderen zellulären Nukleinsäuren oder Proteinen, unter Verwendung von den Standardverfahren, einschließlich der Alkali-/Natriumlaurylsulfat-Behandlung, der Zentrifugation in einem CsCI-Dichtegradienten, der Säulenchromatographie, der Agarosegelelektrophorese und anderer Verfahren gereinigt wird, die dem Fachmann auf diesem Gebiet gut bekannt sind. Siehe F. Ausubel, et al., ed., 1987, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York. Die Nukleinsäure gemäß der Erfindung kann zum Beispiel DNA oder RNA sein und kann die Intronsequenzen enthalten oder nicht enthalten. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Nukleinsäure ein cDNA-Molekül.
Die Nukleinsäuren gemäß der Erfindung können durch die Standardmethoden der Molekularbiologie erhalten werden. Für die Antikörper, die durch Hybridome exprimiert werden (z. B. Hybridome, die von genmanipulierten Mäusen abgeleitet sind, die die humanen Immunglobulingene tragen), cDNA, die die leichten und schweren Ketten des von den Hybridomen produzierten Antikörpers kodieren, können durch die Standard-PCR-Amplifikations- oder cDNA-Klonierungsmethoden hergestellt werden. Für die Antikörper, die von der Bibliothek von den Immunglobulingenen erhalten werden (z. B. unter Verwendung der die Technik von den Phagendarstellungen), kann die angegebenen Antikörper kodierende Nukleinsäure aus dieser Bibliothek gesondert werden.
Die bevorzugten Nukleinsäuremoleküle gemäß der Erfindung sind die Moleküle, die die VH- und VL-Sequenzen eines monoklonalen Antikörpers gegen FGFR1 kodieren. Die DNA-Sequenz, die die VH-Sequenz eines Antikörpers gegen FGFR1 kodiert, ist SEQ ID NO:11. Die DNA-Sequenz, die die VL-Sequenz eines Antikörpers gegen FGFR1 kodiert, ist SEQ ID NO:12. Nach dem Erhalten von den DNA-Fragmenten, die die VH- und VL-Fragmente kodieren, können diese DNA-Fragmente dann durch die Standardmethoden rekombinanter DNA modifiziert werden, zum Beispiel zur Umwandlung von den Genen der variablen Regionen in die Gene, die die Kette Volllängen-Antikörper, in die Gene des Fab-Fragments oder das scFv-Gen kodieren. Bei diesen Manipulationen ist das VL- oder VH-kodierende DNA-Fragment funktionell mit einem anderen DNA-Fragment verbunden, das ein anderes Protein, wie eine konstante Antikörper-Region oder ein flexibler Linker, kodiert. Der Begriff „funktionell gebunden“, der in diesem Zusammenhang verwendet wird, bedeutet, dass zwei DNA-Fragmente aneinander gebunden sind, so dass die Aminosäuresequenzen durch diese zwei DNA-Fragmente kodiert werden, während die Leserahmen beibehalten wird. Die gesonderte DNA, die die VH-Region kodiert, kann durch die funktionelle Addition der VH-kodierenden DNA an ein anderes DNA-Molekül, das die konstanten Regionen der schweren Kette (CH1, CH2 und CH3) kodiert, in ein Gen für die Volllängen-Schwerkette umgewandelt werden. Die Sequenzen von den Genen für die konstante Region der humanen schweren Kette sind dem Fachmann bekannt (siehe, zum Beispiel Kabat, E. A., et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication 91-3242),) und DNA-Fragmente, die diese Regionen enthalten, können durch ein Standard-PCR-Amplifikationsmethoden erhalten werden. Die konstanten Regionen IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM oder IgD und am meisten bevorzugt die konstante Region IgG1 können die konstante Region der schweren Kette sein. Für das Fab-Fragment der schweren Kette kann die VH-kodierende Region von DNA funktionell mit einem anderen DNA-Molekül gebundet werden, das nur die konstante Region CH1 der schweren Kette kodiert. Die gesonderte DNA, die die VL-Region kodiert, kann durch funktionelle Addition der VL-kodierenden DNA an ein anderes DNA-Molekül, das die konstante Region der leichten Kette, CL, kodiert, in das Volllängen-Leichtkettengen (sowie in das Fab-Leichtkettengen) umgewandelt werden. Die konstante Region der leichten Kette kann die konstante Region von Kappa oder Lambda und am meisten bevorzugt die konstante Region von Kappa sein. Um das scFv-Gen zu erzeugen, sind die VH- und VL-kodierenden DNA-Fragmente funktionell mit einem anderen Fragment verbunden, das einen flexiblen Linker kodiert, zum Beispiel die Aminosäuresequenz Gly4-Ser)3 kodiert, so dass die VH- und VL-Sequenzen als einzelnes einkettigenes Protein exprimiert werden können wobei die VL- und VH-Regionen über einen flexiblen Linker miteinander verbunden sind (siehe, zum Beispiel Bird et al., 1988, Science 242:423-426; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., 1990, Nature 348:552-554).
Die Herstellung von monoklonalen Antikörpern gemäß der Erfindung
Die monoklonalen Antikörper (mAb) gemäß der Erfindung können durch differentielle Verfahren produziert werden, einschließlich einer Standardtechnologie für die Herstellung der monoklonale Antikörper, zum Beispiel eine Standardverfahren für Hybridisierung von somatischen Zellen, beschrieben von Kohler und Milstein, 1975, Nature 256: 495. Andere Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern können ebenfalls verwendet werden, beispielsweise virale oder onkogene Transformation. Ein bevorzugtes Tier, das zur Herstellung einigen Hybridoms verwendet werden kann, ist ein Nagetier, beispielsweise eine Maus. Die Herstellung eines Hybridoms an der Maus ist eine gut entwickelte Prozedur. Immunisierungsprotokolle und Verfahren zur Isolierung von immunisierten Splenozyten für die Fusion sind den Spezialisten bekannt. Die Partner in der Zellfusion (zum Beispiel murine Myelomzelle) und Verfahren für eine solche Fusion sind den Spezialisten ebenfalls bekannt. Bei der Herstellung von monoklonalen Antikörpern durch ein Hybridomverfahren wird eine Maus oder ein anderes geeignetes Wirtstier mit einem Antigen durch subkutane, intraperitoneale oder intramuskuläre Injektion immunisiert, um Lymphozyten zu identifizieren, die Antikörper produzieren oder herstellen können, die spezifisch an das / die zur Immunisierung verwendete (n) Protein (e) binden. Alternativ können die Lymphozyten in vitro immunisiert werden. Die Lymphozyten werden dann mit Myelomzellen unter Verwendung eines geeigneten Agens, wie zum Beispiel Polyethylenglykol, fusioniert, um eine Hybridomzelle zu erzeugen (J. Goding. Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103, Academic Press, 1986).
In der vorliegenden Erfindung gibt es ein solches FGFR1 Antigen (Domänen II und IIIc). Das Antigen kann ein Fragment oder ein Teil von FGFR1 mit einem oder mehreren Aminosäureresten sein, die an der FGF-Bindung teilnehmen.
Die so hergestellten Hybridomzellen werden in einem geeigneten Kultur-Medium ausgesät und gezüchtet, das vorzugsweise eine oder mehrere Substanzen enthalten soll, die das Wachstum oder Überleben der unfusionierten Eltern-Myelomzellen inhibieren. Wenn beispielsweise kein Enzym von Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyl-Transferase (HGPRT oder HGP) in den Eltern-Myelomzellen vorhanden ist, enthält das Kultur-Medium für das Hybridom üblicherweise Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin (HAT-Medium), die das Wachstum von denen HGPRT fehlten Zellen hemmen. Vorzugsweise sind solche Myelomzellen ausgewählt, die effizient fusionieren, einen stabilen hoheren Spiegel von Expression den Antikörpern in den ausgewählten Antikörper produzierten Zellen unterhalten und empfindlich gegenüber einem Medium, wie beispielsweise HAT-Medium, sind. Unter solchen Zellen sind bevorzugte Zelllinien: murine Myelom-Linien, wie z. B. Linien, die von murinen Tumoren MORS-21 und MRS-11 abgeleitet sind, die von dem Zellverteilungszentrum des Salk Instituts in San Diego (Kalifornien, die USA) erhalten werden können; SP-2-Zellen, die von der Amerikanischen Kollektion den Typischen Kulturen (American Type Culture Collection - ATCC)) in Rockville (Maryland, USA) erhalten werden können; und die P3X63Ag8U.1-Zellen, von Yelton et al. beschrieben (J. Curr., Top Microbiol. Immunol. 81, 1, 1978). Weiterhin wurden die Zelllinien des humanen Myeloms und humanen-murinen Heteromyeloms beschrieben, die humanen monoklonalen Antikörper produzieren können (D. Kozbor et al. J Immunol. 133, 3001, 1984; B. Brodeur, P. Tsang Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63, Marcel Dekker Inc., New York, 1987). Das Kultur-Medium, in dem Hybridomzellen gezüchtet werden, wird auf die Produktion von gegen das entsprechende Antigen gerichteten monoklonalen Antikörpern analysiert. Vorzugsweise soll die Bindungsspezifität von monoklonalen Antikörpern, die von Hybridomzellen produziert werden, hoch sein.
Die vorliegende Erfindung umfaßt solche monoklonalen Antikörper, die eine hohe Spezifität (2x10-9 oder weniger) der Bindung an diese Antigene zeigten, bestimmt nach dem „BIOCORE“ Standardverfahren.
Die chimären oder humanisierten Antikörper gemäß der Erfindung können basierend auf der Sequenz eines wie oben beschrieben hergestellten murinen monoklonalen Antikörpers hergestellt werden. Die DNA, die die schweren und leichten Ketten des Immunglobulins codiert, kann aus einem interessierenden inhumanen Hybridom isoliert und durch molekularbiologische Standardverfahren so konstruiert werden, dass sie humanisierte Immunglobulinsequenzen enthält. Um zum Beispiel einen chimären Antikörper zu erzeugen, können die murine variable Bereiche an den humanen konstanten Bereichen durch die den Spezialisten bekannten Verfahren angeheftet werden (siehe zum Beispiel, US4816567 , Cabilly et al.). Um einen humanisierten Antikörper zu erzeugen, können die murine CDR-Bereiche in den humanen Gerüstbereich durch den Spezialisten bekannten Verfahren eingefügt werden (siehe zum Beispiel, US5225539 , Winter und US5530101 ; US5585089 ; US5693762 und US6180370 , Queen et al.). In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die Antikörper gemäß der Erfindung die humanisierten monoklonalen Antikörper. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung können die humanen Antikörper gemäß der Erfindung an den Mäusen, die humane Immunglobulinsequenzen in den Transgenen und Transchromosomen haben, hergestellt werden, beispielsweise an den Mäusen, die ein humanes Schwerketten-Transgen und ein humanes Leichtketten-Transchromosom halten. Solche Mäuse, die hierin als „KM-Mäuse“ bezeichnet werden, sind in der internationalen Anmeldung WO2002043478 , Ishida et al. ausführlich beschrieben. Außerdem sind die alternativen Systeme von transgenen Pflenzen, die humane Immunglobulingene exprimieren, den Spezialisten bekannt und können verwendet werden, um Anti-FGFR1-Antikörper gemäß der Erfindung herzustellen. Zum Beispiel kann ein alternatives transgenes System verwendet werden, die so genannte Xenomouse (Abgenix, Inc.); und solche Mäuse sind zum Beispiel in Patenten US5939598 ; US6075181 ; US6114598 ; US6150584 und US6162963 , Kucherlapati et al. Beschrieben. Darüber hinaus sind die alternativen Systeme von transchromosomalen Pflenzen, die humane Immunglobulingene exprimieren, den Spezialisten bekannt und können verwendet werden, um Anti-FGFR1-Antikörper gemäß der Erfindung herzustellen. So können beispielsweise die Mäuse, die ein Transchromosom der Schwerketten und ein Leichtketten-Transchromosom tragen, als „TC-Mäuse“ bezeichnet werden; und solche Mäuse sind in der Publikation Tomizuka et al., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727 beschrieben. Zusätzlich können für die Herstellung des Anti-FGFR1-Antikörpers gemäß der Erfindung die Kühe verwendet werden, die humane Schwer- und Leichtketten-Transchromosomen tragen, wie in der Literatur beschrieben (Kuroiwa et al., 2002, Nature Biotechnology 20:889-894). Die monoklonalen Antikörper gemäß der Erfindung können auch unter Verwendung von Phagen-Display-Verfahren zum Screening von Immunglobulingenbibliotheken hergestellt werden. Solche Phagen-Display-Verfahren zur Isolierung von Antikörpern sind den Spezialisten bekannt. Siehe zum Beispiel, die Patente US5223409 ; US5403484 und US5571698 , Ladner et al.; die Patente US5427908 und US5580717 , Dower et al.; die Patente US5969108 und US6172197 , McCafferty et al.; und die Patente US5885793 ; US6521404 ; US6544731 ; US6555313 ; US6582915 und US6593081 , Griffiths et al.
Die monoklonalen Antikörper gemäß der Erfindung können auch unter Verwendung von SCID-Mäusen hergestellt werden, denen humane Immunzellen injiziert wurden, die rekonstruiert wurden, so dass an diesen Mäusen nach der Immunisierung ein humaner Antikörper produziert wird. Solche Mäuse sind beispielsweise in Patenten US5476996 und US5698767 , Wilson et al. Beschrieben.
Die Immunisierung von Mäusen, die einen Anti-FGFRI-Antikörper produzieren
Wenn, um die Antikörper herzustellen eine Ig-produzierende Mäuse gemäß der Erfindung verwendet werden, können solche Mäuse mit einer FGFR1-exprimierenden Zelllinie, einem gereinigten FGFR1-Antigen oder einer mit diesem Antigen angereicherten Präparation immunisiert werden. Vorzugsweise sollen die Mäuse nach der ersten Immunisierung ein Alter von 6-16 Wochen haben. Zum Beispiel für die intraperitoneale Immunisierung von Mäusen, die einen Anti-FGFR1-Antikörper produzieren, kann ein gereinigtes oder rekombinantes Präparat (5-50 ug) des FGFR1-Antigens verwendet werden. Eine detaillierte Beschreibung der Prozedur zur Herstellung von Anti-FGFR1-Antikörpern ist nachstehend in Beispiel 1 angegeben. Die kombinierten Ergebnisse von Experimenten mit verschiedenen Antigenen wurden gezeigt, dass an den transgenen Mäusen während der primären intraperitonealen Immunisierung (i.p.) mit einem Antigen in komplettem Freund-Adjuvans, gefolgt von der i.p. Immunisierung alle zwei Wochen (insgesamt 6 Immunisierungen) mit einem Antigen in unvollständigem Freund-Adjuvans, die Entwicklung einer Immunantwort beobachtet wurde.
Es wurde jedoch auch gefunden, dass zusätzlich zu Freund-Adjuvans andere Adjuvantien wirksam sind. Zusätzlich wurde es gefunden, dass in Abwesenheit eines Adjuvans die ganzen Zellen hoch immunogen sind. Die Überwachung der Immunantwort kann während des gesamten Immunisierungsverfahrens durch Plasmaproben durchgeführt werden, die aus dem retroorbitalen Bereich erhalten wurden. Dieses Plasma kann durch ELISA gescreent werden, und die Mäuse mit ausreichend hohen Titern von Anti-FGFR1-Antikörpern können dann verwendet werden, um Zellen zu fusionieren. Die Mäuse können durch intravenöse Injektion 3 Tage vor dem Töten und Nehmen der Milz wieder ein Antigen eingeführt werden. Es wird angenommen, dass für jede Immunisierung 2-3 Prozeduren der Zellfusion erforderlich sein können. Typischerweise werden 6-24 Mäuse mit jedem Antigen immunisiert. Hierfür werden üblicherweise HCo7- und HCo12-Stämme verwendet. Die Erzeugung von murinen HCo7- und HCo12-Stämmen wird im Patent US5770429 bzw. im Beispiel 2 der internationalen Anmeldung WO2001009187 beschrieben.
Darüber hinauskönnen sowohl HCo7- und HCo12-Transgene zusammen von einer Maus mit zwei verschiedenen humanen Schwerketten-Transgenen (HCo7/HCo12) übertragen werden. Alternativ oder zusätzlich können die Mäuse des KM-Stamms verwendet werden, die in der internationalen Anmeldung WO2002043478 beschrieben sind.
Die Erzeugung von Hybridomen, die anti-FGFRI-Antikörper gemäß der Erfindung produzieren
Um die Hybridome zu erzeugen, die die Anti-FGFR1-Antikörper gemäß der Erfindung produzieren, können die von den immunisierten Mäusen entnommenden Splenozyten und/oder Lymphknotenzellen isoliert und mit einer geeigneten immortalisierten Zelllinie, wie eine Zelllinie des murinen Myeloms, fusioniert werden. Die herausbekommenden Hybridome können auf die Produktion von Antigenspezifischen Antikörpern gescreent werden. Zum Beispiel können die von den immunisierten Mäusen entnommenden Mono-Zellsuspensionen von Milzlymphozyten zu 1/3 der Anzahl von nicht-sekretorischen Zellen des murinen Myeloms Sp2/0 (ATCC, CRL 1581) fusioniert werden, die mit 50% PEG verbindet sind. Alternativ können die von den immunisierten Mäusen entnommenden Mono-Zellsuspensionen von Milz-Lymphozyten mit einer gleichen Anzahl von Zellen des murinen Myeloms Sp2/0 fusioniert werden, unter Verwendung eines Elektrofusionverfahrens unter Elektofeldwirkung in Verbindung mit einem Elektroporator für die Zellfusion im großen Maßstab Cyto Pulse large chamber cell fusion electroporator (Cyto Pulse Sciences, Inc., Glen Burnie, MD). Die Zellen werden in einer Konzentration von etwa 1×105 Zellen/Vertiefung in einer flachbodigen Mikrotiterplatte zusetzt und dann zwei Wochen land in einem selektiven Medium inkubiert, das 10% fetales Ochsenserum (Hyclone, Logan, UT), 10% P388DI-konditioniertes Medium (ATCC, CRL TIB-63), 3-5% Origen (IGEN) in DMEM (Mediatech, CRL 10013, hochhaltige Glucose, L-Glutamin und Natriumpyruvat) sowie 5 mM HEPES enthält, die Zellen können in einem Medium kultiviert werden, in dem das HAT-Medium (hypoxanthine-aminopterin-thymidine, Hypoxanthin-Aminopterin-Thymidin) durch das HT-Medium ersetzt ist. Die einzelnen Vertiefungen können durch ELISA oder FACS auf die monoklonalen Antikörper IgG gescreent werden. Die positiven Klone können dann durch ELISA auf die FGFR1-positiven Antikörper oder gegen FGFR1-exprimierenden Zellen gescreent werden. Nach dem intensiven Wachstum von den Hybridomen, üblicherweise nach 10-14 Tagen, wird das Medium überwacht. Die Antikörper-sekretierende Hybridome können erneut zusetzt und wieder gescreent werden, und nach Erhalt eines positiven Ergebnisses auf den Anti-FGFR1-Antikörper können die Antikörper durch limitierende Züchtung mindestens zweimal subkloniert werden. Dann können die stabilen Subklone in vitro kultiviert werden, um kleine Mengen von Antikörpern in Gewebekultur-Medium für die Zwecke ihrer Charakterisierung zu erzeugen.
Für die Reinigung von anti-FGFR1-Antikörpern können die ausgewählten Hybridome in Zweiliter-Zentrifugenkolben kultiviert werden, die zur Reinigung von monoklonalen Antikörpern bestimmt sind.
Die Überstände können filtriert und konzentriert werden, dann einer Proteinaffinitätschromatographie auf die A-Sepharose unterzogen werden (Pharmacia, Piscataway, NJ). Um die erforderliche Reinheit sicherzustellen, kann eluiertes IgG durch Gelelektrophorese und Hochleistungsflüssigkeitschromatographie beurteilt werden. Die Pufferlösung kann durch PBS ersetzt werden und die Konzentration kann durch OD280 unter Verwendung eines Extinktionskoeffizienten von 1,43 bestimmt werden. Monoklonale Antikörper können in die Aliquots aufgeteilt und bei -80°C gelagert werden.
Die Erzeugung von Transfektomen, die monoklonalen Antikörper gemäß der Erfindung produzieren
Die Antikörper können auch gemäß der Erfindung in einem Transfektom von Wirtszellen unter Verwendung den kombinierten Verfahren von rekombinanten DNA und Gentransfektion hergestellt werden. Zum Beispiel, für die Expression von Antikörpern oder ihren DNA-Fragmenten können die kodierende unvollständige oder vollständige leichte und schwere Ketten durch Standardmethoden der Molekularbiologie erhalten werden (zum Beispiel durch PCR-Amplifikation oder Klonierung der cDNA unter Verwendung eines Hybridoms, das den interessierenden Antikörper exprimiert, eine detaillierte Beschreibung der Prozedur zur Herstellung der rekombinanten DNA, die die leichte oder schwere Ketten des in der Erfindung vorliegenden Antikörpers codiert, wird im Beispiel 5 angegeben), und diese DNAs können in Expressionsvektoren eingefügt werden, so dass solche Gene funktionell an die Transkriptions- und Translationsregulationssequenzen gebunden sind. In diesem Zusammenhang bedeutet der Begriff „funktionell gebunden“, dass das Antikörpergen in einen Vektor ligiert wird, so dass die Transkriptions- und Translationsregulationssequenzen in diesem Vektor ihre inhärente Funktion der Transkriptions- und Translationsregulierung des Antikörpergens erfüllen. Die Expressionsvektor- und Expressionsregulationssequenzen werden so ausgewählt, dass sie mit der für eine solche Expression verwendeten Wirtszelle kompatibel sind. Das Antikörper-Leichtketten-Gen und das Antikörper-Schwerketten-Gen können in separate Vektoren eingefügt werden, oder häufiger werden beide Gene in den gleichen Expressionsvektor integriert. Die Antikörpergene werden in den Expressionsvektor durch Standardmethoden integriert (beispielsweise durch der Ligatur an komplementären Restriktionsstellen in die Antikörpergenfragmente und in einen Vektor oder durch der Ligatur mit stumpfen Enden, falls solche Restriktionsstellen fehlen - eine detaillierte Beschreibung der Prozedur zur Gewinnung eines Plasmides, die rekombinante DNA enthält, die leichte und schwere Ketten des in der Erfindung vorliegenden Antikörpers kodiert, ist im Beispiel 5 angegeben). Die hierin beschriebenen variablen Bereiche der leichten und schweren Ketten von Antikörpern können verwendet werden, um die vollständige Gene zu erzeugen, die einen Antikörper eines beliebigen Isotyps durch deren Einbau in die Expressionsvektoren kodieren, die bereits die konstanten Bereiche der schweren und leichten Ketten von Antikörper des gewünschten Isotyps kodieren, so dass VH-Segment funktionell am CH-Segment (Segmenten) in diesem Vektor gebunden wird, und VL-Segment funktionell am CL-Segment in diesem Vektor gebunden wird. Zusätzlich oder alternativ kann der rekombinante Expressionsvektor ein Signalpeptid kodieren, das die Sekretion der Antikörperkette aus der Wirtszelle erleichtert. Dieses Antikörperketten-Gen kann in einen Vektor kloniert werden, so dass das Signalpeptid an den N-Terminus des Antikörperketten-Gens unter Belassung der Leserahmen gebunden wird. Ein solches Signalpeptid kann ein Immunglobulin-Signalpeptid oder ein heterologes Signalpeptid (i.e. das von Nicht-Immunglobulinprotein abstammende Signalpeptid) sein.
Die rekombinanten Expressionsvektoren tragen gemäß der Erfindung zusätzlich zu den Antikörperketten-Genen einige regulatorische Sequenzen, die die Expression von Antikörperketten-Gene in der Wirtszelle regulieren. Der Begriff „regulatorische Sequenz“ umfasst Promotoren, Enhancer und andere Regulationselemente der Expression (z. B. Polyadenylierungssignale), die die Transkription oder Translation von Antikörperketten-Genen regulieren. Solche regulatorischen Sequenzen sind beispielsweise in der Publikation Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA, 1990) beschrieben. Es ist zu bemerken, dass die Konstruktion eines Expressionsvektors, einschließlich der Sekretion regulatorischer Sequenzen, von solchen Faktoren wie der Wahl einer transformierbaren Wirtszelle, die Expressionshöhe des nützlichen Proteins und ähnliches abhängen kann. Die besonders bevorzugten regulatorischen Sequenzen, die die Expression in Säuger-Wirtszellen regulieren, sind virale Elemente, die in Säugerzellen die hohe Proteinexpressionsniveaus besichern, wie Promotoren und/oder Enhancer, die von Cytomegalovirus (CMV), Simian-Virus (Affenvirus) 40 (SV40), Adenovirus (beispielsweise der Späte Adenovirus-Hauptpromotor (AdMLP)) und Polyomavirus abstammen. Alternativ können die nicht-virale regulatorische Sequenzen verwendet werden, wie Ubiquitin-Promotor oder β-Globin-Promotor. Außerdem können die regulatorischen Elemente verwendet werden, die aus Sequenzen bestehen, die von differentiellen Quellen abstammen, wie das SR-Promotorsystem, die frühen SV40-Promotorsequenzen und die lange terminale Wiederholung des humanen T-Zell-Leukämievirus Typ 1 enthält (Takebe, Y. et al., 1988, Mol. Cell. Biol. 8:466-472).
Abgesehen von den Antikörperketten-Genen und Regulationssequenzen können die rekombinanten Expressionsvektoren gemäß der Erfindung einige zusätzliche Sequenzen enthalten, wie solche Sequenzen, die die Vektorreplikation in Wirtszellen (z. B. Replikationsursprung) und selektive Markergene regulieren. Ein selektives Markergen erleichtert die Selektion von Wirtszellen, in die der gegebene Vektor eingeführt wurde (siehe beispielsweise Patente US4399216 , US4634665 und US5179017 , von Axel et al. erteilt). Zum Beispiel berichtet das selektive Markergen normalerweise an den Wirtszellen, in denen dieser Vektor eingeführt wurde, über die Resistenz gegen Arzneimittel wie G418, Hygromyzin oder Methotrexat. Die besonders bevorzugte selektive Markergene sind das Dihydrofolatreduktase-Gen (DHFR) (in dhfr-Wirtszellen während der Selektion/Amplifikation unter Verwendung von Methotrexat eingeführt) und das neo-Gen (zur Selektion auf die Resistenz gegen G418).
Für die Expression der leichten und schweren Ketten wird (werden) der Expressionsvektor(en), die die schweren und leichten Ketten kodieren, nach Standardverfahren in die Wirtszelle übertragen. Der Begriff „Transfektion“ umfasst in seinen verschiedenen Formen ein breites Spektrum an Verfahren, die üblicherweise für die Einführung von exogener DNA in einige prokaryotische oder eukaryotische Wirtszellen verwendet wird, beispielsweise Elektroporation, Calciumphosphat-Präzipitation, durch DEAE-Dextran vermittelte Transfektion. Obwohl die Antikörper gemäß der Erfindung theoretisch in beliebigen prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszellen exprimiert werden können, sind eukaryotische Wirtszellen bevorzugt, und Säugerzellen sind am meisten bevorzugt, da solche eukaryotischen Zellen und insbesondere Säugerzellen besser für „korrekte“ Assemblierung und Sekretion eines immunologisch aktiven Antikörpers als prokaryotische Zellen geeignet sind. Es wurde berichtet, dass die Expression von Antikörpergenen in prokaryotischen Zellen bei der Produktion von hohen Niveaus des aktiven Antikörpers unwirksam war (Boss, M. A. & Wood, C. R., 1985, Immunology Today 6:12-13).
Bevorzugte Säuger-Wirtszellen, die zur Expression der rekombinanten Antikörper gemäß der Erfindung geeignet sind, sind Ovarzellen des chinesischen Hamsters (CHO-Zellen) (einschließlich dhfr-CHO-Zellen, die in der Publikation Urlaub & Chasin, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220 beschriebenen und mit einem DHFR-selektiven Marker verwendet sind, zum Beispiel, wie in der Publikation R. J. Kaufman und P. A. Sharp, 1982, Mol. Biol. 159:601-621 beschrieben), NSO-Myelomzellen, COS-Zellen und SP2-Zellen. Insbesondere zur Verwendung mit NSO- Myelomzellen gibt es ein anderes bevorzugtes Expressionssystem, das GS-Gen-Expressionssystem, das in WO8704462 , WO8901036 und EP338841 beschrieben ist. Wenn die rekombinanten Expressionsvektoren, die die Antikörpergene Kodieren, in Säugetierwirtszellen eingeführt werden, produzieren die Antikörper durch Kultivieren der gegebenen Wirtszellen für eine Zeitspanne, die ausreichend ist, um die Expression des Antikörpers in den gegebenen Wirtszellen zu bewirken, und mehr bevorzugt zur Sekretion des Antikörpers in das Kulturmedium, in dem diese Wirtszellen kultiviert wurden. Antikörper können aus dem Kulturmedium durch Standard-Proteinreinigungsverfahren isoliert werden.
Die Charakterisierung der Bindung von Antikörper und Antigen
Die Antikörper können gemäß der Erfindung auf die Bindung an FGFR1 getestet werden, zum Beispiel durch Durchflusszytometrie. Kurz zusammengefasst, werden die frische FGFR1-exprimierende Zellen aus Gewebekulturkolben geerntet und eine monozelluläre Suspension hergestellt. Suspensionen der FGFR1-exprimierenden Zellen werden entweder direkt oder nach Fixierung mit 1% Paraformaldehyd in PBS mit dem „ersten“ Antikörper angefärbt. Ungefähr eine Million Zellen werden in PBS resuspendiert, das 0,5% BSA und 50-200 ug/ml des „ersten“ Antikörpers enthält, und dann für 30 Minuten auf dem Eis inkubiert. Die Zellen wurden zweimal mit PBS, enthaltend 0,1% BSA, 0,01% NaN3 gewaschen, in 100 ul des mit 1:100 FITC-konjugiert verdünnten Ziege-anti-Human-IgG-Antikörpers resuspendiert (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) und dann für noch 30 Minuten auf dem Eis inkubiert. Die Zellen werden wieder zweimal gewaschen, in 0,5 ml Waschpuffer resuspendiert und im FACSCalibur Zytometer auf die Fluoreszenzfärbung analysiert (Becton-Dickinson, San Jose, CA).
Alternativ können die Antikörper gemäß der Erfindung durch Standard-ELISA auf die Bindung an FGFR1 getestet werden. Kurz zusammengefasst werden die Mikrotiterplatten mit gereinigtem FGFR1 in einer Konzentration von 0,25 ug/ml in PBS beschichtet und dann mit 5% Rinderserumalbumin in PBS blockiert. Zu jeder Vertiefung werden die Antikörperverdünnungen zugegeben (beispielsweise Verdünnungen des von FGFR1-immunisierten Mäusen entnommenen Plasma) und für 1-2 Stunden bei 370C inkubiert. Die Platten werden mit PBS/Tween gewaschen und dann mit einem „zweiten“ mit alkalischer Phosphatase konjugierten Antikörper (z. B. für humane Antikörper mit den Ziegen-polyklonalem Fc-spezifischem anti-Human-IgG-Antikörper) für 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Nach dem Waschen wurde das pNPP-Substrat (1 mg/ml) zu den Platten zur Farbentwicklung gegeben und auf OD405-650. analysiert. Vorzugsweise ist eine Maus für die Zellfusion verwendet, die die höchsten Antikörpertiter produziert.
Für das Screening von Hybridomen, die eine positive Reaktivität mit dem FGFR1 Immunogen zeigen, können auch ELISA oder FACS Analyse durchgeführt werden, wie oben beschrieben. Hybridome, die mit hoher Avidität an FGFR1 binden, werden subkloniert und dann charakterisiert. Ein Klon von jedem Hybridom, der die Reaktivität der Elternzellen beibehält (wie durch ELISA oder FACS angezeigt), kann ausgewählt werden, um eine Zellbank in 5-10 Gefäßen zu erzeugen, die bei -140°C gelagert und zur Reinigung von Antikörpern verwendet werden.
Für die Reinigung von Anti-FGFR1-Antikörpern können die ausgewählten Hybridome in Zweiliter-Zentrifugenkolben kultiviert werden, die zur Reinigung von monoklonalen Antikörpern bestimmt sind.
Die Überstände können gefiltert und konzentriert und dann der Affinitätschromatographie auf Protein-A-Sepharose unterzogen werden (Pharmacia, Piscataway, NJ). Um die gewünschte Reinheit sicherzustellen, kann eluiertes IgG durch Gelelektrophorese und hocheffektive Flüssigkeits-Chromatographie beurteilt werden. Die Pufferlösung kann durch PBS ersetzt und die Konzentration kann durch OD280 unter Verwendung eines Extinktionskoeffizienten von 1,43 bestimmt werden. Die monoklonalen Antikörper können aliquotiert und bei -80°C gelagert werden.
Um zu bestimmen, ob die ausgewählten monoklonalen Anti-FGFR1-Antikörper an einzigartige Epitope binden, kann jeder Antikörper unter Verwendung von im kommerziell erreichbaren Reagenzien biotinyliert werden (Pierce, Rockford, IL). Die Untersuchung zur Konkurrenz-Bindung unter Verwendung von unmarkierten monoklonalen Antikörpern und biotinylierten monoklonalen Antikörpern kann mit den oben beschriebenen FGFR1-sensibilisierten ELISA-Platten durchgeführt werden. Die Bindung des biotinylierten mAb kann unter Verwendung von Streptavidin-alkalischer Phosphatase als Sonde nachgewiesen werden. Alternativ kann die Untersuchung zur Konkurrenz-Bindung unter Verwendung eines radiomarkierten Antikörpers durchgeführt werden, und unmarkierte konkurrierende Antikörper können durch Scatchard-Analyse nachgewiesen werden.
Um den Isotyp von gereinigten Antikörpern zu bestimmen, können ELISA-Isotyp-Antikörper-Assays unter Verwendung von Reagenzien durchgeführt werden, die für Antikörper eines bestimmten Isotyps spezifisch sind. Um beispielsweise den Isotyp eines humanen monoklonalen Antikörpers zu bestimmen, werden die Vertiefungen der Mikrotiterplatten mit 1 ug/ml anti-Human-Immunglobulin-Antikörper beschichtet und über Nacht bei 4°C stehen gelassen. Nach dem Blockieren mit 1% BSA werden die Platten mit 1 ug/ml oder weniger der getesteten monoklonalen Antikörper oder gereinigten Kontrollisotyp-Antikörpern bei Raumtemperatur für 1 bis 2 Stunden umgesetzt. Die Vertiefungen können dann mit den für humanes IgG1 oder humanes IgM spezifischen und an alkalische Phosphatase konjugierten Antikörper-Sonden umgesetzt werden. Die Platten werden wie oben beschrieben entwickelt und analysiert.
Physikalische Eigenschaften von Antikörpern
Die Anti-FGFR1-Antikörper gemäß der Erfindung können auch durch verschiedene physikalische Eigenschaften charakterisiert werden. Unterschiedliche Klassen solcher Antikörper können durch verschiedene Assays aus ihren physikalischen Eigenschaften identifiziert und/oder bestimmt werden
In einigen Ausführungsformen der Erfindung können die Antikörper eine oder mehrere Glykosylierungsstellen im variablen Bereich der leichten oder schweren Ketten umfassen. Das Vorhandensein von einer oder mehreren Glykosylierungsstellen im variablen Bereich kann zu einer Erhöhung der Immunogenität des Antikörpers oder einer Veränderung des pK-Antikörpers aufgrund der Änderung von Niveau der Bindung an das Antigen führen (Marshall et al., 1972, Annu. Rev. Biochem. 41:673-702; Gala F.A. & Morrison S.L., 2004, J. Immunol. 172:5489-94; Wallick et al., 1988, J. Exp. Med. 168:1099-109; Spiro R.G., 2002, Glycobiology 12:43R 56R; Parekh et al., 1985, Nature 316:452-7: Mimura et al., 2000, Mol. Immunol. 37:697-706). Es ist bekannt, dass die Glykosylierung in Motiven auftritt, die N-X-S/T Sequenz enthalten. Die Glykosylierung des variablen Bereichs kann durch den Glycoblot-Assay getestet werden, wobei der Testantikörper gespalten wird, um ein Fab-Fragment zu erzeugen, und dann auf dieGlykosylierung unter Verwendung einer Analyse getestet wird, wobei der Periodat-Oxidationszustand und die Bildung von Schiffschen Basen bestimmt werden. Alternativ kann die Glykosylierung des variablen Bereichs durch Chromatographie (Dionex-LC) mit Messung der Lichtstreuung getestet werden, wobei die Fab-Saccharide bei Erhalt von Monosacchariden gespalten und auf den Gehalt einzelner Saccharide analysiert werden. In einigen Fällen ist es bevorzugt, dass der Anti-FGFR1-Antikörper keine Glykosylierungsstellen im variablen Bereich enthält. Das kann entweder durch Selektieren von Antikörpern, die das Glykosylierungsmotiv im variablen Bereich nicht enthalten, oder durch Mutieren von Resten im Glykosylierungsmotiv unter Verwendung von Standardmethoden, die den Spezialisten wohlbekannt sind, erreicht werden.
Jeder Antikörper hat einen einzigartigen isoelektrischen Punkt (pI), aber typischerweise hat der Antikörper pI in einem pH 6-9,5 Intervall. pI für den IgG1-Antikörper liegt üblicherweise im Bereich von pH 7-9,5 und pI für den IgG4-Antikörper liegt üblicherweise im Bereich von pH 6-8. Die Antikörper können einen pI aufweisen, der außerhalb des spezifizierten Intervalls liegt. Obwohl der Effekt solcher pI-Werte im Wesentlichen unbekannt ist, wird es aber angenommen, dass die Antikörper mit einem pI-Wert, der außerhalb des normalen Intervalls liegt, bis zum gewissen Zustand die erweiterte Faltung und Instabilität in Bedingungen in vivo aufweisen können. Der isoelektrische Punkt kann durch eine Analyse mit dem kapillaren isoelektrischen Fokussierungsverfahren bestimmt werden, wobei ein pH-Gradient erzeugt wird, und für größere Präzision kann die Laserfokussierung verwendet werden (Janiniet al., 2002, Electrophoresis 23:1605-11; Ma et al., 2001, Chromatographia 53: S75-89; Hunt et al., 1998, J. Chromatogr A 800:355-67). In einigen Fällen ist es bevorzugt, dass der Anti-FGFR1-Antikörper einen pI-Wert im normalen Intervall aufweist. Das kann entweder durch Auswählen von Antikörpern mit pI im normalen Intervall, oder durch Mutieren der geladenen Oberflächenresten unter Verwendung von an den Spezialisten bekannten Standardmethoden erreicht werden.
Jeder Antikörper hat einen Schmelzpunkt, der ein Indikator für seine thermische Stabilität ist (Krishnamurthy R. & Manning M.C., 2002, Curr. Pharm. Biotechnol. 3:361-71). Je höher die Thermostabilität des Antikörpers ist, desto höher ist seine Gesamtstabilität in vivo. Die Schmelztemperatur des Antikörpers kann durch Standardverfahren, wie Differential-Scanning-Kalorimetrie, gemessen werden (Chen et al., 2003, Pharm. Res. 20:1952-60; Ghirlando et al., 1999, Immunol. Lett. 68:47-52). TM1 bedeutet die Temperatur des anfänglichen Einsatzes des Antikörpers. TM2 bedeutet die Temperatur des vollständigen Einsatzes des Antikörpers. Typischerweise übersteigt TM1 des Antikörpers gemäß der Erfindung vorzugsweise 60°C, bevorzugter mehr als 65°C, und noch bevorzugter mehr als 70°C. Alternativ kann die Thermostabilität des Antikörpers unter Verwendung von Zirkulardichroismus gemessen werden (Murray et al., 2002, J. Chromatogr Sci. 40:343-9). In der bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Antikörper ausgewählt, die sich genug langsam zersetzen. Die Fragmentierung des Anti-FGFR1-Antikörpers kann durch Kapillarelektrophorese (CE) und MALDI-MS gemessen werden, die den Spezialisten gut bekannt sind (Alexander A.J. and Hughes D.E., 1995, Anal. Chem. 67:3626-32). In anderem bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die Antikörper einer minimalen Aggregation unterzogen. Die Aggregation kann eine unerwünschte Immunantwort auslösen und/oder veränderte oder ungünstige pharmakokinetische Eigenschaften hervorrufen. Im Allgemeinen sind die Antikörper akzeptabel, die eine Aggregation von 25% oder weniger, vorzugsweise 20% oder weniger, noch mehr bevorzugt 15% oder weniger, noch mehr bevorzugt 10% oder weniger, und am meisten bevorzugt 5% oder weniger erstellt. Die Aggregation kann durch verschiedene Verfahren gemessen werden, die den Spezialisten bekannt sind, einschließlich Ausschluss-Säulenchromatographie (ASC), hocheffektive Flüssigskeitchromatographie (HEFC) und Lichtstreuverfahren zur Identifizierung von Monomeren, Dimeren, Trimeren oder Multimeren.
Immunkonjugate
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung anti-FGFR1-Antikörper oder ein Fragment davon, das mit einem therapeutischen Molekül konjugiert ist, wie beispielsweise Zytotoxin, ein Arzneimittel (beispielsweise ein Immunsuppressivum) oder Radiotoxin. Solche Konjugate werden hierin als „Immunkonjugate“ bezeichnet. Immunkonjugate, die ein oder mehrere Zytotoxine umfassen, werden „Immunotoxine“ genannt. Das Zytotoxin oder zytotoxische Mittel schließt jedes Agens ein, das eine negative Wirkung auf die Zelle hat (z. B. die Zelle zerstört). Die Beispiele sind Taxol, Zytochalasin B, Gramizidin D, Ethidiumbromid, Emetin, Mitomyzin, Etoposid, Tenoposid, Vincristin, Vinblastin, Kolchizin, Doxorubizin, Daunorubizin, Dihydroxyanthrazyndion, Mitoxantron, Mitramyzin, Aktinomyzin D, 1-Dehydrotestosteron, Glukokortikoide, Prokain, Tetrakain, Lidokain, Propranolol und Puromyzin und ihre Analoge oder Homologe. Therapeutische Mittel sind auch zum Beispiel, Antimetaboliten (beispielsweise Methotrexat, 6-Merkaptopurin, 6-Thioguanin, Zytarabin, 5-Fluorurazildekarbasin), Alkylierungsagens (z.B. Mechlorethamin, Thiotepa, Chlorambuzil, Melphalan, Karmustin (BSNU) und Lomustin (CCNU), Zyklophosphamid, Busulfan, Dibrommannit, Streptosotozin, Mitomyzin C und Cis-dihlordiaminplatina (II) (DDP), das heißt, Cisplatin), Anthrazykline (z.B. Daunorubizin (früher Daunomyzin) und Doxorubicin), Antibiotika (z.B. Daktinomyzin (früher: Aktinomyzin), Bleomyzin, Mithramyzin und Anthramyzin (AMC)) und antimitotische Mittel (beispielsweise Vincristin und Vinblastin).
Andere bevorzugte Beispiele für therapeutische Zytotoxine, die mit dem Antikörper gemäß der Erfindung konjugiert werden können, sind Duokarmizine, Kalicheamizine, Maytansine und Auristatine und Derivate davon. Zum Beispiel ist das „Kalicheamizin-Antikörper“-Konjugat komerziell erreichbar (Mylotarg^®; Wyeth-Ayerst).
Die Zytotoxine können gemäß der Erfindung mit den Antikörpern unter Verwendung einer den Spezialisten bekannten Linker-Technologie konjugiert werden. Beispiele für die Linker, die verwendet werden können, um ein Zytotoxin an einen Antikörper zu konjugieren, umfassen ohne darauf beschränkt zu sein, Linker, die Hydrazone, Thioäther, Ester, Disulfide und Peptide enthalten. Zum Beispiel kann ein Linker ausgewählt werden, das anfällig für die Spaltung bei niedrigen pH-Wert im lysosomalen Kompartiment oder für die Spaltung durch Proteasen empfindlich ist, wie solche Proteasen, die hauptsächlich in Tumorgeweben exprimiert sind, wie beispielsweise Kathepsine (z.B. Kathepsine B, C, D).
Eine ausführlichere Beschreibung der Arten von Zytotoxinen, Linkern und Verfahren zur Konjugation von therapeutischen Wirkstoffen und Antikörpern kann ebenfalls in Publikationen gefunden werden Saito, G. et al., 2003, Adv. Drug Deliv. Rev. 55:199-215; Trail, P.A. et al., 2003, Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337; Payne, G., 2003, Cancer Cell 3:207-212; Allen, T.M., 2002, Wat. Rev. Cancer 2:750-763; Pastan, I. and Kreitman, R. J., 2002, Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089-1091; Senter, P.D. и Springer, C.J., 2004, Adv. Drug Deliv. Rev. 53:247-264.
Die Antikörper können auch gemäß der Erfindung an ein radioaktives Isotop konjugiert werden, um zytotoxische radiopharmazeutische Mittel, auch als Radioimmunkonjugate genannt, zu erzeugen. Beispiele für radioaktive Isotope, die an die Antikörper zur ihre Verwendung bei der Diagnose oder Therapie konjugiert werden können, sind aber nicht darauf beschränkt Jod-131, Jod-125, Indium-111, Yttrium-90 und Lutetium-177. Das Verfahren zur Gewinnung von Radioimmunkonjugaten ist von Fachleuten gut entwickelt.
Beispiele für Radioimmunkonjugate sind komerziell erreichbare Radioimmunkonjugate, einschließlich Zevalin^® (IDEC Pharmaceuticals) und Bexxar^® (Corixa Pharmaceuticals), und für Herstellung von Radioimmunkonjugaten unter Verwendung der Antikörper gemäß der Erfindung können ähnliche Verfahren verwendet werden.
Die Antikörperkonjugate können gemäß der Erfindung verwendet werden, um diese biologische Antwort zu modifizieren, und die Wahl des Arzneimittels muss nicht auf die klassischen chemischen therapeutischen Wirkstoffe beschränkt sein. Somit kann das Arzneimittel beispielsweise ein Protein oder ein Polypeptid mit der erforderlichen biologischen Aktivität sein. Solche Proteine können zum Beispiel ein enzymatisch aktives Toxin oder ein aktives Fragment davon sein, wie beispielsweise Abrin, Rizin A, Pseudomonas Exotoxin oder Diphtherietoxin; ein solches Protein wie Tumornekrosefaktor oder Interferon; oder Modifikatoren von biologischen Antworten, wie beispielsweise Lymphokine, Interleukin-1 (IL-1), Interleukin-2 (IL-2), Interleukin-6 (IL-6), Granulozyten-Makrophagen koloniestimulierender Faktor (GM-CSF), Granulozyten koloniestimulierender Faktor (G-CSF) oder andere Wachstumsfaktoren. Verfahren zum Konjugieren von derartigeren therapeutischen Wirkstoffen an die Antikörper sind den Spezialisten gut bekannt, siehe z. B. Arnon et al., „Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy," Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al, „Antibodies For Drug Delivery," Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, „Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review," in Monoclonal Antibodies '84: Biological and Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506, 1985; „Analysis, Results and Future Prospective of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy," in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection and Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985) und Thorpe et al., „The Preparation and Cytotoxic Properties Of Antibodiy-Toxin Conjugates," Immunol. Rev., 62:119-58, 1982.
Bispezifische Moleküle
In einem anderen Aspekt ist die vorliegende Erfindung auf bispezifische Moleküle gerichtet, die einen anti-FGFR1-Antikörper gemäß der Erfindung oder ein Fragment davon umfassen. Der Antikörper gemäß der Erfindung oder sein antigenbindender Teil kann derivatisiert oder an ein anderes funktionelles Molekül angeheftet sein, beispielsweise an ein anderes Peptid oder Protein (z. B. an einen anderen Antikörper oder Rezeptor), um ein bispezifisches Molekül zu erzeugen, das an mindestens zwei verschiedene Bindungsstellen oder an Zielmoleküle bindet. Der Antikörper kann gemäß der Erfindung tatsächlich derivatisiert oder an mehr als ein anderes funktionelles Molekül gebunden sein, um multispezifische Moleküle zu erzeugen, die an mehr als zwei verschiedene Bindungsstellen und/oder an Zielmoleküle binden; und solche multispezifischen Moleküle sind ebenfalls in der Definition des Begriffs „bispezifisches Molekül“ enthalten. Um ein bispezifisches Molekül gemäß der Erfindung zu erzeugen, kann der Antikörper gemäß der Erfindung funktionell (z. B. durch chemische Bindung, Genbindung, nichtkovalente Bindung oder ein anderes Bindungsverfahren) an ein oder mehrere andere Bindungsmoleküle, wie einen anderen Antikörper, Antikörperfragment, Peptid oder Bindemimetikum gebunden sein, um das gewünschte bispezifische Molekül zu erhalten. Dementsprechend umfasst die vorliegende Erfindung bispezifische Moleküle mit mindestens einer ersten Bindungsspezifität an FGFR1 und einer zweiten Bindungsspezifität für ein zweites Ziel-Epitop. In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung ist das zweite Ziel-Epitop, ein Fc-Rezeptor, beispielsweise humanes FcүRI angegeben. Daher umfasst die vorliegende Erfindung bispezifische Moleküle, die kapabel sind, an FcүRI exprimierende Effektorzellen (z. B. Monozyten, Makrophagen oder polymorphonukleäre Zellen (PMNCs)) und an den FGFR1 exprimierenden Zielzellen zu binden. Solche bispezifischen Moleküle tragen die FGFR1-exprimierenden Zellen zu Effektorzellen und stimulieren Fc-Rezeptor-vermittelte Effektorzellaktivität, wie Phagozytose von FGFR1-exprimierenden Zellen, Antikörper-abhängige zellvermittelte Zytotoxizität (ADCC), Zytokinfreisetzung oder Superoxid-Anionbildung. In einer Ausführungsform der Erfindung, in der das bispezifische Molekül multispezifisch ist, kann das Molekül neben der Bindungsspezifität an Fc und der Bindungsspezifität an FGFR1 zusätzlich eine dritte Bindungsspezifität aufweisen. In einer Ausführungsform der Erfindung weist eine solche dritte Bindungsspezifität ein gegen den Stimulationsfaktor (EF) gerichteter Bereich auf, beispielsweise ein Molekül, das an dem an zytotoxischer Aktivität beteiligten Oberflächenprotein bindet und dadurch die Immunantwort gegen die Zielzelle verstärkt. Ein solcher „gegen den Stimulationsfaktor Bereich“ kann ein Antikörper, ein Fragment des funktionellen Antikörpers oder ein Ligand sein, der an ein gegebenes Molekül, beispielsweise ein Antigen oder einen Rezeptor bindet und dadurch die Bindung von Epitopen für Fc-Rezeptor oder Zielzellen-Antigen verstärkt. Solcher „gegen den Stimulationsfaktor Bereich“ kann an den Fc-Rezeptor oder das Antigen einer Zielzelle binden. Alternativ kann der „gegen den Stimulationsfaktor Bereich“ an ein Molekül binden, das sich von dem Molekül unterscheidet, an das die Bereiche mit der ersten und zweiten Bindungsspezifität binden. Zum Beispiel kann ein Teil des gegen Stimulationsfaktor-Antikörpers an eine zytotoxische T-Zelle binden (z. B. durch CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD40, ICAM-1 oder andere Immunzellen), was zu einer Erhöhung der Immunantwort gegen die Zielzelle führt. In einer Ausführungsform der Erfindung umfassen die bispezifischen Moleküle gemäß der Erfindung mindestens einen Antikörper oder ein Fragment davon als ein Molekül mit Bindungsspezifität, einschließlich zum Beispiel Fab, Fab', F(ab')2/Fv, Fd, dAb oder einkettiges Fv. Der Antikörper kann auch ein Leichtketten- oder Schwerketten-Dimer oder ein beliebiges Minimalfragment davon, wie Fv, oder eine einzelkettige Konstruktion, wie im Patent US4946778 , Ladner et al. beschrieben, sein. In einer Ausführungsform der Erfindung wird die Bindungsspezifität an den Fc-Rezeptor durch einen monoklonalen Antikörper bereitgestellt, dessen Bindung nicht durch humanes Immunglobulin (IgG) blockiert wird. Der hier verwendete Begriff „IgG-Rezeptor“ bedeutet jedes der acht Gene, die die ү-Kette kodieren und auf dem Chromosom 1 lokalisiert sind. Diese Gene kodieren nur zwölf Transmembran- oder lösliche Rezeptor-Isoformen, die in drei Klassen von Fcy-Rezeptoren klassifiziert sind: FcүRI (CD64), FcүRII (CD32) und FcүRIII (CD16). In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der Fcy-Rezeptor humanes hochaffines FcүRI. Human-FcүRI ist ein 72 kDa-Molekül, das eine hohe Affinität für das monomer IgG (108-109 M-1) aufweist. Die Herstellung und Charakterisierung einiger bevorzugter monoklonaler Anti-Fc bei den Antikörpern ist in der internationalen Anmeldung WO 88/00052 , Fanger et al. beschrieben, und auch im Patent US4954617 . Diese Antikörper binden an das Epitop FcүRI, FcүRII oder FcүRIII an einer Stelle, die sich von der Fcy-Bindungsstelle des gegebenen Rezeptors unterscheidet, und daher wird ihre Bindung durch das IgG im physiologischen Bereich nicht wesentlich blockiert.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Bindungsspezifität an den humanen Fc-Rezeptor durch einen Antikörper bereitgestellt, der an einen IgA-Rezeptor bindet, beispielsweise einen Fcα-Rezeptor (FcαRI, CD89), dessen Bindung vorzugsweise nicht durch humanes Immunglobulin A (IgA) blockiert ist. Der hier verwendete Begriff „IgA-Rezeptor“ bedeutet ein beliebiges Genprodukt, das durch ein einzelnes Alpha-Gen (FcαRI) kodiert wird, das auf dem Chromosom 19 lokalisiert ist. Es ist bekannt, dass dieses Gen mehrere alternativ gespleißte Transmembran-Isoformen mit einer Größe von 55 bis 110 kDa kodiert. FcαRI (CD89) wird konstitutiv auf Monozyten/Makrophagen, auf eosinophilen und neutrophilen Granulozyten exprimiert, jedoch nicht auf Populationen von Nicht-Effektorzellen. FcαRI hat eine neutrale Affinität (5x107 M-1) für beide IgA1 und IgA2, welche durch die Wirkung von Zytokinen, wie z. B. G-CSF oder GM-CSF erhöht (Morton, H.C. et al., 1996, Critical Reviews in Immunology 16:423-440). Vier FcαRI-spezifische monoklonale Antikörper wurden beschrieben, die als Antikörper A3, A59, A62 und A77 identifiziert sind, die an den FcαRI-Rezeptor binden, der außerhalb der IgA Ligand bindeten Domäne lokalisiert ist (Monteiro, R.C. et al., 1992, J. Immunol. 148:1764). und FcαRI sind die bevorzugten stimulierenden Rezeptoren, die in den bispezifischen Molekülen der Erfindung verwendet werden, da sie (1) hauptsächlich auf Immuneffektorzellen exprimiert werden, beispielsweise Monozyten, PMN, Makrophagen und dendritischen Zellen; (2) werden auf hohen Niveaus exprimiert (beispielsweise 5000 bis 100.000 pro Zelle); (3) sind Mediatoren zytotoxischer Aktivität (z. B. ADCC, Phagozytose) und (4) vermitteln ein erhöhtes Niveau der Präsentation von Antigenen, einschließlich von gerichteten Autoantigenen.
Obwohl bevorzugte Antikörper sind menschliche monoklonale, jedoch kann in den bispezifischen Molekülen der Erfindung verwendet werden, und andere Antikörper, die sind murine, chimäre und humanisierte monoklonale Antikörper. Bispezifischen Moleküle der Erfindung können durch Konjugieren von Molekülen mit Bindungsspezifitäten hergestellt werden, beispielsweise mit FcR und FGFR1, bekannt unter Verwendung von in der Technik. Zum Beispiel kann jedes bispezifische Molekül mit Bindungsspezifität getrennt hergestellt werden, und dann können alle diese Moleküle miteinander konjugiert werden. Wenn Moleküle, die Bindungsspezifitäten Proteine oder Peptide sind, für die kovalente Bindung kann eine Anzahl von Bindungsmittel oder Vernetzungsmittel verwendet werden. Beispiele für Vernetzungsmittel schließen Protein A, Carbodiimid, N-Succinimidyl-3-acetyl-thioacetat (SATA), 5,5'-Dithiobis (2-nitrobenzoesäure) (DTNB), o-Phenylendimaleimid (OPDM), N-Succinimidyl-3 - (2-pyridyldithio) propionat (SPDP) und sulfosuktsini-midil-4- (N-maleimidomethyl) cyclohexan-1-carboxylat (sulfo-SMCC) (siehe beispielsweise Karpovsky et al, 1984, J. Exp Med .... 160: 1686; Liu, MA et al, 1985, Proc Natl Acad Sci USA 82: 8648) ...... Andere Methoden sind die von Paulus, 1985, Behring Ins. Mitt. Nr. 78, 118-132; Brennan et al., 1985, Science 229: 81-83 und Glennie et al., 1987, J. Immunol. 139: 2367-2375. Bevorzugte Konjugationsmittel sind SATA und Sulfo-SMCC, erhältlich von Pierce Chemical Co. (Rockford, IL). Wenn die spezifischen Bindungsmoleküle Antikörper sind, können sie über Sulfhydryl-Bindungen mit C-terminalen Hinge-Regionen der beiden schweren Ketten konjugiert werden. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Gelenkregion modifiziert, um eine ungerade Anzahl von Sulfhydryl-Resten, vorzugsweise ein Rest, und dann die Konjugation durchgeführt. Alternativ dazu können beide spezifischen Bindungsmoleküle im selben Vektor kodiert werden und können in der gleichen Wirtszelle exprimiert und getestet werden. Dieses Verfahren ist besonders geeignet in dem Fall, wenn das bispezifische Molekül ein Fusionsprotein mAb-mAb, mAb-Fab, Fab-F (ab ,) 2 oder Fab-Ligand ist. Bispezifisches Molekül der Erfindung kann einzelsträngige Molekül einen Einzelketten-Antikörper und ein Bindungs Determinante oder ein einkettiges bispezifisches Molekül, das zwei Bindungsdeterminanten umfaßt sein. Bispezifische Moleküle können mindestens zwei einkettige Moleküle enthalten. Verfahren zur Herstellung von bispezifischen Moleküle sind beispielsweise in dem Patent US5260203 beschrieben sind; im US-Patent Nr. 5,455,030 ; im US-Patent Nr. 4,881,175 ; in dem US-Patent Nr. 5,132,405 ; im US-Patent Nr. 5,091,513 ; in Patent US5476786 ; im US-Patent Nr. 5,013,653 ; im US-Patent Nr. 5,258,498 und im US-Patent Nr. 5,482,858 . Die Bindung der bispezifischen Moleküle auf ihre spezifischen Ziele kann beispielsweise bestätigt werden, unter Verwendung von ELISA (ELISA), Radioimmunoassay (RIA), FACS-Analyse, Bioassay (z.B. Wachstumshemmung) oder Western-Blot-Analyse. Jeder dieser Assays detektieren im Allgemeinen die Anwesenheit von besonderem Interesse Komplexe „Antikörper-Protein“ unter Verwendung eines markierten Reagenzes (beispielsweise ein Antikörper), spezifisch für den Komplex von Interesse. Zum Beispiel können die FcR-Antikörper-Komplexe nachgewiesen werden, unter Verwendung von beispielsweise einem Enzym verknüpft Antikörper oder Antikörperfragment, das diese Komplexe erkennt, „Antikörper-FcR» und spezifisch an sie binden. Alternativ können solche Komplexe durch irgendeinen einer Anzahl anderer Immunoassays nachgewiesen werden. Zum Beispiel kann der Antikörper radioaktiv markiert werden, und kann in der Radioimmunoassay (RIA) verwendet werden (siehe., Z. B. Weintraub Veröffentlichung, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course an Radioligand Assay-Techniken, The Endocrine Society, März 1986). Ein radioaktives Isotop kann durch einen ү-Zähler oder einen Szintillationszähler oder durch Autoradiographie nachgewiesen werden.
Pharmazeutische Zusammensetzungen
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung, wie beispielsweise eine pharmazeutische Zusammensetzung einen monoklonalen Antikörper der Erfindung oder ein Antigen-bindenden (n) Teil (e) oder Kombinationen davon, in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger enthält. Solche Zusammensetzungen können einen einzigen Antikörper oder eine Kombination davon umfassen (beispielsweise zwei oder mehr verschiedene Antikörper) oder Immunokonjugate oder bispezifischen Moleküle der Erfindung. Beispielsweise kann die pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung, eine Kombination von Antikörpern umfassen (oder Immunkonjugate oder bispezifische Moleküle), die an verschiedene Epitope auf dem Zielantigen binden oder zusätzliche Aktivität aufweisen. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen gemß der Erfindung können auch in Kombinationstherapien verwendet werden, d. H. Sie können in Kombination mit anderen Mitteln verabreicht werden. Beispielsweise kann die Kombinationstherapie der Verabreichung von anti-FGFR1-Antikörper nach der Erfindung in Kombination umfasst, die mit mindestens einem anderen entzündungshemmenden oder immunsuppressiven Mitteln. Beispiele für Therapeutika, die in einer Kombinationstherapie verwendet werden können, werden nachstehend im Abschnitt über die Verwendung von Antikörpern der Erfindung näher beschrieben. Der Begriff „pharmazeutisch annehmbare Träger“, wie hierin verwendet, schließt jedes und alle Lösungsmittel, Dispersionsmedien, Beschichtungsmaterialien, antibakterielle und antifungale Mittel, Substanzen, isotonische und Substanzen, die die Absorption verzögern, und dergleichen, die physiologisch kompatibel sind. Typischerweise ist ein solcher Träger für die intravenöse, intramuskuläre, subkutane, parenterale, intradermale oder intraspinale Verabreichung (z.B. durch Injektion oder Infusion) geeignet. In Abhängigkeit von der Art der Verabreichung kann die aktive Verbindung, das heißt Antikörper, Immunkonjugat oder bispezifisches Molekül, kann mit einem Material beschichtet werden, die die Verbindung vor der Wirkung von Säuren und anderen Umgebungsbedingungen schützt, die die Verbindung inaktivieren können. Die pharmazeutischen Verbindungen der Erfindung können ein oder mehrere pharmazeutisch verträgliche Salze einschließen. Der Begriff „pharmazeutisch annehmbares Salz“ bedeutet ein Salz, das die gewünschte biologische Aktivität der Stammverbindung beibehält und besitzt keine unerwünschten toxischen Wirkungen (siehe beispielsweise Berge, SM, et al, 1977, J. Pharm Sci 66: 1 .... -19). Beispiele für solche Salze sind Säureadditionssalze und Basenadditionssalze. Säureadditionssalze schließen Salze, abgeleitet von nicht-toxischen anorganischen Säuren, wie Salzsäure, Salpetersäure, Phosphorsäure, Schwefelsäure, Bromwasserstoffsäure, lodwasserstoffsäure, Phosphorsäure und dergleichen, sowie von nicht toxischen organischen Säuren wie aliphatischen Mono- und Dicarbonsäuren, Phenyl, substituierten Alkansäuren, Hydroxyalkansäuren, aromatische Säuren, aliphatische und aromatische Sulfonsäuren, usw. Basenadditionssalze beinhalten solche, die aus Erdalkalimetallen abgeleitet ist, wie Natrium, Kalium, Magnesium, Calcium und dergleichen, sowie von nicht toxischen organischen Aminen, wie N, N'-Dibenzylethylendiamin, N-Methylglucamin, Chlorprocain, Cholin Diethanolamin, Ethylendiamin, Procain und dergleichen. Die pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung kann auch ein pharmazeutisch verträgliches Antioxidans einschließen. Beispiele für pharmazeutisch verträgliche Antioxidantien umfassen: (1) wasserlösliche Antioxidantien, wie Ascorbinsäure, Cysteinhydrochlorid, Natriumbisulfat, Natriummetabisulfit, Natriumsulfit, etc... (2) öllösliche Antioxidantien, wie Ascorbylpalmitat, butyliertes Hydroxyanisol (BHA), butyliertes Hydroxytoluol (BHT), Lecithin, Propylgallat, α-Tocopherol, etc. und (3) Mittel, die Chelatkomplexe mit Metallen, wie Citronensäure bilden, Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), Sorbitol, Weinsäure, Phosphorsäure, usw.
Beispiele für geeignete wässrige und wasserfreie Träger, die in den pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung verwendet werden können, sind Wasser, Ethanol, Polyole (wie Glycerin, Propylenglykol, Polyethylenglykol und dergleichen) und geeignete Mischungen davon, Pflanzenöle wie Olivenöl, und organische Ester zur Injektion, wie Ethyloleat. Die gewünschte Fließfähigkeit kann beispielsweise durch Beschichten mit Materialien wie Lecithin, Beibehalten der gewünschten Teilchengröße im Falle von Dispersionen und Verwendung von Tensiden aufrechterhalten werden. Diese Zusammensetzungen können auch Adjuvantien wie Konservierungsmittel, Netzmittel, Emulgatoren und Dispergiermittel enthalten. Schutz gegen Mikroorganismen kann beispielsweise durch Sterilisation oder durch Einbringen verschiedener antibakterieller und antimykotischer Mittel, beispielsweise Paraben, Chlorbutanol, Phenolsorbinsäure und dergleichen, erreicht werden. Es kann auch wünschenswert sein, der Zusammensetzung Isotoniemittel wie Zucker, Natriumchlorid und dergleichen zu verabreichen. Zusätzlich kann eine verlängerte Absorption der pharmazeutischen Zubereitung für die Injektion erreicht werden, indem absorptionsverzögernde Substanzen wie Aluminiummonostearat und Gelatine eingeschlossen werden. Pharmazeutisch verträgliche Träger sind sterile wässrige Lösungen oder Dispersionen und sterile Pulver zur schnellen Herstellung von sterilen injizierbaren Lösungen oder Dispersionen. Die Verwendung solcher Medien und Mittel zur Herstellung von pharmazeutisch aktiven Substanzen ist dem Fachmann bekannt. In den pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung können beliebige Standardmedien oder -mittel verwendet werden, mit Ausnahme derjenigen, die mit dieser aktiven Verbindung inkompatibel sind. Zu solchen Zusammensetzungen können auch zusätzliche aktive Verbindungen gegeben werden. Therapeutische Zusammensetzungen sollten unter den Bedingungen ihrer Herstellung und Lagerung steril und stabil sein. Solche Zusammensetzungen können als eine Lösung, Mikroemulsion, Liposom oder andere geordnete Strukturen formuliert werden, die zum Erreichen hoher Wirkstoffkonzentrationen geeignet sind. Der Träger kann ein Lösungsmittel oder Dispersionsmedium sein, das beispielsweise Wasser, Ethanol, ein Polyol (z. B. Glycerin, Propylenglycol und flüssiges Polypropylenglycol und dergleichen) und geeignete Gemische davon enthält. Die gewünschte Fließfähigkeit kann beispielsweise durch Beschichten mit Materialien wie Lecithin, Beibehalten der gewünschten Teilchengröße im Falle von Dispersionen und Verwendung von Tensiden aufrechterhalten werden.
Sterile injizierbare Lösungen können hergestellt werden, indem die aktive Verbindung in das geeignete Lösungsmittel in der erforderlichen Menge, falls für sich allein genommen oder in Kombination mit den oben aufgeführten Bestandteilen, falls erforderlich, gefolgt von Mikrofiltration durch Sterilisation, eingearbeitet wird. Dispersionen werden üblicherweise hergestellt, indem die aktive Verbindung in ein steriles Vehikel eingearbeitet wird, das ein basisches Dispersionsmedium und andere notwendige Bestandteile aus den oben aufgeführten Bestandteilen enthält. Im Fall von sterilen Pulvern, die für die Herstellung von sterilen injizierbaren Lösungen vorgesehen sind, sind die bevorzugten Verfahren zur Herstellung solcher Präparate Vakuumtrocknen und Gefriertrocknen (Lyophilisieren), wobei ein Pulver, bestehend aus dem aktiven Bestandteil und irgendeinem anderen gewünschten Bestandteil, aus der vorher steril filtrierten Lösung erhalten wird.
Die Menge an aktivem Bestandteil, die mit der Trägersubstanz für die Herstellung einer einzelnen Dosierungsform kombiniert werden kann, kann in Abhängigkeit von dem zu behandelnden Individuum und von der speziellen Art der Verabreichung variieren. Die Menge an Wirkstoff, die mit einer Trägersubstanz kombiniert werden, um eine einzelne können Dosierungsform zu produzieren steht im Allgemeinen für die Menge in der Zusammensetzung enthalten, die eine therapeutische Wirkung erzeugt. Im Allgemeinen ist eine Menge, bezogen auf 100% der Gesamtmenge der Zusammensetzung liegt im Bereich von etwa 0,01 bis 99% Wirkstoffe, vorzugsweise von etwa 0,1 bis 70% und am meisten bevorzugt von etwa 1 bis 30% Wirkstoffe in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger. Das Medikamentenregime wird so ausgewählt, dass die optimale gewünschte Reaktion erreicht wird (z. B. eine therapeutische Reaktion). So kann beispielsweise eine Schockdosis oder mehreren unterteilten Dosen für eine bestimmte Zeitdauer oder die Dosis kann in Abhängigkeit von den therapeutischen Indikationen kann proportional reduziert oder erhöht, verabreicht werden.
Verabreichung zu erleichtern und eine gleichmäßige Dosierung besonders bevorzugte Zusammensetzung für die parenterale Verabreichung gewährleisten ist eine Einheitsdosierungsform. Wie hier verwendet, bedeutet der Ausdruck „Einheitsdosisform“ physikalisch getrennte Einheiten, geeignet für Einzelverabreichungsdosis an ein Individuum zu behandeln; jede solche Einheit enthält eine vorbestimmte Menge der aktiven Verbindung, die notwendig ist, um die gewünschte therapeutische Wirkung in Kombination mit einem geeigneten pharmazeutischen Träger zu erzielen. Die Spezifikation für die Dosierungseinheitsformen der Erfindung wird durch solche Faktoren bestimmt, und abhängig direkt von solchen Faktoren wie (a) die einzigartigen Eigenschaften der aktiven Verbindung und besonders erreichbarer therapeutischer Wirkung und (b) die von den Fachleuten in der Herstellung solcher Wirkstoffe auftretenden Einschränkungen und werden im Zusammenhang mit Empfindlichkeit des Individuums für die verwendete Behandlung. Dosen des Antikörpers verabreicht werden, im Bereich von etwa 0,0001 bis 100 mg / kg, in der Regel 0,01 bis 25 mg / kg Körpergewicht des Wirts. Beispielsweise können diese Dosierungen von 0,3 mg / kg Körpergewicht, 1 mg / kg Körpergewicht, der 3 mg / kg Körpergewicht, 5 mg / kg Körpergewicht oder 10 mg / kg Körpergewicht oder im Bereich von 1-10 sind mg / kg. Falls erforderlich, kann es eine höhere Dosis verabreicht werden, wie beispielsweise 15 mg / kg Körpergewicht, 20 mg / kg Körpergewicht oder 25 mg / kg Körpergewicht.
Repräsentative Behandlungsschema umfasst eine Dosis von einmal pro Woche verabreicht, einmal alle zwei Wochen, einmal alle drei Wochen, einmal alle vier Wochen, einmal im Monat, einmal alle 3 Monate oder einmal alle 3-6 Monate. Ein bevorzugtes Schema eines Antikörpers der Erfindung umfasst eine intravenöse Verabreichung von 1 mg / kg Körpergewicht oder 3 mg / kg Körpergewicht, wobei der Antikörper gemäß einem der folgenden Dosierungsschemata verabreicht wird: (i) alle vier Wochen für 6 Dosen, dann durch alle drei Monate; (ii) alle drei Wochen; (iii) eine Einzeldosis von 3 mg / kg Körpergewicht und anschließend eine Dosis von 1 mg/kg Körpergewicht alle drei Wochen.
In einigen Verfahren gleichzeitig verabreicht werden zwei oder mehr monoklonale anti- FGFR1-Antikörper gemäß der Erfindung mit unterschiedlichen Bindungsspezifitäten, und in diesem Fall die Dosierung jeden Antikörpers innerhalb der angegebenen Werte verabreicht wird. Der Antikörper wird im Allgemeinen in mehreren Dosen verabreicht. Einzeldosen können in Abständen von einmal pro Woche, einmal im Monat, alle drei Monate oder einmal pro Jahr verabreicht werden. Die Dosierungsintervalle können auch unregelmäßig sein und können entsprechend den gemessenen Konzentrationen des Antikörpers gegen das Zielantigen im Blut des Patienten eingestellt werden. Bei einigen Verfahren kann die Dosis angepasst werden, um eine Plasma-Antikörper-Konzentration von zwischen etwa 1-1000 ug / ml, und in einigen Verfahren etwa 25-300 ug / ml zu erreichen. Bei anderen Verfahren werden ein oder mehr monoklonale Anti-FGFR1-Antikörper nach der Erfindung wird gleichzeitig mit einem Antikörper mit unterschiedlichen Bindungsspezifitäten, beispielsweise mit einem Antikörper, wie anti-CTLA-4-Antikörper und / oder anti-PD-1-Antikörper verabreicht und in diesem Fall wird jeder Antikörper in einer Dosis verabreicht, deren Menge innerhalb der angegebenen Bereiche liegt. Alternativ kann der Antikörper als Zubereitung mit verzögerter Freisetzung verabreicht werden, und in diesem Fall ist eine weniger häufige Verabreichung erforderlich. Die Dosis und die Häufigkeit der Verabreichung variieren in Abhängigkeit von der Halbwertszeit des Antikörpers im Körper des Patienten. Im Allgemeinen haben menschliche Antikörper die längste Halbwertszeit, gefolgt von humanisierten Antikörpern, chimären Antikörpern und nicht-humanen Antikörpern. Die Dosis und Häufigkeit der Verabreichung kann variieren, abhängig davon, ob die Behandlung prophylaktisch oder therapeutisch ist. Bei der präventiven Anwendung wird eine relativ niedrige Dosis an Antikörper in relativ großen Intervallen über einen langen Zeitraum verabreicht. Einige Patienten werden während ihres gesamten Lebens behandelt. Bei therapeutischen Anwendungen können manchmal in relativ kurzen Abständen zu verlangsamen oder das Fortschreiten der Krankheit zu stoppen, und vorzugsweise ist die Einführung von relativ hohen Dosierung erforderlich, bis der Patient wird nicht beobachtet Dämpfung teilweise oder vollständige Verschwinden der Symptome werden. Dann kann dem Patienten eine vorbeugende Behandlung verordnet werden. Die tatsächliche Dosis der aktiven Bestandteile in den pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung können eine Menge an Wirkstoff zu erhalten, variiert werden, dass die gewünschte therapeutische Antwort bei einem bestimmten Patienten mit einem entsprechenden Teil der Zusammensetzung und dem entsprechenden Verfahren zu seiner Einführung zu erreichen wirksam ist, und das keine toxische Wirkung auf den Patienten. Auswahl der Dosen hängt von einer Reihe von pharmakokinetischen Faktoren, einschließlich der Aktivität der spezifischen Zusammensetzungen gemäß der Erfindung verwendet wird oder deren Ester, Salze oder Amide, die Art der Verabreichung, der Verabreichungszeit, der Ausscheidungsrate der spezifischen verwendeten Verbindung, die Dauer der Behandlung, die Anwesenheit von anderen Arzneimitteln, Verbindungen und / oder Substanzen, in Kombination mit diesen Zusammensetzungen verwendet, sowie auf Alter, Geschlecht, Körpergewicht, Schwere der Krankheit, allgemeinem Gesundheitszustand und Krankengeschichte des Patienten, der behandelt wird und von anderen Faktoren, die den Fachärzten bekannt sind.
Eine „therapeutisch wirksame Dosis“ von anti-FGFR1-Antikörper nach der Erfindung hilft im Allgemeinen die Schwere der Krankheitssymptome, eine Zunahme der Häufigkeit und Dauer der Remission der Krankheit oder Verhinderung der Beeinträchtigung oder Behinderung von dieser Krankheit zu reduzieren. Zum Beispiel für die Behandlung von FGFR1 + -opuholey, „therapeutisch wirksame Dosis“ vorzugsweise hemmt das Zellwachstum oder Tumor um mindestens etwa 20%, stärker bevorzugt mindestens etwa 40%, noch stärker bevorzugt mindestens etwa 60% und am bevorzugtesten mindestens etwa 80% im Vergleich zu unbehandelten Individuen. Die Fähigkeit einer Verbindung, das Tumorwachstum zu hemmen, kann mit einem vorhersagbaren menschlichen Modell des aktiven Tumorwachstums auf einem Tier, ausgewertet werden. Alternativ kann diese Eigenschaft einer Zusammensetzung kann durch die Bestimmung der Fähigkeit einer Verbindung bewertet werden, um Tumorwachstum zu hemmen, wobei eine solche Hemmung in vitro-Assays ist den Praktikern bekannt durchgeführt. Eine therapeutisch wirksame Dosis der therapeutischen Verbindung kann Tumorgrße oder Schwächungs andere Symptome im Individuum reduzieren. Ein Fachmann auf dem Gebiet kann die gewünschte Menge auf der Grundlage von Faktoren wie beispielsweise das individuelle Körpergewicht, der Schwere der Symptome der Erkrankung, der speziellen Zusammensetzung der Zusammensetzung oder Art der Verabreichung, unabhängig ausgewählt bestimmen. Die Zusammensetzung nach der Erfindung kann mit einem oder mehreren Wegen verabreicht wird, nach einem Verfahren im Stand der Technik gut bekannt. Wie dem Fachmann bekannt ist, können die Route und / oder der Verabreichungsweg in Abhängigkeit von den gewünschten Ergebnissen variieren. Bevorzugte Verfahren zur Verabreichung des Antikörpers der Erfindung umfassen die intravenöse, intramuskuläre, intradermale, intraperitoneale, subkutane und intraspinale Verabreichung oder andere parenterale Verabreichungsmethoden, beispielsweise durch Injektion oder Infusion. Der Begriff „parenterale Verabreichung“, wie hierin Modi Verabreichungsmittel verwendet, außer intrakolische und topische Verabreichung, gewöhnlich durch Injektion durchgeführt, und solche Verfahren umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, intravenös, intramuskulär, intraarteriell, intrathekal, intrakapsuläre, intraorbitale, intrakardiale, intradermale beschränkt, intraperitoneale , transtracheal, subkutan, subepidermale, intraartikuläre, subkapsuläre, subarachnoidale, intraspinale, epidurale und intrasternale Injektions- und Infusion. Alternativ kann durch nicht-parenterale Verabreichung, wie topische oder transepidermalen Verabreichung oder transmukosale Verabreichung, beispielsweise durch intranasale, orale, vaginale, rektale, sublinguale oder topische Verabreichung ein Antikörper der Erfindung kann verabreicht werden.
Die aktiven Verbindungen können in Kombination mit Trägern hergestellt werden, die die Verbindung vor schneller Freisetzung schützen, zum Beispiel können sie als Präparat mit kontrollierter Freisetzung formuliert werden, einschließlich Implantaten, transdermalen Pflastern und mikroverkapselten Abgabesystemen. Biologisch abbaubare und biokompatible Polymere wie Ethylenvinylacetat, Polyanhydride, Polyglykolsäure, Kollagen, Polyorthoester und Polymilchsäure können verwendet werden. Viele Verfahren zur Herstellung solcher Präparate sind patentiert oder im Wesentlichen dem Fachmann bekannt. Siehe beispielsweise Depot- und kontrollierte Arzneimittelfreisetzungssysteme, J.R. Robinson, Hrsg., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978. Therapeutische Zusammensetzungen können unter Verwendung einer dem Fachmann bekannten medizinischen Ausrüstung verabreicht werden. Zum Beispiel kann in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung die therapeutische Zusammensetzung der Erfindung durch eine nadellose hypodermische Vorrichtung, wie sie beispielsweise in den US-Patenten Nr. 5,999,163 ; US5383851 ; US5312335 ; US5064413 ; US4941880 ; US4790824 oder US4596556 . Beispiele für gut bekannte Implantate und Module, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können im US-Patent Nr. 4,487,603 gefunden werden, das eine implantierbare Mikroinfusionspumpe zur Verabreichung eines Arzneimittels mit einer kontrollierten Rate beschreibt; im US-Patent Nr. 4,486,194 , das eine therapeutische Vorrichtung zur transdermalen Verabreichung von Medikamenten offenbart; im US-Patent Nr. 4,472,033 , das eine medizinische Infusionspumpe zur Verabreichung eines Arzneimittels mit einer vorbestimmten Infusionsrate beschreibt; in dem US-Patent Nr. 4,472,224 , das eine implantierbare Vorrichtung für die kontinuierliche Infusion eines Arzneimittels bei verschiedenen Strömungsraten beschreibt; im US-Patent Nr. 4,439,196 , das ein osmotisches Arzneimittelabgabesystem mit Mehrkammerabteilen offenbart; und US-Patent Nr. 4,475,196 , das ein osmotisches Abgabesystem für ein Medikament offenbart. Diese Patente sind hierin durch Bezugnahme eingeschlossen. Viele andere ähnliche Implantate, Zuführsysteme und Module sind dem Fachmann bekannt.
In einigen Ausführungsformen können die humanen monoklonalen Antikörper der Erfindung so hergestellt werden, dass sie eine geeignete in vivo-Verteilung aufweisen. So erlaubt beispielsweise die Blut-Hirn-Schranke (BHS) nicht den Durchgang vieler stark hydrophiler Verbindungen. Damit die erfindungsgemäßen therapeutischen Verbindungen (falls erforderlich) die BHS passieren können, können sie beispielsweise in Form von Liposomen hergestellt werden. Verfahren zur Herstellung von Liposomen sind beispielsweise in den US-Patenten 4,422,811 ; US 5374548 und US 5399331 . Liposome können ein oder mehrere Moleküle enthalten, die selektiv zu spezifischen Zellen oder Organen transportiert werden, was die Wirksamkeit der gerichteten Arzneimittelabgabe erhöht (siehe zum Beispiel V. V. Ranade, 1989, J. Clin., Pharmacol. 29: 685). Repräsentative Targeting-Moleküle sind Folat oder Biotin (siehe zum Beispiel US-Patent Nr. 5,416,016 , Low et al.); Mannoside (Umezawa et al., 1988, Biochem., Biophys. Res. Commun., 153: 1038); Antikörper (P. G. Bloeman et al., 1995, FEBS Lett. 357: 140; M. Owais et al., 1995, Antimicrob. Agents Chemother 39: 180); oberflächenaktives Rezeptorprotein A (Briscoe et al., 1995, Am., J. Physiol. 1233: 134); p120 (Schreier et al., 1994, J. Biol. Chem. 269: 9090): siehe auch K. Keinanen; M.L. Laukkanen, 1994, FEBS Lett. 346: 123; J.J. Killion; L.J. Fidler, 1994, Immunomethods 4: 273.
Die Verwendung und Verfahren gemäß der Erfindung
Antikörper, insbesondere humanisierte Antikörper, Antikörper-Zusammensetzungen und Verfahren der Erfindung können in vitro und in vivo in verschiedenen diagnostischen und therapeutischen Zwecken eingesetzt werden, beispielsweise zum Nachweis von FGFR1, für die Krebstherapie oder um die Immunantwort zu verstärken FGFR1 durch Blockierung. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die Antikörper der Erfindung humane Antikörper. Beispielsweise können diese Moleküle in die Zellkultur eingebracht werden, in vitro oder ex vivo, oder Menschen, beispielsweise in vivo, für die Behandlung, Prävention und Diagnose von verschiedenen Erkrankungen oder Immunität in einer Vielzahl von Zuständen zu verbessern. Wie hier verwendet, umfasst der Begriff „Individuum“ Mensch und Tier. Diese Tiere sind alle Wirbeltiere, wie Säugetiere und Nicht-Säugetiere, wie Primaten, nicht menschlich, Schafe, Hunde, Katzen, Kühe, Pferde, Hühner, Amphibien und Reptilien. Der bevorzugte Gegenstand ist ein Mensch, nämlich ein Patient leidet, Störungen im Zusammenhang mit der Expression von FGFR1 verbunden ist, oder in der Notwendigkeit einer verstärkten Immunantwort. Diese Verfahren sind besonders geeignet für die Behandlung einer Person, die an einer Störung leidet, die mit einer Verletzung der Expression von FGFR1 verbunden ist. Solche Verfahren sind auch besonders geeignet, ein menschliches Leid aus zur Behandlung einer Störung, die durch die Erhöhung des Niveaus der T-Zell-vermittelten Immunantwort behandelt werden kann. Um Antigenspezifische Immunantwort zu verbessern anti-FGFR1-Antikörper kann verabreicht werden, zusammen mit dem Antigen von Interesse zu erreichen. Wenn Antikörper gegen FGFR1 zusammen mit einem anderen Mittel verabreicht werden, können diese beiden Komponenten entweder nacheinander oder gleichzeitig verabreicht werden. Unter Berücksichtigung der Tatsache, dass die Antikörper der Erfindung an FGFR1 spezifisch bindet, ist zu beachten, dass die Antikörper der Erfindung kann für den spezifischen Nachweis von FGFR1-Expression auf der Zelloberfläche verwendet werden, und darüber hinaus können sie durch Immunaffinitätschromatographie an FGFR1 Isolierung verwendet werden.
Maligne Tumoren
FGFR1 wird in verschiedenen humanen malignen Tumoren exprimiert, inklusive nichtkleinzelliges Lungenkarzinom, Mammakarzinom, Magen- und Speiseröhrenkarzinom, Prostatakarzinom, Blasenkarzinom, Kopf- und Halstumoren, Melanom (C. Behrens et al. J Clinical cancer research 14, 19, 2008; M. Koziczak et al. J Oncogene, 23, 20, 2004; K. Freier J Oral Oncology 43, 1, 2007; E. Shin et al. J Cancer Res Clin Oncol. 126, 9, 2000; K. Sugiura et al. J Oncology reports 17, 3, 2007; E. Devilard et al. J BMC Cancer 6, 272, 2006; G. Lefevre et al. J Investigative Ophthalmology and Visual Science 50, 2009).
Anti-FGFR1-Antikörper allein kann zur Hemmung des Tumorwachstums verwendet werden. Alternativ kann der Anti-FGFR1-Antikörper in Kombination mit anderen immunogenen Mitteln, mit Standard-Antikrebs-Therapie oder mit anderen unten beschriebenen Antikörpern verwendet werden. In den durchgeführten Studien (KCRB-L01, WO2011000384 ) wurde die FGFR1-Expression bei Patienten mit Nierenzellkarzinom (RCC = renal cell carcinoma) nachgewiesen. Immunhistochemische Untersuchung wurde an den vom Paraffinblock anfertigten Weiterschnitten der Tumoren bei 140 Patienten mit RCC durchgeführt. Die Ergebnisse wurden mit der FGFR1-Expression bei 40 gesunden Spendern, bei denen zuvor aus verschiedenen Gründen eine Nierenbiopsie ohne späteren Nachweis der Organerkrankungen vorgenommen wurde, verglichen. FGFR1-Expression wurde in 98% der Fälle auf den Zellen des primären Nierentumors und in 82,5% der Fälle auf den Zellen von RCC-Metastasen nachgewiesen. In allen Fällen war die Intensität der Färbung bei der immunhistochemischen Untersuchung hoch (3+), was auf eine starke Expression des Rezeptors hinweist. In 68% der Fälle wurde eine Kernfärbung gewonnen. Die FGFR1-Expression auf den Zellen des gesunden Nierengewebes wurde in einem Fall (2,5%) aufgrund der Färbung der Gefäße nachgewiesen. Somit bestätigte diese Untersuchung die Hypothese über das Aufkommen und hohe Expression von FGFR1 wie auf den Zellen des primären Tumors, als auch in den RCC-Metastasen (I. Tsimafeyeu et al. ESMO-ECCO 09, 2009). Im Rahmen der nachfolgenden Untersuchungen wurde die Konzentration von FGF 1 und 2 als Hauptfaktoren mit der mitogenen Aktivität bei der Bindung mit FGFR1 im Plasma von 38 Patienten mit dem metastatischen RCC vor der Target-Therapie, bei der Krankheitsprogredienz im Rahmen der Target-Therapie, sowie im Plasma von 38 gesunden Freiwilligen (mittels der ELISA-Methode) bestimmt. Es wurde festgestellt, dass die Spiegel der beiden FGF im Blut der gesunden Menschen sicher niedriger waren im Vergleich zu den Patienten mit dem metastatischen RCC. Die größten Unterschiede wurden für FGF 2 (p <0.001) dokumentiert. Bei der Krankheitsprogredienz im Rahmen der Target-Therapie (Sunitinib, Sorafenib) gab es einen deutlichen Anstieg von FGF 2 - um mehr als 50% (p <0,001) und von FGF 1 - um mehr als 30% (p <0,05) im Vergleich zum Ausgangsspiegel von FGF. Im Fall der Effektivität der Target-Therapie wurde keine sichere Veränderung des Spiegels von beiden FGF beobachtet (p = 0,3). Mediane der Konzentration von FGF 2 im Plasma von Patienten mit der Krankheitsprogredienz und ohne zeigte keinen sicheren Unterschied (p <0.001, ). Darüber hinaus wurde im Rahmen dieser Studie das Zielniveau für Sunitinib/Sorafenib - Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) - analysiert. Es wurden keine statistischen Unterschiede bei der Konzentration von VEGF im Plasma von Patienten mit RCC bei der Krankheitsprogredienz während der Therapie im Vergleich zum Ausgangsspiegel (p = 0,2), sowie keine Korrelation mit beiden FGF (p> 0,1) nachgewiesen. Somit sprechen die Ergebnisse der Studien KCRB-L01 und KCRB-L02 dafür, dass der pathologische Weg FGF/FGFR1 in der Entwicklung von RCC nicht nur unabhängig ist, sondern auch die Resistenz gegen die vorhandene Target-Therapie bestimmen kann. Basierend auf dem oben Dargelegten, haben wir angenommen, dass die Blockierung des Weges FGF/FGFR1 zu einer Störung der Proliferation der Tumorzellen und zur Hemmung der Angiogenese führen kann. FGFR1-Antagonisten, inklusive humaner monoklonaler Antikörper, können zur Hemmung des Tumorwachstums und der Tumormetastasen verwendet werden. Außerdem kann die Entwicklung der Konjugate des monoklonalen Antikörpers (seiner Fragmente) gegen FGFR1 und der Kontrastmittel bei der Diagnostik von malignen und anderen Neubildungen, deren Zellen FGFR1 in großen Mengen exprimieren, verwendet werden.
In einem ihrer Aspekte betrifft die vorliegende Erfindung die Behandlung des Individuums in vivo unter Einsatz vom Anti-FGFR1-Antikörper, der das Wachstum der Krebstumoren inhibiert. Zur Inhibierung des Wachstums von Krebstumoren kann nur ein Anti-FGFR1-Antikörper verwendet werden. Alternativ kann der Anti-FGFR1-Antikörper in Kombination mit anderen immunogenen Mitteln, mit der Standard-Antikrebs-Therapie oder mit anderen unten beschriebenen Antikörpern verwendet werden. Dementsprechend gehört die vorliegende Erfindung in einer von ihren Varianten zum Verfahren der Inhibierung des Wachstums von Tumorzellen bei einem Individuum, wobei das angeführte Verfahren die Applikation dem Individuum einer therapeutisch wirksamen Menge des anti-FGFR1-Antikörpers oder eines antigenbindenden Teils davon miteinschließt. Ein bevorzugter Antikörper ist ein humanisierter Anti-FGFR1-Antikörper (z. B. beliebiger der hier beschriebenen humanisierten Antikörper gegen humanen FGFR1). Zusätzlich oder alternativ kann der Antikörper ein chimärer oder humaner Anti-FGFR1-Antikörper sein. Bevorzugte Krebstumoren, deren Wachstum durch die Antikörper gemäß der Erfindung inhibiert werden kann, sind Krebstumoren, die normalerweise gegen eine Immuntherapie sensibel sind. Beispiele von Krebstumoren, die für Therapie mit den Antikörpern bevorzugt sind und diese Erfindung nicht einschränken, sind folgende: Nierenzellkarzinom, Lungenkarzinom, Brustkrebs (z. B. Mammakarzinom), Eierstockkrebs (z. B. Ovarialkarzinom). Beispiele der anderen Tumorerkrankungen, die einer Therapie mittels der Methoden gemäß der Erfindung unterzogen werden können, sind folgende: Melanom (z.B. metastasierendes malignes Melanom), Prostatakarzinom, Dickdarmkarzinom, Knochentumoren, Pankreaskarzinom, Hautkrebs, Hirntumoren, chronische oder akute Leukämie, inklusive akuter myeloischer Leukämie (AML), chronischer myeloischer Leukämie (CML), akuter Lymphoblastenleukämie, chronischer lymphozytärer Leukämie, Lymphome (z.B. Hodgkin-Lymphom und Non-Hodgkin-Lymphom, lymphozytäres Lymphom, primäres ZNS-Lymphom (PZNSL), T-Zellen-Lymphom, Nasenrachenkarzinome, Kopf- und Halskarzinom, malignes Hautmelanom oder intraokuläres Melanom, Uteruskarzinom, Mastdarmkarzinom, Anuskarzinom, Magenkarzinom, Hodenkarzinom, Uteruskarzinom, Tubenkarzinom, Endometriumkarzinom, Zervixkarzinom, Scheidenkarzinom, Vulvakarzinom, Ösophaguskarzinom, Dünndarmkarzinom, Karzinom des endokrinen Systems, Schilddrüsenkarzinom, Nebenschilddrüsenkarzinom, Nebennierenrindenkarzinom, Weichteilsarkom, Harnröhrenkarzinom, Peniskarzinom, solide Tumoren bei den Kindern, Harnblasenkarzinom, Nieren- oder Harnleiterkarzinom, Nierenbeckenkarzinom, Tumor des Zentralnervensystems (ZNS), tumoröse Angiogenese, Wirbelsäulentumor, Hirnstammgliom, Hypophysenadenom, Kaposi-Sarkom, Epidermoidkrebs, Plattenepithelkarzinom, Krebsgeschwüre, die durch den Umwelteinfluss induziert sind, inklusive der Krebsgeschwüre, die durch Asbest induziert sind, z.B. Mesotheliom, sowie die Kombinationen der angeführten Krebserkrankungen.
Antikörper gegen FGFR1 können, jedoch nicht unbedingt, mit einem immunogenen Mittel, wie beispielsweise Krebszellen, gereinigte Tumorantigene (einschließlich der rekombinanten Proteine, Peptide und Kohlenhydratmoleküle), Zellen und Zellen, die mit den die immunstimulierende Zytokinen kodierenden Genen transfiziert sind, verbindet werden. Die nicht einschränkenden Beispiele, die für die Verwendung der Antitumor-Impfstoffe geeignet sind, sind Impfstoffe auf Basis der Peptide von Melanom-Antigenen, wie beispielsweise gp100-Peptide, MAGE-Antigene, Trp-2, MART1 und/oder Tyrosinase oder Impfstoffe auf Basis von Tumorzellen, die für die Expression von GM-CSF-Zytokin transfiziert wurden. Es wurde festgestellt, dass einige humane Tumoren, wie z.B. Melanome, immunogen sind. Dabei wird angenommen, dass bei der Steigerung der Aktivierungsschwelle von T-Zellen mittels FGFR1-Blockade die Tumorantworten beim Wirt aktiviert werden können.
Es wurde eine ganze Reihe der experimentellen Strategien für die Impfung gegen Tumoren entwickelt (siehe Rosenberg, S., Development of Cancer Vaccines, ASCO Educational Book Spring: 60-62, 2000; Logothetis, ASCO Educational Book Spring: 300-302, 2000; Khayat, ASCO Educational Book Spring: 414-428, 2000; Foon, ASCO Educational Book Spring: 730-738, 2000; siehe auch Restifo, & Sznol, Cancer Vaccines, Ch. 61, pp. 3023-3043 in DeVita, et al. (eds.), Cancer: Principles and Practice of Oncology, Fifth Edition, 1997, Cancer: Principles and Practice of Oncology, Fifth Edition, 1997). In einer dieser Strategien wird ein Impfstoff unter Einsatz von autologen oder allogenen Tumorzellen hergestellt. Üblicherweise sind diese Zellimpfstoffe die wirksamsten bei der Transduktion von Tumorzellen zum Ziel der Übergabe diesen der Fähigkeit zur GM-CSF-Expression. Es wurde gezeigt, dass GM-CSF ein starker Aktivator der Antigenpräsentation ist und für die antiblastomatöse Impfung verwendet werden kann (Dranoff et al. Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 90: 3539-43, 1993).
Erforschung der Genexpression und der Muster der umfassenden Genexpression in verschiedenen Tumoren hat eine Identifizierung der sogenannten tumorspezifischen Antigene ermöglicht (Rosenberg, Immunity 10: 281-7, 1999). In vielen Fällen repräsentieren diese tumorspezifische Antigene Differenzierung-Antigene, die in den Tumoren und in den Zellen, aus welchen sich der Tumor entwickelt hat, exprimiert werden, z.B. Antigene der Melanozyten gp100, MAGE-Antigene und Trp-2. Es ist wichtig darauf hinzuweisen, dass viele dieser Antigene, wie bereits gezeigt wurde, Ziele von tumorspezifischen bei dem Wirt vorhandenen T-Zellen sind. FGFR1-Blockade kann zusammen mit der Verwendung vom Satz der rekombinanten Proteine und/oder Peptide, die im Tumor zwecks der Erzeugung von einer Immunantwort gegen diese Proteine exprimiert werden, realisiert werden. Solche Proteine werden normalerweise vom Immunsystem als Autoantigene erkannt und sind daher tolerant gegenüber diesen. Tumorantigen kann auch eine Protein-Telomerase sein, diese ist für die Synthese der chromosomalen Telomere erforderlich und wird in mehr als 85% der humanen Krebsgeschwüren und nur in einer begrenzten Anzahl von somatischen Geweben exprimiert (Kim et al. Science 266: 2011-2013, 1994) (diese somatische Gewebe können vor einem Immunangriff durch verschiedene Methoden geschützt werden). Tumorantigene können auch „Neo-Antigene“ sein, diese werden in den Krebszellen unter dem Einfluss von somatischen Mutationen, die Proteinsequenz modifizieren oder zur Bildung der Hybrid-Proteine zwischen zwei fremden (unverwandten) Sequenzen (d.h. bcr-abl im Philadelphia-Chromosom) oder des Idiotyps von B-Zell-Tumoren führen, exprimiert. Andere antiblastomatöse Impfstoffe können Proteine der Viren, die sich an der Bildung von Krebstumoren beim Menschen, wie beispielsweise humane Papillomaviren (HPV), Hepatitis-Viren (HBV und HCV) und Kaposi-Sarkom-Herpesvirus (KHSV) beteiligen, miteinbeziehen. Andere Formen der tumorspezifischen Antigene, die in Kombination mit der FGFR1-Blockade verwendet werden können, bilden gereinigte Hitzeschockproteine (HSP), welche aus dem Tumorgewebe selbst isoliert werden. Diese Hitzeschockproteine enthalten Fragmente von Proteinen der Tumorzellen, und solche HSP sind hoch wirksam in der Anfuhr dieser Fragmente zu den antigenpräsentierenden Zellen zwecks der Erzeugung der Tumorimmunität (Suot & Srivastava, Science 269:1585-1588, 1995; Tamura et al. Science 278:117-120, 1997). Dendritische Zellen (DZ) sind wirksame antigenpräsentierende Zellen, die für die Stimulierung der antigenspezifischen Antworten verwendet werden können. DZ können ex vivo produziert werden und können mit verschiedenen Protein- und Peptid-Antigenen sowie Tumorzellextrakten (Nestle, F. et al., 1998, Nature Medicine A: 328-332) geladen werden. DZ können auch durch genetische Methoden transduziert werden, um diesen eine Fähigkeit zur Expression der Tumorantigene zu vermitteln. DZ wurden auch direkt mit den Tumorzellen zum Zweck der Immunisierung fusioniert (Kugler, A. et al., 2000, Nature Medicine 6:332-336). Immunisierung mit DZ, welche zwecks der Impfung vorgenommen wurde, kann in Kombination mit Blockade von PD-1 erfolgreich durchgeführt werden, um die stärkeren Anti-Tumor-Reaktionen zu aktivieren. Die FGFR1-Blockade kann auch mit der Standard-Antikrebs-Therapie kombiniert werden. FGFR1-Blockade kann erfolgreich in Kombination mit der Chemotherapie durchgeführt werden. In diesen Fällen kann die applizierbare Dosis des Chemotherapeutikums reduziert werden (Mokyr, M. et al., 1998, Cancer Research 58: 5301-5304). Ein Beispiel einer solchen Kombination bildet eine Kombination aus anti-FGFR1-Antikörper und Dacarbazin, welche für die Therapie verschiedener Krebstumoren verwendet wird. Ein weiteres Beispiel einer solchen Kombination ist eine Kombination aus anti-FGFR1-Antikörper und Interleukin-2 (IL-2), welche für die Behandlung von verschiedenen Krebstumoren eingesetzt wird. Neben der Kombinationstherapie mit Einsatz von FGFR1-Blockade und Chemotherapie gibt es einen weiteren wissenschaftlichen Ansatz, basierend auf der Tatsache, dass der Zelltod, welcher eine Folge der zytotoxischen Wirkung der meisten chemotherapeutischen Verbindungen ist, zum Anstieg vom Tumorantigen-Spiegel auf dem Weg der Antigen-Präsentation führen soll.
Eine weitere Kombinationstherapie, die in Verbindung mit FGFR1-Blockade eine synergistische Wirkung erzeugen und dadurch zum Zelltod führen kann, ist eine Strahlentherapie, chirurgischer Eingriff und antihormonelle Therapie. Jede von diesen Strategien erlaubt eine Quelle des Tumorantigens beim Wirt zu erzeugen. Die FGFR1-Blockade kann auch mit einer Hemmung der Angiogenese kombiniert werden. Hemmung der Angiogenese führt zum Tod der Tumorzellen, die das Tumorantigen auf den Weg der Präsentation des Wirtsantigens hinsteuern können. FGFR1-blockierende Antikörper können auch in Kombination mit bispezifischen Antikörpern, die die Fcα- oder Fcy-Rezeptoren exprimierenden Effektzellen an die Tumorzellen hinsteuern, verwendet werden (siehe. z.B. Patente US5922845 und US5837243 ). Bispezifische Antikörper können für die Anfuhr von zwei getrennten Antigenen verwendet werden. So wurden z.B. bispezifische Antikörper gegen das Fc-Rezeptor/Tumorantigen (z.B. Her-2/neu) für die Anfuhr von Makrophagen an die vom Tumor betroffenen Gebiete eingesetzt. Eine solche gezielte Anfuhr kann tumorspezifische Antworten wirksamer aktivieren. FGFR1-Blockade soll zur Steigerung der T-Zell-Komponente dieser Antworten führen. Alternativ erlaubt die Verwendung von bispezifischen Antikörpern, die sich mit dem Tumor-Antigen und mit dem spezifischen Marker der Oberfläche der dendritischen Zellen anbinden, eine direkte Anfuhr von Antigen an DZ zu verwirklichen.
„Entweichen“ der Tumoren von „Immun-Überwachung“ des Wirts erfolgt durch verschiedene Mechanismen einer breiten Reihe. Viele dieser Mechanismen können durch die Inaktivierung der Proteine, die durch Tumoren exprimiert werden und immunsuppressiv sind, eliminiert werden. Solche Proteine sind unter anderem TGF-beta (Kehrl, J. et al 1986, J. Exp Med 163: 1037-1050), IL-10 (Kehrl, J. et al., 1986, J. Exp. Med. 163: 1037-1050), IL-10 (Howard, M. & O'Garra, A., 1992, Immunology Today 13: 198-200) und Ligand Fas (Hahne, M. et al., 1996, Science 274: 1363-1365). Antikörper gegen jedes dieser Moleküle können in Verbindung mit anti-PD-1-Antikörper für die Hemmung der Wirkung des immunsuppressiven Mittels und Indizierung von günstigen antiblastomatösen Immunantworten beim Wirt verwendet werden.
Andere Antikörper, die Immunantworten beim Wirt aktivieren können, können in Kombination mit Anti-FGFR1-Antikörpern verwendet werden. Solche Antikörper sind Moleküle, die auf der Oberfläche der dendritischen Zellen vorhanden sind und die DZ-Funktion und Antigen-Präsentation aktivieren. Anti-CD40-Antikörper können als ein wirksamer Ersatz für die T-Helferzellenaktivität dienen (Ridge, J. et al., 1998, Nature 393: 474-478) und können in Kombination mit Anti-FGFR1-Antikörpern verwendet werden. Aktivierende Antikörper gegen die T-Zell-costimulierenden Moleküle, wie CTLA-4 (z.B. Patent US5811097 ), OX-40 (Weinberg, A. et al., 2000, Immunol. 164: 2160-2169), 4-1BB (Melero, I. et al., 1997, Nature Medicine 3: 682-685, 1997), PD-1 (del Rio et al., 2005, Eur. J. Immunol. 35:3545-60) und ICOS (Hutloff, A. et al., 1999, Nature 397: 262-266), können auch für die Steigerung des T-Zellaktivierungsniveaus verwendet werden.
Gegenwärtig wird für die Therapie verschiedener Tumoren des hämatopoetischen Systems eine Knochenmarktransplantation verwendet. Obwohl die Komplikation einer solchen Behandlung eine „Transplantat-gegen-Wirt-Reaktion“ sein kann, kann jedoch in Ergebnis der Erzeugung einer „Transplantat-gegen-Tumor-Reaktion“ beim Wirt ein positiver therapeutischer Effekt erzielt werden. Die FGFR1-Blockade kann für die Steigerung der Wirksamkeit der den Spendern transplantierten tumorspezifischen T-Zellen eingesetzt werden.
Es wurden auch einige experimentelle Therapiestrategien entwickelt, die eine Aktivierung ex vivo, eine Expansion von antigenspezifischen T-Zellen und einen adoptiven Transfer dieser Zellen an den Empfänger zwecks der Erzeugung bei ihm einer antigenspezifischen antiblastomatösen T-Zell-Antwort (Greenberg, R. & Riddell, S., 1999, Science 285: 546-51) voraussetzen. Diese Methoden können auch für die Aktivierung der T-Zell-Antworten auf Infektionsmittel, wie z.B. CMV, verwendet werden. Man kann davon ausgehen, dass die Aktivierung ex vivo in Gegenwart von anti-FGFR1-Antikörpern die Anzahl und Aktivität von adaptiv übertragenen T-Zellen erhöhen wird. Unter Berücksichtigung der Tatsache, dass FGFR1 an verschiedenen Tumorzellen exprimiert werden, ist es zu bemerken, dass die menschlichen Antikörper, Antikörper-Zusammensetzungen und Verfahren im Rahmen der Erfindung für die Therapie des Individuums mit Tumorerkrankung, z.B. mit einer Erkrankung, welche durch das Vorhandensein von FGFR1-exprimierenden Tumorzellen gekennzeichnet ist, verwendet werden, einschließlich zum Beispiel folgender Erkrankungen: Nierenzellkarzinom, Lungenkarzinom, Brustkrebs (z.B. Mammakarzinom), Eierstockkrebs (z.B. Ovarialkarzinom). Beispiele der anderen Tumorerkrankungen, die einer Therapie mittels der Methoden gemäß der Erfindung unterzogen werden können, sind folgende: Melanom (z.B. metastasierendes malignes Melanom), Prostatakarzinom, Dickdarmkarzinom und Lungenkarzinom, Knochentumoren, Pankreaskarzinom, Hautkrebs, Kopf- und Halstumoren, malignes Hautmelanom oder intraokuläres Melanom, Uteruskarzinom, Mastdarmkarzinom, Anuskarzinom, Magenkarzinom, Hodenkarzinom, Tubenkarzinom, Endometriumkarzinom, Zervixkarzinom, Scheidenkarzinom, Vulvakarzinom, Hodgkin-Krankheit, Non-Hodgkin-Lymphom, akute myeloische Leukämie (AML), chronische lymphatische Leukämie (CLL), Burkitt-Lymphom, anaplastisches großzelliges Lymphom (ALCL), multiples Myelom, T-Zell-Haut-Lymphome, noduläres kleinzelliges differenziertes Lymphom, lymphatisches Lymphom, Lymphome der peripheren T-Zellen, Lennert-Lymphom, Immunoblastenlymphome, T-Zell-Leukämie/T-Zell-Lymphom (ATLL), T-Zell-Leukämie der Erwachsenen (TALL), enteroblastische/zentrozytäre (cb/cc) follikuläre Lymphome, diffus großzelliges B-Zell-Lymphom (DLBCL), der angioimmunoblastischen Lymphadenopathie (AILD) ähnliches T-Zell-Lymphom, HIV-assoziiertes Lymphom der Leibeshöhle, embryonale Karzinome, undifferenzierte Nasenrachenkarzinome (z.B. Schmincke-Tumor), Castleman-Erkrankung, Kaposi-Sarkom, multiples Myelom, Waldenström-Makroglobulinämie und andere B-Zell-Lymphome, Ösophaguskarzinom, Dünndarmkarzinom, Tumoren des endokrinen Systems, Schilddrüsentumoren, Nebenschilddrüsentumoren, Nebennierenrindenkarzinom, Weichteilsarkom, Harnröhrenkarzinom, Peniskarzinom, chronische oder akute Leukämie, inklusive akuter myeloischer Leukämie, chronischer myeloischer Leukämie, Lymphoblastenleukämie, chronischer lymphozytärer Leukämie, solide Tumoren bei Kindern, lymphozytäres Lymphom, Harnblasenkarzinom, Nieren- oder Harnleiterkarzinom, Nierenbeckenkarzinom, Tumor des zentralen Nervensystems (ZNS), primäres ZNS-Lymphom, Glioblastom, Hirntumoren, Nasenrachenkarzinome, Tumorangiogenese, Wirbelsäulentumor, Hirnstammgliom, Hypophysenadenom, Kaposi-Sarkom, Epidermoidkrebs, Plattenepithelkarzinom, T-Zell-Lymphom, Krebsgeschwüre, die durch den Umwelteinfluss induziert sind, inklusive der Krebsgeschwüre, die durch Asbest induziert sind, sowie die Kombinationen der angeführten Krebserkrankungen.
Die vorliegende Erfindung kann auch für die Behandlung von Metastasen der malignen Tumoren verwendet werden. Dementsprechend gehört die vorliegende Erfindung in einer von ihren Varianten zum Verfahren der Inhibierung des Wachstums von Tumorzellen bei einem Individuum, wobei das angeführte Verfahren die Applikation dem Individuum einer therapeutisch wirksamen Menge des anti-FGFR1-Antikörpers oder eines antigenbindenden Teils davon miteinschließt. Ein bevorzugter Antikörper ist üblicherweise ein humanisierter Anti-FGFR1-Antikörper (z. B. beliebiger humanisierter Antikörper gegen FGFR1, der in dieser Anmeldung beschrieben ist). Zusätzlich oder alternativ kann so ein Antikörper ein chimärer oder humaner Anti-FGFR1-Antikörper sein.
Impfstoffe
Anti-FGFR1-Antikörper können für die Stimulierung der antigenspezifischen Immunantworten mittels der Einführung des anti-FGFR1-Antikörpers in Kombination mit einem interessierenden Antigen (z.B. mit einem Impfstoff) verwendet werden. Dementsprechend gehört die vorliegende Erfindung in ihrem anderen Aspekt zum Verfahren der Verstärkung der Immunantwort auf ein Antigen bei dem Individuum, inklusive der Verabreichung dem angeführten Individuum von: (i) Antigen; und (ii) Anti-FGFR1-Antikörper oder seinem antigenbindenden Teil zwecks der Verstärkung der Immunantwort auf das angegebene Antigen bei diesem Individuum. Der bevorzugte Antikörper dabei ist ein humanisierter Antikörper gegen humanen FGFR1 (z. B. jeder der hierin beschriebenen humanisierten Anti-FGFR1-Antikörper). Zusätzlich oder alternativ kann der Antikörper ein chimärer oder humanisierter Antikörper sein. Das angegebene Antigen kann z.B. Tumorantigen, Virusantigen, bakterielles Antigen oder ein vom Pathogen abgeleitetes Antigen sein. Nichteinschränkende Beispiele für solche Antigene sind Antigene, die in den vorstehenden Abschnitten diskutiert wurden, wie beispielsweise oben behandelte Tumorantigene (oder antiblastomatöse Impfstoffe) oder die von Viren, Bakterien oder anderen Pathogenen abgeleiteten Antigene. Geeignete Verfahren der in vivo- und in vitro-Einführung der Zusammensetzungen von Antikörpern (z.B. von humanisierten monoklonalen Antikörpern, multispezifischen und bispezifischen Molekülen und Immunkonjugaten) gemäß der Erfindung sind den Fachleuten gut bekannt und können von einem Fachmann auf diesem Gebiet selbstständig ausgewählt werden. So können zum Beispiel die Antikörperzusammensetzungen mittels Injektion (z. B. intravenös oder subkutan) verabreicht werden. Die geeigneten Dosen der verwendbaren Moleküle hängen von dem Alter und Körpergewicht des Individuums sowie von der Konzentration und/oder der Zusammensetzung der vorliegenden Antikörperkombination ab. Wie vorgängig beschrieben, können die Anti-FGFR1-Antikörper gemäß der Erfindung in Kombination mit einem oder mehreren anderen therapeutischen Mitteln, z.B. mit einem zytotoxischen Mittel, einem radioaktiven toxischen Mittel oder einem immunsuppressiven Mittel, verabreicht werden.
Der Antikörper kann an das angeführte Mittel (in Form des Immunkomplexes) zugefügt oder getrennt eingeführt werden. Im letzteren Fall (getrennte Einführung) kann der Antikörper vor, während oder nach der Verabreichung des Mittels eigeführt werden, oder er kann in Kombination mit der Durchführung einer anderen bekannten Therapie, z.B. Antikrebstherapie, nämlich Strahlentherapie, verabreicht werden. Die angegebenen therapeutischen Mittel sind unter anderem antiblastomatöse Mittel, wie Doxorubicin (Adriamycin), Cisplatin, Bleomycinsulfat, Carmustine, Chlorambucil und Cyclophosphamid-Salz von Hydroxyurea, die an sich nur in den für den Patienten toxischen und subtoxischen Konzentrationen wirksam sind. Cisplatin wird intravenös in einer Menge von 100 mg/ml je eine Dosis ein Mal in vier Wochen eingeführt, und Adriamycin wird intravenös in einer Menge von 60-75 mg/ml je eine Dosis einmal in 21 Tagen verabreicht. Einführung von humanisierten anti-FGFR1-Antikörpern oder ihren antigenbindenden Fragmenten gemäß der Erfindung in Kombination mit chemotherapeutischen Mitteln ermöglicht die Anfuhr von zwei Zytostatika, die durch unterschiedliche Mechanismen wirken und eine zytotoxische Wirkung auf menschliche Tumorzellen ausüben. Eine solche gleichzeitige Verabreichung ermöglicht eine Lösung der Probleme der Erzeugung der Resistenz gegen Arzneimittel oder der Veränderung der Antigenität der Tumorzellen, die sie resistent gegen einen bestimmten Antikörper macht.
Die vorliegende Erfindung gehört auch zu den Sätzen, die die Antikörperzusammensetzungen gemäß der Erfindung (z. B. der humanisierten Antikörper, der bispezifischen oder multispezifischen Moleküle oder Immunkonjugate) und Anweisungen für deren Verwendung enthalten. Solch ein Satz kann auch mindestens ein zusätzliches Reaktionsmittel oder einen oder mehrere zusätzliche humanisierte Antikörper gemäß der Erfindung enthalten (z. B. einen humanisierten Antikörper mit zusätzlicher Aktivität, die auf die Bindung mit dem Epitop des FGFR1-Antigens gerichtet ist und sich von der Aktivität des ersten humanisierten Antikörpers unterscheidet). Üblicherweise enthalten solche Sätze ein Etikett, auf dem die Anweisungen für Verwendung des Inhalts dieses Satzes aufgeführt sind. Der Begriff „Etikett“ umfasst den beliebigen Text oder das gedruckte Material, das auf die Verpackung geklebt oder in die Verpackung dieses Satzes beigelegt oder in einer anderen Form diesem Satz beigefügt wird.
Kombinierte Therapie
In einer ihrer Varianten gehört die vorliegende Erfindung zur Behandlungsmethode einer hyperproliferativen (onkologischen) Erkrankung, welche die Einführung dem Individuum des Antikörpers gegen FGFR1 und des Antikörpers gegen CTLA-4 und/oder PD-1 miteinschließt. In den anderen Varianten der Erfindung wird der anti-FGFR1-Antikörper in der subtherapeutischen Dosis verabreicht, anti-CTLA-4- und/oder anti-PD-1-Antikörper werden in einer subtherapeutischen Dosis verabreicht, oder diese beiden Antikörper werden in der subtherapeutischen Dosis verabreicht. In einer anderen Variante gehört die vorliegende Erfindung zum Verfahren der Unterdrückung der Nebenreaktion, welche mit der Behandlung einer hyperproliferativen Erkrankung mit dem immunostimulierenden Mittel assoziiert ist, wo das angegebene Verfahren die Verabreichung des anti-FGFR1-Antikörpers und der subtherapeutischen Dosis von anti-CTLA-4- und/oder anti-PD-1-Antikörper miteinbezieht. In manchen Varianten der Erfindung ist das Individuum ein Mensch. In einigen Varianten der Erfindung ist der angegebene Anti-CTLA-4-Antikörper ein humaner monoklonaler Antikörper mit der humanen Sequenz 10D1, und der angegebene anti-PD-1-Antikörper ist ein monoklonaler Antikörper mit der humanen Sequenz, wie 17D8, 2D3, 4H1, 5C4 und 4A11. Der monoklonale Antikörper mit der humanen Sequenz 10D1 wurde isoliert und strukturell charakterisiert, wie in dem Patent US6984720 beschrieben ist. Monoklonale Antikörper mit der humanen Sequenz 17D8 2D3, 4H1, 5C4 und 4A11, wurden isoliert und strukturell charakterisiert, wie in der vorläufigen Patentanmeldung USA Nr. 60/679.466 beschrieben ist. Monoklonaler anti-FGFR1-Antikörper, monoklonaler anti-CTLA-4-Antikörper und monoklonaler Anti-PD-1-Antikörper und Antikörper mit der humanen Sequenz gemäß der Erfindung können durch verschiedene Verfahren hergestellt werden, einschließlich der Standardmethode der Herstellung der monoklonalen Antikörper, z.B. Standardmethode der Hybridisierung der somatischen Zellen, beschrieben von Kohler und Milstein, 1975, Nature 256:495. Dabei kann beliebige Methode zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern verwendet werden, zum Beispiel die Methode der viralen oder onkogenen Transformation von B-Lymphozyten. Eines der Tiere, die zur Gewinnung von Hybridomen verwendet werden, ist die Maus. Gewinnung von Hybridomen an den Mäusen ist ein sehr gut entwickeltes Verfahren. Protokolle und Methoden der Immunisierung zur Isolierung von immunisierten Splenozyten zwecks ihrer nachfolgenden Fusion sind den Fachleuten bekannt. Fusionspartner (z.B. Myelom-Zellen der Maus) und Fusionsverfahren sind den Fachleuten auch bekannt (siehe z.B. Harlow und Lane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor New York).
Kombination der Antikörper kann für die Verstärkung der Immunantwort zwecks der Hemmung der hyperproliferativen Erkrankung mittels der Blockierung von FGFR1 und PD-1 und/oder CTLA-4 verwendet werden. So können zum Beispiel diese Moleküle in die Zellkulturen, in vitro oder ex vivo, oder auch dem Menschen, beispielsweise in vivo, zwecks der Verstärkung der Immunantwort in verschiedenen Situationen eingeführt werden. Dementsprechend gehört die vorliegende Erfindung in einem ihrer Aspekte zum Verfahren der Modifikation der Immunantwort bei dem Individuum, das Verfahren umfasst eine Verabreichung einer Antikörperkombination oder der Kombination aus deren antigenbindenden Teilen dem Individuum gemäß der Erfindung, um eine Immunantwort bei dem Individuum zu modifizieren. Vom Vorteil ist dabei, dass diese Antwort verstärkt, stimuliert oder aktiviert wird. In einer anderen Variante gehört die vorliegende Erfindung zum Verfahren der Beseitigung von Nebenwirkungen bei der Therapie der hyperproliferativen Erkrankung mit einem immunstimulierenden therapeutischen Mittel, wo das angegebene Verfahren die Verabreichung des anti-FGFR1-Antikörpers und der subtherapeutischen Dosis von anti-CTLA-4- und/oder anti-PD-1-Antikörper miteinbezieht. Blockierung von FGFR1, PD-1 und CTLA-4 durch Antikörper kann die Immunantwort gegen Krebszellen bei einem Patienten verstärken. Maligne Tumoren, deren Wachstum durch Antikörper gemäß der Erfindung gehemmt werden kann, sind maligne Tumoren, die meist gegen Immuntherapie sensibel sind. Repräsentative Beispiele der malignen Tumoren, für deren Behandlung eine Kombinationstherapie gemäß der Erfindung verwendet werden kann, sind folgende: Nierenzellkarzinom (RCC), Lungenkarzinom, Melanom (z.B. metastasierendes malignes Melanom), Prostatakarzinom, Mammakarzinom, Dickdarmkarzinom, Lungenkarzinom und andere bösartige Tumoren, einschließlich maligner Tumoren, die durch die Umwelteinflüsse induziert sind, einschließlich maligner Tumoren, die durch Asbest induziert sind, sowie die Kombinationen der angeführten malignen Tumoren.
Die vorliegende Erfindung kann auch zur Behandlung der Metastasen von malignen Tumoren verwendet werden. In manchen Varianten kann die hier diskutierte Kombination der therapeutischen Antikörper simultan in Form einer Zusammensetzung in einem pharmazeutisch geeigneten Träger oder simultan in Form der getrennten Zusammensetzungen jedes Antikörpers in einem pharmazeutisch geeigneten Träger verabreicht werden. In einer anderen Variante der Erfindung kann eine solche Kombination der therapeutischen Antikörper nacheinander verabreicht werden. So können beispielsweise anti-FGFR1-Antikörper und anti-PD-1-Antikörper nacheinander verabreicht werden, zuerst kann z.B. der anti-FGFR1-Antikörper eingeführt werden, und danach der anti-PD-1-Antikörper, oder umgekehrt - zuerst kann der anti-PD-1-Antikörper und danach der Anti-FGFR1-Antikörper verabreicht werden. Außerdem im Fall einer aufeinanderfolgenden Verabreichung von mehr als einer Dosis der Kombination von therapeutischen Mitteln kann die Reihenfolge einer solchen Verabreichung umgekehrt oder gleich für jede Verabreichungszeit sein, dabei kann die aufeinanderfolgende Verabreichung mit der simultanen Verabreichung kombiniert werden oder sie kann in irgendeiner anderen Kombination vorgenommen werden. So kann zum Beispiel die erste Verabreichung in Form der simultanen Verabreichung von anti-FGFR1-Antikörper und anti-PD-1-Antikörper in Kombination miteinander durchgeführt werden, bei der zweiten Verabreichung kann zuerst der anti-FGFR1-Antikörper eingeführt werden und danach der anti-PD-1-Antikörper, und im Rahmen der dritten Verabreichung kann zuerst der anti-PD-1-Antikörper verabreicht werden gefolgt vom anti-FGFR1-Antikörper usw. Ein anderes repräsentatives Schema kann eine erste Verabreichung umfassen, bei der zuerst der anti-PD-1-Antikörper eingeführt wird, gefolgt vom anti-FGFR1-Antikörper, und bei der zweiten und den nachfolgenden Verabreichungen werden diese Antikörper simultan verabreicht.
Blockierung aller FGFR1 und PD-1 und/oder CTLA-4 soll zu einer Steigerung der T-Zell-Komponente der tumorspezifischen Antworten führen.
Alternativ erlaubt eine Verwendung von bispezifischen Antikörpern, die sich mit dem Tumor-Antigen und mit dem spezifischen Marker der Oberfläche der dendritischen Zellen anbinden, eine direkte Anfuhr des Antigens an dendritische Zellen.
In einem anderen Beispiel können die Antikörper der Erfindung in Kombination mit antiblastomatösen Antikörpern wie Rituxan^® (Rituximab), Herceptin^® (Trastuzumab), Bexxar^® (Tositumomab), Zevalin^® (Ibritumomab), Campath^® (Alemtuzumab), Lymphocide^® (Epratuzumab), Avastin^® (Bevacizumab) und Tarceva (Erlotinib) usw. verwendet werden.
In einigen ihrer Varianten gehört die vorliegende Erfindung zum Verfahren der Beseitigung der Nebenwirkungen, welche mit der Behandlung einer hyperproliferativen Erkrankung mit einem immunostimulierenden Mittel assoziiert sind, wo das Verfahren die Einführung dem Individuum eines anti-FGFR1-Antikörpers und einer subtherapeutischen Dosis des anti-CTLA-4-Antikörpers miteinschließt. So gehört zum Beispiel die vorliegende Erfindung zum Verfahren der Minderung der Häufigkeit des Auftretens von Kolitis und Diarrhoe, die durch den immunostimulierenden therapeutischen Antikörper induziert sind, wo das angegebene Verfahren die Verabreichung dem Patienten eines nichtabsorbierbaren Steroid miteinschließt. Da bei jedem Patient, der mit dem immunostimulierenden therapeutischen Antikörper behandelt wird, ein Risiko der Entwicklung von Kolitis oder Diarrhoe, welche durch die Verabreichung eines solchen Antikörpers induziert sind, besteht, so bedeutet es, dass die Therapie mit dem Einsatz der Verfahren gemäß der Erfindung für die gesamte Bevölkerung wirksam sein kann. Obwohl die Steroide zum Zweck der Behandlung der entzündlichen Darmerkrankungen (inflammatory bowel disease = IBD) und der Vorbeugung der Komplikationen bei IBD verabreicht worden sind, wurden sie jedoch nicht zwecks der Vorbeugung der Entwicklung von IBD (Minderung der Häufigkeit des Auftretens von IBD) bei den Patienten, bei denen früher keine IBD diagnostiziert wurde, verwendet. Schwere Nebenwirkungen, die mit der Einführung von Steroiden und sogar mit der Verabreichung der nichtabsorbierbaren Steroide assoziiert sind, erlauben es nicht, diese zum Zweck der Vorbeugung zu verwenden.
In anderen Varianten der Erfindung kann die Blockierung von allen FGFR1 und PD-1 und/oder CTLA-4 (d.h. die Verwendung von immunostimulierenden therapeutischen Antikörpern gegen FGFR1 und PD-1 und/oder CTLA-4) auch mit dem Einsatz der beliebigen nichtabsorbierbaren Steroide kombiniert werden. Der hier verwendete Begriff „nichtabsorbierbares Steroid“ bedeutet ein Glukokortikoid, das zuerst den intensiven primären Weg des Metabolismus durchgemacht hat, das heißt, dass nach der Metabolismus in der Leber die Bioverfügbarkeit des Steroids niedriger wird, das heißt weniger als etwa 20%. In einer der Varianten der Erfindung ist das nichtabsorbierbare Steroid Budesonid. Budesonid ist ein Glukokortikosteroid mit der lokalen Wirkung, das nach der oralen Verabreichung einem intensiven Metabolismus unterzogen wird, vor allem in der Leber.
ENTOCORT EC^® (Astra-Zeneca) ist ein orales Budesonid-Präparat, dessen Wirkung vom pH-Wert und der Verabreichungszeit abhängig ist und das für die Optimierung der Arzneimitteltransportierung in das Ileum und durch den Dickdarm entwickelt wurde. In den USA wurde ENTOCORT EC^® für die Therapie der leicht- und mittelgradigen Morbus Crohn, die das Ileum und/oder das Colon ascendens befällt, zugelassen. In der Regel beträgt die orale Dosis von ENTOCORT EC^® für die Therapie von Morbus Crohn 6-9 mg/Tag. ENTOCORT EC^® wird in den Dünndarm freigesetzt, danach wird das Präparat adsorbiert und verbleibt in der Darmschleimhaut. Nach dem Durchzug durch das notwendige Gewebe der Darmschleimhaut wird ENTOCORT EC^® einem intensiven Metabolismus unter dem Einfluss vom Cytochrom-P450-System in der Leber unterzogen, wodurch die Metaboliten mit einer geringen Glukokortikoid-Aktivität gebildet werden. Daher ist seine Bioverfügbarkeit gering (etwa 10%).
Niedrige Bioverfügbarkeit von Budesonid bietet den besten therapeutischen Index im Vergleich zu anderen Glukokortikoiden mit dem weniger intensiven primären Metabolismus-Stadium. Budesonid löst weniger Nebenwirkungen aus, einschließlich einer geringeren Unterdrückung der Funktion von Hypothalamus-Hypophyse im Vergleich zu den systemischen Kortikosteroiden. Dennoch kann eine kontinuierliche Anwendung von ENTOCORT EC^® zur Entwicklung der systemischen Glukokortikoid-Effekten, wie Hyperkortizismus und Unterdrückung der Nebennierenfunktion, führen. Siehe PDR 58th ed. 2004; 608-610.
In anderen Varianten der Erfindung kann die Blockierung der Kombination aus FGFR1 und PD-1 und/oder CTLA-4 (d.h. mit den immunostimulierenden therapeutischen Antikörpern anti-FGFR1- und anti-PD-1-Körpern und/oder anti-CTLA-4-Antikörpern) in Verbindung mit dem nichtabsorbierbaren Steroid kann auch in Kombination mit einem Salicylat vorgenommen werden. Salicylate sind 5-ASA-Verbindungen, wie z.B.: Sulfasalazin (AZULFIDINE^®, Pharmacia & UpJohn); Olsalazin (DIPENTUM^®, Pharmacia & UpJohn); Balsalazid (COLAZAL^®, Salix Pharmaceuticals, Inc.) und Mesalamin (ASACOL^®, Procter & Gamble Pharmaceuticals; PENTASA^®, Shire US; CANASA^®, Axcan Scandipharm, Inc.; ROWASA^®, Solvay).
Im Rahmen der Verfahren gemäß der Erfindung zwecks der Minderung der Fallzahl vom Auftreten der durch die immunostimulierenden Antikörper induzierten Kolitis kann die Einführung von Salicylat in Kombination mit dem anti-FGFR1-Antikörper und dem anti-PD-1-Antikörper oder mit dem anti-CTLA-4-Antikörper und einem nichtabsorbierbaren Steroid durch eine fast simultane oder aufeinanderfolgende Verabreichung von Salicylat und einem nichtabsorbierbaren Steroid erfolgen. So umfassen zum Beispiel die Methoden zur Minderung der Fallzahl vom Auftreten der durch die immunostimulierenden Antikörper induzierten Kolitis gemäß der vorliegenden Erfindung die simultane oder aufeinanderfolgende Einführung von Salicylat und einem nichtabsorbierbaren Steroid (z.B. wird Salicylat 6 Stunden nach der Verabreichung vom nichtabsorbierbaren Steroid eingeführt) oder in einer beliebigen Reihenfolge. Außerdem können gemäß der vorliegenden Erfindung Salicylat und das nichtabsorbierbare Steroid auf die gleiche Weise (so können beispielweise die beiden per os verabreicht werden) oder auf unterschiedliche Weise eingeführt werden (so wird z.B. Salicylat per os verabreicht und das nichtabsorbierbare Steroid per rectum eingeführt), die Einführungsweisen können sich dabei von den Einführungsweisen des anti-FGFR1-Antikörpers, des anti-PD-1-Antikörpers und des anti-CTLA-4-Antikörpers unterscheiden.
Zusammensetzungen gemäß der Erfindung (z.B. humane Antikörper, multispezifische und bispezifische Moleküle und Immunkonjugate) mit den komplementbindenden Stellen, wie z.B. die von IgG1, IgG2 oder IgG3 oder IgM stammenden Teile, die sich mit dem Komplement verbinden, können auch in Anwesenheit von Komplement verwendet werden. In einer der Varianten der Erfindung kann die ex vivo-Bearbeitung der Zellenpopulationen mit den Zielzellen, dem bindenden Mittel gemäß der Erfindung und den entsprechenden Effektzellen zusammen mit der Einführung des Komplements oder des komplementhaltenden Serums realisiert werden. Phagozytose der Zielzellen, die mit dem bindenden Mittel gemäß der Erfindung bedeckt werden, kann durch die Bindung mit den Proteinen des Komplements verstärkt werden. In einer anderen Variante der Erfindung können die Zielzellen, die mit den Zusammensetzungen gemäß der Erfindung (z.B. humanen Antikörpern, multispezifischen und bispezifischen Molekülen) bedeckt sind, unter Einwirkung des Komplements einer Lyse unterzogen werden. In einer weiteren Variante der Erfindung aktivieren die angeführten Zusammensetzungen gemäß der Erfindung das Komplement nicht. Die Zusammensetzungen gemäß der Erfindung (z.B. humane Antikörper, multispezifische und bispezifische Moleküle und Immunkonjugate) können auch in der Verbindung mit dem Komplement eingeführt werden. Dementsprechend umfasst der Umfang der vorliegenden Erfindung die Zusammensetzungen, die humane Antikörper, multispezifische und bispezifische Moleküle, sowie das Serum oder Komplement enthalten.
Diese Zusammensetzungen haben einen Vorteil dadurch, dass in ihnen das angegebene Komplement in unmittelbarer Nähe von den humanen Antikörpern, multispezifischen und bispezifischen Molekülen lokalisiert ist. Alternativ können die humanen Antikörper, multispezifische und bispezifische Moleküle gemäß der Erfindung und das Komplement oder Serum getrennt eingeführt werden.
Demgemäß können die Patienten, die mit den Antikörperzusammensetzungen gemäß der Erfindung behandelt werden, zusätzlich noch (vor, während oder nach der Verabreichung vom humanen Antikörper gemäß der Erfindung) ein anderes therapeutisches Mittel, wie z.B. zytotoxisches oder radiotoxisches Arzneimittel, das die therapeutische Wirkung des humanen Antikörpers verstärkt oder verbessert, erhalten.
Die vorliegende Erfindung wird ausführlich mit den nachstehenden Beispielen dargestellt, dabei dürfen diese Beispiele nicht als eine Einschränkung der Erfindung betrachtet werden. Die Beschreibung aller Veröffentlichungen, Patente und der bekanntgegebenen Patentanmeldungen, die in der vorliegenden Anmeldung zitiert werden, wird in der kompletten Ganzheit in die vorliegende Beschreibung mittels des Verweises eingeführt.
Beispiel 1. Ein monoklonaler Maus-Antikörper OCX-01 gegen FGFR1, abgeleitet von einem Hybridom
Maushybridom PA255 Klon 56 (Office of Research Nierenkrebs) wurde von der Hybridom-Methode G. Köhler, Milstein C. erhalten. J Nature 256, 495 (1975) und in Dulbeccos modifiziertem Eagle Dulbecco MegaCellTM (Firma „Sigma Aldrich“) mit 1 mmol / l Glutamin, 10% FBS („Gibco“, „Invitrogen“) und 50 ug / ml Gentamycin wachsen gelassen (Firma „Sigma Aldrich“) bei einer Temperatur von 37 ° C, 5% CO2. Zelllinie CHO-S Säugern wurde von der Firma „Invitrogen“ erworben und in einem Medium CHO-S-SFM II („Gibco“, „Invitrogen“) bei einer Temperatur von 37 ° C, 8% CO 2 enthielt. Der murine monoklonale Antikörper OCX-01, die von einer Maus-Zellinie PA255 Klon erhalten 56 hat die Fähigkeit, mit hoher Affinität zu binden (Kd = 4,6 nM) und die Fähigkeit, die biologische Aktivität des FGF-Rezeptor zu beeinflussen.
Beispiel 1.1. Isolierung von mRNA und reverse Transkription
Alle RNAs wurden aus den Hybridomzellen unter Verwendung des Nucleospin-RNA-II-Systems (Macherei Nagel GmbH & Co. KG) extrahiert, wobei die cDNA gemäß Herstellerangaben aus 5 & mgr; g gewonnener RNA unter Verwendung des First-Strand-cDNA-Synthesesystems und des Maus-Ig-Primersatzes synthetisiert wurde (Novagen, Merck KGaA) gemäß den Anweisungen des Herstellers.
Beispiel 1.2. Amplifizierung von variablen Bereichen der schweren und leichten Kette von Maus-Ig, Klonierung und Sequenzierung
Die Maus-VDJ- und VJ-Sequenzen für die variablen Regionen der schweren und leichten Ketten wurden unter Verwendung der synthetisierten cDNAs, einer Reihe von Mäuse-Ig-Primern und NovaTaq-DNA-Polymerase (Novagen, Merck KGaA) amplifiziert. Die PCR-Produkte wurden gereinigt und in das pSTBlue-1-AccepTor Vector-System und unter Verwendung von NovaTaq-DNA-Polymerase (Novagen, Merck KGaA) gemäß den Anweisungen des Herstellers kloniert. Die Sequenzierung der Plasmid-DNA wurde von LGC Genomics GmbH durchgeführt.
Die Sequenzen von murinen VDJ- oder VJ-Rearrangements wurden mit weit verfügbaren Generationsliniensequenzen von den murinen Ig-Genen der schweren und leichten Kette unter Verwendung der IMGT / V_QUEST-Software assoziiert. Zahlreiche Verbindungen von VDJ- oder VJ- und Maussequenzen wurden unter Verwendung der ClustalW-Software erhalten.
Beispiel 2. Herstellung von Varianten von humanisierten Antikörpern
Humanisierte Version des monoklonalen Antikörper PA255 Klon 56, OCX-01, wurde unter Verwendung von Immun immunoinformatsionnogo Informationen und Modellierungs-Tool erzeugt, die durch das internationale ImMunoGeneTics^® Informationssystem verfügbar worden ist (IMGT^®, http://www.imgt.org). Die murinen variablen Sequenzen der schweren und leichten Ketten (VH bzw. VL) wurden mit humanen Sequenzen generative Zeile IMGT / V_QUEST Werkzeuge und IMGT / DomainGapAlign. Komponenten murine Sequenzen, die aus menschlichen Komponenten in den Testsegmenten unterscheiden ersetzt wurden, mit Ausnahme von CDR und Schlüssel Aminosäuren. Die vorgeschlagenen Änderungen wurden unter Verwendung analysiert IMGT / collier de perles Systeme und IMGT / 3D-Struktur für den Vergleich mit Referenz generativen murinen und humanen Linien. Bestimmte Aminosäuren aus dem Maus-Antikörper verwendet wurden, wenn sie eine wichtige Rolle bei der Bildung von Antikörpern-Spezifität und Affinität zu sehen sind, wie zu spielen. Gene mit spezifischen Mutationen wurden mit dem GeneArt-System („Invitrogen“) synthetisiert. Nach der DNA-Sequenzierung, wurden humanisierte variable Regionen auf Derivate platziert Vektoren pCDNA3 sowie Expressionsvektoren pHHU_HulgG1 und pHHU_Huk, eines humanen IgG1-Gens IGHG1 * 03 (Datenbank GenBank Daten: Y14737) enthält, und K-Gen IGKC * 01 (Datenbank GenBank Daten: J00241), die die konstanten Domänen der schweren und leichten Ketten des Antikörpers repräsentieren.
Anfangs-Sequenzen für die verschiedenen Domänen der schweren erhaltenen Codes Nucleotid (VH) und leichten (VL) Ketten der monoklonalen Maus-Antikörper nach der mRNA aus einer Hybridomazellinie Extrahieren Klon 56. Die Synthese von cDNA und die Amplifikation der variablen Region der cDNAs durch Polymerasekettenreaktion (PCR) wurden unter Verwendung geeigneter Primersätze. Dann wurden die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen kodiert für verschiedene Domänen der murinen Antikörper analysieren Instrumente IMGT / V-QUEST und IMGT / DomainGapAlign und die nächsten humanen V und J-Gene.
Die Länge der hypervariablen Stellen für die schwere Kette in Höhe von [9.7.9] sowie das engste humane Gen IGHV4-30-4 * 01 (GenBank-Datenbank: Z14238) wurden nachgewiesen. Es gibt 19 Unterschiede zwischen OM-RCA-01 VH und dem menschlichen Gen IGHV4-30-4 * 01 (3, 5 und 11 in FR1, FR2- bzw. FR3-IMGT-Strukturen). In der FR4-IMGT-Struktur wurden die murinen Antikörper-VH-Reste T123 und L124 durch L123 und V124 (1) ersetzt, um eine identische Sequenz für humanes IGHJ4-30-4 * 01 zu erhalten.
Die Länge der hypervariablen Regionen für die leichte Kette in Höhe von [7.3.9] sowie das engste humane Gen IGKV1-9 * 01 (GenBank-Datenbank: Z00013) wurden identifiziert. Es gibt 28 Unterschiede zwischen OM-RCA-01 VL und dem menschlichen IGKV1-9 * 01-Gen (12, 6 und 10 in den FR1-, FR2- bzw. FR3-IMGT-Strukturen). In der FR4-IMGT-Struktur wurde die L124-Einheit des murinen VL-Antikörpers durch V124 ersetzt, um eine identische Sequenz für humanes IGKJ4 * 01 zu erhalten.
Die Längen der hypervariablen Regionen sind an Ort Strukturen FR-IMGT (Lefranc et al 2003, 10) begrenzt. Um die hypervariablen Regionen, die Reste der Schlüssel und die Maus-spezifische Aminosäuren zu erhalten, wurden als potentiell wichtig für die Erhaltung der Struktur der variablen Region sowie Kontakte mit den hypervariablen Regionen wurden in einer humanisierten Form auftreten. Angesichts dieses Kriteriums hat eine Struktur, bestehend aus zwei humanisierten variablen schweren Kette (VH3 und VH4) und drei humanisierten leichten Ketten (VL3, VL4 und VL5) zum Zwecke des Teilens und erhalten funktionellen humanisierter monoklonaler Antikörper (OM-RCA) mit der Erhaltung Antigenbindungsaffinität des murinen Ausgangsantikörpers. Chimäres Organismus murine variable leichte (mVL2) und schweren (mVH2) Kette umfasst, in Kombination mit humanen konstanten kappa und IgG1 schweren Ketten bzw. wurde als Kontrollmaterial verwendet wird.
Die Expressionsvektoren der schweren und leichten Kette für humanisierte Antikörpervarianten wurden in einem Verhältnis von 1: 1 zu CHO-S-Zellen unter Verwendung des FreeStyle TM MAX-Reagens („Invitrogen“) transfiziert. 30 x 10 6 Zellen wurden mit 15 µg jedes Expressionsvektors und 30 µl des Transfektionsreagens transfiziert. Überstände wurden 3 Tage nach der Transfektion durch Zentrifugation erhalten. Die Antikörper wurden auf G-Sepharose (Gl Healsker) gereinigt und unter Verwendung von Silber-SDS-PAGE-Nitrat analysiert.
Beispiel 2.1. Analyse der Antikörperbindung
Um die Immunreaktivität der chimären Antikörper und rekombinante humanisierte Varianten basieren FGFR1, Mikrotiterplatten (Firma „Greiner Bio One“) zu bewerten wurden mit 0,5 ug / ml PA-269 beschichtet # 37 Rekombinante FGFR1 (Antigen) oder kommerziellen rekombinanten humanen FGFR1 (Firma „Sino Biolodzhikals „link Nº 10616-H08H) in 0,05 mol / l Carbonat-Bicarbonat-Puffer, pH 9,6. Gebundene Antikörper wurden unter Verwendung der leichten kappa-Kette protivochelovecheskogo Ziegen-Antikörper, konjugiert an Meerrettich-Peroxidase („Sigma Aldrich“) für den humanisierten Varianten oder anti-Maus-IgG (Fc-spezifisch) Antikörper („Sigma Aldrich“) für den chimären Antikörper detektiert. Absorption wurde bei 450 nm bestimmt (Multiskan EX; «Thermo Electron Corporation").
Beispiel 2.2. Oberflächenplasmonenresonanz
Oberflächenplasmonresonanz-Analyse wurde auf einem BIAcore T100 Instrument durchgeführt („Byakor“, „GE Helsker“). Rekombinantes humanes Antigen FGFR1 PA-269 # 37 oder rekombinantem humanen FGFR1 («Sino Biolodzhikals" link Nº 10616-H08H) wurden über einen Sensorchip CM5 immobilisierter (S-Serie, «Byakor", „GE Helsker“) in 10 mmol / l Natriumacetat pH 5 Verschiedene Ausführungsformen der Antikörper wurden in Puffer HBS-P verdünnt (10 mmol / l HEPES, pH 7,4, 0,15 mol / l NaCl und 0,05% Tensid P20) und durch den Sensorchip durchgeführt (25 µl / min). Die Sensoroberfläche wurde mit Puffer HBS-P, gespült und dann mit 10 mmol / l Glycin-HCI (pH 2) regeneriert. Verschiedene Konzentrationen von Antikörpern getestet wurden (0, 1, 2, 4, 8, 16, 32, 24 und 32 nM). verschiedene cyclischen kinetische Eigenschaften wurden bestimmt und die Ergebnisse wurden unter Verwendung des Modells analysiert von 1: 1 (Langmuir) mit der Konstante der Assoziationsgeschwindigkeit (Kon), die Dissoziationsgeschwindigkeitskonstante (Koff) und Dissoziationskonstanten (Kd) (Byakor,GE Helsker).
Beispiel 2.3. Proliferationstest
Um die Wirkung eines neuen humanisierten anti-FGFR1-Antikörper (OM-RCA-01) an die genannten FGF-Signale, die menschliche FGFR1-exprimierenden Nierenkarzinomzellen Caki-1 (Firma „Charles River“) in einer 96-Well-Mikroplatte gegeben wurde (Costar weiß, flach Boden Nº 3917) in einer Konzentration von 90 ul / Vertiefung und inkubiert (0,5% FBS) mit OM-RCA-01 bei einer Konzentration von 100, 10 und 1 ug / ml. Die Kontrollvertiefungen wurden unbehandelt gelassen. Nach drei Stunden wurde der basische FGF in einer Konzentration von 50 ng / ml zugegeben. Zusätzliche Kontrollvertiefungen wurden mit OM-RCA-01 ohne FGF-Stimulation behandelt. Die Hemmung des Zellwachstums wurde unter Verwendung von Cell Titer-Assay Glo^® von „Promega“ gemessen.
Beispiel 2.4. Xenotransplantat-Modelle
Weiblichen Charles-River-Mäusen (im Alter von 6-12 Wochen) wurden subkutan Fragmente eines 1 mm 3 Caki-1-Tumors injiziert. Mäuse mit nachgewiesenen Tumoren (mittlere Größe 80-120 mg) wurden randomisiert in drei Gruppen eingeteilt, die Placebo, unspezifisches IgG (1 oder 10 mg / kg) oder OM-RCA-01 (1 oder 10 mg / kg) bei 10 Tieren erhielten in jeder Gruppe. Die Dimensionen des Tumors wurden zweimal wöchentlich mit einer Schieblehre gemessen. Die Tiere wurden täglich auf Anzeichen von Toxizität beobachtet und wurden auf humane Weise getötet, und es wurde angenommen, dass die Krankheit fortschreitet, wenn die Tumorgröße ≥2000 mm3 erreicht. Das ultimative Ziel war es, signifikante Unterschiede im Tumorwachstum zu identifizieren. Unterschiede wurden bei P <0,05 als statistisch signifikant angesehen.
Beispiel 2.5. Eigenschaften von chimären und humanisierten Antikörpern gegen FGFR1
Varianten von humanisierten und chimären Gene wurden geklont zwei verschiedene Säuger-Expressionsvektoren (pHHU_HulgG1 und pHHU_Huk) zu erhalten, ein menschliches Gen konstante kappa IGKC * 01-Gen und das menschliche konstante IgG1 schweren Kette enthalten: IGHG1 * 03 und Transfektion in HEK-FS-Zellen. Die DNA-Codes für die gesamte leichte und schwere Kette jeder Variante wurden durch Didesoxynukleotidsequenzierung getestet.
Sechs Varianten des humanisierten Antikörpers und des chimären Kontroll-Antikörpers wurden aus dem Kulturmedium unter Verwendung von G-Sepharose-Chromatographie gereinigt. Reinheit und Integrität wurden unter Verwendung der SDS-PAGE-Methode unter reduzierenden und nicht reduzierenden Bedingungen bestimmt. Unter nicht-reduzierenden Bedingungen wurde eine große Struktur von ungefähr 150 kDa gefunden, die dem unbehandelten Antikörper entsprach. Unter reduzierenden Bedingungen bildeten alle Antikörper zwei große Strukturen mit einer Molekülmasse von etwa 50 kD (schwere Ketten) und 25 kDa (leichte Ketten).
Die Bindungseigenschaften der Kandidaten für die humanisierten Antikörper wurden qualitativ und quantitativ unter Verwendung von Enzym-Immuntest bewertet und Oberflächen-Plasmonresonanz, respectively.
Chimäre Antikörper (mVH2 / mVL2) und Antikörpervarianten VH3 / VL5 (OM-RCA-01) und VH4 / VL5 (OM-RCA-02) an die rekombinante FGFR1-Antigen-PA-269 binden können, # 37, auf der Plattenoberfläche immobilisiert während Enzymimmuntest. Ähnliche Ergebnisse wurden einem im Handel erhältlichen rekombinanten FGFR1-Antigen, erhalten unter Verwendung („Sino Biolodzhikal bezeichnet Nº 10616-H03H) für die Antikörperproduktion durch ELISA.
Um wurden, um quantitativ die Wechselwirkung des chimären Antikörper und humanisierten Antikörpervarianten mit rekombinantem FGFR1-Antigen-Messung bestimmt Dissoziationskonstante (Kd) und die Assoziationskonstante (Ka). Cvyazyvayuschie Fähigkeit mVH2 / mVL2, VH3 / VL5 (OM-RCA-01) und VH4 / VL5 (OM-RCA-02) waren im niedrigen nanomolaren Bereich mit einem Kd Indikatoren bei 1,95 nM, 1,59 nM und 1, 52 nM, jeweils. Zwei Varianten des humanisierten und chimären Kontroll-Antikörper zeigte Werte von Kd, solche Werte ähnlich dem Ausgangs-Maus-Antikörper, was darauf hinweist, dass die Humanisierung Verfahren auf der Bindungsfähigkeit des Eltern-Antikörper keine Wirkung hatte.
Beispiel 2.6. OM-RCA-01 verlangsamt die Proliferation der Nierenzellkarzinom-Zelllinie (PCC) und die Phosphorylierung von FGFR1
OM-RCA-01 wurde auf das Vorliegen einer antiproliferativen Wirkung auf menschliche Nierenzellkarzinomzellen mit FGFR1-Expression (Caki-1) in einem Modell mit der Anwesenheit von FGF-induzierten Signalen untersucht. Basischer FGF erhöhte die Proliferation von Zellen des Nierenzellkarzinoms Caki-1 (P = 0,011). Die Zellen wurden mit erhöhten Konzentrationen an OM-RCA-01-Antikörper im Bereich von 1 bis 100 ug / ml behandelt. Der Antikörper verlangsamte signifikant die FGF-induzierte Zellproliferation im Vergleich zum Kontrollmaterial (P = 0,02). Es gab keine signifikante Wirkung des Antikörpers auf die Zellproliferation ohne vorherige FGF-Stimulation (P = 0,1). Darüber hinaus trat keine Zellproliferation ohne FGF-Stimulation oder -Behandlung auf. In diesem Zusammenhang wurde geschlossen, dass die Proliferation von PKC-Zellen mit FGFR1-Expression die Expression von FGFR1 sowie die Stimulation von FGF erfordert. Darüber hinaus bestätigen die Ergebnisse, dass die Aktivierung von FGF einen Einfluss auf die Entwicklung des PAC hat.
Es gab keinen Unterschied zwischen den verschiedenen Dosierungen von OM-RCA-01 (P = 0,8, 0,6 für 10 und 100 & mgr; g / ml im Vergleich zu 1 & mgr; g / ml). Diese Daten zeigen deutlich, dass eine niedrige Dosierung eines hochselektiven Antikörpers für die Blockade von FGFR1 im FGFR-abhängigen System ausreicht.
Der Enzymimmunoassay wurde verwendet, um die Konzentration von Phospho-FGFR1 in den Zellen des Caki-1-Nierenkrebses nach Inkubation mit OM-RCA-01 zu überwachen. OM-RCA-01 inhibierte die Aktivität von Phospho-FGFR1 unter Verwendung einer Konzentration von 1-50 nmol / l.
Beispiel 2.7. Wirksamkeit in Xenograft-Modellen von menschlichen Tumoren
Anti-Tumor-Wirkung von OM-RCA-01 wurde in FGFR1-abhängigen ksenograftnyh PAC Modellen untersucht. Zu diesem Zweck haben wir die Caki-1-Zellen mit hohen Expression von FGFR1. Ein monoklonaler Antikörper OM-RCA-01 wurde intraperitoneal zweimal pro Woche in Gruppe 3 (1 mg / kg) und Gruppe 4 (10 mg / kg) verabreicht. Es gab keine Anzeichen von Verlust von mittlerem Körpergewicht oder klinischer Manifestationen der Toxizität während der Studie. In den Gruppen 3 und 4 behandelt, mit 1 und 10 mg / kg von OM-RCA-01 führte zum Vorhandensein von mittlerem Tumorvolumen bei 758,3 und 763,8 mm 3 mm 3 am Tag 13, respectively. Dieses Volumen war signifikant geringer im Vergleich zu der Placebo-Gruppe (963,9 mm 3; P = 0,006, P = 0,021) (Gruppe 1) und die Gruppe, behandeln mit nicht-spezifischer IgG (1,017 mm3; P = 0,003, P = 0,01) (Gruppe 2). Bis zum Tag 21 in 6 (60%) und 5 (50%) hatte Fortschreiten der Krankheit um das Volumen auf 2000 mm3 Tumor in den Gruppen mit Placebo behandelt und IgG zu erhöhen. Tumoren in drei (30%) der Mäuse in Gruppe 3 und zwei (20%) in der Gruppe 4 bis 2000 mm3 Mäuse erhöht. Alle Tumoren in Gruppen 3 und 4 erreicht, das Zielvolumen 34 bis Tag im Vergleich mit der Placebo-Gruppe (Tag 24) und IgG (Tag 23), entsprechend 90 und 92 Prozent Indikatoren Verlangsamung des Tumorwachstums.
Beispiel 3. Untersuchungen der Antitumor- und angiogenen Aktivität des OM-RCA-01-Antikörpers an Modellen des Nierenzellkarzinoms (RCC).
In vitro-Studie in bFGF-Medium ohne Zugabe von OM-RCA-01 wurde die Proliferation von RCC-Zellen festgestellt (P = 0,011). Der OM-RCA-01-Antikörper neutralisierte die Wirkungen der Zellstimulation vollständig.

In vivo wurde in Gruppen von Mäusen, die keine Behandlung erhielten oder unspezifisches Immunglobulin erhielten, ein aggressives Wachstum des Tumors bis zu einem Volumen von 2000 mm³ festgestellt, wonach die Tiere getötet wurden. Der monoklonale Antikörper OM-RCA-01 unterdrückte das Tumorwachstum signifikant (Tabelle 2). Unterschiede in der Wirksamkeit von Dosen von 1 mg / kg und 10 mg / kg wurden nicht nachgewiesen (P = 0,917), was auf eine hohe inhibitorische Aktivität des Antikörpers selbst in kleinen Dosen hinweist. Tabelle 2. Die Häufigkeit des Erreichens des Tumorvolumens von 2000 mm3 am Ende von 3 Wochen in Gruppen von Mäusen.

	Kontrolle (N=10)	Immunglobulin (N=10)	OM-RCA-01, 1 mg/kg (N=10)	OM-RCA-01, 10 mg/kg (N=10)
Anzahl der Mäuse mit einem Tumor von 2000 mm3	6	5	3	2
Die Frequenz der Errungenschaft des Tumorvolumens 2000 mm3	60%	50%	30%	20%
Alle Unterschiede zwischen OM-RCA-01 (1 mg / kg), OM-RCA-01 (10 mg / kg) und Kontrollgruppen P <0,05.

Die frühe Antitumoraktivität von OM-RCA-01 wurde ebenfalls in dem Experiment bewertet. Wenn das Tumorvolumen am 13. Tag vom Beginn des Experiments verglichen wurde, wurden signifikante signifikante Unterschiede zwischen der primären Kontrollgruppe und den OM-RCA-01-Behandlungsgruppen 1 mg / kg (P = 0,006) und OM-RCA-01 10 mg / kg gefunden P = 0,021). Das mittlere Tumorvolumen in der Kontrollgruppe, in dem die Behandlung nicht durchgeführt wurde, betrug 963,9 mm³ und in der OM-RCA-01-Gruppe 758,3 mm³ und 763,8 mm³ (für 1 mg / kg und 10 mg / kg).B течение всего периода лечения токсичнсти антитела не отмечено.
Eine experimentelle Studie antiangiogene Aktivität Antikörper-OM-RCA-01 blockierende Aktivität des Rezeptors FGFR-1 auf Matrigel Implantatmodell in vivo. Als Vergleichsprobe verwendet Bevacizumab - humanisierter monoklonaler Antikörper gegen VEGF.
Es wird festgestellt, dass bei einer Verabreichung dreimal in einer Dosis von 10 mg / kg von OM-RCA-01 signifikant Angiogenese durch bFGF stimuliert blockiert, aber nicht VEGF. Bevacizumab in dem gleichen Anwendungsmodus war wirksam gegen das VEGF-stimulierte Angiogenese, aber nicht bei der Verwendung von bFGF.
Die in-vitro- und in-vivo-Studien zeigten, dass OM-RCA-01 ist ein monoklonaler Antikörper, der mit einer ausgeprägten therapeutischen Aktivität gegen Nierenkrebs. Anti-Tumor-Wirksamkeit des Antikörpers wurde am 13. Tag der Behandlung gefeiert.
Beispiel 4. Untersuchungen der Antitumor- und angiogenen Aktivität von OM-RCA-01-Antikörpern an Modellen verschiedener Arten von Tumoren
In den folgenden Zelllinien wurden verwendet: A549 (Lungenkrebs, ATCC # CCL-185), HS578T (Brustkrebs, ATCC # HTB-126), T47D (Brustkrebs, ATCC # HTB-1336), privater metastasierendem Melanom Haut Mel kor ( RF Patent Nº2287578 ) und SVEC-4-10 (endotheliale Zellen, ATCC # CRL-2181).
Die Zellen wurden in RPMI-1640 (PanEco) (A549, HS578T, T47D, mel-kor) oder DMEM (PanEco) (SVEC-4-10), das 10% fötales Rinderserum (FCS, HyClone), 2 mM Glutamin (PanEco), Antibiotika (100 IU / ml Penicillin und 100 mg / ml Streptomycin (alle PanEco)) bei 370C und 5% CO2.
Für die Experimente wurden Zellen in einer 70-80% -Monoschicht verwendet.
Bewertung der Antikörper-Zytotoxizität
Die Zytotoxizität wurde gemäß GOST R ISO 10993-5-2009 bewertet.
Zellen (5-10 × 10 3) wurden in 96-Loch-Platten (Costar, USA) in vollständigem Medium ausgesät. Am nächsten Tag wurden verschiedene Konzentrationen der Testproben, die durch Verdünnen mit dem Kulturmedium hergestellt wurden, oder das geeignete Lösungsmittel (Kontrolle) in die Vertiefungen eingebracht. Das Volumen der eingebrachten Substanzen überstieg 5% des Volumens des Mediums in den Vertiefungen nicht. Jede Konzentration der Testproben wurde in Tripletts untersucht. Die Zellen wurden 72 Stunden lang mit den Proben inkubiert. Am Ende der Inkubation wurden 20 µl Tetrazolium-MTT-Salz 4 Stunden in die Vertiefungen gegeben. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde anhand der Farbreaktion beurteilt, die sich bei der Reduktion von Tetrazolium in Formazan durch mitochondriale Dehydrogenasen entwickelt. Die optische Dichte wurde mit einem Spektrophotometer bei einer Anregungswellenlänge von 540 nm bewertet. Die optische Dichte in den Vertiefungen mit jeder Konzentration der Testpräparationen wurde gemittelt und der Prozentsatz der überlebenden Zellen wurde bei einer gegebenen Konzentration der Testpräparation berechnet.
Der Prozentsatz lebender Zellen wurde nachfolgender Formel berechnet: $N_{0} = \begin{matrix} \begin{matrix} \begin{matrix} \end{matrix} & \begin{array}{l} [N_{1} - n] \times 100 % \end{array} \end{matrix} \\ \bar{\begin{matrix} \begin{matrix} \begin{matrix} \begin{matrix} \begin{matrix} \begin{matrix} \begin{matrix} \end{matrix} & \begin{matrix} \end{matrix} \end{matrix} & N_{2} \end{matrix} \end{matrix} \end{matrix} \end{matrix} \end{matrix}} \end{matrix}$

N₀ - Prozentsatz lebender Zellen;
N₁- die durchschnittliche optische Dichte der Wells, die die Zellen und die Testsubstanz enthalten;
N₂- die durchschnittliche optische Dichte von Kontrollvertiefungen, die nur Zellen enthalten;
n - Optische Dichte von Wells, die nur die Testsubstanz enthalten.

Für jedes Arzneimittel wurde eine Dosis-Antwort-Kurve aufgetragen und IC50 wurde bestimmt.
Die Konzentration der Proben, aus denen der Prozentsatz der überlebenden Zellen weniger als 50% (IC50) betrug, wurde im GraphPad Prizm 5-Programm berechnet.
Die Experimente wurden mindestens dreimal in drei Wiederholungen im Experiment wiederholt.
Antiproliferationstest
Die Zellen wurden in Tripletts mit niedriger Dichte (30 t Zellen / ml) auf eine 96-Well-Platte in Medium, das 0,1-0,5% FCS-Serum enthielt, gepflanzt. Am nächsten Tag wurde die Testsubstanz zu den Vertiefungen in den erforderlichen Konzentrationen gegeben und nach 6 Stunden wurde der Fibroblasten-Wachstumsfaktor (100 ng / ml bFGF (BD Bioscience)) zugegeben. Mittwoch, Antibiotika und Drogen wurden alle 3 Tage gewechselt. Das Zellwachstum wurde am 7. Tag nach Versuchsbeginn mit der modifizierten „mitogenen Methode nach Crystal Violet“ bestimmt. Die Zellen wurden mit PBS gewaschen, mit 1% Parafarmaldehyd auf PBS fixiert und mit einer 0,5% igen Kristallviolettlösung (Sigma Chemical Co.) auf Ethanol gefärbt. Der Farbstoff wurde in Ethanol gelöst und mit einem Spektrophotometer bei 540-560 nm gemessen.
Die Hemmkurve der Zellproliferationsaktivität wurde aus der Abhängigkeit des Prozentsatzes an Zellen (Ordinatenachse) von der Konzentration der Testsubstanz in der Vertiefung der Platte (Abszissenachse) konstruiert. Die Konzentration der Proben, aus denen der Prozentsatz der überlebenden Zellen weniger als 50% (IC50) betrug, wurde im GraphPad Prizm 5-Programm berechnet.
Experimente wiederholen sich mindestens dreimal in drei Wiederholungen im Experiment.
Verfahren zur Beurteilung der Blockierung der Migrationsfähigkeit von Zellen nach der Methode der „Wundheilung“
SVEC-4-10-Zellen (3 × 10 5 Zellen / ml) wurden zu den Wells einer 24-Well-Platte in einem vollständigen DMEM-Medium gegeben und inkubiert, bis eine Monoschicht gebildet wurde. Dann wurde die Monoschicht durch Abkratzen eines Teils der Zellen aufgebrochen. Die Zellen wurden 24 Stunden in DMEM-Medium inkubiert, das 10% FCS, 2 mM Glutamin und nicht zytotoxische Dosis der Proben enthielt. Als negative Kontrolle wurden Zellen in serumfreiem DMEM-Medium verwendet. Die Ergebnisse wurden als der Prozentsatz an wandernden Zellen in dem Test gegenüber der Kontrolle bewertet.
Die Methode zur Bewertung der Blockierung der Bildung vaskulärer Strukturen (ATP)
Die Platte mit 24 Vertiefungen wurde mit Matrigel (100 µl / Vertiefung, Dichte 8,4 mg / ml (BD Bioscience)) beschichtet und für 20 bis 30 Minuten bei Raumtemperatur bis zur vollständigen Polymerisation inkubiert. SVEC-4-10-Zellen (5 × 10 5 Zellen / ml) wurden in DMEM-Medium, ergänzt mit nicht zytotoxischen Dosen des Antikörpers, für 30 Minuten bei 37 ° C inkubiert. Die Zellen wurden dann in Matrigel-beschichtete Vertiefungen überführt und in einem CO & sub2; -Inkubator für 4-6 Stunden inkubiert. Als positive Kontrolle wurden in DMEM ohne Antikörper inkubierte Zellen verwendet.

Die zytotoxische Wirkung von OM-RCA-01-Antikörper auf Kulturen von Tumor- und Endothelzellen wurde untersucht. Gemäß den Ergebnissen des MTT-Tests ist der OM-RCA-01-Antikörper nicht cytotoxisch und verursacht nicht den Tod von Tumorzellen in den untersuchten Konzentrationen (von 100 & mgr; g / ml bis 1,5 & mgr; g / ml) (Tabelle 3). Tabelle 3 - Zytotoxische Wirkung des OM-RCA-01-Antikörpers auf Tumor- und Endothelzellkulturen

Zellkultur	Maximale Konzentration	Anzahl der lebensfähigen Zellen, M±SD
A549	100 ug/ml	85,3±2,3
HS578T	100 ug/ml	95,3±1,5
T47D	100 ug/ml	101,7±0,7
Mel Kor	100 ug/ml	97,6±5,6
SVEC-4-10	100 ug/ml	91,7±8,7

Antitumoraktivität des Antikörpers OM-RCA-01
Die Untersuchung von OM-RCA-01 antiproliferative Antikörperaktivität auf Tumorzellinien exprimiert FGFR1: A549 (Lungenkarzinom, ATCC # CCL-185), HS578T (Brustkrebs, ATCC # HTB-126) und T47D (Mammakarzinom, ATCC # HTB-1336). Privater Leitung metastasierendem Melanom Mel kor wurde (Patent RU2287578 ) mit unbekannter Expression von FGFR1 verwendet.

Die Anzahl der Zellen wurde am 6. Tag nach der Inkubation mit der Testprobe in Gegenwart von bFGF bestimmt. Gezeigt, dass der Antikörper OM-RCA-01 dosisabhängig blockiert die Proliferation von Tumorzellen exprimieren FGFR1 (Tabelle 4). Der Test Antikörper hat blockiert nicht die proliferative Aktivität von metastasierendem Melanom-Zelllinie Mel kor. Tabelle 4 - Antiproliferative Wirkung von OM-RCA-01-Antikörper auf Tumorzellkulturen

Zell kultur	Blockierung der Proliferation (IC₅₀±SD), mcg/l
A549	9,69±2,5
HS578T	128,5±68,2
T47D	58,9±3,24
Mel Kor	IC¹
¹ - IC₅₀ nicht erreicht
Antiangiogene Aktivität des Antikörpers OM-RCA-010M-RCA-01

Die antiangiogene Aktivität des OM-RCA-01-Antikörpers wurde an der SVEC-4-10-Mausendothelzelllinie (Endothelzellen, ATCC # CRL-2181) untersucht.

Tabelle 5 fasst die allgemeinen Ergebnisse der Blockierung der angiogenen Aktivität von Zellen in drei verschiedenen Tests zusammen: Hemmung der proliferativen und migratorischen Aktivität, Blockierung vaskulärer Strukturen (VS). Tabelle 5 - Antiangiogene Aktivität des Antikörpers OM-RCA-01 im Kultur von Endothelzellen SVEC-4-10

Zellkultur	Blockierung der Proliferation (IC₅₀±SD), ug/ml	Blockierung der Migration (10 ug/ml), %	Blockierung der Bildung cпc (10 ug/ml), %
OM-RCA-01	1,82±0,16	71,7±8,4	71,3±6,9
Bevacizumab	IC¹	64,3±3,9	85,6±11,5
¹ - IC₅₀ nicht erreicht

Es wurde gezeigt, dass der OM-RCA-01-Antikörper die angiogene Aktivität bei Konzentrationen, die mit Bevacizumab vergleichbar sind, blockiert.
Die Migrationsaktivität wurde im „Wundheilungstest“ untersucht. 0,1% FCS wurde als negative Kontrolle (der Punkt der maximalen Hemmung der Migration, „0“ -Punkt), 10% FCS als positiv (der Punkt der maximalen Migrationsaktivität, 100%) verwendet. Die untersuchten Antikörper (100, 50 und 10 µg / ml) wurden SVEC-4-10-Zellen in DMEM-Medium, das 10% FCS enthielt, zugesetzt. Die Fähigkeit von Antikörpern, die Zellmigration zu blockieren, wurde 24 Stunden nach der Zugabe der Testproben bewertet. Es wurde gezeigt, dass die Antikörper OM-RCA-01 und Bevacizumab die Migrationsaktivität von Endothelzellen in vergleichbaren Konzentrationen blockieren.
Bei der Inkubation auf Matrigel bilden Endothelzellen das primäre Gefäßnetzwerk - vaskuläre Strukturen. Wenn OM-RCA-01 und Bevacizumab (10 & mgr; g / ml) untersucht wurden, wurde eine fast vollständige Hemmung der Bildung dieser Strukturen beobachtet.
Eine experimentelle Untersuchung der Antitumor- und antiangiogenen Aktivität von OM-RCA-01-Antikörpern, die die Aktivität des FGFR1-Rezeptors auf Kulturen von Tumor- und Endothelzellen in vitro blockieren, wurde durchgeführt. Als Vergleichsprobe verwendet Bevacizumab - humanisierter monoklonaler Antikörper gegen VEGF.
Es wurde gefunden, dass OM-RCA-01 die proliferative Aktivität von Kulturen von Tumor- und Endothelzellen in vitro dosisabhängig blockiert. Außerdem blockiert der OM-RCA-01-Antikörper die Migration von Endothelzellen und die Bildung vaskulärer Strukturen. Das antiangiogene Aktivitätsprofil von OM-RCA-01 entspricht dem Profil von Bevacizumab.
Die erhaltenen Daten zeigen, dass OM-RCA-01 eine vielversprechende Antitumor- und antiangiogene Substanz ist. Die Ergebnisse legen nahe, dass der OM-RCA-01-Antikörper das Tumorwachstum durch zwei unabhängige Mechanismen blockieren kann: Blockierung der Proliferation von Tumorzellen und Hemmung der Angiogenese in Tumorgewebe.
Beispiel 5. Herstellung von stabilen Zellinien, die Antikörper gegen FGFR1 produzieren
Herstellung einer cDNA, die einen Anti-FGFR1-Antikörper codiert
Die Nucleotidsequenz des cDNA-kodierenden Gene der schweren und OM-RCA-01 (OM-1-HC und OM-1-LC, jeweils) eine leichte Antikörperkette, wurden durch chemisch-enzymatische Synthese von GenScripts (USA) hergestellt. Gene OM-1-HC enthielt 1418 bp, OM-1-LC-Gen - 735 bp Nach Beendigung der Synthese wurden die Sequenzen durch Sequenzierung in der gleichen Firma überprüft.
Das rekombinante Plasmid DNA pCBp2-OM1s enthält die folgende Sequenz: zwei Kopien des Promotors-Enhancers Teils des unmittelbaren frühen Gens des humanen Cytomegalovirus, zwei Kopien des chimären Intron, zwei Kopien Polyadenylierung später Gene von SV40 Signal, synthetische Gene, die für die schwere und OM-RCA-01-Antikörper-Leichtkette, die minimale Seite der SV40-Replikationsinitiation. Als selektiver Marker verwendet: beta-Lactamase-Gen (AmpR), Bereitstellung von Resistenz gegenüber Ampicillin und E. coli-Zellen-Deaminase-Genen Blasticidin S (BSR), Widerstand bietet an Eukaryonten ein blistitsidin.
Das Plasmid pCBp2-OM1s ist durch die folgenden Parameter charakterisiert:

- besteht aus 8028 Elementen,
- hat ein Molekulargewicht 4,95 MDa,
- kodiert die schweren und leichten Ketten eines monoklonalen Antikörpers OM-RCA-01,
- liefert die Stabilität von Bakterienzellen, die mit diesem Plasmid transformiert sind, zu Ampicillin und Säugetierzellen, die mit dem Plasmid zu Blasticidin transfiziert sind,
- enthält einzigartige Erkennungsstellen für die folgenden Restriktionsendonukleasen: Nhel (1125 Elementen), Mlul (1854 Elementen), Xbal (3288 Elementen), Notl (4698 Elementen).

Die Herstellung eines Plasmids pCBp2-OM1s wurde in mehreren Stufen des Klonens durchgeführt.
In der ersten Stufe wurde das kommerzielle Plasmid pCl-neo (Promega, USA) verwendet, aus dem das Plasmid pCB durch Einführen einer zweiten Expressionskassette in die 3'-flankierende Region der vorliegenden Expressionskassette erhalten wurde. Beide Expressionskassetten hatten Promotor-Enhancer-Regionen der frühen Gene des humanen Cytomegalovirus, chimäre Introns, Signale der Polyadenylierung der späten SV40-Gene, die aus dem Plasmid pCl-neo erhalten wurden. Die erste Kassette enthielt die Erkennungsstellen der Nhel- und Mlul-Restriktionsenzyme, die zweite Kassette waren die Restriktionsenzyme Xbal und Notl.
In der zweiten Stufe der Klonierung wurde das Gen, das für den selektiven Marker für die Resistenz gegen Antibiotikum Neomycin (Neo) kodiert, durch das Gen für Desaminase von Blasticidin S (bsr) ersetzt, das Antibiotikaresistenz gegen Blasticidin verursacht. Zu diesem Zweck wurde eine optimierte Nucleotidsequenz, die Deaminase von Blasticidin S codiert, die die Erkennungsstellen der Restriktionsenzyme Avrll und BstBI enthält, bei GenScript (USA) synthetisiert. Das synthetisierte Gen wurde in das Plasmid pCB an den Stellen dieser Restriktionsenzyme anstelle des Neo-Gens eingefügt, um das Plasmid pCBp2 zu erhalten.
Die synthetisierten Gene OM-1-HC und OM-1-LC, kodierend die schweren und leichten Ketten des Antikörpers, die jeweils umfassen an ihren Enden Erkennungsstellen für die Restriktionsenzyme Nhel und Mlul (für OM-1-HC) und Xbal und Notl (für den OM-1 -LC). Gene OM-1-HC wurde in dem Plasmid pCBp2 eingefügt durch Nhel- und Mlul-Stellen Plasmid pCBp2-HC, OM-1-LC-Gene zu erhalten - in Plasmid pCBp2 die Stellen Notl und Xbal zu erhalten, um einen Plasmid pCBp2-LC.
Plasmide pCBp2-HC und pCBp2-LC wurden mit den Restriktionsenzymen Mlul und Notl und ligiert das erhaltene Plasmid pCBp2-OM1s zu erhalten. Sequenz OM-1-HC und OM-1-LC-Gens als Teil dieses Plasmids wurde durch Sequenzierung unter Verwendung der folgenden Primer überprüft wurde:

Primer für die Gensequenzierung OM1-LC:
- OM1-LC-F1: CAGAAGCCAGGGAAAGCAC
- OM1-LC-R1: TGTGCCTGACTTCAGCTGTT
Primer für die Gensequenzierung OM1-HC:
- OM1-HC-F1: CCCTCCAGCTCTCTGGGTAC
- OM1-HC-R1: CCCAGCAGTTCTGGTGCA

Transfektion von CHO-ksl-Zellen mit pCBp2-OM1s mit einem Plasmid
Die Zellen wurden unter Verwendung eines Elektroporators („BiTiks Harvard Apparatus“, Holliston, MA) transfiziert. 20 Millionen Zellen wurden in ein 50 ml Falkon-Röhrchen überführt und 5 Minuten bei 1000 U / min zentrifugiert. Das Medium wird entfernt und die Zellen werden erneut in 100-800 ul Elektroporationslösung („BT-Express“, Katalognummer 45-8050, Serie Nr. BT1201626), gemischt mit Vektor-DNA, gelöst. Die Zellen werden in eine Elektroporationsküvette überführt und ein Impuls wird angelegt. Unmittelbar nach dem Puls wurden die Zellen in einen T150-Zellkulturkolben überführt, der 27 ml Nährmedium enthielt.
Die Transfektion wurde zwei weitere Male durchgeführt (insgesamt 60 Millionen Zellen) und die Zellen wurden in einer T150-Flasche gesammelt. Alle Verfahren wurden unter sterilen Bedingungen durchgeführt. Die Zellen in der T150-Flasche wurden 2 Tage lang inkubiert.
Auswahl von Blasticidin und die Erzeugung eines stabilen Pools.

Zelldichte: 2,26 × 106 Zellen/ml
Zelllebensfähigkeit: 85,2%
Mittlerer Durchmesser der Zellen: 14,2 MKM
Gesamtzahl der lebenden Zellen = 67 Millionen

Dieses Ergebnis zeigt, dass die Zellen nach der Transfektion eine hohe Lebensfähigkeit behalten.

• Die Zellen wurden aus dem T150-Kolben gereinigt und in ein 50 ml „Falkon“-Röhrchen überführt.
• Die Zellen werden zentrifugiert und das Medium wird von den Zellen getrennt.
• Die Zellen werden in 30 ml CDM4CHO-Medium resuspendiert, das 400 µg / ml G-418 und 10 µg / ml Blasticidin enthält (Invitrogen, Katalognummer A11139-03, Serie Nr. 1145016).
• Die Zellen werden in 3 CultiFlask-Kolben (jeweils 10 ml Zellsuspension) überführt und mit 20 ml (pro Kolben) zusätzlichem Medium gemischt.
• Die Zellen wurden in einem CO2-Inkubator auf einem Schüttler (verbesserter digitaler Vibrator „ViDable-uA“) bei 179 U/min inkubiert.

Dann wurden die Zellen des stabilen OM1-Pools nach MoFLo FACS sortiert.
Klonierung einzelner Zellen in Platten mit 96 Vertiefungen und Enzymimmunoassay

• Die Wasserung von OM1-7-Zellen (50 Wells) 100 ug von Medium:
• 1:1-Mischung von ExCellCHO und PowerCHO-2 mit 400 µg/ml G-418 und 10 µg/ml Blasticidin
• Dies ergibt 50% der anfänglichen Antibiotikakonzentration.
• Basierend auf den ELISA-Ergebnissen wurden 24 am meisten exprimierte Klone ausgewählt, sie wurden in Platten mit 24 Vertiefungen in 1 ml Medium pro Vertiefung repliziert.
• Von den 24 vorgewählten Klonen zeigten drei die größte Stabilität und Produktivität.

Die nach dem obigen Verfahren erhaltene CHO-OM8-21-Zellinie weist eine hohe Produktivität von 0,8 g / l OM-RCA-01-Antikörper und eine hohe Affinität für den Antikörper gegen den FGFR1-Rezeptor von 9,27 × 10 & supmin; & sup9; M auf.
Die CHO-OM8-21-Zelllinie, Registrierungsnummer VKPM H-134, wurde am 6. November 2012 beim Internationalen Lager der Russischen Nationalen Sammlung industrieller Mikroorganismen FSUE GosNligenetika hinterlegt.
Die CHO-OM8-21-Zelllinie stammte von der stabilen ano-ploiden Zelllinie CHO-S (Invitrogen, Kat. Nr. R800-07), die als separater Subklon aus der CHO-K1-Zelllinie isoliert wurde. Das Gewebe sind chinesische Hamsterovarien (CHO), epitheloid.
Morphologie der Zelllinie.
Im Phasenkontrast- und Lichtmikroskop wird die Kultur durch eine Suspension von runden Zellen mit einem ovalen Kern dargestellt, der kleine Endosomen enthält. Die Verdopplungszeit beträgt 20-22 Stunden.
Kulturelle Eigenschaften, Markierungszeichen.
Die Zellen sind ohne Zugabe von Molke, Proteinen und in chemischen Medien ohne den Zusatz von tierischen oder menschlichen Komponenten an das Wachstum von Power CHO 2CD angepasst. Außerdem wachsen die Zellen auf traditionellen Medien mit dem Zusatz von Serum gut.
Empfohlene Bedingungen für das Einfrieren.
Friere die Zellen mit einer Dichte von ≥ 2,0 × 10 6 Lebendzellen / ml ein. Zentrifugiere die Zellsuspension, entferne den Überstand und resuspendiere das Zellpellet im Kulturmedium mit 7,5% DMSO. Freeze zu -800C mit einer kontrollierten Rate von 10C / min. Halten Sie die Zellen in kryogenen Röhrchen in flüssigem Stickstoff.
Empfohlene Bedingungen für den Anbau.
Die Zellen werden in Fläschchen mit 0,1-1,0 L (Volumen des Mediums - 20-30% des Gesamtvolumens) auf dem Orbitalschüttler bei 100-120 U / min in einer befeuchteten Atmosphäre bei 5% CO 2 kultiviert. Der Durchgang der Zellen wird alle 2-3 Tage durchgeführt, indem die Zellsuspension mit frischem Medium verdünnt wird. Die Keimdichte beträgt 0,2-0,3×106 Zellen / ml, die maximale Dichte 3,0x106 Zellen / ml. Falls erforderlich, kann eine Zentrifugation bei 200 x g durchgeführt werden.
Produziertes Produkt: monoklonaler Antikörper zur Behandlung von Krebs.Empfindlichkeit gegenüber Viren: vesikuläre Stomatitis, Arboviren.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Claims

Ein Antikörper oder ein funktionelles Fragment davon, das spezifisch den Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptor 1 bindet, einschließlich einer schweren Kette umfassend H-CDR1 mit Sequenz SEQ ID NO:1 oder Variantenfolge SEQ ID NO:1, oder eine Variante, die nacheinander eine oder zwei konservative Aminosäuresubstitutionen enthält, H-CDR2 mit Sequenz SEQ ID NO:2 oder Variantenfolge SEQ ID NO:2, das eine oder zwei konservative Aminosäuresubstitutionen enthält, und H-CDR3 mit SEQ ID NO:3 oder Variantenfolge SEQ ID NO:3, das eine oder zwei konservative Aminosäuresubstitutionen enthält, und eine leichte Kette enthaltend L-CDR1 mit Sequenz SEQ ID NO:4 oder Variantenfolge SEQ ID NO:4, das eine oder zwei konservative Aminosäuresubstitutionen enthält, L-CDR2 mit Sequenz SEQ ID NO:5 oder Variantenfolge SEQ ID NO:5, das eine oder zwei konservative Aminosäuresubstitutionen enthält, und L-CDR3 mit SEQ ID NO:6 oder Variantenfolge SEQ ID NO:6, das eine oder zwei konservative Aminosäuresubstitutionen enthält.
Der Antikörper oder ein funktionelles Fragment davon nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper oder das funktionelle Fragment davon spezifisch an die Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptor-Typ-II- und -Illc-Domänen bindet.
Der Antikörper oder ein funktionelles Fragment davon nach Anspruch 1, der einen Fibroblastenwachstumsfaktor Typ 1 Rezeptor mit einer Dissoziationskonstante Kd von 2 × 10 -9 M oder weniger bindet.
Der Antikörper oder ein funktionelles Fragment davon nach Anspruch 1, der einen Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Typ-1-Rezeptor mit einer Dissoziationskonstante Kd von 1,59 × 10 -9 M bindet.
Der Antikörper oder ein funktionelles Fragment davon nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die schwere Kette eine variable Domäne mit einer mindestens homologen Sequenz umfasst 90% SEQ ID NO:7.
Der Antikörper oder ein funktionelles Fragment davon nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die schwere Kette eine variable Domäne mit einer Sequenz umfasst SEQ ID NO:7.
Der Antikörper oder ein funktionelles Fragment davon nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die leichte Kette eine variable Domäne mit einer mindestens homologen Sequenz umfasst 90% SEQ ID NO:8.
Der Antikörper oder ein funktionelles Fragment davon nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die leichte Kette eine variable Domäne mit einer Sequenz umfasst SEQ ID NO:8.
Der Antikörper oder ein funktionelles Fragment davon gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die schwere Kette eine mindestens homologe Sequenz aufweist 90% SEQ ID NO:9.
Der Antikörper oder ein funktionelles Fragment davon nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die schwere Kette eine Sequenz aufweist SEQ ID NO:9.
Der Antikörper oder ein funktionelles Fragment davon nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die leichte Kette eine zu mindestens homologe Sequenz aufweist 90% SEQ ID NO:10.
Der Antikörper oder ein funktionelles Fragment davon nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die leichte Kette eine Sequenz aufweist SEQ ID NO:10.
Der Antikörper oder ein funktionelles Fragment davon nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper monoklonal ist.
Der Antikörper oder ein funktionelles Fragment davon nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper chimär, humanisiert oder human ist.
Der Antikörper oder ein funktionelles Fragment davon nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper ein Isotyp IgA, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 oder IgM ist.
Der Antikörper oder ein funktionelles Fragment davon nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper an ein cytotoxisches Mittel konjugiert ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung einer onkologischen Erkrankung, umfassend einen Antikörper oder ein funktionelles Fragment davon, wie in irgendeinem der Ansprüche beansprucht 1-16 in einer wirksamen Menge und einem pharmazeutisch verträglichen Träger.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die onkologische Erkrankung ein Nierenzellkarzinom ist.
Verwendung eines Antikörpers oder eines funktionellen Fragments davon nach einem der Ansprüche 1 bis 5 1-16 für die Behandlung von Krebs.
Verwendung eines Antikörpers oder funktionellen Fragments davon nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die onkologische Erkrankung ein Nierenzellkarzinom ist.
Verfahren zur Behandlung eines Krebses, umfassend das Verabreichen einer wirksamen Menge eines Antikörpers oder eines funktionellen Fragments davon an einen Patienten gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5 1-16 oder eine pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 17 oder Anspruch 18.
Nucleinsäure, die einen Antikörper oder ein funktionelles Fragment davon nach einem der folgenden kodiert A 1-16.
Nukleinsäure nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens eine homologe Sequenz aufweist von 90% SEQ ID NO:11.
Nukleinsäure nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Sequenz aufweist von SEQ ID NO:11.
Nukleinsäure nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens eine homologe Sequenz aufweist von 90% SEQ ID NO:12.
Nukleinsäure nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Sequenz aufweist von SEQ ID NO:12.
Chinesische Hamsterovarienzelllinie, umfassend eine Nucleinsäure nach einem der folgenden 22-26 zur Herstellung eines Antikörpers oder funktionellen Fragments davon nach einem der Ansprüche 1-16.
Die Zelllinie nach Anspruch 27, hinterlegt in der allrussischen Sammlung industrieller Mikroorganismen unter der Registrierungsnummer VKPM H-134.
Das Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers oder eines funktionellen Fragments davon nach einem der Ansprüche 1 bis 10 1-16, umfassend Kultivieren einer Zelllinie nach Anspruch 27 oder Anspruch 28 in einem Nährmedium und Isolieren des Antikörpers oder funktionellen Fragments davon aus den obigen Zellen und / oder dem obigen Medium.