NO173974B - Fremgangsmaate ved fremstilling av en cytotoksisk blanding - Google Patents

Fremgangsmaate ved fremstilling av en cytotoksisk blanding Download PDF

Info

Publication number
NO173974B
NO173974B NO87874569A NO874569A NO173974B NO 173974 B NO173974 B NO 173974B NO 87874569 A NO87874569 A NO 87874569A NO 874569 A NO874569 A NO 874569A NO 173974 B NO173974 B NO 173974B
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
cytotoxic
cells
mixture
epithelial cells
antibody
Prior art date
Application number
NO87874569A
Other languages
English (en)
Other versions
NO874569L (no
NO173974C (no
NO874569D0 (no
Inventor
Dominic Man-Kit Lam
Original Assignee
Baylor College Medicine
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Baylor College Medicine filed Critical Baylor College Medicine
Publication of NO874569D0 publication Critical patent/NO874569D0/no
Publication of NO874569L publication Critical patent/NO874569L/no
Publication of NO173974B publication Critical patent/NO173974B/no
Publication of NO173974C publication Critical patent/NO173974C/no

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • A61K47/6819—Plant toxins
    • A61K47/6825—Ribosomal inhibitory proteins, i.e. RIP-I or RIP-II, e.g. Pap, gelonin or dianthin
    • A61K47/6827—Ricin A
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6845—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a cytokine, e.g. growth factors, VEGF, TNF, a lymphokine or an interferon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/12—Ophthalmic agents for cataracts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Lubricants (AREA)
  • Liquid Crystal Substances (AREA)
  • Transition And Organic Metals Composition Catalysts For Addition Polymerization (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

Oppfinnelsen angår en fremgangsmåte ved fremstilling av en cytctoksisk blanding gjennom konjugering av et proteinmakromolekyl og et cytotoksisk reagens, hvori konjugeringen foreligger gjennom en binding som er særpreget ved cytoplastisk spaltbarhet
Ekstrakapsulær kataraktekstraksjon er en ønskelig fremgangsmåte for fjerning av katarakter på grunn av en lavere forekomst av postoperative komplikasjoner såsom cystoid macula-ødem og eventuell retinal løsgjøring med denne teknikk. Tilgjenge-lighet til en forbedret teknikk for ekstrakapsulær ekstraksjon såsom phacoemulgering og fordringen om en uskadd bakre linse-kapsel for implantering av mange forskjellige intraokulære linser har ytterligere understøttet anvendelsen av ekstrakapsulær kataraktekstraksjon. Imidlertid ledsages denne kirurgiske fremgangsmåte av en betydelig forekomst av opasifisering av den bakre linse-kapsel, hvilket kan fordre ytterligere kirurgiske inngrep (innsnitt i den bakre kapsel eller polering om igjen av den bakre linsekapsel) for oppnåelse av god syns-evne. Patogenesen ved opasifisering av den bakre linsekapsel etter ekstrakapsulær katarakt-ekstraksjon er beskrevet å skyldes formering av en liten rest av linseepitelceller på den bakre linsekapsel under dannelse av uutviklede linse-"fibrer" og "blære"-celler (d.v.s. Elschnig's perler).
Forskjellige teknikker er blitt beskrevet å inhibere denne sekundære kataraktdannelse eller opasifisering av den bakre linsekapsel. Roy et al. beskrev i Contact and Intraocular Lens Medical Journal (1979) 5:175-178 anvendelsen av vincristin og vinblastin. Bestråling ble også forsøkt, hvilket ble beskrevet å være lovende. Metotreksat og retinsyre er blitt beskrevet for inndrypping i øyets fremre kammer for forebygging av opasifisering av den bakre linsekapsel.
Fremstilling av monoklonale antistoffer er blitt beskrevet. Se for eksempel Monoclonal Antibodies, forfattere Roger H. Kennet, Thomas J. McKearn, Kathleen B. Bechtol, Plenum Press, New York, 1980; Nature (1975) 256:495-497: US-patent 4 271 145,
4 196 265, 4 172 124, 4 195 125, 4 262 090 og 4 294 927. Se også US-patent nr. 4 432 751, som beskriver kombinasjonen av monoklonale antistoffer og komplement for forebygging av sekundære katarakter.
Ifølge foreliggende oppfinnelse konjugeres et monoklonalt antistoff eller fragment derav gjennom den innledningsvis nevnte binding med et cytotoksisk reagens, hvori det cytotoksiske reagens er en A-kjede av et toksin. Den fremstilte cytotoksiske blanding er spesifikk for epitelceller og kan innføres i øyets bakre kammer samtidig med eller etter den ekstrakapsulære kataraktekstraksjon. Av spesiell interesse er innføring av ikke-cytotoksiske blandinger i det bakre kammer før innføring av de cytotoksiske blandinger, hvor de ikke-cytotoksiske og cytotoksiske blandinger hoved-sakelig har den samme bindings-affinitet for epitelceller. Fremgangsmåten er effektiv til forebygging av opasifisering av den bakre linsekapsel.
Den fremstilte blanding inhiberer av formering av små rester av linseepitelceller etter ekstrakapsulær ekstraksjon. Man drypper inn i øyets bakre kammer cytotoksiske blandinger som er spesifikke for epitelceller, for hovedsakelig inhibering av formering av linseepitelcellene. De cytotoksiske blandinger er hovedsakelig spesifikke for linseepitelcellene og har liten eller ingen kryss-reaktivitet overfor andre celler som finnes i det fremre kammer, såsom fibroblaster, melanocytter, hornhinne-endotelceller o.s.v., og ønskelig også overfor andre epitelceller, for eksempel hornhinneepitelceller. Fortrinnsvis inn-dryppes et ikke-cytotoksisk blanding, før inndrypping av den cytotoksiske blanding og før den ekstrakapsulære katarakt-ekstraksjon, i det fremre linsekammer, hvor den ikke-cytotoksiske blanding er kryssreaktivt med eller har hovedsakelig samme bindingsspesifisitet som den cytotoksiske blanding, for binding til hvilke som helst av cellene i det fremre kammer som er i kontakt med det fremre kammer med homologe determinant-eller antigen-seter.
Den cytotoksiske blanding er et konjugat av et proteinmakromolekyl som kan bindes hovedsakelig spesifikt til epitelceller, spesielt linseepitelceller, sammenliknet med andre celler som kan være tilstede i eller i kontakt med øyets fremre kammer. Det monoklonale antistoff kan være dannet som et resultat av hybridomdannelse og ekspresjon av hybridomet, enten det er i kultur eller tilstede som ascites, et fragment av et monoklonalt antistoff, såsom Fab, F(ab')2/ Fv, et rekombinant variabelt område, en T-celle-reseptor eller liknende. De monoklonale antistoffer og reseptorer kan være fra hvilket som helst pattedyr, innbefattende mus, kaniner, mennesker eller liknende, eller kombinasjoner av disse såsom kimæriske antistoffer med et stabilt humant område og et variabelt område fra mus eller annet pattedyr. Antistoffene kan være hvilken som helst klasse eller underklasse, såsom IgA, IgD, IgG, IgM, og kan innbefatte IgGl, 2a, 2b eller 3 eller de humane ekvivalenter til disse.
Fremgangsmåtene for fremstilling av de monoklonale antistoffer er vel-etablerte som vist ved de tallrike referanser beskrevet ovenfor. Videre kan de resulterende monoklonale antistoffer isoleres og modifiseres ved avskjæring av det stabile område ved forskjellige peptidase-digereringer. De monoklonale antistoffer kan reduseres under tilveiebringelse av Fab-fragmenter med tilgjengelige merkaptanseter for konjugering med andre praparater. T-celle-reseptorer kan oppnås som beskrevet i WO85/03947.
Forskjellige epitelceller kan anvendes som immunogenet, spesielt linseepitelceller, mer spesielt humane epitelceller, skjønt andre arter kan finne anvendelse, f.eks. primater. Hele celler er foretrukket, men homogenater, membranfragmenter eller liknende kan anvendes.
De bindende preparater med spesifisitet for epitelcellene kan knyttes til mange forskjellige toksiske blandinger, mikro-organismer eller planter. Av spesiell interesse er de toksiske undergrupper av naturlig forekommende toksiner, såsom ricin, abrin, difteritoksin o.s.v. Se for eksempel Oeltmann og Heath, J. Biol. Chem. (1979) 254:1022-1027; Yule og Neville Jr., Proe, Nati. Acad. Sei. USA (1980) 77:5483-5486; Gilliland et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA (1978) 75:5319-5323; US-patent
nr. 4 379 145; Britisk patent nr. 2 034 324 og Masuho et al., Biochem. Biophys. Res. Crnn. (1979) 90:320-326; og Blythman, Nature (1981) 290:145.
Illustrerende toksin-A-kjeder eller grupper som er effektive på samme måte, innbefatter difteritoksin-A-kjeder, enzymatisk aktive proteolytiske fragmenter fra Pseudomonas aeruginosa-eksotoksin A, ricintoksin-A-kjede, abrin-A-kjede, modeccin-A-kjede og proteiner funnet i • forskjellige planter med liknende aktivitet, såsom for eksempel plantene Gelonium multi-florum, Phytolacca americana, Croton tiglium, Jatropha curcas, Momordic charantia og hvetekim. Mutante arter av artenes toksiner kan også anvendes, såsom CRM45 (Boquet et al.,
Proe. Nati. Acad. Sei. USA (1976) 73:4449-4453).
De toksiske blandinger og reseptor kan sammenkoples, vanligvis ved hjelp av en binding som kan spaltes cytoplasmisk. Passende bindinger innbefatter disulfid, spesielt hvor den toksiske blanding har et iboende svovelatom, eller andre bindinger, såsom peptidbindinger, ureabindinger, tioetere, iminer, amider, imider, amidiner o.s.v. Funksjonelle grupper som kan finne anvendelse, innbefatter karboksylsyregrupper, aminogrupper, iminer, aldehyder, isocyanater, merkaptaner, olefiner eller liknende. Dessuten kan det anvendes mer komplekse bindingsgrupper, hvor en gruppe kan bindes til én av delene i konjugatet under tilveiebringelse av passende binding til en iboende gruppe i den annen del. For eksempel kan N-hydroksysuksinimidesteren av m-maleimidoylbenzosyre anvendes for fremstilling av et amid av toksinet, som så kan bindes gjennom et tilgjengelig svovelatom på det monoklonale antistoff under tilveiebringelse av en tioeter.
Cytotoksiske blandinger kan eksempelvis ha følgende formel:
hvor
ASn angir den toksiske blanding med én eller flere svovel-grupper som en del av midlet; n er fra 1 til antallet svovel-grupper tilstede i den toksiske blanding som er tilstede som tilgjengelige merkaptidgrupper, som vanligvis er opp til 4;
R er en monoklonalt-antistoff-reseptor eller et derivat derav; m er fra 1 opp til n, vanligvis 1-2; og X er en sammenbindende gruppe og kan være en binding eller en gruppe på fra 1 til 20, vanligvis 1-12 atomer som ikke er hydrogen og som innbefatter karbon, nitrogen, oksygen og svovel. Svovel vil normalt være bundet til karbon, spesielt alifatisk mettet. X kan være alifatisk, alicyklisk, aromatisk, heterocyklisk eller kombinasjoner derav, vanligvis med 0-6, mer vanlig fra 0 til 4, fortrinnsvis 1-4 heteroatomer, hvor oksygen og svovel er tilstede som okso eller ikke-okso-karbonyl eller tioanalogene derav, eller eter (innbefattende tioeter), og nitrogen er tilstede som amino eller amido. Heteroatomene vil hovedsakelig være bundet til karbon alene.
Illustrative grupper som binder disulfidet, innbefatter aminoetylen-3-propanylmetylenkarbonyl, a-suksinimidyl, 3-propy-lentiokarbonyl. De grupper som kan anvendes, er hovedsakelig konvensjonelle grupper som tilveiebringer en disulfidbinding. Disulfid-forbindelsen er én som kan reagere med den celle-spesifikke ligand, hvorved en merkaptidgruppe kan fjernes fra disulfidet, hvilket resulterer i en ny disulfidbinding mellom den toksiske blanding og liganden.
Bindingene vil hovedsakelig være alifatiske med fra 1 til 6 karbonatomer, idet det tilveiebringes en amidbinding til reseptoren, skjønt dette er først og fremst av bekvemmelighets-hensyn, ikke nødvendig for anvendbarheten av de foreliggende preparater.
Andre toksiske blandinger kan også anvendes, såsom vismut ikke-diffusivt bundet til de monoklonale antistoffer eller reseptorer som beskrevet av Waldman, J. Amer. Med. Assoc.
Alternativt kan liposomer bindes til de monoklonale antistoffer eller reseptorer, hvor liposomene inneholder forskjellige cytotoksiske blandinger, såsom metotreksat, 5-fluoruracil, hvilke som helst av de ovennevnte toksiner, eller liknende. Se for eksempel Szoka og Papahadjopoulos, Proe. Nati. Acad. Sei. USA (1978) 75:4194-4198 og Szoka et al., Biochem. et Biophys. Acta. (1980) 601:559-571 for dannelse av liposomer, hvilke beskrivelser er medtatt i det foreliggende som referanse. Binding av antistoffer til liposomet er blitt beskrevet i stor utstrekning i litteraturen; se for eksempel Heath et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA (1983) 80:1377-1381 og Leserman et al., Nature (1981) 293:226-228, hvis beskrivelser er medtatt i det
foreliggende som referanse.
Andre cytotoksiske blandinger konjugert med reseptoren kan også anvendes i forbindelse med den foreliggende fremgangsmåte ifølge denne oppfinnelse. Konjugatet vil være tilstrekkelig for tilveiebringelse av den cytotoksiske effekt uten tilsetning av hj elpe-agenser.
Den foretrukkede fremgangsmåte vil innbefatte innledende innsnitt rundt hornhinnen og inndrypping av 25-200, fortrinnsvis 50-150, mer foretrukket ca. 100 ^1 av et ikke-cytotoksisk blanding som spesifikt kan bindes til et sete som er kryssreaktivt med den cytotoksiske blanding. Denne blanding vil hoved-sakelig være et monoklonalt antistoff eller et spesifikt bindende fragment derav. Oppløsningen vil vanligvis være en fysiologisk tilfredsstillende oppløsning, som kan være salt-oppløsning, fosfatbufret saltoppløsning eller liknende og vil ha en konsentrasjon på 108-1013, mer vanlig 10<9->10<12> antistoffer pr. ml.
Antistoffene eller fragmentene derav vil bindes til alle seter som kan være kryssreaktive med den cytotoksiske blanding og vil også bindes ikke-spesifikt til "hot spots" som kan være tilstede inne i øyets fremre kammer. På denne måte vil cellene være beskyttet mot den cytotoksiske blanding.
Anvendelsen av det kryssreaktive bindemiddel vil være av spesiell betydning hvor den cytotoksiske blanding har kryss-reaktivitet med andre celler enn linseepitelceller. Ved anvendelse av den tidligere inndrypping av den kryssreaktive ikke-cytotoksiske reseptor kan cytotoksiske blandinger fremstilles som kryssreagerer i varierende grad med celler, spesielt epitelceller, som ikke er linseepitelceller.
Etter inndrypping av det ikke-cytotoksiske bindemiddel og inkubering i en tilstrekkelig tid til at bindemidlet bindes til dets homologe antigen, kan det fremre kammer skylles for fjerning av innholdet i det fremre kammer.
Enten før, men vanligvis etter, den ekstrakapsulære kataraktekstraksjon vil den cytotoksiske blanding bli innført i det fremre kammer i et fysiologisk tilfredsstillende medium (se ovenfor) i en mengde på 25-200, mer vanlig 50-150 /il av den cytotoksiske blanding, hvilken blanding vil være tilstede i en mengde som er tilstrekkelig til hovedsakelig fullstendig, eller fullstendig, å drepe alle linseepitelcellene. Antallet cytotoksiske molekyler vil vanligvis være i området 10<7->10n molekyler pr. ml. Vanligvis vil den cytotoksiske effekt kunne sees innen forholdsvis kort tid etter inndrypping av de cytotoksiske blandinger, vanligvis innen 0,5 time, eller kort tid deretter, når inhibering av proteinsyntesen anvendes for vurdering av begynnelsen av den cytotoksiske effekt. Hvis imidlertid leve-dyktigheten vurderes ved hjelp av en annen mekanisme, f.eks. vitalfarging o.s.v., kan det gå fra timer til dager før man merker cytotoksisk effekt (f.eks. celledød).
De foreliggende preparater kan tilveiebringes som utstyrssett for anvendelse ved én eller flere operasjoner. Utstyrs-settene vil innbefatte de ikke-cytotoksiske blandinger og de cytotoksiske blandinger, enten som konsentrater som kan for-tynnes ytterligere før anvendelse eller ved anvendelses-konsentrasjonen, hvor ampullene kan innbefatte én eller flere doseringer. Enkeltdoseringer kan passende tilveiebringes i sprøyter som oppbevares i steriliserte beholdere, slik at legen kan anvende sprøytene direkte, hvor sprøytene vil ha den ønskede mengde og konsentrasjon av agenser. Således kan utstyrssettet ha mange sprøyter som inneholder den cytotoksiske blanding såvel som den ikke-cytotoksiske blanding i passende forholdsmessige mengder. Hvor sprøytene inneholder produktene for direkte anvendelse, vil det vanligvis ikke være noe behov for andre reagenser for anvendelse ved fremgangsmåten.
De følgende eksempler er gitt som illustrasjon.
Eksempel 1
Fremstilling av monoklonale antistoffer
A. Immunisering
Mus (BALB/c) ble immunisert med humane cervikale karsinom-epitelceller (ME180) ved i.p. injeksjon av ca. 5 x 10<6> celler pr. 200 fil tre ganger over 2 ukers intervaller og i.v. 3 dager før isolering av milten med 5 x 10<6> celler pr. 200 ul. Ytter-ligere mus (BALB/c) ble immunisert med humane linseepitelceller, oppnådd etter kataraktkirurgi, emulgert i Freunds Complete Adj uvant. Ca. 5 x IO<5> celleekvivalenter pr. 200 fil ble gitt pr. dyr for den primære injeksjon. Ytterligere injeksjoner bestående av ekvivalent cellemateriale emulgert i Freunds Incomplete ble gitt i.m. med 3 ukers mellomrom. Disse mus fikk to ytterligere injeksjoner av enten ME180-celler eller humane amnionceller (WISH) før høsting av miltene for sammensmeltning.
B. Sammensmeltning
Milter fra immuniserte dyr ble fjernet 3-5 dager etter den siste injeksjon og fremstilt som en enkeltcellesuspensjon. Lymfocyttene ble deretter sammensmeltet med P3-X-63/Ag8.653 musemyelomceller under konvensjonelle betingelser. Se US-patent nr. 4 432 751, hvis beskrivelse er medtatt i det foreliggende som referanse. Etter sammensmeltningen ble cellene suspendert på nytt i Iscoves medium inneholdende hypoxantin, aminopterin og tymidin (HAT-medium) og anbrakt i brønner i henhold til antallet myelomceller under oppnåelse av en densitet på ca. 10<*> celler pr. brønn. Cellene ble ernært på dagene 5, 12 og 15 ved fjerning og erstatning av halvparten av mediet. Kulturer identifisert som positive for antistoffsekresjon ved screening-rekker ble over-ført til 24-brønns-plater som inneholdt 1 ml Iscoves medium inneholdende hypoxantin og tymidin (HT) .
C. Screening
(i) ME180- immunisering; For screening ble hybridom-supernatanten (100 jil) og 100 /il ME180-celler (2 x 105 celler pr. ml) inkubert ved 4° i 1 time og deretter ved 37° over natten i mikrotitrerplater med 9 6 brønner. Brønnene ble undersøkt mik-roskopisk for påvisning av forstyrrelser (forstyrret adhesjon). Celler som viste tegn til forstyrrelse ble isolert og klonet 3 ganger. Ett av de hybridomer som hadde positiv test, ble betegnet 3D4. 3D4 gir et monoklonalt IgG-L-antistoff som bestemt ved geldiffusjon under anvendelse av klassespesifikt antiserum
(ICN).
(ii) HLE/ ME180- immunisering: For screening ble hybridom-supernatanter undersøkt med hensyn til binding til ME180-celler ved ELISA. Bundet muse-immunoglobulin ble påvist ved geite-antimus-IgG-hestereddik-peroksydase. Ett av hybridomene som ga positiv test, ble betegnet 4757. Dette hybridom gir et IgGx, som bestemt ved geldiffusjon. (iii) HLE/ WISH- immunisering: For screening ble hybridom-supernatant undersøkt med hensyn til binding til WISH-celler ved ELISA. Bundet muse-immunoglobulin ble påvist som beskrevet.
Ett av de hybridomer som ga positiv test, ble betegnet 4197. Dette hybridom gir et IgG2a-antistoff som bestemt ved gel-dif fusjon. (iv) Humant linseepitelcelleantigen: Hybridomsuper-natanter fra sammensmelting utført med miltceller oppnådd fra humane linseepitelcelle-immuniserte mus ble undersøkt ved ELISA. Plater med 96 brønner ble belagt med en Nonidet-P-4 0-løselig fraksjon av humane linseepitelceller oppnådd etter katarakt-kirurgi. Femti mikroliter av denne løselige fraksjon pr. brønn ble tilsatt til plater med 96 brønner, tørket og fiksert med 0,05% glutaraldehyd i 15 minutter ved 25°C. Platene ble vasket og inkubert med celledyrkningsmedium inneholdende 10% FBS i 60 minutter ved romtemperatur. (Kelleher et al., Cancer Immmunol. Immunother (1983) 14:185-190 og Mujoo et al., J. Biol. Chem.
(1986) 261:10299-10305). Hybridom-supernatanter, 50 ^l/brønn, ble tilsatt til brønnene og inkubert i 60 minutter. Brønnene ble deretter vasket og bundet antistoff påvist ved geite-antimus-IgG-hestereddik-peroksydase. Kulturer som ga positiv test ble ekspandert til plater med 24 brønner og ytterligere utprøvet med hensyn til cellulær bindingsspesifisitet.
D. Cellebinding av monoklonalt antistoff
Supernatanter fra hybridomer 3D4, 4197 og 4757 ble utprøvet ved ELISA med hensyn til evne til binding til både normale og tumorceller. Vedheftende cellelinjer ble dyrket til konfluens i plater med 96 brønner og deretter fiksert med 0,05% glutaraldehyd i 10 minutter. Suspensjonskulturer ble festet til poly-L-lysin-belagte plater og fiksert som -ovenfor. Monoklonalt antistoff i dyrkningsmedium ble tilsatt i brønnene og inkubert ved 37°C i 1 time. Platene ble vasket tre ganger og bundet muse-IgG påvist med geite-antimus-IgG konjugert med heste-reddikperoksydase. Binding av de monoklonale antistoffer til forskjellige celletyper er vist i Tabell 1.
Antistoffene fremstilt under anvendelse av humane cervikal-karsinomceller eller andre epitelceller som immunogen kan bindes til kanin-linseepitelceller såvel som epitelceller som stammer fra mange forskjellige vev. Det er liten eller ingen binding til celler av ikke-epitel-opprinnelse. Dessuten er det vist at antistoffene fra 3D4, 4197 og 4757 binder humane linseepitelceller ved immunocytokjemisk farging. Disse resultater er vist i Tabell 2.
Eksempel 2
Fremstilling av Toksin- A- kiede- antistoffkoniugater
A. Fremstilling av Toksin- A- kiede
(i) Difteritoksin: Fragment A (DTA) fremstilles ut fra difteritoksin (Connaught Laboratories) som beskrevet (Chung og Collier, Biochem. Biophys. Acta (1977) 483:248-257) og oppvarmes til 8 0°C i 10 minutter for inaktivering av eventuelle restspor av toksin. Enzymatisk aktivitet overfor DTA undersøkes ved ADP-ribosylering av hvetekim-forlengelsesfaktor 2 med <1>AC-NAD som substrat. (ii) Ricin- toksin: Ricin-toksin ble renset fra ricinusfrø
(A.H. Hummert Seed Co., St. Louis, Missouri) ved affinitetskro-matografi på Sepharose 4B. (Nicolson og Blaustein, ibid. (1972) 266:543-54 og modifisert av Cawley et al., Arch. Biochem. Biophys. ( ) 190:744-755). Ricin-toksin-A-kjede (RTA) ble renset fra helt ricin-toksin ved reduksjon fra 2-merkaptoetanol og kromatografi på Cellex-D (Bio-Rad) (Olsnes og Pihl, Biochem.
(1973) 12:3121-3126). RTA frigjøres for restspor av ricin-toksin ved gjentatt sirkulering på kolonner av Sepharose 4B.
B. Syntese av Toksin- SS- Antistoffkoniuqater
(i) Syntese av ( DTA)- SS- antistoffkoniuqater:
Antistoff 3D4 (7,0 ml, 2 mg/ml) dialyseres mot Dulbeccos fosfatbufret saltoppløsning (DPBS Gibco), pH 7,4, inneholdende anti-biotisk-antimykotisk oppløsning (Gibco, 5,0 ml pr. liter). N-suksinimidyl-3-(2-pyridylditio)-propionat (SPDP) (0,186 ml,
10 mM) i absolutt etanol tilsettes til antistoffet under kraftig blanding. Blandingen får reagere i 3 0 minutter ved romtemperatur og dialyseres deretter mot to skift på 1 liter av den samme buffer. Etter dialyse analyseres antistoffpreparatet med hensyn til 2-pyridyldisulfid-innhold som beskrevet (Stuchbury et al., Biochem. J. (1975) 151:417-432). DTA (3,0 ml, 2,5 mg/ml) reduseres ved tilsetning av 0,3 ml 1,0 M ditiotreitol, pH 7,0, i 30 minutter ved romtemperatur og avsaltes på Sephadex G-25 (2,6 x 12 cm kolonne) ekvilibrert med bufferen beskrevet ovenfor. Fraksjoner med maksimalverdi fra kolonnen samles (11,0 ml, 0,53 mg/ml) og blandes med PDP-(3D4)-antistoff (7,0 ml, 2,1 mg/ml). Sluttkonsentrasjon av DTA og antistoff er henholdsvis 1,5 x
10"<5> M og 5,5 x 10"<6> M. Det endelige molare forhold mellom DTA og antistoff i reaksjonsblandingen er ca. 3. Råkonjugat-preparatet (18,0 ml) konsentreres til et endelig volum på 0,9 ml ved ultrasentrifugering på en membran av typen Amicon YM-10. Ubear-beidet (DTA)-SS-(3D4) (9,0 ml) kromatograferes på en kolonne av typen Sephacryl S-2000 (2,6 x 106 cm, strømnings-hastighet 22,1 ml/time) ekvilibrert med DPBS-buffer. Hver fraksjon (6,2 ml) analyseres med hensyn til ADP-ribosylerings-aktivitet og ved natriumdodecylsulfat/polyakrylamid-gelelektroforese (SDS/PAGE).
Fraksjonene 3 0-4 0 samles, konsentreres på en membran av typen Amicon YM-10 og anvendes ved cytotoksisitetsforsøk etter ste-ril filtrering. (ii) Syntese av ( RTA)- SS-( 3D4)- antistoffkoniuqat:
(RTA)-SS(3D4) ble syntetisert som beskrevet av Kernan et al.,
J. Biol. Chem. (1984) 133:137-146. Kort oppsummert ble 3D4
(1-2 mg/ml) dialysert mot 0,1 M NaP0A, 0,1 M NaCl, pH 7,7, og 15-20-dobbelt molart overskudd av n-suksinimidyl-3-(2-pyridyl-ditiopropionat) (SPDP) ble tilsatt til antistoffet under kraftig blanding. Etter inkubering ved romtemperatur i 30 minutter ble den pyridylditiopropionat-(PDP)-modifiserte antistoffoppløsning dialysert mot to skift av PBS. Etter dialyse ble forholdet mellom PDP-gruppe og antistoff bestemt. RTA ble redusert i begynnelsen ved tilsetning av ditiotireitol ved en sluttkonsentrasjon på 50 mM, fulgt av inkubering i 1 time ved romtemperatur. RTA ble deretter dialysert grundig mot PBS (4°C) under fjerning av eventuelle rester av reduserende middel. RTA ble deretter konsentrert ved anvendelse av en omrørt Amicon-celle utstyrt med en YMIO-membran til en sluttkonsentrasjon på 4 mg/ml. Et 5-10-dobbelt molart overskudd av RTA ble deretter tilsatt til PDP-antistoffoppløsningen og inkubert i 16 timer ved 4°C. RTA-3D4-konjugatet ble renset ved kromatografi på Sephacryl S-200.
C. Effekt av 3D4- ricin^ A- koniuqater på målceller:
(i) Cvtotoksisitet: Målceller (ME180, RPMI 7932; kanin-linseepitelceller (RLE)) ble utplatet i 96-brønns-plater under oppnåelse av 25% konfluens. Ricin-A-konjugat (forrådsoppløsning 1 mg protein pr. ml) eller kontrollmedier ble tilsatt ved de angitte fortynninger og inkubert i 10 minutter ved enten 37 eller 25°C. Supernatanten ble fjernet, cellene vasket to ganger og friskt medium uten toksin-konjugat tilsatt i brønnene. Platene ble inkubert ved 37°C inntil kontrollbrønnene var konfluente. Celledensiteten ble så bestemt ved omdannelse av det gule fargestoff 3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyltetra-zoliumbromid (MTT) til et purpurfarget produkt ved levende celler direkte proporsjonalt til celleantall og metabolsk aktivitet. Tilsynekomst av produktet ble målt spektrofoto-metrisk. Mosmann, J. Immunol. Methods (1983) 65:55. Prosentvis reduksjon i cellene ble beregnet ved:
Resultatene er vist i Tabell 4 nedenfor.
Formering av spesifikke mål-epitelceller ble betydelig hemmet ved utsettelse for så lite som 10 / ig protein pr. ml 3D4-rici.i-A-konjugat, en konsentrasjon som ikke hadde noen effekt på kontrollceller av typen RPMI 7932.
(ii) Inhibering av vekst:
Humane linseepitelceller oppnådd ved katarakt-kirurgi ble inkubert i RPMI 1640 inneholdende 10% FBS. For forsøket ble dyrkningsmediet fjernet og erstattet med 3D4-RTA-immunokonjugat i medium (20 jug/ml) eller medium alene i 6 timer ved 37°C. Etter denne inkubering ble cellene vasket og gitt friskt dyrkningsmedium uten konjugat og inkubert i 48 timer. <3>H-leucin ble tilsatt til alle kulturer 24 timer før høsting av TCA-utfellbart protein. Thorpe et al., Eur. J. Biochem. (1981) 116:447; Domingo og Trowbridge, Methods in Enzymology (1985) 112:238; Vitetta et al. Proe. Nat. Acad. Sei. USA (1983) 80:6332. Resultatene er vist i Tabell 5.
Basert på disse data viser det seg at det monoklonale anti-stof f-toksin-konjugat flyttes inn i linseepitelcellen hvor den cytotoksiske del er aktiv.
Eksempel 3
Inhibering av cytotoksisk effekt av
konjugat ved tidligere inkubering
med ukoniugert monoklonalt antistoff
For å vise beskyttelse av kryssreaktive celler som binder konjugatet spesifikt, ble ukonjugert 3D4 eller medium alene tilsatt til kulturene 10 minutter før tilsetting av 3D4-ricin-toksin A. En fortynning av konjugat (som angitt i Tabell 6) ble deretter tilsatt til cellene, inkubert i 60 minutter ved 37°C. Cellene ble gitt friskt medium og inkubert i 3 dager ved 37°C. Celledensiteten ble bestemt med MTT som beskrevet ovenfor (Se Eksempel 2).
Eksempel 4
Effekt av konjugat på formering av linseepitelceller in vivo
Hvite New Zealand-hunn-kaniner, 3 kg, undergikk ekstrakapsulær linsefjerning under vanlig bedøvelse. (Emery et al., The CV. Mosby Company, 1983)). Før operasjonen fikk dyrene en injeksjon av 3D4-IgG i balansert saltoppløsning (BSS) (Alcon Labs, Fort Worth, TX) i det fremre kammer. Forkapselinnsnitt ble utført og linsen ekstrahert ved hjelp av en fakoemulgator av typen Kelman (Cooper Vision, Irvine, CA). Linsematerialet ble bortsugd/utskyllet fra øyet med BSS. Like før avslutning ble 2 00 / il immunokonjugat eller BSS injisert i det fremre kammer. Øynene ble behandlet eksternt med bredspektret-antibiotikum-salve og steroider. Øynene ble undersøkt med hensyn til tegn på små rester av linseepitelcelle-formering.
Ved inndrypping av de aktuelle cytotoksiske blandinger, spesielt etter inndrypping av bindemidlet, kan man forebygge formering av små rester av linseepitelceller, idet man således unngår sekundære katarakter. De foreliggende fremgangsmåter og preparater tilveiebringer en sikker og enkel fremgangsmåte for forebygging av sekundære katarakter uten at man skader annet vev i øyet, idet det således tilveiebringes et sikkert alternativ til tidligere cytotoksiske blandinger som har funnet anvendelse og er funnet å ha generelle cytotoksiske effekter.
Alle publikasjoner og patentsøknader nevnt i denne beskrivelse angir fagnivået hos fagfolk på det område som denne oppfinnelse vedrører. Alle publikasjoner og patentsøknader er i det foreliggende medtatt som referanse i den samme utstrekning som om hver individuell publikasjon eller patentsøknad var spesifikt og individuelt angitt å være medtatt som referanse.
Idet oppfinnelsen nå er beskrevet i sin helhet, vil det være klart for en fagmann på området at det kan gjøres mange forandringer og modifikasjoner når det gjelder oppfinnelsen uten at man avviker fra ånden eller rammen for de tilknyttede krav.

Claims (3)

1. Fremgangsmåte ved fremstilling av en cytotoksisk blanding gjennom konjugering av et proteinmakromolekyl og et cytotoksisk reagens, hvori konjugeringen foreligger gjennom en binding som er særpreget ved cytoplastisk spaltbarhet, karakterisert ved at
(1) et monoklonalt antistoff eller fragment derav konjugeres gjennom nevnte binding med
(2) et cytotoksisk reagens, hvori det cytotoksiske reagens er en A-kjede av et toksin.
2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det som A-kjede anvendes en ricin-A-kjede, en abrin-A-kjede eller en difteritoksin-A-kjede.
3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det som monoklonalt antistoff anvendes et monoklonalt antistoff med evne til spesifikk binding til epiteliale celler .
NO874569A 1986-11-04 1987-11-03 Fremgangsmaate ved fremstilling av en cytotoksisk blanding NO173974C (no)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US92731886A 1986-11-04 1986-11-04

Publications (4)

Publication Number Publication Date
NO874569D0 NO874569D0 (no) 1987-11-03
NO874569L NO874569L (no) 1988-05-05
NO173974B true NO173974B (no) 1993-11-22
NO173974C NO173974C (no) 1994-03-02

Family

ID=25454561

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO874569A NO173974C (no) 1986-11-04 1987-11-03 Fremgangsmaate ved fremstilling av en cytotoksisk blanding

Country Status (12)

Country Link
EP (1) EP0267005B1 (no)
JP (1) JPH07121878B2 (no)
AT (1) ATE83666T1 (no)
AU (1) AU608257B2 (no)
CA (1) CA1338777C (no)
DE (1) DE3783211T2 (no)
DK (1) DK575487A (no)
ES (1) ES2053561T3 (no)
FI (1) FI95203C (no)
GR (1) GR3007052T3 (no)
IE (1) IE60436B1 (no)
NO (1) NO173974C (no)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU618317B2 (en) * 1987-12-31 1991-12-19 Tanox Biosystems, Inc. Unique antigenic epitopes on ige-bearing b lymphocytes
WO1995003783A1 (en) * 1990-03-06 1995-02-09 Houston Biotechnology Incorporated Polymeric device for the delivery of immunotoxins for the prevention of secondary cataract
US5876438A (en) * 1993-08-02 1999-03-02 Houston Biotechnology Incorporated Polymeric device for the delivery of immunotoxins for the prevention of secondary cataract
US5620013A (en) * 1994-10-21 1997-04-15 American Cyanamid Company Method for destroying residual lens epithelial cells
US6063116A (en) * 1994-10-26 2000-05-16 Medarex, Inc. Modulation of cell proliferation and wound healing

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0044167A3 (en) * 1980-07-14 1982-04-21 The Regents Of The University Of California Antibody targeted cytotoxic agent
US4432751A (en) * 1982-03-05 1984-02-21 Baylor College Of Medicine Monoclonal antibodies against lens epithelial cells and preventing proliferation of remnant lens epithelial cells after extracapsular extraction
DE3483996D1 (de) * 1983-09-15 1991-02-28 Univ Leland Stanford Junior Allotransplantat mit verminderter immunogenitaet und verfahren und reagenz fuer seine herstellung.
EP0173648A3 (en) * 1984-08-30 1988-04-27 Ciba-Geigy Ag New monoclonal antibodies to glycoconjugates, processes for their production, and applications
US4590071A (en) * 1984-09-25 1986-05-20 Xoma Corporation Human melanoma specific immunotoxins

Also Published As

Publication number Publication date
EP0267005A3 (en) 1989-11-08
FI95203B (fi) 1995-09-29
FI874852A (fi) 1988-05-05
NO874569L (no) 1988-05-05
JPS63211239A (ja) 1988-09-02
FI874852A0 (fi) 1987-11-03
DK575487A (da) 1988-05-05
JPH07121878B2 (ja) 1995-12-25
NO173974C (no) 1994-03-02
DK575487D0 (da) 1987-11-03
EP0267005A2 (en) 1988-05-11
DE3783211T2 (de) 1993-04-29
IE872977L (en) 1988-05-04
GR3007052T3 (no) 1993-07-30
FI95203C (fi) 1996-01-10
IE60436B1 (en) 1994-07-13
AU8066687A (en) 1988-05-05
DE3783211D1 (de) 1993-02-04
CA1338777C (en) 1996-12-10
AU608257B2 (en) 1991-03-28
ATE83666T1 (de) 1993-01-15
ES2053561T3 (es) 1994-08-01
EP0267005B1 (en) 1992-12-23
NO874569D0 (no) 1987-11-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5055291A (en) Compositions for preventing secondary cataracts
RU2130780C1 (ru) Композиция и способ обработки неопластической клетки
US5744580A (en) Immunotoxins comprising ribosome-inactivating proteins
US4966577A (en) Prevention of lens-related tissue growth in the eye
NO301168B1 (no) Fremgangsmåte for fremstilling av et konjugat av et antistoff rettet mot antigen
NO303122B1 (no) FremgangsmÕte for fremstilling av immunkonjugater
US5837491A (en) Polynucleotides encoding gelonin sequences
US4871350A (en) Methods and compositions for preventing secondary cataracts
NO314686B1 (no) Immuntoksiner rettet mot CD33-beslektede overflateantigener, farmasöytisk preparat og anvendelse derav
EP0267005B1 (en) Compositions for preventing secondary cataracts
US5616122A (en) Methods and compositions for preventing secondary cataracts
CA1333048C (en) Monoclonal antibodies against lens epithelial cells and methods for preventing proliferation of remnant lens epithelial cells after extracapsular extraction
FI94258C (fi) Menetelmä linssin epiteelisoluihin olennaisesti spesifisesti sitoutuvan sytotoksisen koostumuksen valmistamiseksi ja menetelmä siinä käytettävän monoklonaalisen vasta-aineen valmistamiseksi
US6306626B1 (en) Anti-IgM monoclonal antibodies and methods of their use
RU2105062C1 (ru) Конъюгат на основе анти-jgm-антитела (варианты) и способ снижения секреции jgm антитела лимфоцитами (варианты)
WO1995033492A1 (en) Methods and compositions for modulation of wound healing
WO1995033492A9 (en) Methods and compositions for modulation of wound healing
AU650659C (en) Monoclonal anti-IgM antibodies, their production and use, and hybridomas for producing the same

Legal Events

Date Code Title Description
MM1K Lapsed by not paying the annual fees