CN102791733A - 抗hsv 抗体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及如权利要求中定义的抗HSV抗体，包含有效量的所述抗体的药物组合物，包含编码所述抗体的核苷酸序列的表达载体，包含所述核苷酸序列的宿主细胞，能够产生所述抗体的杂交瘤细胞和所述抗体作为药物的用途，特别涉及用于制备用于预防性或治疗性处理受试者中的HSV相关疾病的药物的用途；如权利要求中所定义。
Description
发明背景
本发明涉及如权利要求中定义的抗HSV抗体，包含有效量的所述抗体的药物组合物，包含编码所述抗体的核苷酸序列的表达载体，包含所述核苷酸序列的宿主细胞，能够产生所述抗体的杂交瘤细胞和所述抗体作为药物的用途，特别涉及用于制备用于预防性或治疗性处理受试者中的HSV相关疾病的药物的用途；如权利要求中所定义。
人致病性单纯疱疹病毒(HSV)是嗜皮肤的和嗜神经的DNA病毒，其临床表现主要起源于皮肤和附近的粘膜，继发性导致神经并发症，例如神经炎、脑膜炎、脑炎、脊髓炎、多神经根炎等等。在先天性、获得性和医原性的免疫缺陷的情况下，报告了一定程度上的严重进展，具有高致死性。由于具有1型HSV(HSV-1,95%;唇疱疹,角膜疱疹,疱疹性湿疹)和2型HSV(HSV-2,10-30%;生殖器疱疹,新生儿疱疹)的群体的高感染率，并且由于该病毒经常被重新激活，在感觉和自主神经节中持续终生潜伏，所以HSV具有特别的临床意义。与病毒的类型无关，原发或复发性HSV感染的征候治疗目标是抑制病毒复制、缩短患病时间，和预防影响复发频率的系统性并发症。
在早识别和正确用药剂量的情况下，病毒抑制试剂被成功用于抗病毒治疗。最常见的病毒抑制试剂(例如阿昔洛韦,喷昔洛韦,膦甲酸,碘苷)是核苷或焦磷酸盐类似物，其共同的活性原理是基于在病毒感染的细胞中抑制DNA的合成。
治疗HSV感染的最重要的治疗剂之一是嘌呤核苷类似物阿昔洛韦。其被病毒胸苷激酶磷酸化，然后干扰病毒DNA聚合酶。与此相反，人的DNA聚合酶对于阿昔洛韦的易感性仅有1/50至1/30，因此仅观察到边际效应。
然而，虽然在选择性作用的病毒抑制试剂上有进展，但是病毒性疾病的化学治疗仍然是严重的问题。特别地，在长时间的预防性和治疗性处理免疫抑制患者时观察到的针对常见的化疗剂的抗性株系的出现是个问题。因此，在10%以上的病例中，由于缺乏有效的病毒抑制试剂，观察到了迅速进展的泛发的感染，具有致死性进展。
目前，焦磷酸盐类似物膦甲酸特别用于在免疫抑制患者中抵抗阿昔洛韦抗性疱疹病毒。该试剂引起病毒DNA聚合酶的直接抑制，并且对于胸苷激酶没有影响。然而，膦甲酸的使用导致严重的不希望的副作用，例如肾衰竭、心脏问题、对于骨髓具有毒性，并且还可能导致皮肤溃疡。由于其致畸形效应，在环孕期间也不能施用膦甲酸。此外，观察到交叉抗性株系的形成，这使得替代性治疗剂的开发成为高度必需的。目前没有被动免疫预防。一些针对HSV1和HSV2的主动免疫的实验性疫苗未显示出可证实的成功。
抗体对于治疗癌症、自身免疫病症和病毒感染具有极大的前景。JP6135854描述了针对单纯疱疹病毒感染的治疗剂，其中通过静脉内点滴以注射的形式同时或相继施用针对HSV的人单克隆抗体和抗病毒核酸类似物例如阿昔洛韦(ACV)。DK 187286公开了显示出针对来自HSV-1和HSV-2的糖蛋白D(gD)(HSV gD-1和gD-2)的多特异性免疫反应性的抗体。WO 1997/26329描述了对于诊断和治疗HSV-1和HSV-2有用的人单克隆抗体。后者的抗体与HSV 863单克隆抗体竞争与HSV-1和HSV-2的糖蛋白D抗原的结合。US 4,950,595公开了小鼠-人杂交瘤，其产生抗病毒-人抗体，其制备方法，以及抗病毒-人单克隆抗体。
此外，描述了特异于HSV1/2的另一鼠单克隆抗体(Fd79)(Kogae etal.,1986)的人源化(Co,M.S.et al.,1991;Zeitlin L.et al.,1998)。该抗体识别HSV1和HSV2的糖蛋白B(gB)的共有表位。此外，已经在转基因植物和真核细胞系SP2/0中产生了人源化Fd79，并随后进行了表征，显示出53nM的亲和性。
鼠单克隆抗体H1815识别糖蛋白B(gB)的氨基酸263-283的区域中的相似但不同的表位(Navarro et al.,1992)。然而，H1815不能进行病毒中和或抑制“细胞至细胞的传播”。
最后，US 6,180,370描述了人源化的免疫球蛋白及其制备方法。此外，WO 2003/105782涉及鼠抗体特异性接枝至人框架。
因此，化疗剂具有不希望的副作用，并且观察到数目渐增的抗性株系。
因此，本发明的目标是提供能够中和HSV感染并抑制细胞至细胞的传播的(人源化的)抗HSV抗体。此外，本发明的目标是提供用于治疗HSV相关疾病的预防剂和/或治疗剂，其克服了常规应用的化疗剂的上述缺点。
令人惊奇的是，发现根据本发明的抗体实现了该目标。因此，本发明提供了用于治疗HSV感染的本领域已知的治疗剂的有前景的替代物，其是基于重组产生的抗体，其可以是人源化的。这些抗体能够阻断病毒在宿主内传播的两种机理。它们有效地中和无细胞的病毒颗粒，并抑制病毒的直接的细胞至细胞传播。由于该抗体特异性结合HSV1和HSV2被膜的表面糖蛋白B(gB)的高度保守的表位，而gB对于病毒复制周期是必不可少的，所以，药物抗性的出现是极不可能的。
虽然本发明的鼠抗体的效应已经部分地被描述，见参考文献Eis-Hübinger et al.,Intervirology(1991);32:351-360和Eis-Hübinger etal.,Journal of General Virology(1993);74:379-385，但是从未公开过或使公众可获得抗体本身或本发明的抗体的互补决定区(CDR)的序列，以及其所结合的表位。
总之，(人源化的)抗体提供了以下一项或多项优点：
■已经证明了本发明的鼠单克隆抗体的功效(见Eis-Hübinger et al.,1991;Eis-Hübinger et al.,1993)。此外，本发明人在实施例部分证明了本发明的人源化抗体也能够在体外中和HSV1和HSV2病毒感染，并通过抑制“细胞至细胞传播”机制而抑制病毒传播。在人类中的感染进展的情境中，人免疫系统不能产生用于有效预防HSV1/2典型性细胞至细胞传播的抗体特异性。
■保守性化疗剂例如阿昔洛韦和膦甲酸的经常性和长期性的预防性以及治疗性应用导致抗性病毒株系的形成增加。该抗性问题可以通过单独施用的或与病毒抑制试剂例如阿昔洛韦和/或膦甲酸组合施用的本文描述的(人源化)抗HSV抗体得以克服，因为其依赖于不同的作用机理。
■本文描述的抗体特异性结合HSV gB蛋白的表位。预期不会有针对本发明的抗体的HSV抗性的出现，因为gB蛋白的突变会导致病毒感染力的丧失。
■禁忌系统性施用常规的病毒抑制试剂的患者特别地获益于本文描述的(人源化)抗体。
发明内容
因此，提供了包含如SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的互补决定区的抗体。另外，提供了与包含SEQ ID NO:1-6所示的互补决定区的抗体识别相同表位的抗体。
此外，还提供了包含有效量的本文描述的抗体和至少一种药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
此外，提供了包含编码如权利要求中定义的抗体的核苷酸序列的表达载体，包含所述核苷酸序列的细胞，和能够产生所述抗体的杂交瘤细胞。
最后，本文还提供了用作药物的如权利要求中定义的抗体，如权利要求中定义的抗体用于制备用于预防性或治疗性处理受试者中的HSV相关疾病的药物的用途。
如独立权利要求中所定义的本发明的各个方面和包含于从属权利要求中的优选实施方式通过引用方式并入本文。
发明详述
因此，在第一个方面，本发明涉及包含如SEQ ID NO:1(TSGMSVG),SEQ ID NO:2(HIWWNNDKYYKPALKS),SEQ ID NO:3(IYYGYRPYAMDY),SEQ ID NO:4(RSSQSIVHSNGNTYLE),SEQID NO:5(KVSNRFS)和SEQ ID NO:6(FQGSHVPWS)所示的互补决定区的抗体。
抗体或免疫球蛋白是γ球蛋白，其天然形式由通过二硫键连接的两条大的重链和两条小的轻链组成(参考图3)。有5种类型的哺乳动物Ig重链：α,δ,ε,γ和μ。所存在的重链的类型确定了抗体的类(同种型)；它们分别是IgA,IgD,IgE,IgG和IgM抗体。每条重链具有2个区域：恒定区和可变区。恒定区在相同物种的相同同种型的所有天然产生的抗体中几乎是相同的。轻链也由1个恒定区和1个可变区组成。在哺乳动物中有2种类型的免疫球蛋白轻链：λ和κ。
虽然所有抗体的一般结构是非常相似的，但是给定抗体的独特性质是由可变区(V)决定的。更具体地，可变环(在轻链(VL)上有3个，在重链(VH)上有3个)负责与抗原的结合，即负责其抗原特异性。这些环被称作互补决定区(CDR)。由于来自VH和VL结构域的CDR都对抗原结合位点有贡献，所以，重链和轻链的组合决定了最终的抗原特异性，而非单独的重链或轻链。
如本文使用的术语“抗体”意指任何能够结合抗原的多肽，其中结合特异性由SEQ ID NO:1至6所示的CDR决定。因此，“抗体”意在涉及包含至少一个抗原结合片段的任何多肽。抗原结合片段至少由重链的可变结构域和轻链的可变结构域组成，按照“两个结构域一起能够结合特异性抗原”的方式排列。“抗体”包括完整抗体或抗体片段，例如Fab-片段、F(ab)2-片段或scFv-片段(参考图3)。
就术语“完整抗体”而言，意思是具有天然产生的抗体的典型的总体结构域结构(即包含3或4个恒定域的重链和1个恒定域的轻链以及各个可变域)的任意抗体，虽然每个结构域可以包含另外的修饰，例如突变、删除或插入，它们不改变总体的结构域结构。
“抗体片段”也包含至少一个如上文定义的抗原结合片段，并显示出与该片段所衍生自的完整抗体相同的功能和特异性。Fab片段可以使用木瓜蛋白酶切割免疫球蛋白而产生。木瓜蛋白酶在铰链区下切割，因此，在二硫键下切割，所以形成F(ab)2片段。此外，重链和轻链的可变区可以融合在一起以形成单链可变片段(scFv)。
另外，术语“抗体”意在包括所有上述的免疫球蛋白同种型，即，抗体可以是IgA,IgD,IgE,IgG或IgM抗体，包括这些同种型的任何亚类。优选地，抗体是IgG抗体，更优选为IgG1或IgG2抗体。由于可以重组地表达和产生抗体，所以抗体也可以包含2个不同的重链恒定区，例如，1个IgG1和1个IgG2重链，或来自不同物种的重链。然而，重链优选来自相同的物种。此外，抗体可以包含λ或κ轻链。
如实施例2所示，抗体的价数(valency)对于介导病毒中和以及抑制细胞至细胞的传播的效力具有重大影响，使用二价抗体显示出了最佳的结果，即，使用具有两个抗原结合区的抗体。二价抗体的实例为：完整抗体或二价抗体片段，例如F(ab)2-片段。因此，在优选实施方式中，抗体是二价抗体，优选地，其中所述抗体是完整抗体或抗体片段，特别地，其中所述抗体片段是F(ab)2-片段。在替代的优选实施方式中，抗体是多价抗体，即，具有多于2个结合位点的抗体，包括重组抗体或其片段，优选为triabody或tetrabody，或者完整的免疫球蛋白，例如IgM五聚物，或连接的免疫球蛋白。这些抗体形式是本领域已知的。
在另一个优选实施方式中，抗体是单克隆抗体，优选地，其中所述抗体是鼠抗体，嵌合抗体或人源化抗体，更优选地，其中所述人源化抗体衍生自人种系序列，如下文所讨论。嵌合抗体是这样的抗体：其中一种物种的免疫球蛋白的至少一个区域通过遗传工程化融合至另一物种的免疫球蛋白的另一区域，从而降低其免疫原性。嵌合抗体的实例如图3A所示，其描绘了与人免疫球蛋白的剩余部分融合的鼠VL和VH区。嵌合抗体的特别类型是人源化抗体。人源化抗体是通过将编码非人类抗体的CDR的DNA接枝到编码人类抗体框架的DNA而产生的。然后，得到的DNA构建体可用于表达和产生免疫原性通常低于非人类亲代抗体或低于嵌合抗体的抗体，因为仅有CDR是非人类的。
在一个优选实施方式中，抗体能够抑制HSV感染从一个被感染的细胞传播至邻近的另一个未被感染的细胞（细胞至细胞的传播）。细胞至细胞的传播是疱疹病毒从一个被感染的细胞传播至邻近的未被感染的细胞的能力，而不释放无细胞的颗粒。为了检查某抗体是否能够抑制HSV从一个被感染的细胞向邻近的另一个未被感染的细胞的传播（细胞至细胞的传播），可以使用如下测定法。
使用400TCID50/孔的恒定病毒量感染在24孔组织培养板中的盖玻片上生长至汇合的Vero细胞，感染在37℃持续4小时。1个“中值组织培养物感染剂量”(1TCID50)是在50%的接种的细胞培养物中产生致细胞病变效应的致细胞病变试剂、例如病毒的量。然后除去病毒接种物，以PBS洗涤细胞2次，在包含过量的不同的抗HSV抗体或多克隆抗HSV对照血清(以阻止病毒通过上清液传播)的1ml DMEM,2%FCS,Pen/Strep中在37℃再温育2天。使用荧光标记的多克隆山羊抗HSV血清(BETHYL Labolatories,Montgomery,TX USA,Catalog No.A190-136F,Lot No.A190-136F-2)检测感染了HSV的细胞的病毒抗原。
优选地，如果在上述测定中少于20%的邻近细胞被感染，优选地，少于15%、少于10%、少于5%，更优选少于3%、最优选少于1%的邻近细胞被感染，则抗体能够抑制细胞至细胞的传播。
在另一个优选实施方式中，抗体具有至多40nM、优选至多30nM、更优选至多20nM、再更优选至多15nM、例如至多13nM、至多10nM、最优选至多7nM的解离常数KD。KD代表解离常数，作为复合物可逆地解离为其组分的倾向性的度量(即，抗体对抗原的亲和性)，并且是结合常数的倒数。可以根据Scatchard等式计算KD，用于确定KD的方法是本领域熟知的。
在另外的优选实施方式中，浓度为至多20nM、优选至多16nM、更优选至多12nM、例如至多10nM、例如至多8nM或至多6nM、最优选至多4nM的抗体能够中和100TCID50的确定量的HSV至80%以上，优选90%以上，例如95%以上，更优选96%以上，例如97%以上，最优选98%以上，例如99%以上，或甚至100%。“中和”在本文中意思是抗体调理病毒，从而病毒不能再感染任何其它细胞。用于测定浓度为至多20nM的抗体是否能够中和100TCID50的确定量的HSV的测定法提供于Eis-Hübinger et al.,1991和Eis-Hübinger et al.,1993，以及下文的实施例1和2中。
此外，在一个优选实施方式中，抗体包含在框架区与SEQ ID NO:9的位置1至30,38至51，68至99,112至122(或者，根据Kabat编号，分别为位置1至30,36至49,66至94,103至113)和SEQ ID NO:10的位置1至23,40至54,62至93,103至113(或者，根据Kabat编号，分别为位置1至23,35至49,57至88,98至108)的氨基酸残基具有至少70%、优选至少75%、至少80%、更优选至少85%、至少90%、再更优选至少95%、最优选98%的(总体)序列同一性的氨基酸序列，如图4所示。
SEQ ID NO:9:
QVTLKESGPG ILLPSQTLSL TCSFSGFSLS TSGMSVGWIRQPSGKGLEWL GHIWWNNDKY YKPALKSRLT ISKDTSNKQVFLKIASVVTA DTATYYCARI YYGYRPYAMD YWGQGTSVTV SS
SEQ ID NO:10:
DVLMTQTPLS LPVSLGDQAS ISCRSSQSIV HSNGNTYLEWYLQKPGQSPK LLIYKVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKISRVEAEDLGV YYCFQGSHVP WSFGGGTKLE IKR
如果SEQ ID NO:9或10与目标多肽的最佳匹配序列比对时，所比对的两个序列之间的氨基酸同一性在SEQ ID NO:9的位置1至30,38至51，68至99,112至122(或者，根据Kabat编号，分别为位置1至30,36至49,66至94,103至113)和SEQ ID NO:10的位置1至23,40至54,62至93,103至113(或者，根据Kabat编号，分别为位置1至23,35至49,57至88,98至108)上是至少X%，则多肽在框架区与SEQ ID NO:9或10具有“至少X%的序列同一性”。氨基酸序列的这种比对可以使用例如公众可获得的计算机同源性程序、例如“BLAST”程序来进行，所述程序提供于国家生物技术信息中心(NCBI)的主页，见http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi，使用其中提供的缺省设定。用于计算一组氨基酸序列或核酸序列的序列同一性百分率的其它方法是本领域已知的。
备选地，在另一优选实施方式中，抗体包含在框架区与SEQ ID NO:7的位置1至30,38至51,68至99,112至122(或者，根据Kabat编号，分别为位置1至30,36至49,66至94,103至113)和SEQ ID NO:8的位置1至23,41至55,63至94,104至114(或者，根据Kabat编号，分别为位置1至23,35至49,57至88,98至108)的氨基酸残基具有至少80%、优选至少85%、更优选至少90%、再更优选至少95%、例如98%、最优选100%的(总体)序列同一性的氨基酸序列，如图4所示。如果SEQ IDNO:7或8与目标多肽的最佳匹配序列比对时，所比对的两个序列之间的氨基酸同一性在SEQ ID NO:7的位置1至30,38至51,68至99,112至122(或者，根据Kabat编号，分别为位置1至30,36至49,66至94,103至113)和SEQ ID NO:8的位置1至23,41至55,63至94,104至114(或者，根据Kabat编号，分别为位置1至23,35至49,57至88,98至108)是至少X%，则多肽在框架区与SEQ ID NO:7或8具有“至少X%的序列同一性”。
SEQ ID NO:7和8源自人种系序列。虽然非种系人免疫球蛋白框架序列是人类来源的，但是一般不能排除它们不是免疫原性的。因此，本发明人注意了种系序列，因为它们不是超突变，因此，预期不是免疫原性的。因此，人源化的抗体优选衍生自人种系序列，例如衍生自SEQID NO:7和/或8。SEQ ID NO:7和8如下所示：
SEQ ID NO:7:
QVTLKESGPA LVKPTQTLTL TCTFSGFSLS TSGMRVSWIRQPPGKALEWL ARIDWDDDKF YSTSLKTRLT ISKDTSKNQVVLTMTNMDPV DTATYYCARX XXXXXXXYFD YWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:8:
DIVMTQTPLS LPVTPGEPAS ISCRSSQSLL DSDDGNTYLEWYLQKPGQSP QLLIYTLSYR ASGVPDRFSG SGSGTDFTLKISRVEAEDVG VYYCMQRIEF PWTFGQGTKV EIKR
在本发明的上下文中，已经确定了：通过使用SEQ ID NO:7和8来产生本发明的人源化抗体，无需回复突变以实现如亲代抗体一样的亲和性，这可能暗示了对应的人源化抗体显示出极低的免疫原性。因此，在本发明的上下文中，优选包括那些抗体，其显示出与包含SEQ ID NO:9和10或包含SEQ ID NO:7和8的抗体相同的特异性。
在另一个优选实施方式中，抗体缀合于效应子部分(effectormoiety)、治疗部分或可检测部分。在该情境下，术语“缀合”是指用于功能性连接蛋白结构域的本领域已知的任何方法，包括但不限于：使用或不使用居间结构域的重组融合、intein介导的融合、非共价结合和共价键合，例如二硫键合、肽键合、氢键合、静电键合和构象键合，例如生物素-亲和素结合。与效应子部分的缀合可以通过化学或重组方式进行。化学方式是指抗体与效应子部分之间的反应，从而在两个分子之间形成共价键以形成一个分子。
术语“效应子部分”意思是对于抗体所靶向的细胞具有效应的化合物。效应子部分可以是例如治疗部分或可检测部分。
“治疗部分”是用作治疗剂的化合物，例如细胞毒性试剂或药物。下文给出了用于药物组合物的化合物的实例。
“可检测部分”包括可通过分光检查、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学或化学方式检测的任何化合物或蛋白标签，例如荧光标记物。
抗体的特异性可以由CDR表示或由抗体所结合的表位来表示。因此，在第二个方面，本发明涉及与第一方面的抗体识别相同表位的抗体。如实施例部分所示以及如图13A和13B所例示，该表位是不连续的或假连续(pseudocontinuous)的表位，对于变性具有部分抗性，位于HSV1和HSV2的糖蛋白B的氨基酸172-195和295-313。
在本申请的上下文中，mAb 2c抗体的表位可以位于gB蛋白的前487个氨基末端残基内。优选地，表位可以包含位于gB蛋白的位置172和307之间的氨基酸序列内的至少一个氨基酸序列。
表位可以包含gB蛋白的连续氨基酸序列301YGYRE305，优选地，包含连续氨基酸序列301YGYREG306或300FYGYRE305，更优选地，所述序列可以在末端进一步延伸(即，299PFYGYRE305或300FYGYREGS307)。本发明的抗体的表位可以包含gB的连续氨基酸序列298-313(298SPFYGYREGSHTEHTS313)。
或者，表位可以位于连续氨基酸序列172QVWFGHRYSQFMGIFED188中。表位可以包含连续氨基酸序列172QVWFGHRYSQFMG184。
优选地，表位可以由一个以上的连续氨基酸序列组成。表位可以部分地是非连续表位。更优选地，表位可以包含两个连续氨基酸序列。此类由两个氨基酸序列组成的表位可以被称作“双表位(duotope)”。抗体可以与两个氨基酸序列结合。
更优选地，双表位的氨基酸序列可以包含氨基酸序列300FYGYRE305和位于氨基酸位置172与188之间的氨基酸序列。更优选地，表位可以包含gB蛋白的氨基酸序列300FYGYRE305和氨基酸序列179YSQFMG184。或者，表位或双表位可以是化学合成的。表位可以是具有序列YSQFMG-βA-FYGYRE的化学合成的表位。如本文使用的缩写βA是指β-丙氨酸。
最优选地，表位可以包含gB蛋白的氨基酸序列FYGYRE和氨基酸序列FED。表位可以是具有序列FED-βA-βA-FYGYRE或PFYGYREGFEDF的化学合成的表位。
本领域技术人员可以理解：表位可以包含于gB蛋白中，但是也可以包含于其降解产物中，或者可以是化学合成的肽。指明氨基酸位置仅仅是为了显示gB蛋白的序列中的相应的氨基酸序列的位置。本发明包括包含该表位的所有的肽。肽可以是长度为大于100个氨基酸的多肽的一部分，或者可以是小于100、优选小于50、更优选小于25个氨基酸、再更优选小于16个氨基酸的小肽。此类肽的氨基酸可以是天然氨基酸或非天然氨基酸（例如β-氨基酸、γ-氨基酸、D-氨基酸）或其组合。此外，本发明可以包括表位的各自的逆反肽(retro-inverso peptide)。肽可以是未结合的或结合的。其可以结合至例如小分子（例如药物或荧光团），或结合至高分子量的聚合物（例如聚乙二醇（PEG）、聚乙烯亚胺（PEI）、羟丙基甲基丙烯酸酯（HPMA）等），或结合至蛋白质、脂肪酸、糖部分，或者可以插入膜中。
与本领域已知的抗体H126不同，由本发明的mAb 2c抗体识别的表位不是本质上非连续的。与H126不同，本发明的抗体可以结合连续表位，因此结合连续氨基酸序列，或可以结合非连续表位。因此，本发明的抗体的性质是改进的。例如，mAb 2c抗体可用于其中靶蛋白为变性状态的方法（例如SDS-PAGE电泳）或用于检测小的线性肽。
为了测试待测抗体与第一个方面的抗体是否识别相同表位，可以进行如下的竞争性研究：以3moi（感染复数）感染20小时之后的Vero细胞与不同浓度的待测抗体（作为竞争者）一起温育1小时。在另一个温育步骤中，以100nM的恒定浓度施用第一个方面的抗体，使用针对第一个方面的抗体的恒定域的荧光标记的抗体通过流式细胞术检测其结合（另见实施例部分和图6）。与待测抗体的浓度成反比例关系的结合表示这两种抗体识别相同的表位。然而，也可以使用很多本领域已知的其它测定法。
第二个方面的优选实施方式与第一个方面相同，如上文所述。
在第三个方面，本发明涉及药物组合物，其包含有效量的根据第一个或第二个方面的抗体和至少一种药学上可接受的赋形剂。然而，术语“药物组合物”在本文中可以与术语“药物”相互替换地使用。
药物组合物中的抗体的含量没有限制，只要其对于治疗或预防是有用的，但是优选包含0.0000001-10%重量/总组合物。此外，本文描述的抗体优选在载体中使用。载体的选择可以取决于施用途径和活性试剂的浓度，载体可以是冻干成分或含水溶液的形式。一般地，在载体中使用适当量的药学上可接受的盐以赋予组合物等渗性。载体的实例包括但不限于：盐水、Ringer溶液和葡萄糖溶液。优选地，可接受的赋形剂、载体或稳定剂是所应用的剂量和浓度是非毒性的，包括：缓冲剂，例如柠檬酸盐，磷酸盐和其它有机酸；成盐反离子，例如钠和钾；低分子量（>10个氨基酸残基）多肽；蛋白质，例如血清白蛋白或明胶；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如组氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、天冬酰胺、精氨酸或甘氨酸；碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；非离子表面活性剂，例如Tween、Pluronics或聚乙二醇；抗氧化剂，包括甲硫氨酸、抗坏血酸和生育酚；和/或防腐剂，例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双胺；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；尼铂金酯类，例如尼铂金甲酯或尼铂金丙酯；儿茶酚；雷琐酚；环己醇；3-戊醇；间-甲酚。适宜的载体及其配制更详细地描述于Remington's Pharmaceutical Sciences,17th ed.,1985,MackPublishing Co。
组合物还可以包含一种以上的活性化合物，例如化疗剂或病毒抑制试剂，包括阿昔洛韦,喷昔洛韦,碘苷和膦甲酸。
阿昔洛韦，也称作无环鸟苷(ACV)或2-氨基-9-(2-羟基乙氧基甲基)-3H-嘌呤-6-酮，是鸟苷类似物抗病毒药物，以下列商品名上市，例如：
Aciclovir,
AciVision,Cyclovir,
Herpex,
Virzin,
Zovir和喷昔洛韦(2-氨基-9-[4-羟基-3-(羟基甲基)丁基]-6,9-二氢-3H-嘌呤-6-酮)是鸟嘌呤类似物抗病毒药物，以下列商品名上市，例如：Denavir和Fenistil。泛昔洛韦(2-[(乙酰氧基)甲基]-4-(2-氨基-9H-嘌呤-9-基)乙酸丁酯)是喷昔洛韦的前药，具有改善的口的生物可获得性。碘苷(2'-脱氧-5-碘-尿苷)是核苷“尿苷”的生物化学类似物，以下列商品名上市，例如：
和
膦甲酸是具有化学式HO2CPO3H2的化合物的缀合物基底，以下列商品名上市：和
优选地，以有效量包括抗体和/或活性化合物。术语“有效量”是指足以在药物组合物所要施用至的受试者中诱导可检测的治疗性应答的量。
在第四个方面，本发明提供了表达载体，其包含编码本发明的抗体的核酸序列。一般地，表达载体是用于将目标基因导入靶细胞的质粒，从而导致该基因编码的蛋白即抗体的转录和翻译。因此，表达载体包含调节序列，例如启动子和增强子区域，以及多腺苷化信号位点，以指导该表达载体携带的基因的有效转录。表达载体也可以包含另外的必需的或有用的区域，例如用于在真核或原核细胞中选择的可选择标志物，复制起始点，等等。
因此，本发明的第五个方面涉及宿主细胞，其包含编码本发明的抗体的核苷酸序列。宿主细胞可以是适合用于表达本发明的抗体的任何细胞，包括哺乳动物细胞、酵母细胞、昆虫细胞、优选哺乳动物细胞、更优选永生化细胞系，例如骨髓瘤细胞系。合适的细胞系可以从美国典型培养物保藏中心ATCC获得。
此外，在第六个方面，提供了能够产生第一个/第二个方面的抗体的杂交瘤细胞。杂交瘤细胞是能够迅速和无限复制的工程化的细胞，其大量产生所需的抗体。杂交瘤细胞是这样制备的：从经过相关抗原刺激的动物的脾脏取出产生抗体的B细胞，然后将其与永生化的骨髓瘤肿瘤细胞融合。
在非常重要的第七个方面，本发明涉及用作药物的根据本发明的抗体。更具体地，本发明涉及本发明的抗体在制备用于预防性或治疗性处理受试者中与HSV相关的疾病的药物中的用途。同样，本发明涉及用于预防性或治疗性处理受试者中与HSV相关的疾病的本发明的抗体。此外，本发明涉及预防性或治疗性处理受试者中与HSV相关的疾病的方法，其中以治疗有效量向受试者施用本发明的抗体。HSV感染可以引发数种不同疾病。皮肤或粘膜的常见感染可以影响面部和口（口面疱疹）、生殖器（生殖器疱疹），或手（疱疹性瘭疽）。当病毒感染并损伤眼睛（疱疹性角膜炎）或侵入中枢神经系统时（损伤脑（疱疹性脑炎）），会发生更严重的病症。具有不成熟或受抑制的免疫系统的患者，例如新生儿、移植受体或AIDS患者对于来自HSV感染的严重并发症易感。HSV相关的疾病还包括外伤性疱疹、莫拉雷特脑膜炎、可能的贝尔麻痹、与双相型障碍（bipolar disorder）的认知缺陷相关的病症，也称作躁狂忧郁、躁郁症或双相情感障碍，和阿尔茨海默病。就阿尔茨海默病而言，最近的科学出版物证明了1型单纯疱疹病毒DNA惊人地定位于β-淀粉样蛋白斑内，这说明该病毒可能是所述斑的诱因。最后，如果观察到出现针对常见的化疗病毒抑制试剂的抗性株系，例如，在长期预防性和治疗性处理免疫抑制患者时，则根据本发明的抗体是有用的。
因此，在优选实施方式中，与HSV相关的疾病伴随着一项或多项下列特征：存在口的复发、存在生殖器的复发、疱疹性湿疹、新生儿疱疹、免疫缺陷(免疫障碍的患者)、免疫抑制、脑炎、脑膜炎、脑膜脑炎、眼睛感染，泛发的HSV感染和/或对于病毒抑制剂的抗性。
在备选的优选实施方式中，与HSV相关的疾病伴随着对于化疗病毒抑制试剂的不耐性。
在另一个优选实施方式中，药物包含至少一种另外的活性试剂，优选地，其中所述另外的活性试剂是化疗试剂或病毒抑制试剂，更优选地，其中所述另外的活性试剂选自阿昔洛韦、喷昔洛韦、碘苷和膦甲酸，如上文所述。
在最后的优选实施方式中，受试者是哺乳动物，例如狗、猫、猪、牛、绵羊、马、啮齿类，例如大鼠、小鼠和豚鼠，或灵长类，例如大猩猩、黑猩猩和人，优选地，所述受试者是人。
附图说明
图1显示了在阴道粘膜中建立感染之后，通过施用单克隆抗体(mAb)2c而在体内减少HSV的复制。在感染后第3天和第11天(箭头)，通过腹膜内注射(i.p.)方式使用多克隆HSV免疫血清(三角形)、mAb 2c(圆形)或对照培养基(方框)处理免疫活性的(实心符号)和CD4+耗竭(空心符号)小鼠。
图2显示了mAb 2c对于免疫抑制的(CD4-/CD8-)小鼠中的HSV感染进展的效应。在感染后第1天和第3天(通过箭头指示)，通过i.p.方式向动物施用对照培养基(实心方框)、多克隆HSV免疫血清(空心方框)或mAb 2c(实心圆圈)。(A)显示了存活率；(B)显示了阴道粘膜中的病毒复制。
图3是衍生自mAb 2c的抗体和抗体片段的示意图。(A)完整抗体：鼠可变区(VL,VH;左侧)与人恒定域(CL,CH1,CH2,CH3;中间)的遗传融合产生嵌合抗体。在人源化的IgG抗体(右侧)中，鼠单克隆抗体的高变区被接枝至人抗体的框架。(B)抗体片段：单价Fab片段(Fab)，其由轻链(VL+CL)和重链的2个N末端结构域(VH+CH1)组成；二价的F(ab’)2片段，其由2个非配对的C末端半胱氨酸残基共价连接，可以通过常规的蛋白酶消化的方式来产生。为了产生鼠scFv抗体(“单链片段可变”)，从2c杂交瘤细胞系分离编码可变域VH和VL的基因，并通过编码柔性连接肽(“连接子”)的基因区段连接。
图4显示了重链和轻链可变域(VH和VL)的序列比对。抗原结合位点根据Chothia(Chothia and Lesk,1987;Chothia et al.,1989)(点划线)和Kabat(Kabat and Wu,1991)(虚线)定义。人种系序列DP28和DPK13来自V-Base数据库(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)并作为鼠mAb 2c的CDR的受体序列。(A)“不变残基”(Kabat and Wu,1991);(B)“关键残基”(Chothia et al.,1989)和(C)VH/VL交界处的残基(Chothia et al.,1985)分别以(+)(代表在鼠和人序列之间匹配的残基)或(-)(代表在鼠和人序列之间不匹配的残基)标示。(D)核心位点处的残基，如Chothia(Chothia et al.,1998)定义为不变的(i)残基位点；相似的(r)残基位点；表面的(s)残基R,K,E,D,Q,N;中性的(n)残基P,H,Y,G,A,S,T;和埋藏的(b)残基C,V,L,I,M,F,W；埋藏的中性残基由x标示；表面的中性残基由y标示；在鼠与人序列之间非匹配的残基位点以粗体标示；以鼠CDR残基特异性接枝的序列VHhum2c和VLhum2c以粗体标示。所有残基以单字符显示，并根据Kabat(Kabat et al.,1991)编号。
图5显示了单克隆抗体2c、ch2c和人源化变体hu2c-V1-V4的平衡结合曲线。通过流式细胞术测定与HSV-1F感染的Vero细胞表面上的糖蛋白B的特异性结合。在所标示的浓度的结合活性以中值荧光强度(MFI)减掉背景荧光表示。以一式三份进行测定；标准偏差显示为条棒。根据Levenberg-Marquard方法，通过将抗原结合数据拟合至非线性回归模型而确定结合亲和常数KD。
图6显示了竞争性研究，其证明了嵌合和人源化抗体与亲代鼠mAb2c的相同的表位特异性。嵌合mAb ch2c(空心圆圈)和人源化的mAb变体hu2c-V1(方框),-V2(三角形),-V3(星号),-V4(菱形)与亲代mAb 2c竞争与存在于HSV-1感染的Vero细胞表面上的gB的结合。经感染的Vero细胞首先与浓度渐增的mAb ch2c或人源化mAb hu2c-V1至V4温育，然后与100nM mAb 2c(作为竞争者)温育。中值荧光强度(MFI)显示了所施用的竞争者的结合。
图7显示：亲代mAb 2c和人源化mAb hu2c-V1的HSV中和活性是补体非依赖性的。将HSV-1与培养基(对照)、多克隆IgG(120μg/ml)、mAb 2c(2μg/ml)或mAb hu2c-V1(2μg/ml)在存在或不存在10%人补体的情况下进行预温育，然后施用至Vero细胞。2天后对产生的斑进行评分。
图8显示了：相对于非抗性实验室株系(HSV-1F,HSv-1324hv,HSV-117syn+,HSV-2G)、ACV抗性实验室株系HSV-1TK-和未研究过其抗性的临床分离体，人源化mAb h2c-V1中和源自阿昔洛韦抗性(ACV)、ACV和膦甲酸抗性(PFA)或ACV,PFA和Cidovir抗性(CDV)的临床患者分离体的HSV-1和HSV-2的效率。为了测定mAb h2c-V1对于完全病毒中和的效价，将数种浓度的抗体在37℃与100TCID50的HSV-1或HSV-2分离体温育1小时，并与Vero细胞温育3天。MAbhu2c-V1在浓度为7.8-15.6nM时完全中和HSV-1实验室株系HSV-1F,HSV-1324hv,HSV-117syn+,HSV-1TK-。HSV-1临床分离体被mAbh2c-V1类似地中和，与它们的抗性谱无关。此外，对于株系HSV-2G和ACV抗性HSV-2分离体，mAb hu2c-V1在浓度为31.3-62.5nM时显示出相同的中和效率。
图9显示了本发明的抗HSV抗体对于病毒的细胞至细胞的传播的抑制。洗涤2次以HSV-1F感染4小时的Vero细胞，并与含有过量的人多克隆抗HSV对照血清(1:20)、鼠mAb 2c(500nM)、2c衍生的抗体片段F(ab’)2(500nM)或Fab(3000nM)(通过酶促消化而制备)、嵌合mAb ch2c(500nM)或与人源化的mAb变体1,hu2c-V1(500nM)的培养基温育。感染2天之后，使用荧光标记的多克隆山羊抗HSV血清，使用Leica DM IRE2共聚焦显微镜在40倍的放大倍数下检测病毒的传播。之前使用体积为100μl的100TCID50测定了人多克隆抗HSV的中和效价是1:160。稀释度为1:20的抗HSV血清不能阻止病毒向邻近细胞的传播。500nM的鼠mAb 2c、2c-F(ab’)2-抗体片段、嵌合和人源化的mAb能够成功抑制细胞至细胞的传播。在所测的最高浓度即3.000nM时，单价的2c-Fab片段不能完全抑制细胞至细胞的传播。
图10显示了以抗HSV mAb被动免疫之后，阴道内感染HSV-1的NOD/SCID小鼠的存活。在感染之前24小时，小鼠静脉内经受PBS(叉号),2.5mg/kg(方框),5mg/kg(三角形)或15mg/kg(圆圈)的亲代mAb2c(空心的符号)或人源化的mAb hu2c-V1(实心的符号)。以1x106TCID50/20μl的神经毒性的HSV-1株系F阴道内感染小鼠。杀死具有体重下降、外阴炎/阴道炎或神经疾病的症状的被感染的小鼠，按照之前的描述，通过在Vero细胞单层上滴定，就感染性病毒检查它们的器官。在第30天时杀死未被感染的小鼠。每组有7只动物。
图11显示了通过全身施用抗体而保护NOD/SCID小鼠抵抗HSV-1的传播。从感染后24小时开始，在箭头所标示的时间点(24小时、40小时、56小时)，小鼠通过静脉内方式接受3次15mg/kg mAb 2c或人源化mAb hu2c-V1。每组有7只被感染的动物。
图12显示：在感染后24小时、40小时和56小时，通过静脉内方式以15mg/kg人源化mAb hu2c-V1处理之后，通过阴道内感染了源自患者的对于阿昔洛韦、膦甲酸和Cidovovir有抗性的HSV-1分离体的NOD/SCID小鼠显示出免于致死性脑炎的显著性保护。每日接受2次标准阿昔洛韦治疗的小鼠在28天内全部死亡。
图13显示了mAb 2c的表位定位于gB。(A)显示了HSV 1和HSV2的糖蛋白B(gB)的氨基酸序列比对。显示了下列株系(对应于括号内的NCBI登记号)的gB蛋白氨基酸序列的比对：HSV1株系KOS(P06437),F(P06436),gC-39-R6(ABM66850)和HSV2株系333(ABU45423),HG52(P08666)和MMA(AAB60547)。gB的信号序列以下划线标示。成熟的gB起始于位置31，氨基酸AP。显示了gB的氨基酸编号，包括信号肽序列。相应地进行表位编号。MAb 2c结合至gB内的两个分开的区域(加框的序列区域)，如通过肽微阵列所显示。已经显示了氨基酸299PFYGYRE305对于mAb 2c的结合是必不可少的。(B)：根据mAb 2c与重组gB在不同的蛋白印迹条件下的反应活性而表征mAb 2c。在天然(N)或变性(D)条件下在8%的SDS-PAGE上分离重组gB(730t)，转移至硝酸纤维素膜并在含有2%牛奶的TNT封闭缓冲液中温育1小时。以gB特异性单克隆抗体mAb H1817,mAb H126或mAb 2c探测该膜，通过HRP缀合的多克隆山羊抗小鼠血清和化学发光法检测与gB的结合。使用mAb H1817和H126作为对照，它们分别识别连续表位(Bender etal.,2007)和非连续表位(Kousoulas et al.,1988)。在使用mAb H1817进行的蛋白印迹分析中获得了线性表位的典型染色式样，这显示在非还原条件下检测到单体和三聚体形式的gB，在还原条件下为唯一的主要为gB单体染色。如所预期，mAb H126与gB仅在天然条件下反应。仅识别上面的大于170kDa的gB蛋白带，这表明mAb H126与三聚体的gB特异性结合。MAb 2c与天然和变性的gB反应，然而，在变性条件下的反应活性比mAb H1817弱得多，这说明mAb 2c结合至不连续的表位，该表位在SDS-PAGE电泳中对于变性或重折叠具有抗性，因此被称作“假连续”表位(Bender et al.,2007)。在左侧标明了分子量(kDa)，在右侧标明了gB三聚体和单体的迁移。
图14显示了mAb 2c与gB的肽图分析(peptidemapping)。(A)：在跨越gB的细胞外结构域的氨基酸31至505的肽文库中鉴定的结合区A和B的图示定位。在连续纤维素膜上合成了13个氨基酸的肽，偏移3个氨基酸，使用过氧化物酶缀合的二抗通过化学发光法检测结合的mAb2c。功能性结构域I-V对应于gB的晶体结构(根据Heldwein等人)，在晶体结构中未解决的区域以灰色显示(24),S：信号序列。(B)：来自高分辨率激光扫描的荧光信号强度，13个氨基酸的肽通过柔性连接子固定于玻片上。
图15显示了中和性mAb 2c的表位在gB晶体结构上的定位(PDB-ID 2GUM)。显示了gB三聚体的带状图。星号表示2个原体(protomer)的融合环，第三个原体的融合环不可见。在表面图示中标示了非连续的mAb 2c表位的定位的残基F175至A190和F300至E305，对于一个原体以深灰色表示，对于另两个原体以浅灰色表示。
图16显示了mAb 2c的双表位扫描。mAb 2c结合区A和B(阴影条柱)的共有序列(下划线)合成为双表位(白色和黑色条柱)，直接连接或通过1或2个β-丙氨酸间隔子(B,B-B)分开。通过来自高分辨率激光扫描的荧光信号强度记录mAb 2c与双表位的反应活性。
图17显示了通过流式细胞术测定的mAb 2c,2c-F(ab’)2,2c-Fab和2c-scFv的平衡-结合曲线。以相对于最大中值荧光强度的百分率显示了在指定浓度时与(A)HSV-1F或(B)HSV-2G感染的Vero细胞的结合活性。实验按照一式三份进行2次，条柱代表标准偏差。
图18显示了mAb 2c对于HSV-1病毒粒子与靶细胞的附着的抑制。在以100TCID50HSV-1预温育之后(附着前的中和)或100TCID50HSV-1吸附至靶细胞之后(附着后的中和)，将连续稀释的(A)mAb 2c(0.98-125nM)或(B)多价人γ球蛋白
(0.33-42μM)加入到96孔微量滴定板中的Vero细胞单层中。在37°C温育72小时后(并认为是末端点)，测定在10个单一的接种的细胞单层中，相对于对照而言，100%和50%地阻止病毒诱导的致细胞病变效应(CPE)的最高抗体效价和多价人IgG效价。三次独立实验的平均值的标准误差小于0.1。
图19显示了抗gB抗体的价数对于体外中和HSV的影响。(A)：将二价抗体mAb 2c(IgG)和2c-F(ab’)2和单价2c-Fab的稀释物与100TCID50HSV-1F或HSV-2G温育1小时，然后接种至Vero细胞。72小时后，对CPE进行评分，如对于图3所描述。显示了来自三次代表性重复实验之一的中和100%病毒接种物所需的抗体浓度。(B)：与鼠抗Fab IgG交联的2c-Fab片段的抗病毒活性。
图20显示了mAb 2c处理的免疫缺陷小鼠的剂量依赖性存活。NOD/SCID小鼠静脉内接受不同的单一剂量的mAb 2c，24小时后，以1x106TCID50HSV-1进行阴道内刺激。对于PBS每组有7只动物，对于所有其它组每组有9只动物。
图21显示：在NOD/SCID小鼠中通过系统性施用mAb 2c或人源化mAb hu2c-V1(抵抗HSV-1传播)而从生殖器粘膜消除已经建立的HSV-1感染。从感染后24小时开始，小鼠在箭头指定的时间点(24小时、40小时、56小时)静脉内接受15mg/kg mAb 2c(空心符号)或人源化mAbhu2c-V1(实心符号)3次。从培养于Vero细胞单层上的阴道冲洗物测定经抗体或对照处理的小鼠的阴道病毒效价。误差条表示标准偏差。
图22显示了HSV-1gB序列上从氨基酸31至505的肽扫描。与纤维素膜结合的15个氨基酸的肽(重叠12个氨基酸)(15/12扫描)总共产生155种不同的肽斑点，将它们与MAb 2c温育。使用过氧化物酶标记的抗小鼠IgG Fab片段和鲁米诺样化学发光底物检测与肽结合的MAb 2c。发现MAb 2c结合连续gB肽的三元组(肽49-51)和二元组(肽90-91)：称作结合位点A和B。以粗体(下面的)高亮标示了每个位点的肽的共同的gB序列，它们代表gB序列的残基181至189和残基301至312。
图23显示了HSV-1gB序列上从氨基酸296至315的肽扫描。将与纤维素膜结合的13个氨基酸的肽[每个肽沿序列移动1个氨基酸(13/12扫描)并按一式两份合成]与MAb 2c温育，然后进行化学发光蛋白印迹检测。观察到MAb 2c结合连续的5个肽。这5个反应性肽的共同序列是300FYGYREGSH308。
图24显示了gB序列上从残基295至315的关键基序。将HSV-1gB序列的氨基酸295至315分解为6个氨基酸的肽，每个肽沿序列移动1个氨基酸，总共产生16种肽。源自gB的序列在N和C末端各有4个随机碱基。鉴定出2个连续肽结合MAb 2c，它们代表gB序列300FYGYRE305和301YGYREG306。这些肽的共同序列以粗体高亮标示(肽6和7)。
图25显示了在病毒接种前24小时接受被动转移的多克隆免疫血清(空心方框,实心方框),MAb 2c(空心圆圈,实心圆圈)或作为对照的沉淀的培养基(空心三角形,实心三角形)的C57BL/6小鼠的生殖器粘膜中的HSV-1消除动力学。空心符号表示来自接种了野生型(wt)株系F及其突变衍生物R126(Y303N),R1375(R304Q),R1435(H308Y)和R233(R328H)的小鼠的数据，实心符号表示接种了野生型株系KOS 321及其突变衍生物B4.1(E305K)的小鼠的数据。接种的小鼠的S.E.(log10)的范围和数目：wt株系F,空心方框,±1.5至0,12只小鼠;空心圆圈,±0.4至0,7只小鼠;空心三角形,±1.3至0,9只小鼠;wt株系KOS,实心方框,±1.4至0,8只小鼠;实心圆圈,±0.6至0,8只小鼠;实心三角形,±1.4至0,8只小鼠;F突变株系R126(Y303N),空心方框,±0.6至0,5只小鼠;空心圆圈,±0.6至0,6只小鼠;空心三角形,±0.5至0,6只小鼠;F突变株系R1375(R304Q),空心方框,±1.2至0,11只小鼠;空心圆圈,±1.3至0,10只小鼠;空心三角形,±1.2至0,11只小鼠;KOS突变株系B4.1(E305K),实心方框,±0.9至0,12只小鼠;实心圆圈,±0.7至0,12只小鼠;实心三角形,±0.9至0,10只小鼠;F突变株系R1435(H308Y),空心方框,±1.4至0.6,6只小鼠;空心圆圈,0,5只小鼠;空心三角形,±1.0至0.6,6只小鼠;F突变株系R233(R328H),空心方框,±1.0至0,5只小鼠;空心圆圈,±0.1至0,5只小鼠;空心三角形,±1.1至0,6只小鼠。
图26显示了MAb 2c与肽90(见图22,gB序列298SPFYGYREGSHTEHT312;左侧)以及设计为包含位点B的关键残基、甘氨酸连接子和源自位点A的基序FEDF的肽(PFYGYRE-G-FEDF;右侧)的反应活性的比较。
实施例
通过以下实施例进一步描述本发明，这些实施例不应被解释为限制本发明的范围。
实施例1
具有针对1型和2型单纯疱疹病毒(HSV1、HSV2)的糖蛋白B(gB)
的特异性的鼠单克隆抗体(mAb)2c的制备
为了产生抗HSV特异性mAb，使用UV灭活的HSV-1株系342hv免疫BALB/c小鼠。然后，通过体细胞融合使鼠脾细胞永生化为骨髓瘤细胞系X63-Ag8.653，通过使用酶免疫测定法、免疫荧光测定法以及HSV中和测定法筛选单细胞克隆的上清液而分离分泌抗HSV特异性mAb 2c(IgG2a)的杂交瘤细胞系。结合研究揭示：mAb 2c识别HSV1和HSV2的糖蛋白gB的共有的、不连续的表位。糖蛋白B长度约为904个氨基酸，其在病毒膜和HSV1/2感染的细胞的膜中整合为三聚体。mAb 2c不仅中和细胞外病毒颗粒的传播，而且有效抑制从最初感染的细胞至邻近的未被感染的细胞的直接感染途径(细胞至细胞的传播)(这是HSV的特性)，这具有特别重要的意义。后一个过程通常不被人体内天然产生的HSV特异性抗体库抑制。
为了检测mAb 2c的体内功效，选择了小鼠模型中的感染途径，其非常近似人类中的天然感染。因此，通过在完整的阴道粘膜施用HSV1株系342hv而感染C57BL/6J小鼠。为了在体内抑制HSV复制，通过腹膜内(i.p.)方式在感染后的不同时间点向小鼠施用mAb 2c。在免疫活性小鼠和CD4+T细胞耗竭的动物中，mAb 2c均能够抑制阴道粘膜中的病毒繁殖以及短期内的炎性损伤的形成(图1)。
与多克隆HSV血清不同，mAb 2c能够在完全耗竭T细胞(CD4+和CD8+)的免疫抑制动物中高效抑制病毒复制以及阻止一般化的致死的进展性疾病(图2)。在病毒接种之前24小时施用mAb 2c有效地保护了动物免受感染(Eis-Hübinger et al.,1993)。
为了检测抗原结合位点的数目(价数)和Fc部分对于中和性质的影响，通过常规蛋白酶消化产生了mAb 2c的Fab-片段和F(ab’)2-片段，并使用本领域熟知的方法克隆、产生和纯化了mAb 2c的重组的“单链Fv”(scFv)(图3)。
作为本领域熟知的方法，使用在天然HSV复制周期中在细胞表面表达gB蛋白(作为与膜结合的糖蛋白)的HSV感染的Vero细胞，通过流式细胞术测定亲和常数(KD)。结果如下表1所示。
表1.鼠mAb 2c和所产生的2c抗体片段的亲和常数(KD)
与亲代mAb 2c相比，F(ab’)2-片段显示出稍微升高的亲和性。Fab-片段和scFv-片段具有几乎相同的亲和性，然而，由于它们是单价，所以亲代mAb的亲和性比它们强大约1.7至1.9倍。
使用在微量滴定板中以单层生长的Vero细胞，通过标准的末端点稀释测定法测定抗体的中和活性。简而言之，在100μl细胞培养基中在37℃预温育100TCID50HSV与连续稀释的抗体(2c-IgG和F(ab)2:0.98nM-125nM;Fab:23nM-3000nM)1小时，然后接种Vero细胞。在37℃温育72小时之后，测定100%阻止病毒诱导的CPE的形成所需的抗体浓度，作为完全中和效价。另外，在存在交联抗体的情况下，测定了单价2c-Fab片段的病毒中和能力。
表2.100TCID50的确定病毒量的完全中和
可以证明亲代mAb 2c及其F(ab’)2-片段和Fab-片段能够完全中和HSV1和HSV2。然而，与mAb 2c相比，单价抗体片段显示出对于HSV1/2的显著降低的中和效率。100%中和的HSV1和HSV2分别需要375倍和97倍浓度的Fab-片段。scFv显示出斑点减小效应，但是在所测试的最高浓度3000nM不能完全抑制CPE(数据未显示)。可以通过在预温育步骤中加入过量的抗Fab特异性IgG(Jackson ImmunoResearch,Newmarket,England)而使单价2c Fab-片段的病毒中和能力增强2倍(未显示)。与此相反，二价的F(ab’)2-片段显示出几乎是亲代mAb 2c的效率2倍的针对HSV1和HSV2的中和活性。结论：抗体价数对于它的中和特性具有重要意义。完全中和HSV-2所需的较高的抗体浓度可以这样解释：相对于HSV-1，HSV-2产生更大量的非感染性颗粒，如通过RT-PCR测定HSV-1和HSV-2的DNA拷贝数所确认(数据未显示)。
mAb 2c的性质及其制备的更详细的内容提供于Eis-Hübinger et al.,1991和Eis-Hübinger et al.,1993。
实施例2
mAb 2c的嵌合和人源化
为了利用鼠单克隆抗体2c作为治疗剂，使用遗传工程方法修饰了该抗体，目标是降低或消除其在向人类施用时的免疫原性，同时完全保留亲代抗体的特异性。因此，产生了具有与mAb 2c相同的特异性的嵌合的和人源化的单克隆抗体(图3)。
首先，使用5’-RACE(cDNA末端的快速扩增)-PCR，从杂交瘤细胞系分离和扩增mAb 2c的可变重链和轻链(VH,VL)的真实基因。通过在表达载体[由我们的合作者Grosse-Hovest博士(
Tübingen)构建，其包含人IgG1同种型的轻链和重链的恒定区]中克隆扩增的VH-和VL-基因而产生嵌合IgG1-抗体(ch2c)。该抗体最终被分泌到稳定转染的Sp2/0鼠骨髓瘤细胞的细胞培养物上清液中。
为了进一步降低免疫原性，构建了人源化抗体。为此，将mAb 2c的编码6个互补决定区(CDR)的基因区段(2c VL-CDR1/2/3和2cVH-CDR1/2/3)分别克隆进入人VH和VL种系基因的适当的人框架免疫球蛋白受体支架(CDR接枝)。通过与V-Base数据库(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)中的相应的人框架区的序列比对来确定用于克隆mAb 2c的轻链和重链CDR区的适当的人种系受体支架。DP28显示出与对应的鼠mAb 2c重链VH序列最高的框架序列同一性(88.5%的序列同一性);DPK13显示出与对应的鼠mAb 2c轻链VL序列最高的框架序列同一性(88.9%序列同一性)。因此，将鼠供体抗体2c的编码CDR的基因区段(即2c VL-CDR1/2/3和2c VH-CDR1/2/3)分别克隆进入编码DP28和DPK13受体框架。
在人源化单克隆抗体的情境下，需要鉴定人框架区中的那些对于导入的鼠CDR的结构完整性可能有害、从而对于抗原结合特性可能有害的氨基酸。通常使用计算机产生的同源模型来鉴定此类氨基酸，将表现为空间上的关键性的位置突变为对应的鼠的序列，以保留鼠供体mAb的抗原结合特性(见参考文献Queen et al.,1989)。然而，也可以使用抗体库数据库鉴定潜在的关键性氨基酸，并基于具有已知的三维结构的参考抗体评价它们的关键性意义(见参考文献Krauss et al.,2003)。因此，测定了VH-和VL-框架区内的几个潜在的关键残基(图4)，通过重叠延伸PCR产生了4个人源化mAb 2c变体，其中这些潜在的关键性氨基酸接连地回复突变为它们的对应的鼠残基(见下文表3)。
表3.人源化的mAb 2c变体，在框架区具有向鼠供体序列的回复突变
通过将人源化的VH-和VL-基因克隆进入上述表达载体[由我们的合作者Grosse-Hovest博士(Tübingen)构建]而构建人源化抗体变体h2c-V1-4。在稳定转染鼠骨髓瘤细胞系Sp2/0之后，最终表达了抗体。选择了具有高特异性生产速率的克隆之后，从细胞培养物上清液大量产生并纯化这些抗体以进行进一步表征。
嵌合和人源化的抗HSV IgG1抗体的表征
通过流式细胞术类似地测定亲和常数(KD)，如对于亲代mAb 2c和2c-抗体片段所描述的那样(见实施例1)，使用了HSV感染的Vero细胞。结果显示于图5。
嵌合抗体ch2c保留了亲代抗体mAb 2c的亲和性。在人源化变体的情况下，对于变体h2c-V1，仅接枝CDR已足以保留与鼠mAb 2c相当的亲和性。因此，不必为了改善抗原结合位点的结构完整性而进行进一步的人框架残基的接连回复突变为各自的鼠的序列。变体h2c-V2甚至显示出为mAb 2c的1/2的亲和性。
为了证明嵌合的mAb 2c和人源化的抗体变体mAb h2c 1-4与亲代mAb 2c识别相同的表位，进行了竞争研究。首先将HSV-1感染的(3moi,20小时)Vero细胞与浓度渐增的嵌合的mAb ch2c或人源化的mAbhu2c V1-V4温育1小时。在第二个温育步骤中，加入100nM亲代mAb2c，使用针对鼠恒定域的荧光标记的抗体通过流式细胞术检测其结合(图6)。
竞争研究显示：代表了竞争者的结合的荧光信号与第一个温育步骤中施用的未标记的抗体的浓度成反比。这证明嵌合mAb和人源化的mAb变体与mAb 2c竞争结合相同的特异性结合位点，因此识别相同的表位。
使用如上所述的纯化的抗体制备物检测了mAb ch2c和4种人源化变体h2c的病毒中和能力。结果显示于下表4。标明了中和50%和完全中和100TCID50的确定病毒量的HSV所需的浓度。
表4.中和50%或完全中和100TCID50的确定病毒量所需的抗体浓度
嵌合的mAb ch2c和所有的人源化的mAb h2c(除了mA h2c-V2之外)都与亲代mAb 2c以相同效率中和HSV。mAb h2c-V2的中和效率为1/2，这与该变体的较低的亲和性相关联。为了进一步实验表征并进行临床前评估，选取了mAb h2c-V1，因为该变体具有与亲代抗体mAb 2c相同的亲和性和病毒中和性质。此外，mAb h2c-V1在框架区内不具有至鼠供体序列的回复突变，因此预期其在人类中具有低免疫原性潜在可能性。
使用斑减少测定法研究补体对于人源化的mAb h2c-V1和鼠mAb2c的中和活性的影响。与人超免疫球蛋白血清(
Biotest AG)不同的是，亲代mAb 2c和人源化的变体mAb h2c-V1以补体非依赖性方式中和HSV(图7)。在文献中已经描述了针对HSV-1gB的补体非依赖性中和抗体，其中和50%的病毒输入量的效价为0.8-160μg/ml(Navarro et al,1992,Virology 186)。使用鼠mAb 2c、嵌合mAb ch2c和人源化mAb变体的末端点稀释测定法测定的中和50%的HSV-1(F)所需的效价是3.3-5.1nM，其对应于0.49-0.78μg/ml(见表4)。
HSV-1和HSV-2的临床分离体的中和测定证明：与HSV-1和HSV-2的实验室株系相比，人源化的mAb变体h2c-V1对于失活具有相同的易感性。此外，mAb h2c-V1以相同的效率中和来自临床患者分离体的、对于阿昔洛韦(ACV),ACV和膦甲酸(PFA),或ACV、PFA和Cidovir(CDV)具有抗性的HSV、以及非抗性的实验室株系或具有未知抗性的临床分离体(图8)。因此，人源化的mAb h2c-V1代表了新的强有力的抗病毒试剂，其克服了诱导抗性HSV株系的常规抗疱疹药物的局限性。
为了在宿主内传播，HSV使用下列两种机制：释放无细胞的颗粒和直接的细胞至细胞的传播。HSV的细胞至细胞传播相对于无细胞传播具有优势，例如：更迅速的病毒复制和传播，以及对于体液免疫应答的要素的抗性。为了测定抗HSV抗体对于细胞至细胞传播的抑制，将Vero细胞种植于24孔组织培养板中的盖玻片上，生长至汇合，并在37℃以400TCID50/孔接种HSV-1F，持续4小时。吸出病毒接种物，以PBS洗涤Vero细胞2次，并在37℃在含有2%FBS、抗生素和过量的中和抗体、人多克隆抗HSV血清或无中和抗体(用于对照目的)的1mlDMEM中再培养48小时。48小时后，除去培养基，以HEPES缓冲的盐水洗涤Vero细胞单层2次，并在室温于PBS中的4%多聚甲醛中固定15分钟。以PBS润洗细胞单层2次，并在含有0.05%Tween 20(在HEPES缓冲的盐水中)的500μl封闭缓冲液中温育15分钟。通过使用在封闭缓冲液中按照1:100稀释的FITC缀合的多克隆山羊抗HSV血清(BETHYL,Montgomery,TX,USA)染色HSV-1感染的细胞单层而检测病毒抗原。使用PBS洗涤细胞单层3次，并使用Mowiol(Calbiochem,San Diego,CA,USA)封片。使用Leica DM IRE2共聚焦显微镜在40倍放大倍数下获取免疫荧光阳性的细胞(图9)。
人多克隆抗HSV血清(1:20)对于HSV的细胞至细胞的传播无抑制性效应(图9A)。浓度为500nM的亲代mAb 2c及其F(ab)2-片段完全抑制细胞至细胞的传播，仅可检测到单一的HSV感染的细胞(图9B和C)。相对于人多克隆抗HSV血清，以亲代mAb 2c的6倍浓度施用的Fab-片段轻微减少了细胞至细胞的传播，但是不能完全抑制细胞至细胞的传播(图9D)。如在中和测定中已经得知的，这些结果确认：中和抗体的二价对于它们抑制HSV传播的能力具有重要意义。嵌合mAb ch2c和人源化的变体mAb 2c h2c-V1在浓度为500nM时与亲代mAb 2c同样有效地抑制HSV的细胞至细胞的传播(图9E和F)。另外进行的常规的斑点抑制测定(Highlander et al.,1988)确认了通过共聚焦显微镜获得的结果。
最初的体内HSV保护实验显示：类似于亲代mAb 2c，静脉内单一剂量的5mg/kg的人源化mAb h2c-V1显著延长阴道内感染HSV-1F的严重免疫缺陷小鼠(NOD-SCID)的存活(图10)。接受15mg/kg人源化mAb h2c-V1或亲代mAb 2c的小鼠被保护完全免于了致死性脑炎(图10)。此外，在存在已经建立的外周HSV感染的情况下，人源化的mAb2c-V1还提供了对于病毒传播和致死性脑炎的保护。当在24小时、40小时和56小时通过静脉内施用15mg/kg人源化mAb 2c-V1或mAb 2c而反复处理时，对于在病毒刺激后24小时在阴道冲洗物中具有高HSV-1效价的NOD/SCID小鼠提供了免于感染的致死后果的完全保护(图11)。此外，人源化抗体mAb 2c-V1还在具有已经建立的多抗性HSV株系感染的NOD/SCID小鼠中防止了致死性脑炎。与此相反，接受阿昔洛韦的小鼠全部死亡(图12)。
表位定位(epitope mapping)
使用以编码全长gB(31-904)或在位置720,630,503,487和470具有C-末端截短的gB突变体的表达质粒转染的COS-1细胞进行的结合研究定位了亲代鼠mAb 2c识别的表位是在gB的前487个氨基酸内。使用固相结合的合成的15个氨基酸(aa)的肽(在连续肽之间具有12个氨基酸的重叠)进行的进一步研究表明：mAb 2c结合于构象表位。MAb 2c结合3个连续的肽，其代表糖蛋白B的序列上的氨基酸175至195(区域A)。另外，mAb 2c强烈结合代表氨基酸298-312的肽(298SPFYGYREGSHTEHT312)(SEQ ID NO:17)，并中等地结合代表氨基酸301-315的下一个肽(图13A和图22)。根据mAb 2c在蛋白印迹[使用重组gB(gB(730)t，由Florent Bender,University of Pensylvania,Philadelphia,USA惠赠),其在天然或变性SDS-PAGE条件下被分离]中的反应活性对其进行的表征确认：mAb 2c识别不连续的表位，所述表位对于蛋白印迹条件下的变性或重构是部分抗性的，因此其被称作“假连续”表位(见参考文献Bender,F et al.J.Virol.2007,81 p3872-3841)(图13B)。
为了鉴定HSV-1gB蛋白内与mAb 2c的病毒中和活性相关的表位，研究了在糖蛋白中具有单一氨基酸(aa)改变的单克隆抗体抗性(mar)HSV-1突变体(表5)。
表5.mAb 2c对于单克隆抗体抗性(mar)HSV-1突变体的中和以及结合活性
(a)根据包括信号序列的成熟糖蛋白B编号(图13A)
(1)Kousoulas et al.,1984
(2)Pellett et la.,1985
(3)Kousoulas et al.,1988
(4)Highlander et al.,1989
MAb 2c不中和mar突变体R126,R1375和B4.1，但是完全中和突变体R1435和R233的感染力。此外，免疫荧光测定法确认：mAb 2c不结合感染了mar突变体R126,R1375和B4.1的Vero细胞。这些结果表明：氨基酸Y303,R304和E305对于mAb 2c的中和活性是必不可少的。使用感染了mar突变体R1435和R233的Vero细胞获得了强烈的荧光信号。
特别地，发现mAb 2c对于gB的氨基酸303-305的识别和结合对于其功能(病毒中和、细胞至细胞传播的抑制)是必不可少的。由于gB的该区域在HSV-1和HSV-2株系之间是高度保守的，所以推测这些氨基酸属于gB的核心融合机构，并且对于病毒进入是必不可少的。因此，即使是在高度选择压力下，不与mAb 2c结合的天然gB-突变体的产生也是不可能的。
实施例3
抗体亲和性的测定
使用MOI为3的HSV-1或HSV-2感染80%-90%汇合度的Vero细胞的单层，次日，通过胰蛋白酶处理收获，然后在PBS中洗涤。按照之前的描述(1)进行2c抗体的细胞表面结合测定。简而言之，按照一式三份将浓度为0.03nM-500nM的纯化的mAb 2c或衍生的抗体片段2c-F(ab’)2,2c-Fab和2c-scFv与100μl FACS缓冲液(PBS,2%FBS,0.1%叠氮化钠)中的5x 105Vero细胞在室温温育1小时。使用200μlFACS缓冲液洗涤细胞2次并与FITC标记的Fab特异性山羊抗小鼠IgG(15μg/ml,Jackson ImmunoResearch,Newmarket,Suffolk,England)温育，以检测结合的mAb 2c,2c-F(ab’)2和2c-Fab。结合的scFv这样检测：首先与饱和浓度的抗-c-myc mAb 9E10(10μg/ml;Roche,Indianapolis,IN,USA)温育，然后洗涤2次并与Fcγ特异性的FITC标记的山羊抗小鼠IgG(15μg/ml;Jackson ImmunoResearch)温育。将细胞洗涤2次并重悬于FACS缓冲液。在FACScalibur(BD Bioscience,San Jose,CA,USA)上测定荧光，使用CellQuestTM软件(BD Biosciences)计算中值荧光强度(MFI)。减掉背景荧光，并使用Marquardt和Levenberg的非线性回归方法，使用GraphPad Prism 4.0版本(GraphPad Software,La Jolla,CA)确定平衡结合常数。
表位的表征
mAb 2c与天然或变性的截短的糖蛋白B[gB(730)t(4)，由Roselyn J.Eisenberg和Gary H.Cohen(University of Pennsylvania,Philadelphia,USA)惠赠]的免疫反应活性基本上按照描述进行(4)：在非还原(含有0.2%SDS的样品缓冲液)或变性(含有2%SDS和155mM β-巯基乙醇的样品缓冲液，2分钟、95℃)条件下在8%的SDS-PAGE上分离纯化的gB(730)t(0.75μg)，并转移至硝酸纤维素膜。以TNT缓冲液(0.1MTris.HCl,pH 7.5,0.15M NaCl,0.05%Tween-20)中的2%牛奶封闭膜的剥离物，持续1小时；然后以5μg/ml特异于糖蛋白B的抗体mAb 2c,H126(Novus Biologicals,Littleton,CO,USA)和H1817(Novus)(在2%牛奶/TNT缓冲液中)在室温温育2小时。使用辣根过氧化物酶缀合的多克隆山羊抗小鼠抗体(1:20,000QED Bioscience Inc.San Diego,CA,USA)和化学发光法(Thermo Scientific)，使用LAS 3000Luminescent ImageAnalyzer(Fujifilm,Tokyo,Japan)检测结合的抗体。
使用编码全长HSV-1gB(31-904,pRB9221)或在下列位置截短的C末端删除的突变体：720(pTS690),630(pPS600),503(pRB9510),487(pRB9509),470(pRB9508)的质粒，通过DEAE-葡聚糖方法瞬时转染COS-1细胞。质粒由L.Pereira(52,55)惠赠。按照其它地方的描述(53)，使用mAb 2c或对照抗体进行转染的细胞的免疫荧光测定。
肽定位(peptide mapping)
按照描述(20,34)，根据标准的SPOT合成程序(JPT PeptideTechnologies,Berlin,Germany)，自动化制备与纤维素结合的重叠的13个氨基酸的肽和双表位。另外，将偶联了反应活性标签和连接子的肽化学选择性地固定于3个相同的亚阵列中的修饰的玻璃表面上，并通过随后的洗涤步骤除掉截短的和乙酰化的序列而进行纯化。以含有TBS的封闭缓冲液(Pierce International)封闭肽微阵列2小时，并以封闭缓冲液中的10μg/ml mAb 2c温育2小时。以含有0.1%Tween的TBS缓冲液(T-TBS)洗涤肽微阵列，将肽膜上的与肽结合的抗体转移至PVDF膜上。使用终浓度为1μg/ml(在封闭缓冲液中)的过氧化物酶标记的抗小鼠IgG(Sigma)或荧光标记的抗小鼠IgG(Pierce)作为二抗。温育2小时并以T-TBS最终洗涤之后，使用化学发光底物(Roche Diagnostics)分析PVDF膜。使用T-TBS和3mM SSC缓冲液(JPT Peptide Technologies)彻底洗涤玻片肽微阵列，在氮气下干燥并使用高分辨率荧光扫描仪扫描(Axon GenePix 4200AL)。使用斑点识别软件(GenePix 6.0)分析荧光信号强度(光单位，LU)，并根据使用抗小鼠IgG二抗的对照温育的背景强度进行校正。
病毒中和测定
通过之前描述的末端点稀释测定法(16)测定抗体的中和活性。简而言之，将连续稀释的抗体与100TCID50HSV-1或HSV-2在37℃在细胞培养基中温育1小时。将抗体病毒接种物施用至生长于微量滴定板中的Vero细胞单层，在37℃温育72小时之后对致细胞病变效应(CPE)进行评分。减少病毒诱导的CPE达100%所需的抗体浓度测定为完全中和效价。另外，在存在交联抗体的情况下，通过在预温育步骤中加入过量的抗鼠Fab IgG(2600nM,Jackson ImmunoResearch,Newmarket,Suffolk,England)，研究了单价2c-Fab片段的病毒中和能力。为了对照目的，使用无抗体的病毒和单独的抗体，以诱导最大化的CPE或无CPE。病毒中和测定重复至少2次，具有类似的结果。
附着后中和测定
在4℃以100TCID50HSV-1F感染预冷(4℃，15分钟)的Vero细胞单层1小时，以允许病毒吸附，然后加入连续稀释的mAb 2c或来自人血浆的多价IgG制剂(
Biotest AG,Dreieich,Germany)(附着后中和)。为了比较相同实验条件下mAb 2c的附着前与附着后中和效力，在4℃将100TCID50HSV-1F与相同的抗体稀释物温育1小时，然后加入至预冷的Vero细胞单层中。将这两种测定中的接种的Vero细胞在4℃再温育1小时，然后转移至37℃。在72小时后按照如上所述的标准中和测定法测定中和效价。
细胞至细胞的传播测定
在37℃，以400TCID50/孔(500μl)的HSV-1F接种在盖玻片上生长至汇合的Vero细胞，持续4小时。吸出病毒接种物，以PBS洗涤Vero细胞2次，在存在或不存在过量的中和抗体(在含有2%FBS的1ml生长培养基中)的情况下，在37℃再培养48小时。以1:20的稀释度使用源于具有高效价的抗HSV-1免疫球蛋白的经免疫的供体的汇集的人血清作为对照，二价抗体mAb 2c和2c-F(ab’)2的浓度是500nM，单价2c-Fab的浓度是3000nM。48小时后，除去培养基，以HEPES缓冲的盐水洗涤Vero细胞单层2次，并在室温以PBS中的4%多聚甲醛固定15分钟。为了显示病毒传播，以PBS润洗细胞2次，在含有0.05%Tween20的500μl HEPES缓冲的盐水中温育15分钟，并以FITC缀合的多克隆山羊抗HSV血清(1:100,BETHYL,Montgomery,TX,USA)染色。以PBS洗涤染色的细胞3次，并在含有0.2g/ml Mowiol 4-88(Calbiochem,San Diego,CA,USA)的封片培养基中封片。使用Leica DM IRE2共聚焦显微镜在40倍的放大倍数下获取免疫荧光图像。另外，通过吸附后病毒中和测定法测试细胞至细胞的传播抑制。在37℃将生长于6孔板中至汇合的Vero细胞与200TCID50HSV-1F(在含有2%FBS和抗生素的3ml DMEM中)温育4小时。以PBS洗涤2次细胞单层，并以含有过量中和抗体或多克隆人HSV-1中和血清的温暖的成斑培养基(DMEM,5%(w/v)琼脂,10%FBS,抗生素)覆盖。在37℃温育48小时后通过光学显微镜分析斑的形成。
DNA定量
通过进行实时(RT)PCR定量HSV-1和HSV-2的基因组。根据生产商的说明书，使用自动化核酸提取系统MagNA Pure LC System(Roche)从含有等量的HSV-1和HSV-2感染性颗粒的样品中纯化DNA。然后使用RealArt HSV-1/HSV-2定量试剂盒(Qiagen)进行RT-PCR(Lightcycler,Roche)，以定量病毒DNA。
小鼠保护实验
使用20μl 1x106TCID50HSV-1F接种物/小鼠阴道内刺激6-8周龄的经麻醉的雌性非肥胖的糖尿病/严重组合免疫缺陷(NOD-SCID)小鼠(NOD.CB17-Prkdcscid/J,Charles River Laboratories,Research Modelsand Services,Sulzfeld,Germany)。将皮肤胶水(Epiglu,Meyer-HaakeMedical Innovations,Wehrheim,Germany)应用至外阴以防止病毒接种物流出。通过培养阴道灌洗物检测，递送的接种物诱导了大于94%的感染率。在病毒接种之后每日检查小鼠的体重下降、外阴炎/阴道炎(红色、黏脓性流出物和炎症迹象)和神经疾病。显示出这些症状中的任意项的小鼠被立即杀死。通过在病毒接种前24小时(为了免疫预防)或病毒感染后24小时、40小时和56小时(为了治疗性处理))静脉内(i.v.)注射纯化的mAb 2c而被动免疫小鼠。通过测定在感染后第1、2、4、6和8天以及在死亡时获得的阴道冲洗物的病毒效价而检测小鼠的感染情况，使用末端点稀释测定法在Vero细胞上进行。在器官匀浆之后测定被杀死的小鼠的器官(脾、肾上腺、肺、心脏、肝、肾、脊髓和脑)中的病毒载量，通过其它地方的描述(41)通过在Vero细胞单层上滴定而进行。每个测试组和对照组含有9-10只具有可检测的HSV-1感染的动物。
结果
mAb 2c识别的gB表位的定位和分析
最近确定的来自1型HSV(HSV-1)的gB的外部结构域的晶体结构揭示了多结构域的三聚体，其具有5个不同结构域：结构域I(基底)、结构域II(中间)、结构域III(核心)、结构域IV(冠部)和结构域V(臂)(24)。为了表征mAb 2c的中和表位，我们在还原或非还原条件下的蛋白印迹分析中测定了其与重组gB(730t)(4)的反应活性。作为对照，我们使用了识别线性表位的mAb H1817(4)和识别非连续表位的mAbH126(33)。在使用mAb H1817的蛋白印迹分析中获得了线性表位的典型染色样式，显示在非还原条件下检测到单体和三聚体形式的gB，在还原条件下仅检测到主要是gB单体的染色(图13B)。如所预期的，mAbH126与gB仅在天然条件下反应。令人惊奇的是，仅识别大于170kDa的上面的gB蛋白说明mAb H126是三聚体特异性的(图13B)。然而，MAb 2c与天然和变性的gB反应，在变性条件下的反应活性比mAbH1817弱得多(图13B)。之前已经报道了一组其它的与非连续表位结合的中和抗体在变性条件下与gB单体的弱的反应活性，所述抗体似乎对于SDS-PAGE电泳过程中的变性或重构有抗性，因此被称作“假连续”表位(4)。
为了鉴定mAb 2c的结合中涉及的特异性表位，我们使用了显示于肽微阵列上的源自gB的肽。首先，通过点合成(Spot-Synthesis)制备了显示氨基酸31至505的gB序列，作为重叠的13个氨基酸的肽，所述肽通过不带电荷的乙酰化的氨基末端与连续纤维素膜结合，具有3个氨基酸的偏移。为了避免非复合抗体的结合平衡的偏移，将mAb 2c肽扫描固定于PVDF膜上，然后通过化学发光法检测。如具有指明的功能结构域的全长gB的示意图中所示(图14A)，mAb 2c的反应活性限定于跨越结构域I中的两个单独区域的肽，包含残基175-193的3个连续肽(结合区域A)和包含残基295-310的两个重叠肽(结合区域B)。为了验证所鉴定的这两个结合区域，我们使用了另外一组纯化的通过柔性连接子固定于玻片上的13个氨基酸的肽。与纤维素筛选相比，该微阵列扫描的读出(通过荧光)确认了相同的表位结合区域(图14B)。由于纯化的肽和高分辨率微阵列扫描系统的应用，在该肽微阵列中mAb2c在两个结合位点识别另外的连续肽(图14B)。
我们将所鉴定的mAb 2c的结合位点定位至经解析的gB结构(24)。有趣的是，显示出与mAb 2c最强的反应活性的肽172QVWFGHRYSQFMG184(SEQ ID NO:18)与2个推定的融合环之一(融合环1173VWFGHRY179)(SEQ ID NO:19)重叠，所述环位于结构域I的弯曲亚结构域中(22)(图15)。然而，结合位点A位于gB三聚体的基底处，这使得在最可能代表融合后构象的可获得的gB结构(24)中，其不能靠近mAb 2c。结合位点B的残基是暴露的并位于结构域I的上面的部分(图15)。
为了进一步测定mAb 2c的构象依赖性表位，以多种组合连接(直接或通过1个或2个β-丙氨酸间隔子分开)了两个结合区的共有序列，作为双表位(图16)。最近已经证明了在残基E187后非常靠近融合环1的地方插入连接子会导致融合缺陷型gB突变体(40，61)，即使gB折叠成为融合后构象(61)。因此，除了结合区域A的共有基序179YSQFMG184(SEQID NO:20)之外，我们在单独的双表位扫描中包括了结合区域A的186FED188基序。与在13个氨基酸的肽扫描中显示出与mAb 2c最强结合反应活性的肽172QVWFGHRYSQFMG184(SEQ ID NO:18)(图16)相比，结合位点A基序与结合位点B的共有肽300FYGYRE305(SEQ ID NO:21)的组合产生了具有增强的信号强度的两个双表位(图16，双表位组I和II)。虽然mAb 2c与双表位179YSQFMG184-βA-300FYGYRE305(SEQ IDNO:22)的结合强度仅有稍微增加，但是使用双表位186FED188-βA-βA-300FYGYRE305(SEQ ID NO:23)获得了几乎饱和的荧光信号强度。
因此，来自肽微阵列的结果对应于蛋白印迹结果，并且证明mAb 2c识别构象依赖性表位。为了防止病毒粒子被膜与细胞膜融合，mAb 2c应该结合gB的融合前构象。然而，mAb 2c的中和表位仅部分定位于存在于可获得的gB晶体结构(24)中的gB构象的表面，这说明gB可能在进入过程中采纳不同的构象。
mAb 2c衍生的二价和单价抗体的表征
数位研究人员已经使用单克隆抗体来鉴定gB上的对于其在病毒进入中的功能必不可少的区域(4，25，39，52)。已经提出，中和抗体[结合于gB三聚体的基底的独特功能区(包含结构域V的C末端的残基和靠近的原体的结构域I的残基)]干扰gB的融合活性(4)。因此我们假设，与靠近结构域V的C末端的结构域I内的mAb 2c表位结合的单价抗体应该足以阻断gB激活之后的合作构象变化。由于mAb 2c在体外在无补体的情况下中和HSV-1(16)，我们产生了常规的F(ab’)2和Fab片段和重组单链片段可变(scFv)，作为研究mAb 2c介导的假设的机理的有用工具。通过尺寸排阻色谱监视所产生的抗体制备物的匀质性(数据未显示)。使用被HSV-1或HSV-2感染或未感染的Vero细胞进行的流式细胞术分析证明了mAb 2c和mAb 2c衍生的抗体片段的特异性结合(数据未显示)。我们进一步使用荧光细胞术测定抗体与HSV-1和HSV-2感染的Vero细胞的平衡结合曲线(图17)。这些研究的结果证明：相对于Fab和scFv，完整IgG和F(ab’)2片段具有更高的表观亲和性(表6)。二价抗体的功能亲和性(avidity)相对于单价抗体的所测定的亲和性的增加表明二价抗体能够同时结合细胞表面上的两个gB表位。相对于单价抗体对应物，二价的mAb 2c和2c-F(ab’)2显示出1.7-2.8倍的表观亲和性。F(ab’)2片段相对于IgG的表观KD的稍微增加可能是由于F(ab’)2构建体内的抗原结合位点的较高的柔韧性。mAb 2c,2c-F(ab’)2和2c-Fab对于HSV-1和HSV-2感染的Vero细胞的相似的表观亲和性确认了识别的gB表位在这两种病毒之间无结构上的差异(表6)。
表6.mAb 2c和衍生的抗体片段对于结合HSV-1F或HSV-2G感染的Vero细胞的表观平衡常数
通过将来自以流式细胞术测定的平衡结合曲线的数据(图17)拟合至Marquardt-Levenberg等式而测定与HSV感染的细胞上的gB结合的aKD值。
单价和二价抗体在体外的中和活性
与在HSV-1病毒粒子与Vero细胞相互作用之前（附着前）还是之后（附着后）无关，mAb 2c的中和效力是相同的(图18A)，这说明mAb2c不干扰病毒与靶细胞的结合。与此相反，多克隆人γ球蛋白
明显是通过抑制病毒粒子与靶细胞附着而中和(图18B)。在Vero细胞上进行的标准中和测定中比较了mAb 2c衍生的片段F(ab’)2,Fab和scFv的中和活性与它们的亲代IgG对应物的中和活性。亲代mAb 2c在浓度为8nM时100%减少HSV-1诱导的致细胞病变效应(CPE)。有趣的是，需要4倍高的mAb 2c浓度以完全减少HSV-2诱导的CPE(图19A)。相对于亲代mAb 2c，二价2c-F(ab’)2减少HSV-1和HSV-2诱导的CPE的效率高2倍。令人惊奇的是，我们观察到单价2c抗体片段对于中和HSV-1和HSV-2的能力上的根本性差异。与亲代mAb 2c相比，分别需要大约375倍和94倍的浓度的2c-Fab以100%减少HSV-1和HSV-2诱导的CPE(图19A)。重组2c-scFv在光学显微镜下显示出斑减少效应，但是即使在所测的最高浓度即3000nM也不能100%减少HSV诱导的CPE(数据未显示)。
由于二价抗体mAb 2c和2c-F(ab’)2都以相对于HSV-1的约1/4的效率中和HSV-2(图19A)，所以我们通过定量实时PCR分析了含有等量的感染性颗粒中的HSV-1和HSV-2制备物的基因组拷贝数。与HSV-1相比，发现HSV-2有4倍数目的基因组当量(数据未显示)，这与中和HSV-2所需的较高的mAb 2c和2c-F(ab’)2抗体效价良好相关。
如图19A所示的中和测定表明在抗体价数与中和效力之间存在强烈关联。因此，我们研究了是否可以通过交联Fab片段来恢复2c-Fab片段的清除病毒感染的能力。在不存在或存在与鼠Fab片段反应的IgG的情况下重复了针对2c-Fab的病毒中和测定。如图19B所示，2c-Fab的交联显著增加了中和活性，但是不能将其恢复至与亲代mAb 2c相同的效力。单独的抗鼠Fab IgG对于病毒中和无效应(数据未显示)。
细胞至细胞传播的抑制
虽然2c-Fab片段不有效中和游离病毒粒子，但是有人报道小的抗体片段具有更有利的扩散性质(66)，我们研究了它们阻止HSV-1从被感染的细胞跨越细胞接点到达未被感染的细胞的活性。二价抗体mAb 2c和2c-F(ab’)2都完全消除了Vero细胞单层中的HSV-1传播，通过间接免疫荧光仅可见到单一的感染的细胞(图9)。虽然多克隆人血清具有中和游离病毒粒子的能力，但它完全不能抑制病毒的细胞至细胞的传播。这最有可能是针对多种HSV表位的中和抗体的群体的异质性的结果。与多克隆人免疫血清相比，单价2c-Fab片段能够在一定程度上控制细胞至细胞的传播。然而，与其二价对应物不同，单价2c-Fab片段即使在所测的6倍高的浓度时也不能完全消除病毒传播(图9)。因此，抗体价数在抑制HSV-1在邻近细胞之间的传播上也具有关键作用。
对于免疫缺陷小鼠免于传播的HSV感染的免疫保护
我们之前显示了CD4+和CD8+T-细胞耗竭的小鼠在阴道内感染HSV-1之后，通过被动转移mAb 2c能够提供免于致死脑炎的完全保护(17)。在人类中的HSV-2感染位点积聚的天然杀伤(NK)细胞(28)是干扰素γ的早期来源(45)，其对于控制HSV感染具有至关重要的意义(2，45，62)。更近期以来，已经首次证明了人NK细胞介导免于人源化小鼠中的原发性生殖器HSV感染的保护，作为先天免疫应答(37)。为了研究mAb2c是否独立于抗体介导的免疫应答而赋予抗病毒活性，我们应用了NOD/SCID小鼠模型，该模型除了SCID T-和B-细胞缺陷之外，还缺乏NK细胞和巨噬细胞功能和刺激补体途径的能力。NOD/SCID小鼠的阴道内HSV-1感染(1x106TCID50)导致迅速的进展性系统性疾病，其中值生存时间为9天。通过末端点稀释测定法测定了器官中的HSV效价，其显示脊髓(2.3x106TCID50),脑(3.8x105TCID50)和阴道粘膜(1.4x106TCID50)中的高病毒效价，肾(1.7x104TCID50)和肾上腺(1.1x104TCID50)中的中等效价，肺(1.1x103TCID50)和心脏(1.9x102TCID50)中的低效价(数据未显示)。为了测定mAb 2c的治疗效果，在阴道内HSV-1刺激之前24小时，以2.5mg/kg,5mg/kg或15mg/kg抗体静脉内处理NOD/SCID小鼠(图20)。接受低抗体剂量的小鼠不能完全被保护免于HSV-1的致死感染。然而，与接受PBS的对照小鼠相比，以5mg/kg mAb2c处理的小鼠的中值生存时间延长2.6倍。来自未被保护免于致死脑炎的小鼠的所研究的器官中的HSV-1效价与未经处理的对照组是相当的。与此相反，在15mg/kg剂量的mAb 2c达到了动物的完全保护。由抗体保护的小鼠的器官中的抗体效价在1x102TCID50的检测极限之下。
接下来我们研究了，在存在已经建立的外周HSV感染的情况下，在暴露后以mAb 2c免疫是否也赋予免于病毒传播和致死脑炎的保护。在24小时、40小时和56小时静脉内以15mg/kg mAb 2c反复处理在病毒刺激后24小时在阴道清洗物中具有高HSV-1效价的NOD/SCID小鼠(图11和图21)。PBS处理的对照组显示恒定的阴道病毒蜕落物，直至在第7天至第9天之间不得不杀死具有神经症状的小鼠。与此相反，mAb2c在第8天时清除了已经建立的HSV-1感染，并完全阻止了感染的致死后果(3x300μg;与PBS相比，P=0.0003)。此外，在感染后1个月，在mAb 2c处理的动物的感觉神经元和各器官中未检测到病毒粒子(数据未显示)。
讨论
在病毒采取了进入靶细胞的步骤之后，病毒中和性mAb能够通过数种机制抑制其进入。病毒表面蛋白与细胞蛋白、脂质或碳水化合物的特异性相互作用代表了感染的最初阶段，其可被中和抗体阻断。抑制病毒附着的抗体可以直接结合病毒粒子受体结合位点，例如与HIV-1gp120的CD4结合位点反应的mAb F105，和覆盖流感病毒血细胞凝集素(HA)的受体结合位点的Fab HC19(6，19，54)；或者，空间地干扰受体衔接，例如与HA受体结合位点靠近
结合的Fab HC45(18)。除了HSV gD与其细胞受体之一的必不可少的结合之外，gB在病毒粒子与靶细胞的附着中具有重要作用。最近描述了HSV gB的两个不依赖于硫酸乙酰肝素蛋白多糖的真实细胞表面受体和/或附着因子的存在(5，23，60)。配对的免疫球蛋白样2型受体(PILRα)已被表征为在至少某些细胞类型中是gB的一种可能的蛋白受体(60)。对于mAb 2c，比较性的附着前和附着后中和测定显示：抗体可能不抑制病毒与细胞表面的结合，但是阻断病毒进入。之前已经证明了gB通过其融合结构域的关键性疏水和亲水残基与脂膜的相互作用(22，23)可以被识别紧邻其融合环的表位的mAb阻断(4，22)。由于mAb 2c的构象表位与融合环1部分重叠，所以我们推论：mAb 2c的结合最有可能干扰融合信号的传播，我们进一步测定了结合后/融合前阶段的中和，作为可能的作用模式。
激发的结构重排是病毒融合糖蛋白的关键特征，其导致不同的融合前和融合后构象。已经沿着波峰的侧面结构域以及gB晶体结构的冠部的尖端定位了不同中和mAb的表位(4，24)。mAb 2c的表位定位于gB三聚体的基底处的独特功能区(FR1)，由结构域V的C末端螺旋αF内的残基和邻近原体的结构域I内的残基组成(4)。我们的同源性模型显示：mAb 2c识别的非连续表位的一个部分(F300至E305)定位于gB的结构域I的上面的部分，其具有pleckstrin同源性(PH)结构域的特征(7，38)。该表位的另一个部分(F175至A190)也位于结构域I，然而，其是埋藏的，对于mAb 2c的结合是不可靠近的，除非gB经历大的构象改变。因此，我们假设mAb 2c优先在融合前构象阻止gB转变。基于mAb 2c表位的定位和“激活后的构象变化是合作性”的假设，我们推论mAb 2c的单价相互作用将足以阻断gB的融合结构域与细胞膜的并列。然而，令人惊奇的是，所产生的单价抗体片段(Fab和scFv)没有一个能够有效中和游离的病毒粒子或抑制病毒的细胞至细胞的传播。与此相反，两个二价分子，mAb 2c和2c-F(ab’)2，对于病毒中和以及细胞至细胞传播的抑制是高效率的。本研究中的所有的衍生自mAb 2c的抗体都保留了特异性和相当的结合活性，这排除了由于非配对抗原识别而导致的单价与二价抗体的功能差异。免疫球蛋白的多价结合加强它们的功能亲和性(26)。然而，功能亲和性上的增加与抗体结合位点的内在亲和性为相反的关系(49)。对于因此，当与单价对应物scFv和Fab比较时，二价2c抗体，IgG和F(ab’)2，的平衡常数仅在1.7和2.8之间的中等增加，对于具有低的nM范围的内在亲和性的抗体而言不是不寻常的。因此，事实上，较高的表观亲和性表示的确发生了与gB抗原的多价(较高的亲和力(avidity))结合，并且提示mAb 2c与2c-F(ab’)2的抗病毒活性是gB交联的结果。相对于二价或多价抗体(具有针对水痘带状疱疹病毒(VZV)的gH抗原的特异性)，单价抗体的较差的中和效率已经被讨论为空间位阻的问题(由于这些抗体具有不同的大小)(15)。虽然我们不能完全排除这种可能性(作为mAb 2c变体的潜在的额外的中和机制)，但是这似乎是不可能的，因为没有观察到抗体大小、中和效率和细胞至细胞的传播抑制之间的直接关联。此外，我们的数据显示：较小的2c-F(ab’)2具有甚至比较大的2c-IgG更好的病毒中和活性。因此，本发明的发现表明gB交联是mAb2c的抗病毒活性的关键机制，并且提出了通过gB三聚体的固定引起的gB融合前构象的稳定化抑制融合信号的激活。Silverman最近的研究(61)提出：在靠近融合环1的残基E187后插入5个氨基酸之后，HSV-1gB外结构域的融合缺陷型表型可能不是源于gB的构象变化的干扰，而是源于其它机械gB功能的干扰。在我们的双表位扫描中，mAb 2c与覆盖特定的插入位点E187的结合位点A/B双表位186FED188-βA-βA-300FYGYRE305(SEQ ID NO:23)强烈反应，该插入位点对于gB功能似乎是关键性的。因此，可有趣地推论：mAb 2c交联破坏gB与HSV融合机构的其它成分的相互作用。然而，尚需要进一步研究，因为我们的结果不允许辨别，交联阻断gB本身的构象变化，还是阻断gB、gD和gH/gL之间的相互作用，它们发生于细胞融合中(3)并且对于完成融合过程是必不可少的(65)。在解析的晶体中观察到的HSV-1gB构象(24)提示代表融合后形式，gB的融合前模型尚未被表征。因此，mAb 2c或其F(ab’)2与gB的复合物的X-射线晶体学研究可能提供关于gB的天然构象的知识和关于融合信号的传播的更好的理解。
评估表面施用的抗-gD和抗gB抗体用于在小鼠中阻止HSV-2感染的阴道传播的保护性功效的研究证明了工程化的重组抗体作为新的阴道杀微生物剂的可行性(67-69)。在母体继承感染的新生儿中，在具有复发性眼睛感染的患者中，或在严重免疫缺陷患者中可能发生严重的、甚至危及生命的HSV感染。为了研究系统性施用我们的抗gB抗体是否也在体内环境下在高度免疫缺陷下赋予保护，我们应用了NOD/SCID小鼠模型。我们使用阴道内HSV-1接种作为已经建立的神经节感染途径，病毒的轴突传播引起后肢瘫痪，并且在免疫活性的以及T细胞耗竭的小鼠中引起致命性疱疹脑炎(16，17)。在本文中我们证明：mAb 2c不仅完全保护NOD/SCID免于原发性HSV－1感染的急性期，而且对于完全阻止神经疾病和死亡是有效的，即使是在外周病毒传播已经开始后。HSV的细胞至细胞传播是病毒跨越神经突触和紧密接点以及规避获得性免疫系统的免疫屏障而转移的非常有效的途径。MAb 2c减少感染的阴道组织中的病毒表达，并且抑制HSV的轴突传播。其它报告显示：在病毒刺激之后施用抗HSV IgG能够减少动物中的急性神经节感染的量(16，42)。与此一致，显示了向具有角膜HSV-1感染的小鼠腹膜内施用的重组人抗gD IgG定位于HSV感染的神经纤维和感觉神经元(59)。此外，以特异于HSV gD、gC或gB的mAb对免疫活性动物进行的被动免疫(在暴露之后的适当的时间施用)显示出针对HSV诱导的神经疾病的保护(13，16)。然而，从数项动物研究已经得出结论：仅有体液免疫力对于控制HSV感染是无效的。
我们的抗体的体内保护效力与免疫效应子功能是无关的。从文献中的数项动物研究还得出了结论：仅有体液免疫力对于控制HSV感染是无效的。与该观点一致，已经报道了使用抗HSV-1超免疫血清对于保护免疫抑制的或免疫缺陷的小鼠是无效的(47，48，50，51，56)。相对于未处理的对照，在HSV-1感染后24小时以人抗gD mAb系统性处理无胸腺裸鼠延长了其存活，但是未阻止死亡(58)。另一项研究显示：在HSV-1诱导的基质角膜炎小鼠模型中，抗gD mAb阻止了CD4+或CD8+T细胞耗竭的小鼠的死亡，但是当小鼠同时耗竭这两种T细胞子集时，未能阻止其死亡(64)。
据我们所知，我们首次证明了系统性施用的抗gB交联mAb的保护性功效，其完全阻止了神经元的HSV-1传播，与细胞效应子机制和补体无关。mAb 2c对于常见类型的gB表位(其对于HSV复制是至关重要的)的特异性及其高度保护性功效、无需募集另外的免疫效应子功能，表明了该抗体作为新型免疫治疗剂的巨大潜力。
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实施例4
病毒中和测定
在微量滴定板中的Vero细胞上进行中和测定：使用过量的抗体，通过斑点减少测定法进行，以确定病毒的中和敏感性；或者，通过末端点稀释法进行，以测定抗体溶液的中和效价。斑点减少测定法这样进行：将250个斑点形成单元与20μgMAb 2c温育。2小时后，加入50μL/孔的Vero细胞悬浮液(1.5x 105个细胞/mL)。3天之后，以结晶紫染色细胞。对于末端点滴定，将稀释的抗体溶液(0.025mL)与100TCID50HSV-1(0.025mL)，和0.025mL豚鼠补体(以1:10稀释)一起温育。效价表示为在50%的培养物中阻止病毒诱导的致细胞病变效应的最高血清稀释度的倒数。
gB删除突变体的构建和在COS-1细胞中的表达
已经在其他地方[30，31]描述了编码全长HSV-1gB(gB(1-904)=pMT2gB),gB(1-720),gB(1-630),gB(1-505),gB(1-503),gB(1-487)和gB(1-470)的质粒的构建。质粒由Leonore Pereira,University ofCalifornia,San Francisco惠赠。编码gB(1-130),gB(1-223),gB(183-488)和gB(436-642)的质粒这样构建：将两翼有限制性酶切位点Bam HI和Xho I的PCR扩增子克隆进入真核表达载体pSVL(AmershamPharmacia,Freiburg,Germany)。包含gB核苷酸52588至60362的HSV-1株系17+的亚基因组质粒克隆[33;GenBank X14112]用作PCR中的模板。为了表达N-末端截短的gB构建体，使用在其5′末端包含XhoI位点的引物通过PCR扩增编码gB信号序列的DNA，并插入至亚片段质粒gB(183-488)和gB(436-642)的gB编码DNA的5′。通过核苷酸测序确认插入物的正确方向及其序列。使COS-1细胞在置于24孔板中的盖玻片(直径10mm)上生长，并通过DEAE-葡聚糖方法[34]以质粒转染所述细胞。使用良好表征的抗-HSV-1gB小鼠单克隆抗体H1396和H1781的混合物，通过间接免疫荧光显微镜法验证gB及其截短的衍生物的表达。使转染并固定的COS-1细胞与MAb 2c反应并通过免疫荧光显微镜分析。
gB的定点诱变和重组病毒的构建
使用Altered SitesTM体外诱变系统(Promega,Mannheim,Germany)通过寡核苷酸定点诱变在HSV-1gB中导入单一氨基酸突变。简而言之，将pMT2gB[31]中的gB编码序列转移进入大肠杆菌噬菌粒诱变载体pAlter-1。通过使用噬菌体R408感染经pALTER-1gB转化的大肠杆菌JM109细胞而制备单链pALTER-1gB DNA分子。根据生产商的说明书，使用下列错配引物(以下划线标示了突变的位置)进行定点诱变：
Y296N(N=突变),5’-GGGACATGTTCACAAAGTC-3’;(SEQ ID NO:24);
Y296F,5’-GGGACATGAACACAAAGTC-3’ (SEQ ID NO:25);
M297L,5’-ACGGGGACAGGTACACAAA-3’ (SEQ ID NO:26);
M297T,5’-AACGGGGACGTGTACACAA-3’ (SEQ ID NO:27);
M297V,5’-ACGGGGACACGTACACAAA-3’ (SEQ ID NO:28);
S268A:5′-AAAACGGGGCCATGTACAC-3′ (SEQ ID NO:29);
P299S,5’-CGTAAAACGAGGACATGTA-3’ (SEQ ID NO:30);
F300Y,5’-TAGCCGTAATACGGGGACA-3’ (SEQ ID NO:31);
F300I:5′-TAGCCGTAAATCGGGGACA-3′ (SEQ ID NO:32);
Y301N,5’-GTAGCCGTTAAACGGGG-3’ (SEQ ID NO:33);
G302R,5’-CCCGGTAGCGGTAAAACGG-3’ (SEQ ID NO:34);
G302V,5’-TCCCGGTAGACGTAAAACG-3’ (SEQ ID NO:35);
Y303N,5’-ACCCCTCCCGGTTGCCGTAAAACG-3’ (SEQ ID NO:36);
R304G,5’-ACCCCTCCCCGTAGCCGTA-3’ (SEQ ID NO:37);
R304L,5’-GACCCCTCCAGGTAGCCGT-3’ (SEQ ID NO:38);
E305K,5’-GTGCGACCCCTTCCGGTAGCCGT-3’ (SEQ ID NO:39);
G306A,5’-GTGTGCGACGCCTCCCGGT-3’ (SEQ ID NO:40);
G306V,5’-GTGTGCGACACCTCCCGGT-3’ (SEQ ID NO:41);
S307A,5’-CGGTGTGCGCCCCCTCCCG-3’ (SEQ ID NO:42)。
引物延伸并连接以形成完全双链的、共价闭合的环状分子之后，将异双链DNA转化进入大肠杆菌BMH 71-18mutS，其不能修复核苷酸错配。从氨比西林抗性克隆得到的质粒用于转化大肠杆菌JM109(recA-)。通过gB DNA测序确认得到的pAlter-1gB质粒中的突变的身份。诱变之后，将突变的插入物克隆回表达载体pMT2gB，得到各自的pMT2gBmut构建体。为了分析MAb 2c与具有单一氨基酸突变的gB的反应活性，根据生产商的说明书，通过LipofectamineTM/OPTI-MEMTM方法(Invitrogen,Karlsruhe,Germany)，使用pMT2gBmut构建体转染生长于盖玻片(10x30mm)上的COS-1细胞。培养44小时之后，使用甲醇/丙酮固定细胞。使用多克隆兔子抗-HSV-1IgG(Dako,Hamburg,Germany)通过间接免疫荧光分析法验证gBmut的表达。
通过HSV-1基因组与质粒pMT2gBmut DNA之间的同源重组将具有单一氨基酸改变的糖蛋白B插入HSV-1野生型株系F。按照下述从病毒贮液制备基因组HSV-1DNA：通过SDS/蛋白酶K在56°C裂解1-3小时，然后通过苯酚/氯仿/异戊醇提取，并透析65小时(缓冲液I：10mMNaCl,10mM EDTA,50mM Tris-HCl,pH 8;缓冲液II：10mM NaCl,1mM EDTA,10mM Tris-HCl,pH 7.5)。通过Qiagen Plasmid Midi试剂盒(Qiagen,Hilden,Germany)提取pMT2gBmut质粒。按照下述制备重组病毒：根据Graham和Van der Eb的方法[35]并使用Stow和Wilkie的修改[36]，使用磷酸钙沉淀的DNA；或根据生产商的说明书通过LipofectamineTM/OPTI-MEMTM方法(Invitrogen,Karlsruhe,Germany)转染Vero细胞。简而言之，对于磷酸钙方法转染，通过加入64μL 1MCaCl2、持续5分钟，使用500ng质粒DNA和5μg牛胸腺DNA(在0.436mL A.bidest中)而沉淀大约100ng纯化的HSV-1F DNA。将生长于皮氏培养皿(直径25cm)中的细胞与DNA沉淀物温育45分钟以及与含有10%胎牛血清的EMEM温育3小时之后，通过HEBS缓冲液中的25%的DMSO震荡细胞2分钟。然后，继续以含有10%胎牛血清和MAb 2c的EMEM培养。对于使用Lipofectamine进行转染，使用1μgHSV-1DNA和1μg质粒DNA。挑取良好分离的斑点并通过PCR扩增子的循环测序法就各自的突变进行筛选。总体而言，获得的斑点数目低，其中在存在编码gB的质粒的情况下，有未成功产生任何斑点的实验(不存在编码gB的质粒和MAb 2c的对照实验产生了多个斑点)。为了测试抗体的反应活性，以200-300个斑点形成单位的病毒(在1mL EMEM中)感染生长于盖玻片(8x16mm)上的3x105Vero细胞。1小时后，将细胞培养基替换为含有10%胎牛血清的EMEM。温育2天之后，在-20°C以甲醇/丙酮固定细胞。
免疫荧光测定
使用DTAF缀合的山羊抗-小鼠IgG(Jackson ImmunoResearchLaboratories,Dianova,Hamburg,Germany)检测HSV gB特异性小鼠单克隆抗体与细胞的结合。为了检测兔子抗HSV-1IgG的结合，使用TexasRed或Cy3缀合的山羊抗兔子IgG(Jackson ImmunoResearchLaboratories,Dianova)。为了检测人抗体，使用DTAF缀合的山羊抗-人IgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories,Dianova)。
与纤维素结合的肽的合成和扫描(肽扫描、关键基序扫描、置换分析)
所有的肽均按照之前的描述[37,38]通过半自动化SPOTTM合成在Whatman 50纤维素膜上产生。合成之后，在含有封闭剂(1X,CambridgeResearch Biochemicals,Northwich,UK)的封闭缓冲液[在Tris缓冲盐水(50mM Tris,125mM NaCl,4mM KCl,pH 8.0),0.05%(v/v)Tween 20和5%(w/v)蔗糖(TBST)中]过夜封闭该膜。在TBST中洗涤1次之后，将薄层(sheets)在室温在封闭缓冲液中同时与MAb 2c(0.5-1.0μg/mL)和POD缀合的抗小鼠IgG Fab片段(5倍过量；Roche Applied Science,Mannheim,Germany)温育3小时。在TBST中洗涤2次之后，根据生产商的说明书，使用Chemiluminescence Western Blotting Kit(RocheApplied Science,Mannheim,Germany)检测抗体结合。
合成重叠肽的扫描(肽扫描)[39]：合成为15个氨基酸，具有12个氨基酸的重叠(即，沿着gB序列移动3个氨基酸)，其对应于gB残基氨基酸31至505(HSV-1株系17+[33]GenBank X14112)；以及，合成为13个氨基酸，具有12个氨基酸的重叠(即，沿着gB序列移动1个氨基酸)，其对应于gB残基296至315。
为了鉴定MAb 2c结合位点B内的最小结合基序，使用14个氨基酸的肽[其由下列组成：中心的衍生自gB的六聚物和N与C末端的4个随机残基(x1x2x3x4B1B2B3B4B5B6x11x12x13x14;x：随机位置；B：固定的衍生自gB的位置)]进行关键基序扫描[40]。通过每个肽，六聚物序列移动一个氨基酸：起始于gB位置V295，跨越序列直至gB位置A315。
通过肽178RYSQFMGIFEDRAPV192,(SEQ ID NO:43)的置换分析来分析gB结合位点A内的单一氨基酸对于结合MAb 2c的结合的影响，其是按照之前的描述[40-42]通过连续改变每个氨基酸为所有其他的19种天然氨基酸来进行的。
小鼠和小鼠保护实验
雌性C57BL/6J(H-2b)小鼠获自Charles River Wiga(Charles RiverLaboratories,Sulzfeld,Germany)，在33至37日龄时使用。按照之前的描述[1,2]进行实验。简而言之，使用2x106TCID50HSV-1(在0.1mL含有10%胎牛血清的EMEM中)通过阴道内接种小鼠。在病毒接种前24小时，通过腹膜内注射向小鼠施用0.5mL MAb 2c、多克隆免疫血清或沉淀的培养基。所使用的人标准免疫血清制备物(Beriglobin STM,CSLBehring,Germany)具有1:1280的针对HSV-1(0.025mL)的补体非依赖性中和效价，在Iscove培养基中稀释4倍来使用。MAb 2c的贮液制备物具有1:640的补体非依赖性中和效价，稀释2倍，以使其包含与多克隆免疫血清相同的中和活性。当使用过氧化物酶缀合的兔子抗小鼠和人IgG根据Kahlon & Whitley的方法[43]测定时，所用的抗体稀释物的ELISA效价是104.5至105.5。对于对照，以相同的方式处理等体积的Iscove培养基。被施以培养基的对照小鼠等同于给予非HSV特异性MAb的对照[1]。病毒接种之后，每2天取阴道拭物并在Vero细胞单层上测定病毒。根据Reed & Muench的方法[44]，在微量滴定板中通过TCID50/0.05mL测定感染性病毒效价。
结果
gB的前487个氨基酸对于MAb 2c的结合是必需的
为了获得对于MAb 2c表位的正确折叠所需的糖蛋白B区域的最初理解，在COS-1细胞中表达了全长HSV-1gB构建体和一组羧基末端截短的gB构建体，如“方法”部分所述。使用鼠HSV gB特异性单克隆抗体H1396和H1781的混合物，通过间接免疫荧光显微镜法验证gB的表达。也通过间接免疫荧光测定法显示了MAb 2c的结合。如表7所示，全长蛋白和截短的衍生物gB(1-720),gB(1-630),gB(1-505),gB(1-503)和gB(1-487)被MAb 2c识别。但是，MAb 2c不结合gB(1-470),gB(1-223)和gB(1-130)。此外，具有N和C末端截短的两个构建体(gB(183-488),gB(436-642))未观察到反应。这些结果表明：MAb 2c的表位位于前487个氨基末端残基内。
表7.MAb 2c与COS-1中表达的截短的HSV-1糖蛋白B(gB)的结合
*使用HSV gB特异性单克隆抗体H1396和H1781[30-32]通过间接免疫荧光确认了所有gB构建体的表达。
＊＊通过间接免疫荧光检测MAb 2c的结合。
+表示MAb 2c结合，-表示MAb 2c不结合。
＊＊＊pSVL：表达载体，用作阴性对照。
MAb 2c识别两个不同gB区域的序列
由于不可能使用COS-1细胞中表达的gB删除构建体来进行MAb2c识别的表位的精细定位，所以，通过SPOTTM合成法在连续纤维素膜支持物上合成了gB衍生的重叠肽的扫描(肽扫描)。所述的肽跨越gB区域上的氨基酸31至505，被合成为15个氨基酸的肽，具有12个氨基酸的重叠(即，沿gB序列移动3个氨基酸)，得到总共155个肽。通过同时与一抗(MAb 2c)和二抗(POD缀合的抗小鼠IgG Fab)温育并通过化学发光法检测而显示MAb 2c的结合。
如图22所示，发现MAb 2c结合两个不同gB区域即位点A和B内的5个肽。位点A包含3个连续肽，对应于gB残基175FGHRYSQFMGIFEDRAPVPFE195(SEQ ID NO:44)(共有序列为181QFMGIFEDR189(SEQ ID NO:45))；位点B包含2个连续肽，包括残基298SPFYGYREGSHTEHTSYA315(SEQ ID NO:46)(共有序列为301YGYREGSHTEHT312(SEQ ID NO:47))。
MAb 2c的结合位点B的最小长度的鉴定
由于肽90(图22;298SPFYGYREGSHTEHT312(SEQ ID NO:48))显示出最强的信号强度，所以我们假设结合位点B对于MAb 2c的结合是显性决定簇。因此，我们使用较高分辨率的与纤维素结合的肽扫描鉴定了MAb 2c结合所需的位点B的最小长度。按照一式两份合成了跨越gB衍生的残基296至315的的13个氨基酸的肽，具有12个氨基酸的重叠(即，沿着gB序列移动1个氨基酸)。在进行了如上所述的温育和检测程序之后，观察到MAb 2c与5个连续肽的反应活性。图23中显示了这5个反应性肽的序列的比对。所有5个肽的共有序列是300FYGYREGSH308(SEQ ID NO:49)。
在第二种方法即关键基序扫描法中，使用了14个氨基酸的肽，每个由下列组成：衍生自gB的6个氨基酸，其两翼为4个随机位置。在该测定法中，每个肽分子的4个末端位置代表随机序列，其中以统计方式插入氨基酸。因此，每个点包含大量肽混合物，在外面的肽位置具有众多序列，但是在肽的位置5至10具有相同的衍生自gB的序列。gB衍生的中心六聚物跨越gB区域的残基V295至A315，移动1个氨基酸。选择六聚物的gB序列是因为已知75%以上的非线性表位包含最大4至7个残基的长度的序列段[45]。使用两个连续肽xxxx300FYGYRE305xxxx(SEQ ID NO:21)和xxxx301YGYREG306xxxx(SEQ ID NO:50)观察到了MAb 2c的反应活性(图24)。因此，序列300FYGYREG306(SEQ ID NO:51)被认为是与MAb 2c相互作用所需的位点B肽的最小结合基序。
通过突变的gB鉴定对于MAb 2c在位点B结合具有关键意义的个
别残基
为了确认在完整和天然折叠的蛋白情况下，MAb 2c的结合位点B，我们通过结合位点B内的单一氨基酸变化改变了克隆于pMT2gB内的全长gB的氨基酸序列。通过使用用于定点诱变的基于噬菌粒的系统，产生了多个具有单一氨基酸变化的gB构建体。在COS-1细胞中表达突变的gB之后，通过免疫荧光测定法分析MAb 2c的结合。如表8所示，鉴定了一系列被证明对于MAb 2c结合具有关键意义的gB残基。具体而言，gB的位置299处的残基P置换为S、F300置换为Y和I、Y301置换为N、G302置换为R和V、Y303置换为N、R304置换为G和L、E305置换为K，导致MAb 2c结合的完全丧失，这说明位置299至305的每个残基对于表位形成具有关键意义，其是通过关键残基经由侧链与抗体相互作用，或通过影响对于形成抗体所识别的表位的构象所需的正确的总体或局部的gB蛋白折叠。通过细胞与鼠MAb 2c和多克隆兔子抗HSV IgG免疫血清的共同温育验证了COS-1细胞中的突变的gB的表达，然后通过与DTAF缀合的抗小鼠IgG(如果MAb 2c是结合的，则为绿色荧光)和TexasRed或Cy3缀合的抗兔子抗体(相同细胞的红色荧光)共温育而鉴定。然而，单一的gB残基Y296改变为N和F、M297改变为L,T和V、S298改变为A，以及G306改变为A和V、以及S307改变为A不影响MAb 2c的结合。
表8.MAb 2c与表达于COS-1细胞中的含有单一氨基酸改变的HSV-1全长糖蛋白B(gB)变体的结合
＊gB位置编号之前的是野生型氨基酸；位置编号之后的是导入的残基。通过免疫荧光确认所有gB变体的表达：通过将细胞与多克隆兔子抗HSV-1 IgG血清共温育而获得荧光。
＊＊通过间接荧光测定MAb 2c的结合。
+表示MAb 2c结合，-表示MAb 2c不结合。
＊＊＊对于该特定结果的分析，见“讨论”部分。
通过突变体病毒鉴定对于MAb 2c在位点B的结合具有关键意义的
单个残基
为了最接近体内的情况，通过使用5种良好表征的HSV-1变体(R126,R1375,B4.1,R1435,R233)(每个包含gB中的氨基酸突变[27-29])并使用本研究中产生的突变病毒(vY301N[位置301处的Y被置换为N],vG302R,vG302V)(见“方法”部分)进一步分析了位点B的单个氨基酸的影响。使用这些突变体或亲代野生型病毒HSV-1F和KOS 321的200-300个斑点形成单元感染盖玻片上的Vero细胞。间接免疫荧光测定证明MAb 2c不能结合被病毒vY301N,vG302R,vG302V,R126(Y303被置换为N),R1375(R304Q)和B4.1(E305K)感染的细胞，而MAb 2c对于被突变体R1435(H308Y),R233(R328H)和野生型病毒感染的细胞具有反应活性(表9)。
表9.HSV-1野生型病毒和病毒gB突变体对于与MAb 2c的结合和被MAb 2c中和的敏感性
＊通过使用多克隆兔子抗HSV-1 IgG血清获得的免疫荧光确认了对于所有病毒而言，gB都表达。+表示MAb 2c与被感染的Vero细胞结合，通过间接免疫荧光检测；-代表MAb 2c不结合。
＊＊+表示病毒被MAb 2c中和，-表示病毒不被中和。
＊＊＊gB位置编号之前的是野生型氨基酸；位置编号之后的是导入的残基。
为了确定所鉴定的对于MAb 2c与gB的结合具有关键意义的残基是否对于抗体的中和活性也有关键意义，使用病毒突变体或野生型病毒的250个斑点形成单元进行了中和测定。如表9所示，野生型株系F和KOS 321以及突变体R1435(H308Y)和R233(R328H)完全被MAb 2c中和。但是，MAb 2c完全不能中和突变体病毒vY301N,vG302R,vG302V,R126(Y303N),R1375(R304Q)和B4.1(E305K)，这说明这些残基中的每一个对于形成MAb 2c的中和能力所需的表位都是必不可少的靶标。总之，通过肽分析和突变的蛋白所获得的结果显示：残基299至305对于表位形成以及MAb 2c的体外生物活性具有重要意义。
通过小鼠保护实验进行表位定位
为了分析MAb 2c的体内保护效应是否也依赖于位点B的特定氨基酸，在腹膜内注射MAb 2c后24小时，使用突变体病毒或亲代野生型株系通过阴道内接种总共168只C57BL/6小鼠。为了对比，提供了调整至相同的中和效力的多克隆免疫血清。按照之前的描述进行实验[1，2]。如图25所示，MAb 2c对于接种了突变体R126(Y303N),R1375(R304Q)和B4.1(E305K)的小鼠是无效的，而对于接种了突变体R1435(H308Y)或R233(R328H)或野生型病毒的小鼠是有效的。使用病毒突变体R126,B4.1和R233的实验由于下列事实稍被阻碍：这些突变体的病毒复制在小鼠的粘膜中是低效的。特别地，突变体R126显示出非常低的复制能力。因此，感染进程在经MAb 2c、多克隆免疫血清或对照液处理的以R126感染的小鼠中没有差异。总之，小鼠保护实验的结果清楚地证明gB残基Y303,R304和E305对于MAb 2c显示其体内保护效应是必不可少的。
MAb 2c结合的位点A的表征
通过肽扫描方法获得的MAb 2c表位定位结果(图22)最初说明：具有共同序列181QFMGIFEDR189的结合位点A是与位点B和潜在地其它区域(可能不可通过区段化肽检出，但是是天然折叠的蛋白中的功能性表位的一部分)一起形成的不连续表位的组分。然而，令人惊奇的是，位点A不位于三维gB三聚体结构的表面[21]。此外，位点A和B在gB的表面上不是紧邻的，不能同时被抗体表位的平均面积覆盖。
为了研究位点A的相关性，我们产生了具有单一氨基酸改变的gB构建体和病毒突变体。但是，试图证明这些氨基酸在生物系统中的重要性的尝试是无果的，因为gB构建体和病毒突变体中的任意这些残基的置换之后都没有产生抗体结合的丧失，最可能是由于在分子中存在位点B基序(数据和诱变引物未显示)。
为了研究肽50即178RYSQFMGIFEDRAPV192(SEQ ID NO:43)(其是通过肽扫描方法鉴定的)的每个氨基酸的相对重要性，我们进行了完全置换分析。因此，通过SPOTTM合成了所有可能的单一位点置换类似物(即，每个位置被所有其它19种形成蛋白质的氨基酸置换)，并测试了MAb 2c的结合。该肽的多数位置可以被数种理化上不同的氨基酸改变，而不丧失结合。然而，基序186FED188是保守的，即，这些氨基酸的改变与抗体结合的丧失相关(数据未显示)。因此，我们假设：位点A或主要基序186FED188模拟不连续的MAb 2c表位的一部分。
为了验证该假设，我们通过计算机设计了12个氨基酸的肽PFYGYRE-G-FEDF(SEQ ID NO:52)，其由位于MAb 2c结合位点B内的残基[299PFYGYRE305(SEQ ID NO:53)(其被发现具有生物重要意义)(表8)]、甘氨酸连接子和C末端FEDF基序(衍生自位点A的最重要的序列)组成。比较了MAb 2c与该肽的结合以及与肽298SPFYGYREGSHTEHT312(SEQ ID NO:48)(其在15个氨基酸的肽扫描中显示出最强的反应活性)(图22)的结合。按照“方法”中的描述在纤维素膜上合成这两种肽，并以MAb 2c探测。如图26所示，相对于单独的位点B肽，组合肽PFYGYRE-G-FEDF(SEQ ID NO:52)的信号强得多，但是X-射线薄膜的暴露时间仅为15个氨基酸的肽扫描的1/4。该发现强烈支持下列假设：MAb 2c识别由下列组成的非连续表位：i)残基299至残基305的位点B(PFYGYRE)(SEQ ID NO:53)，和ii)可以被序列FEDF(SEQ ID NO:54)模拟的一个或多个另外的非连续区域。
讨论
本研究的目标是定位MAb 2c在单纯疱疹病毒糖蛋白B上的结合位点，并鉴定表位的关键残基。使用一系列C末端截短形式的重组表达的gB蛋白，发现487个N末端残基对于MAb 2c的结合是必需的。从C末端另外删除17个或更多个氨基酸导致抗体结合的丧失，虽然可以在瞬间感染的细胞中容易地确认所有的删除形式的gB的合成。为了使表位定位变窄，构建了另外两个删除突变体：gB(183-488)和gB(436-642)，每个均与信号肽序列(氨基酸1-30)融合。由于MAb2c不能结合后者这些截短的gB蛋白中的任一个，因此与我们最初的假设“MAb 2c的表位可能位于残基470与487之间”矛盾，我们决定利用合成的肽进行替代性表位定位策略。
很多B细胞表位天然为非连续的[46]。使用蛋白片段即肽(化学或生物地产生)进行的这些非连续表位的定位具有以下缺点：源自单一结合区域的肽对于在ELISA或表面等离子共振测定法中通常不可测定的结合伴侣一般具有非常低的亲和性。在过去的二十年中，已经描述了使用在连续表面上合成的肽进行的关于非连续表位定位的研究的数项实例[47-50]。就敏感性而言，SPOTTM方法是特别合适的[37]，因为在纤维素膜上具有高的肽密度(大约50nmol/cm2)。这引起亲和及重结合效应，因此，使得能够鉴定非常低亲和性的肽-抗体相互作用。覆盖了直至2006年的超过600篇文献的综述广泛总结了使用SPOTTM的肽合成技术进行的关于线性和非连续表位的定位的研究[51]。
在确定了MAb 2c表位定位于N末端的487个gB残基之后，使用肽扫描方法与SPOTTM合成方法的组合实现了对于抗体结合具有关键意义的氨基酸的精细定位。如图20所示，MAb 2c与位于结合位点B的15个氨基酸的肽298SPFYGYREGSHTEHT312(SEQ ID NO:48)的反应最强烈，这产生了如下假设：该序列是MAb 2c识别中的主要涉及的序列。随后，可以通过gB氨基酸300-308的高分辨率的肽扫描使位点B的识别序列更加细致。然后，通过生物学方法研究MAb 2c与以具有单一点突变的全长gB构建体转染的细胞的结合，以此实现了表位的关键残基的最终确认，得到了序列300FYGYRE305(SEQ ID NO:21)。此外，发现脯氨酸残基299对于体内具有重要意义，虽然其在三维gB结构上的暴露非常有限[21]。然而，由于脯氨酸侧链的构象限制——由于其环式性质，脯氨酸经常使固定结构的蛋白序列稳定化——该残基也被假设为对于gB在抗体结合位点的局部折叠是必不可少的。通过小鼠保护实验确认了所鉴定的残基的影响，该实验显示：当关键残基被突变时，MAb 2c的体内保护性效应被消除。综合起来，这些数据证明氨基酸300至305构成了有活性的MAb 2c表位的必不可少的部分。
如所预期的那样，具有位点B内的关键残基的单一点突变的HSV突变体对于MAb 2c结合和中和具有抗性。但是，发现多数病毒突变体严重失能，在细胞培养物或粘膜中的生长很差。特别地，位置300处的苯丙氨酸残基显示出对于gB的生物学功能具有关键意义，因为：尝试产生在该位置具有氨基酸改变的活的病毒突变体目前为止均未获成功。该事实可以说明该gB基序在病毒的裂解周期中的重要作用。因此，有趣的是，推论MAb 2c的表位可能一定意义上代表gB的致命的弱点。
通过肽扫描进行的最初的表位定位表明：MAb 2c识别另外的gB区域，其被称作位点A。通过对肽178RYSQFMGIFEDRAPV192进行置换分析进行了该位点的关键残基的确认，证明了残基F186,E187和D188是高度置换敏感性的。这些氨基酸在生物系统中的意义不能被证明，因为gB构建体和病毒突变体中的这些残基的置换不影响抗体结合，最可能是由于在分子中存在位点B基序。
基于最近确定的外部gB结构域的晶体结构[21]，将gB单体分为了6个不同的结构域。结构域I包含氨基酸154至363。根据本文呈现的结果，MAb 2c的最重要的活性表位的残基(位点B)位于结构域I中。通过将位点B的关键残基叠加到gB晶体结构上，清楚的是，这些残基位于gB的表面上，在结构域I的上部1/3中的两个β链(β13,β14)之间的22个氨基酸的环样区段内。位点A残基186FED188也位于结构域I内，但是处于gB结构域I的基底，在几乎不暴露的小腔内，这暗示了这两个位点在空间上不邻近。但是，由于gB与其他病毒糖蛋白之间的结构相似性，并且根据连接子插入诱变的结果，这说明晶体结构代表gB的融合后形式[52-54]。然而，病毒例子包含gB的融合前形式，这说明中和抗体应该识别gB的融合前构象[21]。但是，最近的研究已经证明所测试的所有的gB特异性MAb都识别融合前和融合后gB[55]。
基于实验数据与“位点A在三维gB结构内[21]以及相对于位点B的定位”的结合，备选的、更具吸引性的解释是：位点A不是MAb 2c表位的组成部分。来自肽扫描和置换分析的结果表明了非连续表位的一个或多个区域的模仿，其通过所使用的方法是明显不可检出的。与主要位于位点B的残基300至305的活性表位相比，整个功能表位即与MAb 2c接触的所有氨基酸，只能通过X-射线或NMR技术检测抗体-抗原复合物来检测[56,57]。
关于“位点A、尤其是FED基序模拟非连续表位的另一部分”的假设显然得到下列的支持：尝试将位点B的关键残基通过甘氨酸残基(作为柔性间隔子)与源自位点A的序列FEDF在一个共价连接的分子内组合(图26)。与来自位点B的肽90相比，这种工程化的肽导致信号强度的大大增加(见图22)，其与亲和性的增加相关联。在数个公开物中已经描述了在一个合成分子中集成的覆盖单一结合区的肽对于非连续结合位点的模拟，例如，模拟识别非连续表位的抗体的白介素-10[49]。
数年来已有数个研究者使用单克隆抗体来鉴定HSV gB的功能性结构域[30,32,58-60]。最近的一项研究表明了至少4个功能区的存在，其分散在整个gB结构上，如通过中和MAb与gB的结合模式所定义[55]。根据这些结果，MAb 2c的表位定位于功能区(FR)1内，FR1由结构域I和结构域V的残基697至725的序列组成，后者从残基670延伸至727。有趣的是，由Bender et al.[55]产生的最有力的中和MAb中的3种也定位于FR1内的结构域I内，如通过与包含残基98至472的gB蛋白水解切割片段的反应活性所确定。
由1型HSV引发的MAb 2c与2型HSV交叉反应[1，2]。因此，我们将HSV-1的位点A和B的氨基酸序列与HSV-2gB的进行了比较。在NCBI蛋白质数据库中存在的所有53种全长HSV-2gB(2010年7月30日的状态)中，都存在HSV-1gB序列178RYSQFMGIFEDRAPV192(SEQ ID NO:43)和298SPFYGYREGSHTEHT312(SEQ ID NO:48)。
由于抗HSV治疗的主要目标是迅速清除病毒复制，所说MAb 2c可能提供用于治疗1型和2型HSV感染的潜在工具。原理上讲，两种策略是允许的。第一，如果能够证明，可以通过源自位点B的肽或模拟表位PFYGYRE-G-FEDF(SEQ ID NO:52)而诱导MAb 2c的特异性和生物活性，则主动免疫是可能的。除了良好建立的抗病毒化疗之外，利用MAb 2c的预防性和治疗性潜力的备选方案是将小鼠抗体转化为人源化分子用于被动免疫。
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Claims (16)
1.抗体，其包含SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的互补决定区。
2.与根据权利要求1的抗体识别相同表位的抗体。
3.权利要求1或2任一项的抗体，其中所述抗体能够抑制HSV从被感染的细胞至邻近的另一个未被感染的细胞的传播（细胞至细胞的传播）。
4.权利要求1-3任一项的抗体，其中所述抗体具有至多40nM，优选至多30nM，更优选至多20nM，再更优选至多15nM，至多13nM，至多10nM，最优选至多7nM的解离常数KD。
5.权利要求1-4任一项的抗体，其中浓度为至多20nM，优选至多16nM，更优选至多12nM，至多10nM，至多8nM，至多6nM，最优选至多4nM的所述抗体能够中和100TCID50的确定量的HSV。
6.权利要求1-5任一项的抗体，其中所述抗体包含与SEQ ID NO:9的位置1至30,38至51,68至99,和112至122以及SEQ ID NO:10的位置1至23,40至54,62至93,和103至113所示的氨基酸残基具有至少70%序列同一性的氨基酸序列。
7.权利要求1-6任一项的抗体，其中所述抗体包含与SEQ ID NO:7的位置1至30,38至51,68至99,和112至122以及SEQ ID NO:8的位置1至23,41至55,63至94,和104至114所示的氨基酸残基具有至少80%、优选100%序列同一性的氨基酸序列。
8.权利要求1-7任一项的抗体，其中所述抗体是二价抗体或多价抗体。
9.权利要求1-8任一项的抗体，其中所述抗体缀合至效应子部分、治疗部分或可检测标记物。
10.药物组合物，其包含有效量的根据权利要求1-9任一项的抗体和至少一种药学上可接受的赋形剂。
11.表达载体，其包含编码权利要求1-8任一项的抗体的核酸序列。
12.宿主细胞，其包含编码权利要求1-8任一项的抗体的核苷酸序列。
13.杂交瘤细胞，其能够产生权利要求1-8任一项的抗体。
14.根据权利要求1-9任一项的抗体，其用作药物。
15.根据权利要求1-9任一项的抗体，其用于预防性或治疗性处理受试者中与HSV相关的疾病的方法。
16.用于权利要求15的用途的抗体，其中所述与HSV相关的疾病伴随下列一项或多项特征：
(a)存在口的复发，
(b)存在生殖器的复发，
(c)疱疹性湿疹，
(d)新生儿疱疹，
(e)免疫缺陷，免疫障碍的患者，
(f)对于病毒抑制剂的抗性，
(g)脑炎，
(h)脑膜炎，
(i)脑膜脑炎，
(j)眼睛感染，和/或
(k)泛发的HSV感染。
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