BR112012009432B1

BR112012009432B1 - anticorpo anti-hsv e composição farmacêutica que o compreende

Info

Publication number: BR112012009432B1
Application number: BR112012009432A
Authority: BR
Inventors: Krawczyk Adalbert; Eis-Hübinger Anna-Maria; Exner Evelyn; Krauss Jürgen; Eduard Schneweis Karl; P Däumer Martin; Roggendorf Michael; Arndt Michaela
Original assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung Des Oeffentlichen Rechts; Heidelberg Immunotherapeutics Gmbh; Univ Bonn Rheinische Friedrich Wilhelms; Univ Duisburg Essen
Priority date: 2009-10-01
Filing date: 2010-10-01
Publication date: 2020-05-05
Also published as: EP2483306B1; US9657088B2; EP2483306A2; JP6663747B2; ES2715787T3; CN104650222B; CA2776271C; JP2018183148A; WO2011038933A3; US20150166638A1; EP2308895A1; BR112012009432A2; WO2011038933A2; JP2013506403A; US20130058952A1; CN102791733A; JP2016147870A; JP5980681B2; BR112012009432A8; CA2776271A1

Abstract

"anticorpo anti-hsv". a invenção refere-se a um anticorpo anti-hsv, conforme definido nas reivindicações, uma composição farmacêutica contendo uma quantidade eficaz do referido anticorpo, um vetor de expressão incluindo uma sequência de nucleotídeos que codifica o referido anticorpo, uma célula hospedeira compreendendo a referida sequência de nucleotídeos, uma célula de hibridoma capaz de produzir o referido anticorpo e ao uso do referido anticorpo como fármaco, em especial ao uso para a fabricação de um fármaco destinado ao tratamento profilático ou terapêutico de doenças associadas ao hsv em um indivíduo, conforme definido nas reivindicações.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para ANTICORPO ANTI-HSV E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA QUE O COMPREENDE.

Antecedentes da invenção [001] A presente invenção refere-se a um anticorpo anti-HSV conforme definido nas reivindicações, a uma composição farmacêutica contendo uma quantidade efetiva do referido anticorpo, a um vetor de expressão incluindo uma sequência de nucleotídeos que codifica o referido anticorpo, a uma célula hospedeira compreendendo a referida sequência de nucleotídeos, a uma célula de hibridoma capaz de produzir o referido anticorpo e ao uso do referido anticorpo como fármaco, especialmente ao uso para a fabricação de um fármaco destinado ao tratamento profilático ou terapêutico de doenças associadas ao HSV em um indivíduo, conforme definidos nas reivindicações.

[002] O vírus do herpes simples (HSV) humano patogênico é um vírus DNA dermotrópico e neutrotrópico, cujas manifestações clínicas têm como origem a pele e a mucosa vizinha e que levam secundariamente a complicações neurológicas como neurite, meningite, encefalite, mielite, poliradiculite entre outras. Na deficiência imune inata, adquirida e também iatrogênica, há relatos de evoluções em certa medida graves com alta letalidade. Dado às altas taxas de infecção da população pelo HSV tipo 1 (HSV-1, 95%; herpes labial, herpes na córnea, eczema herpético) e pelo HSV tipo 2 (HSV-2, 1030%; herpes genital, herpes neonatal) e tendo em vista a reativação frequente do vírus, que persiste de modo latente por toda a vida nos gânglios neurais sensitivos e autônomos, o HSV é de particular relevância clínica. Independentemente do tipo do vírus, os objetivos terapêuticos sintomáticos da infecção primária ou recidivante pelo HSV são inibir a replicação viral, encurtar o tempo de sofrimento e prevenir

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2/111 as complicações sistêmicas que influenciam a frequência da recrudescência.

[003] No reconhecimento precoce e na dose correta, agentes virustáticos são empregados com êxito para terapia antiviral. Os agentes virustáticos mais comuns (por exemplo, aciclovir, penciclovir, foscarnet, idoxuridina) são análogos nucleosídicos ou do pirofosfato, cujo princípio ativo comum é fundamentado na inibição da síntese de DNA em células infectadas pelo vírus.

[004] Um dos mais importantes agentes terapêuticos para o tratamento de infecções pelo HSV é o aciclovir, nucleosídeo análogo da purina. O aciclovir é fosforilado pela timidina quinase viral e interfere depois com a DNA polimerase viral. Por outro lado, a DNA polimerase humana é menos suscetível ao aciclovir por fator de 30 a 50, motivo pelo qual serem observados efeitos colaterais meramente marginais.

[005] Contudo, apesar do desenvolvimento de agentes virustáticos que atuam seletivamente, o tratamento quimioterapêutico de doenças virais ainda representa um problema sério. Especificamente, o desenvolvimento de cepas resistentes contra agentes quimioterapêuticos comuns, observada durante o tratamento profilático e terapêutico prolongado de pacientes imunossuprimidos, é problemático. Como resultado, em mais de 10% dos casos, devido à ausência de agentes virustáticos eficazes, é observada infecção rápida progressiva generalizada com evolução letal.

[006] Atualmente, o foscarnet, análogo do pirofosfato, é empregado especialmente em pacientes com imunossupressão contra o vírus do herpes resistente ao aciclovir. Este agente causa inibição direta da DNA polimerase viral e não tem influência sobre a timidina quinase. No entanto, o uso de foscarnet leva a graves efeitos colaterais indesejáveis tais como insuficiência renal, problemas

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3/111 cardíacos, toxicidade sobre a medula óssea e pode causar também ulceração cutânea. Em vista de seus efeitos teratogênicos, o foscarnet não pode também ser administrado durante a gravidez. Além disso, a formação de cepas com resistência cruzada é observada, o que torna altamente necessário o desenvolvimento de agentes terapêuticos alternativos. Atualmente, não há disponível imunoprofilaxia passiva. Algumas vacinas experimentais para imunização ativa contra o HSV1 e o HSV2 não demonstraram sucesso verificável.

[007] Anticorpos são altamente promissores para o tratamento de câncer, transtornos autoimunes e infecções virais. O documento JP 6135854 descreve um agente terapêutico para infecção pelo vírus Herpes simplex, em que um anticorpo monoclonal humano contra o HSV e um análogo antiviral do ácido nucleico, tal como aciclovir (ACV), são administrados simultaneamente ou com sucesso na forma de injeção por infusão intravenosa em gotas. O documento DK 187286 descreve anticorpos que exibem imunorreatividades multiespecíficas no que diz respeito à glicoproteína D (gD) do HSV-1 e do HSV-2 (HSV gD-1 e gD-2). O documento WO 1997/26329 descreve anticorpos monoclonais úteis para o diagnóstico e o tratamento contra HSV-1 e HSV-2. O ultimo anticorpo compete com o anticorpo monoclonal HSV 863 pela ligação ao antígeno da glicoproteína D do HSV-1 e do HSV-2. O documento US 4 950 595 descreve um hibridoma camundongohumano que produz um anticorpo humano antivírus, um processo para prepará-lo e um anticorpo monoclonal humano antivírus.

[008] Além disso, é descrita a humanização de outro anticorpo monoclonal murino (Fd79) (Kogae et al., 1986) específico contra

HSV1/2 (Co, M.S. et al., 1991; Zeitlin L. et al., 1998). Este anticorpo reconhece um epitopo compartilhado da glicoproteína B (gB) do HSV1 e do HSV2. Ademais, o Fd79 humanizado produzido em plantas transgênicas e na linhagem de células eucarióticas SP2/0 e

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4/111 subsequentemente caracterizado, mostrando 53 nM de afinidade.

[009] O anticorpo monoclonal murino H1815 reconhece um epitopo similar, mas não idêntico na região dos aminoácidos 263-283 da glicoproteína B (gB) (Navarro et al., 1992). Entretanto, o H1815 não é capaz de neutralizar ou inibir a “disseminação célula a célula” do vírus.

[0010] Finalmente, o documento US 6 180 370 descreve imunoglobulinas humanizadas e métodos para produzi-las. Além disso, o documento WO 2003/105782 diz respeito a enxertar especificidade a um anticorpo murino para estrutura humana.

[0011] Dessa forma, agentes quimioterápicos possuem efeitos colaterais indesejados e um número cada vez maior de cepas resistentes é observado.

[0012] Por conseguinte, a invenção tem como objeto prover um anticorpo anti-HSV (humanizado) que seja capaz de neutralizar infecções por HSV e de inibir disseminação célula a célula. Adicionalmente, a invenção tem como objeto prover um agente profilático e/ou terapêutico para o tratamento de doenças associadas ao HSV que supere as desvantagens citadas acima dos agentes quimioterapêuticos comumente aplicados.

[0013] Surpreendentemente, foi descoberto que um anticorpo de acordo com a invenção atinge este objeto. Consequentemente, a presente invenção provê uma alternativa promissora aos agentes conhecidos no estado da técnica para o tratamento de infecção pelo HSV tendo como base anticorpos produzidos por recombinação e que podem ser humanizados. Estes anticorpos são capazes de bloquear mecanismos virais de disseminação dentro de um hospedeiro. Os anticorpos efetivamente neutralizam partículas virais sem células e inibem a disseminação direta célula a célula do vírus. Dado que os anticorpos se ligam especificamente a um epitopo altamente

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5/111 conservado da glicoproteína B (gB) de superfície do envelope do HSV1 e do HSV2, a qual é essencial para o ciclo de replicação viral, o desenvolvimento de resistência ao fármaco é altamente improvável. [0014] Embora o efeito do anticorpo murino da invenção já tenha sido descrito em parte, conforme Eis-Hübinger et al., Intervirology (1991); 32:351-360 e Eis-Hübinger et al., Journal of General Virology (1993); 74: 379-385, o próprio anticorpo ou a sequência das regiões determinantes de complementaridade (CDR) do anticorpo da invenção, bem como o epitopo ao qual se liga nunca haviam sido publicados ou disponibilizados para o público.

[0015] Em suma, o anticorpo (humanizado) oferece uma ou mais das seguintes vantagens:

- A eficácia do anticorpo monoclonal murino da invenção já foi comprovada (conforme Eis-Hübinger et al., 1991; Eis-Hübinger et al., 1993). Além disso, os inventores mostram na seção de Exemplos que o anticorpo humanizado da invenção consegue também neutralizar in vitro a infecção viral pelo HSV1 e HSV2 e inibir a disseminação viral ao inibir o mecanismo de “disseminação célula a célula”. No contexto de evolução de infecções em humanos, o sistema imune humano não é capaz de gerar anticorpos com especificidades que impeçam eficientemente a disseminação célula a célula típica do HSV1/2.

- A aplicação profilática, bem como a terapêutica frequente e prolongada de agentes quimioterapêuticos conservadores, tais como aciclovir e foscarnet, aumenta a formação de cepas virais resistente. Esse problema de resistência pode ser superado pelo anticorpo antiHSV (humanizado) descrito neste pedido de patente, administrado isoladamente ou associado com um agente virustático, como aciclovir e/ou foscarnet, pelo fato de ser diferente o mecanismo de ação sobre o qual se baseia.

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- O anticorpo descrito neste pedido de patente liga-se especificamente a um epitopo da proteína gB do HSV gB. O desenvolvimento de resistência do HSV contra o anticorpo da invenção não deve ser previsto, pois mutações na proteína gB levam à perda da infectividade viral.

- Pacientes nos quais a administração sistêmica de agentes virustáticos convencionais está contraindicada se beneficiam especialmente do anticorpo (humanizado) descrito neste pedido de patente.

Sumário da invenção [0016] Consequentemente, é provido um anticorpo, compreendendo as regiões determinantes de complementaridade mostradas em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6. Adicionalmente, é provido um anticorpo que reconhece o mesmo epitopo que o anticorpo compreendendo as regiões determinantes de complementaridade mostradas em SEQ ID NOs: 1a 6.

[0017] Adicionalmente, uma composição farmacêutica contendo uma quantidade efetiva do anticorpo aqui descrito e menos um excipiente farmaceuticamente aceitável é também provida.

[0018] Além disso, é provido um vetor de expressão, incluindo uma sequência de nucleotídeos que codifica o anticorpo conforme definido nas reivindicações, uma célula compreendendo a referida sequência de nucleotídeos e uma célula de hibridoma capaz de produzir o referido anticorpo.

[0019] Finalmente, a presente invenção provê o anticorpo conforme definido nas reivindicações para o uso em medicina e, adicionalmente, o uso do anticorpo conforme definido nas reivindicações para a fabricação de um medicamento destinado ao tratamento profilático ou terapêutico de doenças associadas ao HSV

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7/111 em um indivíduo.

[0020] Os vários aspectos da invenção, conforme definida nas reivindicações independentes e nas concretizações preferidas contidas nas reivindicações independentes, são aqui incorporados por referência neste pedido de patente.

Descrição detalhada da invenção [0021] Dessa forma, em um primeiro aspecto, a invenção refere-se a um anticorpo compreendendo as regiões determinantes de complementaridade mostradas em SEQ ID NO: 1 (TSGMSVG), SEQ ID NO: 2 (HIWWNNDKYYKPALKS), SEQ ID NO: 3 (IYYGYRPYAMDY), SEQ ID NO: 4 (RSSQSIVHSNGNTYLE), SEQ ID NO: 5 (KVSNRFS) e SEQ ID NO: 6 (FQGSHVPWS).

[0022] Anticorpos ou imunoglobulinas são proteínas globulinas gama, compostas, em sua forma natural, por duas grandes cadeias pesadas e duas pequenas cadeias leves, unidas por ligações dissulfeto (consultar a figura 3). Existem cinco tipos de cadeia pesada na Ig de mamíferos: α, δ, ε, γ e μ. O tipo presente de cadeia pesada define a classe (isotipo) do anticorpo; os anticorpos são IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, respectivamente. Toda cadeia pesada possui duas regiões, a região constante e a região variável. A região constante é praticamente idêntica em todos os anticorpos naturais pertencentes ao mesmo isotipo da mesma espécie. Uma cadeia leve é composta também por um domínio constante e um domínio variável. Em mamíferos, existem dois tipos de cadeia leve de imunoglobulinas, lambda (λ) e kappa (κ).

[0023] Embora a estrutura geral de todos os anticorpos seja muito similar, as propriedades únicas de um anticorpo específico são determinadas pelas regiões variáveis (V). Mais especificamente, alças variáveis, três cada na cadeia leve (VL) e três na pesada (VH), são responsáveis pela ligação ao antígeno, ou seja, por sua especificidade

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8/111 pelo antígeno. Estas alças são designadas as regiões determinantes de complementaridade (CDRs). As CDRs dos domínios da Vh e da Vl contribuem para o sítio de ligação ao antígeno, portanto, é a combinação das cadeias pesadas e leves, não qualquer uma sozinha, que determina a especificidade final pelo antígeno.

[0024] O termo “anticorpo”, neste relatório descritivo, significa qualquer polipeptídeo que seja capaz de se ligar a um antígeno, em que a especificidade de ligação é determinada pelas CDRs mostradas nas SEQ ID NOs: 1 a 6. Por conseguinte, “anticorpo” destina-se a relacionar-se a qualquer polipeptídeo que compreenda pelo menos um fragmento de ligação a antígeno. Os fragmentos de ligação a antígenos são formados por pelo menos o domínio variável da cadeia pesada e o domínio variável da cadeia leve, dispostos em maneira que ambos os domínios juntos possam ligar-se ao antígeno específico. “Anticorpo” inclui anticorpo complexo ou fragmentos de anticorpos, por exemplo, fragmentos Fab, F(ab)2 ou scFv (consultar também a figura 3).

[0025] Em relação a “anticorpo completo”, o termo significa qualquer anticorpo que possua a estrutura global típica de um domínio de um anticorpo natural (ou seja, compreendendo uma cadeia pesada formada por três ou quatro domínios constantes e uma cadeia leve formada por um domínio constante, bem como os respectivos domínios variáveis), embora cada domínio possa compreender modificações adicionais, tais como mutações, deleções ou inserções, que não alterem a estrutura global do domínio.

[0026] “Fragmento de anticorpo” contém também pelo menos um fragmento de ligação a antígeno, conforme definido acima, e exibe a mesma função e especificidade que o anticorpo completo do qual o fragmento é derivado. Fragmentos Fab podem ser gerados utilizando a enzima papaína para clivar uma imunoglobulina. A enzima pepsina faz

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9/111 a clivagem abaixo da região hinge (articulação) e, portanto, abaixo das ligações dissulfeto, de modo que um fragmento F(ab)2 seja formado. Além disso, as regiões variáveis da cadeia pesada e da leve podem ser fundidas para formar em conjunto um único fragmento de cadeia variável (scFv).

[0027] Adicionalmente, o termo “anticorpo” destina-se a abranger todos os isotipos de imunoglobulinas citados acima, isto é, o anticorpo pode ser anticorpo IgA, IgD, IgE, IgG ou IgM, incluindo qualquer subclasse destes isotipos. De preferência, o anticorpo é IgG, mais preferivelmente, anticorpo IgG1 ou IgG2. O anticorpo pode ser expresso e produzido por recombinação, portanto, pode compreender também duas diferentes regiões constantes de cadeias pesadas, por exemplo, uma cadeia pesada de IgG1 e uma de IgG2, ou cadeias pesadas de diferentes espécies. Contudo, as cadeias pesadas são de preferência da mesma espécie. Além disso, o anticorpo pode compreender uma cadeia leve lambda ou kappa.

[0028] Conforme mostrado no Exemplo 2, a valência do anticorpo possui grande influência sobre a eficácia para mediação da neutralização viral e inibir a disseminação célula a célula, e os melhores resultados têm sido demonstrados com anticorpos bivalentes, isto é, com um anticorpo tendo duas regiões de ligação a antígeno. Exemplos de anticorpos bivalentes são anticorpos completos ou fragmentos bivalentes de anticorpos, tais como fragmento F(ab)2. Por conseguinte, em uma concretização preferida, o anticorpo é anticorpo bivalente, de preferência em que o anticorpo seja um anticorpo completo ou fragmento de anticorpo, especialmente em que o fragmento de anticorpo seja fragmento F(ab)2. Em uma concretização alternativamente preferida, o anticorpo é anticorpo multivalente, isto é, um anticorpo tendo mais de dois sítios de ligação, incluindo anticorpos recombinantes ou seus fragmentos, de

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10/111 preferência tricorpo ou tetracorpo, ou imunoglobulinas inteiras, tais como pentâmero de IgM ou imunoglobulinas ligadas. Esses formatos de anticorpos são conhecidos no estado da técnica.

[0029] Em outra concretização preferida, o anticorpo é anticorpo monoclonal, de preferência em que o anticorpo seja anticorpo murino, anticorpo quimérico ou anticorpo humanizado, mais preferivelmente em que o anticorpo humanizado seja derivado de uma sequência germinativa humana, conforme discutido abaixo. Anticorpo quimérico é um anticorpo no qual pelo menos uma região de uma imunoglobulina de uma espécie está fundida a outra região de uma imunoglobulina de outra espécie por engenharia genética a fim de reduzir sua imunogenicidade. Um exemplo de anticorpo quimérico é mostrado na Figura 3A, que retrata regiões de Vl e Vh murinas fundidas à parte restante de uma imunoglobulina humana. Um tipo específico de anticorpos quiméricos é representado por anticorpos humanizados. Anticorpos humanizados são produzidos enxertando o DNA que codifica as CDRs de um anticorpo não humano no DNA que codifica a estrutura de um anticorpo humano. O construto resultante do DNA pode ser então utilizado para expressar e produzir anticorpos que não são habitualmente tão imunogênicos como o anticorpo precursor não humano ou em forma de anticorpo quimérico, uma vez que meramente as CDRs não são humanas.

[0030] Em uma concretização preferida, o anticorpo é capaz de inibir a disseminação da infecção pelo HSV a partir de uma célula infectada para uma segunda célula adjacente não infectada (disseminação célula a célula). Disseminação célula a célula é a habilidade do vírus do herpes se disseminar de uma célula infectada para uma célula adjacente não infectada, sem liberar partículas livres de células. A fim de examinar se um anticorpo é capaz de inibir a disseminação de HSV de uma célula para uma segunda célula

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11/111 adjacente não infectada (disseminação célula a célula), o ensaio a seguir pode ser utilizado.

[0031] Células Vero, cultivadas para confluência sobre lamínulas de vidro colocadas em placas de cultura de tecido de 24 poços, são infectadas durante 4 h a 37°C com quantidade constante do vírus de 400 TCID50/poço. Uma dose infecciosa mediana de cultura de tecido (1 TCID50) é a quantidade de um agente citopatogênico, tal como vírus, que produzirá efeito citopático em 50% das culturas celulares inoculadas. O inóculo viral é subsequentemente removido, as células lavadas duas vezes com PBS e incubadas adicionalmente durante 2 dias a 37°C em 1 ml de DMEM, FCS 2%, Pen/Strep contendo excesso de diferentes anticorpos anti-HSV ou soro contendo anti-HSV policlonal de controle a fim de prevenir a disseminação viral por intermédio do sobrenadante. Antígenos virais de células infectadas pelo HSV são detectados com soro anti-HSV policlonal de cabra marcado com fluorescência (BETHYL Labolatories, Montgomery, TX, EUA, ref. do catálogo n^o A190-136F, Lote N^o A190-136F-2).

[0032] De preferência, um anticorpo é capaz de inibir a disseminação célula a célula se menos de 20% das células adjacentes forem infectadas, preferivelmente em que menos de 15%, menos de 10%, menos de 5%, mais preferivelmente menos de 3% e o mais preferível menos de 1% das células adjacentes são infectadas no ensaio acima.

[0033] Ainda, em uma concretização preferida adicional, o anticorpo possui constante de dissociação KD de no máximo 40 nM, de preferência de no máximo 30 nM, mais preferivelmente de no máximo 20 nM, ainda mais preferivelmente de no máximo 15 nM, tal como de no máximo 13 nM, de no máximo 10 nM e o mais preferível de no máximo 7 nM. A KD representa a constante de dissociação como medida da propensão de um complexo se dissociar reversivelmente

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12/111 em seus componentes (ou seja, a afinidade do anticorpo pelo antígeno) e é o inverso da constante de associação. A Kd pode ser calculada a partir da equação de Scatchard e métodos para determinar a KD são bem conhecidos no estado da técnica.

[0034] Em uma concentração preferida adicional, o anticorpo em concentração de no máximo 20 nM, de preferência de no máximo 16 nM, mais preferivelmente de no máximo 12 nM, tal como de no máximo 10 nM, por exemplo de no máximo 8 nM ou de no máximo 6 nM e o mais preferível de no máximo 4 nM é capaz de neutralizar uma quantidade definida de HSV de 100 TCID50 a mais de 80%, de preferência em mais de 90%, tal como mais de 95%, mais preferivelmente mais de 96%, por exemplo, mais de 97%, e o mais preferível mais de 98%, por exemplo, mais de 99% ou mesmo 100%. “Neutralizar”, neste relatório descritivo, significa que o anticorpo opsoniza o vírus de modo que este não possa infectar qualquer célula adicional. Um ensaio para testar se um anticorpo em concentração de máximo 20 nM é capaz de neutralizar uma quantidade definida de HSV de 100 TCID50 é fornecido em Eis-Hübinger et al., 1991, e em Eis-Hübinger et al., 1993, e nos Exemplos 1 e 2 abaixo.

[0035] Além do mais, em uma concretização preferida, o anticorpo compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, de preferência pelo menos 75%, pelo menos 80%, mais preferivelmente de pelo menos 85%, pelo menos 90%, ainda mais preferivelmente de pelo menos 95% e o mais preferível de 98% (total) de identidade de sequência nas regiões do arcabouço, quando comparado aos resíduos de aminoácidos mostrados nas posições 1 a 30, 36 a 49, 66 a 94 e 103 a 113, de acordo com a numeração por Kabat, respectivamente) da SEQ ID NO: 9 e nas posições 1 a 23, 40 a 54, 62 a 93 e 103 a 113 (ou posições 1 a 23, 35 a 49, 57 a 88 e 98 a 108 de acordo com a numeração por Kabat, respectivamente) da SEQ ID NO: 10, conforme

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13/111 ilustrado na Figura 4.

SEQ ID NO: 9:

QVTLKESGPG ILLPSQTLSL TCSFSGFSLS TSGMSVGWIR QPSGKGLEWL GHIWWNNDKY YKPALKSRLT ISKDTSNKQV FLKIASVVTA DTATYYCARI YYGYRPYAMD YWGQGTSVTV SS SEQ ID NO: 10:

DVLMTQTPLS LPVSLGDQAS ISCRSSQSIV HSNGNTYLEW YLQKPGQSPK LLIYKVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YYCFQGSHVP WSFGGGTKLE IKR [0036] Um polipeptídeo possui “pelo menos X% de identidade de sequência” nas regiões do arcabouço com a SEQ ID NO: 9 ou 10, se a SEQ ID NO: 9 ou a 10 estiver alinhada com a sequência de melhor pareamento de um polipeptídeo de interesse, e a identidade dos aminoácidos entre estas duas sequências alinhadas formam pelo menos de X% sobre as posições 1 a 30, 38 a 51, 68 a 99 e 112 a 122 (ou posições 1 a 30, 36 a 49, 66 a 94 e 103 a 113 de acordo com a numeração por Kabat, respectivamente) da SEQ ID NO: 9 e posições 1 a 23, 40 a 54, 62 a 93 e 103 a 113 (ou posições 1 a 23, 35 a 49, 57 a 88 e 98 a 108 de acordo com a numeração por Kabat, respectivamente) da SEQ ID NO: 10. Tal alinhamento de sequências de aminoácidos pode ser realizado utilizando, por exemplo, programas de homologia disponíveis publicamente por computador tal como programa “BLAST” fornecido na página inicial da Internet do National Centre for Biotechnology Information (NCBI) no endereço http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi, utilizando as configurações padrão ali fornecidas. Métodos adicionais para calcular percentuais de identidade de sequência de conjuntos de sequências de aminoácidos ou de sequências de ácidos nucleicos são conhecidos no estado da técnica.

[0037] Alternativamente, em outra concretização preferida, o

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14/111 anticorpo é formado por uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, de preferência pelo menos 85%, mais preferivelmente com pelo menos 90%, ainda mais preferivelmente com pelo menos 95%, tal como 98%, e o mais preferível com 100% (total) de identidade de sequência nas regiões do arcabouço, quando comparado aos resíduos de aminoácidos mostrados nas posições 1 a 30, 38 a 51, 68 a 99 e 112 a 122 (ou posições 1 a 30, 36 a 49, 66 a 94 e 103 a 113 de acordo com a numeração por Kabat, respectivamente) da SEQ ID NOs: 7 e posições 1 a 23, 41 a 55, 63 a 94 e 104 a 114 (ou posições 1 a 23, 35 a 49, 57 a 88 e 98 a 108 de acordo com a numeração de Kabat, respectivamente) da SEQ ID NO: 8, conforme ilustrado na figura 4. Um polipeptídeo possui “pelo menos X% de identidade de sequência” nas regiões do arcabouço com a SEQ ID NO: 7 ou 8, se a SEQ ID NO: 7 ou a 8 estiver alinhada com a sequência de melhor pareamento de um polipeptídeo de interesse, e a identidade dos aminoácidos entre estas duas sequências alinhadas for de pelo menos X% sobre as posições 1 a 30, 38 a 51, 68 a 99 e 112 a 122 (ou posições 1 a 30, 36 a 49, 66 a 94 e 103 a 113 de acordo com a numeração por Kabat, respectivamente) da SEQ ID NO: 7 e posições 1 a 23, 41 a 55, 63 a 94 e 104 a 114 (ou posições 1 a 23, 35 a 49, 57 a 88 e 98 a 108 de acordo com a numeração por Kabat, respectivamente) da SEQ ID NO: 8.

[0038] A SEQ ID NO: 7 e a 8 são derivadas de sequências de linhagens germinativas humanas. Apesar de serem de origem humana, não se pode excluir que sequências do arcabouço de imunoglobulinas humanas que não sejam de linhagens germinativas não serão imunogênicas. Por conseguinte, os presentes inventores examinaram sequências de linhagem germinativa, pois estas não são hipermutadas e, portanto, supostamente não serão imunogênicas. Dessa forma, o anticorpo humanizado é derivado de preferência de

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15/111 uma sequência de linhagem germinativa humana, por exemplo, da SEQ ID NO: 7 e/ou 8. A SEQ ID NO: 7 e a 8 são como segue: SEQ ID NO: 7:

QVTLKESGPA LVKPTQTLTL TCTFSGFSLS TSGMRVSWIR QPPGKALEWL ARIDWDDDKF YSTSLKTRLT ISKDTSKNQV VLTMTNMDPV DTATYYCARX XXXXXXXYFD YWGQGTLVTV SS SEQ ID NO: 8:

DIVMTQTPLS LPVTPGEPAS ISCRSSQSLL DSDDGNTYLE

WYLQKPGQSP QLLIYTLSYR ASGVPDRFSG SGSGTDFTLK

ISRVEAEDVG VYYCMQRIEF PWTFGQGTKV EIKR [0039] No contexto da presente invenção, foi determinado que, utilizando a SEQ ID NO:7 e a 8 para a geração do anticorpo humanizado da invenção, não são necessárias mutações reversas para ser atingida a mesma afinidade que a do anticorpo precursor, o que pode implicar que o anticorpo humanizado correspondente exibe imunogenicidade muito baixa. Consequentemente, no contexto da presente invenção, de preferência, estão incluídos aqueles anticorpos que mostram a mesma especificidade que o anticorpo compreendendo as SEQ ID NOs: 9 e 10 ou as SEQ ID NOs 7 e 8, respectivamente.

[0040] Em ainda outra concretização preferida, o anticorpo está conjugado a uma porção efetor, porção terapêutica ou porção detectável. Neste contexto, o termo “conjugado” refere-se a qualquer método conhecido no estado da técnica para unir funcionalmente domínios proteicos, incluindo, entre outros, a fusão recombinante com ou sem domínios intervenientes, fusão mediada por inteína, associação não covalente e ligação covalente, por exemplo, ligação dissulfeto, ligação peptídica, ligação por hidrogênio, ligação eletrostática e ligação conformacional, por exemplo, associações com biotina-avidina. A conjugação a uma porção efetor pode ser por meios químicos ou recombinantes. Meios químicos referem-se a uma reação

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16/111 entre o anticorpo e a porção efetor de tal modo que seja forma uma ligação covalente entre as duas moléculas para formar uma única molécula.

[0041] A @@termo “porção efetor” significa um composto destinado a ter efeito sobre uma célula contra a qual o anticorpo é direcionado. A porção efetor pode ser, for exemplo, uma porção terapêutica ou porção detectável.

[0042] “Porção terapêutica” é um composto destinado a atuar como agente terapêutico, tal como agente citotóxico ou fármaco. Exemplos de compostos são fornecidos abaixo para a composição farmacêutica.

[0043] “Marcador detectável” inclui qualquer composto ou etiqueta proteico detectável por meios espectroscópicos, fotoquímicos, biomecânicos, imunomecânicos, elétricos, ópticos ou químicos, tal como marcador fluorescente.

[0044] A especificidade de um anticorpo pode ser expressa pelas

CDRs ou pelo epitopo ao qual o anticorpo é ligado. Dessa forma, em um segundo aspecto, a invenção refere-se a um anticorpo que reconhece o mesmo epitopo que o anticorpo do primeiro aspecto. Como mostrado na seção de Exemplos e conforme ilustrado nas figuras 13A e 13B, este epitopo é descontínuo, ou melhor, um epitopo pseudocontínuo parcialmente resistente à desnaturação, situado nos aminoácidos 172-195 e 295-313 da glicoproteína B do HSV1 e do HSV2.

[0045] No contexto do presente relatório descritivo, o epitopo do anticorpo mAb 2c pode estar situado dentro dos primeiros 487 resíduos amino terminais da proteína gB. De preferência, o epitopo pode compreender pelo menos uma sequência de aminoácidos situada dentro da sequência de aminoácidos entre a posição 172 e 307 da proteína gB.

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17/111 [0046] O epitopo pode compreender a sequência consecutiva de aminoácidos 301YGYRE305 da proteína gB, de preferência a sequência consecutiva de aminoácidos 301YGYREG306 ou 300FYGYRE305, mais preferivelmente, a sequência pode ser ainda prolongada nos terminais (ou seja, 299PFYGYRE305 ou 300FYGYREGS307). O epitopo dos anticorpos da presente invenção pode compreender a sequência consecutiva de aminoácidos 298-313 (298SPFYGYREGSHTEHTS313) de gB.

[0047] Alternativamente, o epitopo pode estar situado na sequência consecutiva de aminoácidos

172QVWFGHRYSQFMGIFED188. O epitopo pode compreender a sequência consecutiva de aminoácidos 172QVWFGHRYSQFMG184.

[0048] De preferência, o epitopo pode ser formado por mais de uma sequência consecutiva de aminoácidos. O epitopo pode ser um epitopo parcialmente descontínuo. Mais preferivelmente, o epitopo pode compreender duas sequências consecutivas de aminoácidos. Tal epitopo formado por duas sequências de aminoácidos pode ser criado como “duótopo”. O anticorpo pode ligar-se a ambas as sequências de aminoácidos.

[0049] Mais preferivelmente, as sequências de aminoácidos do duótopo podem compreender a sequência de aminoácidos 300FYGYRE305 e uma sequência de aminoácidos situada entre a posição do aminoácido 172 e 188. Ainda mais preferivelmente, o epitopo pode compreender a sequência de aminoácidos 300FYGYRE305 e a sequência de aminoácidos 179YSQFMG184 da proteína gB. Alternativamente, o epitopo ou o duótopo pode ser sintetizado quimicamente. O epitopo pode ser um epitopo sintetizado quimicamente tendo a sequência YSQFMG-pA-FYGYRE. A abreviação pA, neste relatório descritivo, refere-se à beta-alanina.

[0050] Mais preferivelmente, o epitopo pode compreender a

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18/111 sequência de aminoácidos FYGYRE e a sequência de aminoácidos FED da proteína gB. O epitopo pode compreender um epitopo sintetizado quimicamente tendo a sequência FED-pA-pA-FYGYRE ou PFYGYREGFEDF.

[0051] Pode ser entendido por aquele versado no estado da técnica que os epitopos podem estar contidos na proteína gB, mas podem também estar contidos em um produto da degradação desta ou podem ser um peptídeo sintetizado quimicamente. As posições de aminoácidos estão indicadas somente para demonstrar a posição da sequência correspondente de aminoácidos na sequência da proteína gB. A invenção abrange todos os peptídeos compreendendo o epitopo. O peptídeo pode ser parte de um polipeptídeo contendo mais de 100 aminoácidos em comprimento ou pode ser um pequeno peptídeo de menos de 100, de preferência menos de 50, mais preferivelmente menos de 25 aminoácidos, anda mais preferivelmente de menos de 16 aminoácidos. Os aminoácidos deste peptídeo podem ser naturais ou não (por exemplo, beta-aminoácidos, gama-aminoácidos, Daminoácidos) ou uma combinação destes. Além disso, a presente invenção pode abranger os respectivos peptídeos retro inversos dos epitopo. O peptídeo pode estar não ligado ou ligado. Pode estar ligado, por exemplo, a uma pequena molécula (por exemplo, fármaco ou fluoróforo), a um polímero de alto peso molecular (por exemplo, polietilenoglicol (PEG), polietileno imina (PEI), hidroxipropilmetacrilato (HPMA), etc.) ou a uma proteína, ácido graxo, porção açúcar ou pode estar inserido em uma membrana.

[0052] Ao contrário do anticorpo H126 conhecido no estado da técnica, o epitopo reconhecido pelo anticorpo mAb 2c da presente invenção não é essencialmente descontínuo. Ao contrário do H126, o anticorpo da presente invenção pode ligar-se a um epitopo contínuo, sendo assim, uma sequência consecutiva de aminoácidos, ou pode

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19/111 ligar-se a um epitopo descontínuo. Por conseguinte, as propriedades do anticorpo da presente invenção são melhoradas. Por exemplo, o anticorpo mAb 2c pode ser utilizado para métodos nos quais a proteína alvo é desnaturada (por exemplo, eletroforese tipo SDS page) ou para a detecção de pequenos peptídeos lineares.

[0053] A fim de testar se um anticorpo em questão e o anticorpo do primeiro aspecto reconhecem o mesmo epitopo, o estudo a seguir de competição pode ser conduzido. Células Vero infectadas com 3 moi (multiplicidade de infecção) são incubadas depois de 20 h com concentrações variadas do anticorpo em questão, como o competidor por 1 hora. Em uma segunda etapa de incubação, o anticorpo do primeiro aspecto é aplicado em concentração constante de 100 nM, e sua ligação é detectada por citometria de fluxo, utilizando um anticorpo marcado por fluorescência direcionado contra os domínios constantes do anticorpo do primeiro aspecto (consultar também a seção de Exemplos e a Figura 6). A ligação que conduz de modo inversamente proporcional à concentração do anticorpo em questão é indicativa de que ambos os anticorpos reconhecem o mesmo epitopo. Contudo, são conhecidos muitos outros ensaios no estado da técnica que podem ser utilizados.

[0054] As concretizações preferidas do segundo aspecto são iguais às do primeiro aspecto, conforme descritas acima.

[0055] Em um terceiro aspecto, a invenção refere-se a uma composição farmacêutica, contendo uma quantidade efetiva do anticorpo de acordo com o primeiro ou o segundo aspecto e pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável. Contudo, o termo “composição farmacêutica” pode ser utilizado alternadamente neste relatório descritivo com o termo “fármaco”.

[0056] O teor do anticorpo na composição farmacêutica não é limitado, desde que seja útil para o tratamento ou a prevenção, porém,

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20/111 contém de preferência 00000001-10% em peso por composição total. Adicionalmente, o anticorpo descrito neste pedido de patente é empregado de preferência em um veículo. A escolha do veículo pode depender da via de administração e da concentração do(s) agente(s) ativo(s), e o veículo pode estar na forma de composição liofilizada ou solução aquosa. Em geral, uma quantidade apropriada de um sal farmaceuticamente aceitável é utilizada no veículo para tornar a composição isotônica. Exemplos do veículo incluem, entre outros, solução salina, solução de Ringer e solução de dextrose. De preferência, excipientes aceitáveis, veículos ou estabilizantes não são tóxicos nas doses e nas concentrações empregadas, incluindo tampões como de citrato, fosfato e de outros ácidos orgânicos; contra íons formadores de sal, por exemplo, sódio e potássio; polipeptídeos de baixo peso molecular (> 10 resíduos de aminoácidos); proteínas, por exemplo, albumina sérica ou gelatina; polímeros hidrofílicos, por exemplo, polivinilpirrolidona; aminoácidos como histidina, glutamina, lisina, asparagina, arginina ou glicina; carboidratos incluindo glicose, manose ou dextrinas; monossacarídeos; dissacarídeos; outros açúcares, por exemplo, sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; agentes quelantes, por exemplo, EDTA; tensoativos não iônicos, por exemplo, Tween, Plurônicos ou polietilenoglicol; antioxidantes incluindo metionina, ácido ascórbico e tocoferol; e/ou conservantes, por exemplo, cloreto de octadecilmetil amônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; fenol, álcool butílico ou benzílico; alquil parabenos, por exemplo, metil ou propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; e m-cresol). Veículos adequados e suas formulações estão descritos mais detalhadamente em Remington's Pharmaceutical Sciences, 17^a ed., 1985, Mack Publishing Co.

[0057] A composição pode conter também mais de um composto

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21/111 ativo, como agente quimioterapêutico ou agente virustático, incluindo aciclovir, penciclovir, idoxuridina e foscarnet.

[0058] Aciclovir, conhecido também como acicloguanosina (ACV) ou 2-amino-9-(2-hidroxietoximetil)-3H-purin-6-ona, é um fármaco antiviral análogo da guanosina, comercializado sob nomes comerciais tais como ACERPES^®, Acic^®, Aciclobeta^®, AcicloCT^®, Aciclostad^®, Aciclovir, Acic^®, Ophtal^®, Acivir^®, AciVision, Acyclovir^®, Aviral^®, Cyclovir, Helvevir^®, Herpex, Supraviran^®, Virucalm^®, Virupos^® Virzin, Zoliparin®, Zovir e Zovirax®. Penciclovir (2-amino-9-[4-hidroxi-3(hidroximetil)butil]-6,9-di-hidro-3H-purin-6-ona) é um fármaco antiviral análogo da guanina comercializado sob nomes comerciais tais como Denavir e Fenistil. Famciclovir (acetato de 2-[(acetil)metil]-4-(2-amino9H-purin-9-il)butila) é um profármaco de penciclovir com biodisponibilidade oral melhorada. Idoxuridina (2'-desóxi-5-iodouridina) é um análogo bioquímico do nucleosídeo uridina e comercializado sob marcas comerciais como Virunguent^® e Zostrum^®. Foscarnet é a base conjugada do composto químico tendo a fórmula HO2CPO3H2, sendo comercializado sob as marcas comerciais Foscavir^® e Triapten^®.

[0059] De preferência, o anticorpo e/ou o composto ativo estão incluídos em quantidade efetiva. O termo “quantidade efetiva” referese a uma quantidade suficiente para induzir uma resposta terapêutica detectável no indivíduo ao qual a composição farmacêutica deverá ser administrada.

[0060] Em um quarto aspecto, a invenção provê um vetor de expressão, compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica o anticorpo da invenção. Em geral, vetores de expressão são plasmídeos que são utilizados para introduzir um gene em questão em uma célula alvo, resultando na transcrição e tradução da proteína codificada pelo gene, ou seja, o anticorpo. Dessa forma, o vetor de

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22/111 expressão contém sequências reguladoras como regiões promotoras e reforçadoras, bem como um sítio de sinalização de poliadenilização, cuja finalidade é direcionar a transcrição eficiente do gene no vetor de expressão. O vetor de expressão pode compreender também outras regiões necessárias ou úteis, por exemplo, um marcador selecionável para a seleção em células eucarióticas ou procarióticas, uma origem de replicação, etc.

[0061] Consequentemente, em um quinto aspecto, a invenção refere-se a uma célula hospedeira, incluindo uma sequência de nucleotídeos que codifica o anticorpo da invenção. A célula hospedeira pode ser qualquer célula adequada para expressar o anticorpo da invenção e inclui células de mamíferos, células de levedura e células de insetos, de preferência, células de mamíferos, mais preferivelmente linhagens de células imortais, tais como linhagens celulares de mieloma. Linhagens celulares adequadas estão disponíveis na American Tissue Culture Collection, ATCC.

[0062] Além disso, em um sexto aspecto, uma célula de hibridoma, capaz de produzir o anticorpo do primeiro e/ou do segundo aspecto, é provida. Células de hibridoma são células construídas capazes de se multiplicarem rápida e indefinidamente, produzindo um anticorpo desejado em grandes quantidades. Células de hibridoma são preparadas removendo células B produtoras de anticorpos do baço de um animal que foi exposto ao antígeno pertinente, as quais são então fundidas com células imortais tumorais de mieloma.

[0063] Em um sétimo aspecto muito importante, a invenção referese a um anticorpo de acordo com a invenção para uso como fármaco. Mais especialmente, a invenção refere-se a uso do anticorpo da invenção para a produção de um fármaco destinado ao tratamento profilático ou terapêutico de doenças associadas ao HSV em um indivíduo. Igualmente, a invenção refere-se ao anticorpo da invenção

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23/111 para uso no tratamento profilático ou terapêutico de doenças associadas ao HSV em um indivíduo. Além do mais, a presente invenção refere-se a um método do tratamento profilático ou terapêutico de doenças associadas ao HSV em um indivíduo, em que o anticorpo da invenção é administrado a um indivíduo em quantidade terapeuticamente efetiva.

[0064] A infecção pelo HSV pode causar diversas doenças distintas. A infecção comum da pele ou da mucosa pode afetar a face e boca (herpes orofacial), órgãos genitais (herpes genital) ou mãos (herpes whitlow). Transtornos mais sérios ocorrem quando o vírus infecta e danifica o olho (ceratite do herpes) ou invade o sistema nervoso central, danificando o cérebro (encefalite herpética). Pacientes com sistemas imunes imaturos ou suprimidos, tais como recémnascidos, destinatários de transplantes ou pacientes com AIDS são propensos a complicações graves de infecções pelo HSV. Doenças associadas ao HSV incluem também herpes gladiatorum, meningite de Mollaret, possivelmente paralisia de Bell, transtornos associados com déficits cognitivos do transtorno bipolar, conhecido também como depressão maníaca, transtorno maníaco depressivo ou transtorno afetivo bipolar, e doença de Alzheimer. Em relação à doença de Alzheimer, publicações científicas recentes demonstraram uma localização surpreendente do DNA do vírus Herpes simplex tipo 1 DNA dentro das placas beta-amiloides, sugerindo que este vírus pode ser uma causa das placas. Finalmente, o uso do anticorpo de acordo com a invenção é útil se o desenvolvimento de cepas resistentes contra agentes virustáticos quimioterapêuticos comuns for observado, por exemplo, durante tratamento profilático ou terapêutico prolongado de pacientes imunossuprimidos.

[0065] Assim, em uma concretização preferida, a doença associada ao HSV é acompanhada por uma ou mais das seguintes

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24/111 características: presença de recidiva oral, presença de recidiva genital, eczema herpético, herpes neonatal, deficiência imune (pacientes imunocomprometidos), imunossupressão, encefalite, meningite, meningoencefalite, infecções oculares, infecções generalizadas pelo HSV e/ou resistência contra um agente virustático.

[0066] Em uma concretização alternativa preferida, a doença associada ao HSV é acompanhada por intolerância frente a um agente virustático quimioterapêutico.

[0067] Em uma concretização preferida adicional, o fármaco compreende pelo menos um agente ativo adicional, de preferência em que o agente ativo adicional é um agente quimioterapêutico ou agente virustático, mais preferivelmente em que o agente ativo adicional é selecionado a partir da porção constituída por aciclovir, penciclovir, idoxuridina e foscarnet, conforme descrito acima.

[0068] Em uma concretização final preferida, o indivíduo é um mamífero como cão, gato, porco, vaca, ovelha, cavalo, roedor, por exemplo, rato, camundongo e cobaia, ou um primata, por exemplo, gorila, chimpanzé e humano, de preferência o indivíduo é humano. Descrição dos desenhos [0069] A figura 1 mostra a redução da replicação do HSV in vivo pela administração do anticorpo monoclonal (mAb) 2c depois de estabelecida a infecção na membrana mucosa vaginal. Camundongos imunocompetentes (símbolos cheios) e com depleção de CD4⁺(símbolos vazados) foram tratados no Dia 3 e 11 após a infecção (setas) por injeção intraperitoneal (i.p.) com soro imune de HSV policlonal (triângulos), com o mAb 2c (círculos) ou com meio de cultura de controle (quadrados).

[0070] A figura 2 mostra o efeito de mAb 2c sobre a progressão da infecção pelo HSV em camundongos imunossuprimidos (CD4^-/CD8^-). No Dia 1 e 3 após a infecção (indicados por setas), foi administrado

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25/111 aos animais por via i.p. meio de controle (quadrados cheios), soro imune de HSV policlonal (quadrados vazados) ou mAb 2c (círculos cheios). (A) mostra a taxa de sobrevida e (B) a replicação viral na membrana mucosa vaginal.

[0071] A Ffgura 3 é uma apresentação esquemática do mAb 2C derivado de anticorpo e de fragmentos de anticorpo. (A) Anticorpos completos: A fusão genética de regiões variáveis murinas (VL, VH; esquerda) a domínios constantes humanos (CL, CH1, CH2, CH3; meio) resulta em um anticorpo quimérico. Em um anticorpo IgG humanizado (direita), as regiões hipervariáveis de um anticorpo monoclonal murino são enxertadas no arcabouço de um anticorpo humano. (B) Fragmentos de anticorpo: É possível produzir fragmentos Fab monovalentes (Fab), formados pela cadeia leve (VL + CL) e os dois domínios N-terminal da cadeia pesada (Vh + Chi), ou fragmentos F(ab')2 bivalentes, ligados covalentemente por dois resíduos não pareados de cisteínas no C-terminal, por meio de digestão convencional por protease. Para a geração do anticorpo scFv murino (“fragmento variável de cadeia única”), os genes codificadores dos domínios variáveis de Vh e Vl foram isolados da linhagem de células 2c do hibridoma e unidos por um segmento gênico codificador de um peptídeo flexível de ligação (“ligante”).

[0072] A figura 4 mostra um alinhamento de sequências do domínio variável de cadeia pesada e leve (Vh e Vl). O sítio de ligação a antígeno é definido de acordo com Chothia (Chothia and Lesk, 1987; Chothia et al., 1989) (linha pontilhada) e Kabat (Kabat and Wu, 1991) (linha tracejada). As sequências das linhagens germinativas humanas DP28 e DPK13 foram obtidas do banco de dados V-Base (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) e serviram como sequências aceitadoras para as CDRs do mAb 2c murino. (A) “resíduos invariantes” (Kabat and Wu, 1991); (B) “resíduos-chave” (Chothia et

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26/111 al., 1989) e (C) resíduos na interface Vh/Vl (Chothia et al., 1985) estão marcados com (+) para resíduos pareados ou (-) para não pareados entre a sequência murina e humana, respectivamente. (D) Resíduos em sítios centrais conforme definido por Chothia (Chothia et al., 1998) como sítios de resíduo invariante (i); sítios de resíduos similares (r); resíduos de superfície (s) R,K,E,D,Q,N; resíduos neutros (n) P,H,Y,G,A,S,T; e resíduos enterrados (b) C,V,L,I,M,F,W respectivamente; resíduos neutros enterrados estão marcados por x; resíduos neutros de superfície estão marcados por y; sítios de resíduos não pareados entre a sequência murina e a humana estão marcados com letras em negrito; VHhum2c e VLhum2c, sequências enxertadas de especificidade com resíduos de CDRs murinas mostrados com letras em negrito. Todos os resíduos são mostrados no código de uma única letra e numerados de acordo com Kabat (Kabat et al., 1991).

[0073] A figura 5 mostram as curvas de ligação no equilíbrio dos anticorpos monoclonais 2c, ch2c e variantes humanizadas de hu2cV1-V4. A ligação específica à glicoproteína B sobre a superfície de células Vero infectadas com HSV-1 F foi determinada por citometria de fluxo. A atividade de ligação nas concentrações indicadas é fornecida como mediana da intensidade de fluorescência (MFI) menos a fluorescência de fundo. As medições foram realizadas em triplicata; desvios padrão são mostrados como barras. As constantes da afinidade de ligação Kd foram determinadas ajustando os dados de ligação a antígenos ao modelo de regressão não linear de acordo com o método de Levenberg-Marquard.

[0074] A figura 6 mostra um estudo de competição que demonstra a especificidade pelo mesmo epitopo dos anticorpos quiméricos e humanizados que o mAb 2C murino precursor. As variantes quiméricas do mAb ch2c (círculo vazado) e as variantes humanizadas

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27/111 do mAb hu2c-V1 (quadrado), V2 (triângulo), V3 (asterisco),V4 (losango) competem com o mAb 2c precursor pela ligação à gB presente na superfície de células Vero infectadas com HSV-1. Células Vero infectadas foram incubadas primeiramente com concentrações crescentes do mAb ch2c ou dos mAbs humanizados hu2c-V1-V4, seguido pela incubação com 100 nM de mAb 2c como competidor. A mediana da intensidade de fluorescência (MFI) mostra a ligação do competidor aplicado.

[0075] A figura 7 mostra que a atividade de neutralização de HSV do mAb 2c precursor e do mAb hu2c-V1 humanizado independe de complemento. HSV-1 é previamente incubado com meio (controle), IgG policlonal Cytotect® (120 pg/ml), mAb 2c (2 pg/ml) ou mAb hu2cV1 (2 pg/ml) na presença ou ausência de complemento humano 10% antes de ser aplicado em células Vero. O desenvolvimento de placas foi pontuado 2 dias depois.

[0076] A figura 8 mostra a eficiência do mAb humanizado h2c-V1 para neutralizar HSV-1 e HSV-2 derivados de isolados de pacientes clinicamente resistentes ao aciclovir (ACV), a ACV e Foscarnet (PFA) ou a ACV, PFA e Cidovir (CDV), em comparação a cepas não resistentes de laboratório (HSV-1 F, HSv-1 324hv, HSV-1 17 syn⁺, HSV-2 G), a cepa resistente a ACV de laboratório HSV-1 TK^- e a isolados clínicos nos quais a resistência não foi investigada. A fim de determinar o título de mAb h2c-V1 para neutralização completa do vírus, diversas concentrações de anticorpo foram incubadas por 1 hora a 37°C com 100 TCID50 de isolados de HSV-1 ou de HSV-2 e incubadas durante 3 dias com células Vero. O MAb hu2c-V1 neutraliza completamente as cepas de HSV-1 de laboratório HSV-1 F, HSV-1 324 hv, HSV-1 17 syn⁺, HSV-1 TK^- a concentrações de 7,8 -15,6 nM. Isolados clínicos de HSV-1 são neutralizados igualmente pelo mAb h2c-V1 independente do seu perfil de resistência. Além disso, a

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28/111 mesma eficiência de neutralização do mAb hu2c-V1 foi mostrada para isolados de HSV-2 G e de HSV-2 resistente a ACV a concentrações de 31,3 - 62,5 nM.

[0077] A figura 9 mostra a inibição da disseminação viral célula a célula pelo anticorpo anti-HSV da invenção. Células Vero infectadas com HSV-1 F por 4 h foram lavadas duas vezes e incubadas com meio contendo excesso de soro de anti-HSV policlonal humano de controle (1:20), o mAb 2c murino (500 nM), fragmentos derivados do anticorpo 2c F(ab')2 (500 nM) ou Fab (3000 nM) preparados por digestão enzimática, o mAb ch2c quimérico (500 nM) ou com a variante 1 do mAb humanizado, hu2c-V1 (500 nM), respectivamente. Dois dias depois da infecção, a disseminação do vírus foi detectada com soro anti-HSV policlonal de cabra marcado com fluorescência, utilizando microscópio confocal DM IRE2 Leica em ampliação de 40 vezes. O título de neutralização do anti-HSV policlonal humano foi previamente determinado em 1:160, utilizando 100 TCID50 em volume de 100 pL. O soro anti-HSV em diluição de 1:20 não consegue impedir a disseminação do vírus para células adjacentes. A disseminação célula a célula pôde ser inibida com êxito por 500 nM do mAb 2c murino, o fragmento de anticorpo 2c-F(ab% o mAb quimérico e do humanizado. O fragmento monovalente 2c-Fab na concentração mais alta testada de 3.000 nM não foi capaz de inibir completamente a disseminação célula a célula.

[0078] A figura 10 mostra a sobrevida de camundongos

NOD/SCID infectados por via intravaginal com HSV-1 depois da imunização passiva com mAbs anti-HSV. Os camundongos receberam por via intravenosa, 24 horas antes da infecção, PBS (cruz), 2,5 mg/kg (quadrados), 5 mg/kg (triângulos) ou 15 mg/kg (círculos) do mAb 2c precursor (símbolos vazados) ou do mAb humanizado hu2c-V1 (símbolos escuros). Os camundongos foram infectados por via

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29/111 intravaginal com 1x10⁶ TCID50/20 pL da cepa F neurovirulenta do HSV-1. Camundongos infectados com sintomas de perda de peso, vulvite/vaginite ou doenças neurológicas foram sacrificados, e seus órgãos examinados quanto à presença de vírus infeccioso por titulação em monocamadas de células Vero, conforme descrito previamente. Os camundongos não infectados foram sacrificados no Dia 30. Animais por porção n = 7.

[0079] A figura 11 mostra a proteção de camundongos NOD/SCID por anticorpos aplicados sistemicamente contra a disseminação de HSV-1. A partir de 24 horas após a infecção, os camundongos receberam mAb 2c ou mAb humanizado hu2c-V1, 15 mg/kg, três vezes por via intravenosa em momentos indicados por setas (24 h, 40 h, 56 h). Animais infectados por porção n = 7.

[0080] A figura 12 mostra que camundongos NOD/SCID infectados por via intravaginal com isolado de paciente derivado de HSV-1 resistente ao aciclovir, foscarnet e ao cidovovir estavam significativamente protegidos contra encefalite letal quando do tratamento por via intravenosa em 24 h, 40 h e 56 h após a infecção com o mAb hu2c-V1 humanizado, 15 mg/kg. Camundongos que receberam o tratamento padrão duas vezes ao dia com aciclovir morreram todos em 28 dias.

[0081] A figura 13 mostra a localização do epitopo do mAb 2c contra gB. (A) mostra um alinhamento de sequências de aminoácidos da glicoproteína B (gB) do HSV 1 e do HSV2. É mostrado um alinhamento da sequência de aminoácidos da proteína gB das seguintes cepas (número de acesso correspondente do NCBI em parênteses): cepas do HSV1: KOS (P06437), F (P06436), gC-39-R6 (ABM66850) e cepas do HSV2: 333 (ABU45423), HG52 (P08666) e MMA (AAB60547). A sequência de sinalização de gB está sublinhada. A gB Madura inicia na posição 31 com os aminoácidos AP. A

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30/111 numeração de aminoácidos é mostrada para gB, incluindo a sequência peptídica de sinalização. Os epitopos estão numerados de acordo. MAb 2c liga-se a duas regiões separadas dentro da gB (regiões da sequência em caixas), conforme mostrado por microarranjos de peptídeos. Os aminoácidos 299PFYGYRE305 demonstraram ser essenciais para ligação do mAb 2c. (B) Caracterização de mAb 2c de acordo com sua reatividade com gB recombinante gB sob diferentes condições de Westernblot. gB recombinante (730t) foi resolvida em SDS-PAGE 8% SDS-PAGE em condições nativas (N) ou desnaturantes (D), transferida para membrana de nitrocelulose e incubada por 1 h em tampão TNT de bloqueio contendo leite 2%. As membranas foram sondadas com os anticorpos monoclonais específicos para gB mAb H1817, mAb H126 ou mAb 2c, e a ligação à gB foi detectada por soro policlonal de cabra anticamundongo conjugado a HRP-e quimioluminescência. Para controle, os mAbs H1817 e H126, que reconhecem um epitopo contínuo (Bender et al., 2007) e um descontínuo (Kousoulas et al., 1988), respectivamente, foram utilizados. Um padrão típico de coloração para epitopo linear foi obtido na análise de Western blotting com o mAb H1817 mostrando detecção de formas monoméricas e triméricas de gB em condições não redutoras, e coloração única predominante de monômero de gB em condições redutoras. Como previsto, o mAb H126 somente reagiu com gB em condições nativas. O reconhecimento exclusivamente da banda superior da proteína gB > 170 kDa indica que o mAb H126 se liga especificamente à gB trimérica. O MAb 2c reagiu com gB nativa e desnaturada, contudo, a reatividade em condições desnaturantes foi muito mais fraca, quando comparado com o mAb H1817 e indica que o mAb 2c se liga a um epitopo descontínuo que parece ser resistente à desnaturação ou que se dobra novamente durante a eletroforese SDSPAGE e é denominado, portanto, epitopo “pseudocontínuo” (Bender et

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31/111 al., 2007). A massa molecular (kDa) é indicada à esquerda e a migração de trímero e monômero de gB à direita.

[0082] A figura 14 mostra o mapeamento peptídico do mAb 2c contra gB. (A) Localização esquemática de regiões de ligação A e B, identificadas em uma biblioteca de peptídeos abrangendo o domínio extracelular de gB dos aminoácidos 31 a 505. Os peptídeos 13méricos foram sintetizados em membrana continua de celulose com compensação para 3 aminoácidos, e o mAb 2c ligado foi detectado com anticorpo secundário conjuntado à peroxidase por quimioluminescência. Os domínios funcionais I-V correspondem à estrutura em cristal de gB por Heldwein et al., e as regiões não resolvidas na estrutura em cristal são mostradas em cinza (24), S, sequência de sinalização. (B) Intensidades do sinal de fluorescência obtidas de varreduras a laser de alta resolução com peptídeos 13méricos imobilizados sobre lâminas de vidro por intermédio de ligante flexível.

[0083] A figura 15 mostra a localização de epitopos neutralizantes do mAb 2c na estrutura em cristal da gB (PDB-ID 2GUM). O diagrama em fita do trímero de gB é mostrado. Os asteriscos indicam as alças de fusão de dois promotores, as alças de fusão do terceiro promotor não estão visíveis. Os resíduos mapeados do epitopo descontínuo do mAb 2c, F175 a A190 e F300 a E305, estão indicados em representação da superfície por cinza escuro, para um promotor, e por cinza claro para os dois outros promotores.

[0084] A figura 16 mostra a varredura de duótopos do mAb 2c.

Sequências de consenso (sublinhadas) das regiões de ligação A e B do mAb 2c (barras tracejadas) foram sintetizadas como duótopos (barras brancas e pretas) unidas diretamente ou separadas por um ou dois espaçadores β-alanina (B, B-B). A reatividade de mAb 2c com duótopos foi registrada por intensidades do sinal de fluorescência de

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32/111 varreduras a laser de alta resolução.

[0085] A figura 17 mostra as curvas de ligação no equilíbrio para mAb 2c, 2c-F(ab')2, 2c-Fab e 2c-scFv, conforme determinadas por citometria de fluxo. As atividades de ligação a células Vero infectadas por (A) HSV-1 F ou (B) HSV-2 G às concentrações indicadas são mostradas em percentual da mediana da intensidade máxima de fluorescência. Os experimentos foram realizados duas vezes em triplicata; barras representam desvios padrão.

[0086] A figura 18 mostra a inibição da adesão de vírions do HSV1 pelo mAb 2c a células alvo. Diluições em série de (A) mAb 2c (0,98 125 nM) ou (B) gama globulina humana polivalente (Intratect®) (0,33 42 μΜ) foram adicionadas a monocamadas de células Vero em placas de microtitulação de 96 poços, após a incubação prévia com 100 TCID50 de HSV-1 (neutralização pré-adesão) ou após a adsorção de 100 TCID50 de HSV-1 a células alvo (neutralização pós-adesão). O título mais alto de anticorpo e de IgG humana polivalente, respectivamente, impedindo o efeito citopático (CPE) induzido pelo vírus em dez monocamadas individuais de células inoculadas a 100% e 50% em relação a controles, foi determinado depois de 72 h de incubação a 37°C e considerado o parâmetro final. Erros padrão da média de três experimentos independentes foram < 0,1.

[0087] A figura 19 mostra o efeito da valência de anticorpos antigB sobre a neutralização in vitro do HSV. (A) Diluições dos anticorpos bivalentes mAb 2c (IgG) e 2c-F(ab')2 e do 2c-Fab monovalente foram incubadas por 1 hora com 100 TCID50 de HSV-1 F ou de HSV-2 G antes da inoculação em células Vero. O CPE foi pontuado 72 h depois, como descrito na Figura 3. São mostradas concentrações de anticorpo necessárias para neutralizar 100% do inóculo viral obtido de um de três experimentos representativos em triplicata. (B) Atividade antiviral de fragmentos 2c-Fab em ligação cruzada com IgGs murinas anti-Fab.

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33/111 [0088] A figura 20 mostra a sobrevida dependente da dose de camundongos imunodeficientes tratados com mAb 2c. Camundongos NOD/SCID receberam diferentes doses únicas de mAb 2c por via intravenosa 24 h antes do desafio intravaginal com 1x106 TCID50 de HSV-1. Animais por porção n = 7 para PBS, n = 9 para todas as outras porções.

[0089] A figura 21 mostra a eliminação de infecções por HSV-1 estabelecidas em membranas mucosas genitais de camundongos NOD/SCID pelo mAb 2c ou pelo mAb humanizado hu2c-Vi aplicados sistematicamente contra a disseminação do HSV-1. A partir de 24 horas após a infecção, os camundongos receberam mAb 2c (símbolos vazados) ou mAb humanizado hu2c-V1 (símbolos escuros), 15 mg/kg, três vezes por via intravenosa nos momentos indicados por setas (24 h, 40 h, 56 h). Os títulos virais vaginais de camundongos tratados com anticorpo ou controle foram determinados a partir de irrigações vaginais cultivadas em monocamadas de células Vero. Barras de erro indicam o desvio padrão.

[0090] A figura 22 mostra a varredura de peptídeos na sequência da gB do HSV-1 do aminoácido 31 ao 505. Peptídeos 15-mer ligados à membrana de celulose com sobreposição de 12 aminoácidos (varredura 15/12), resultando no total em 155 diferentes pontos de peptídeos, foram incubados com MAb 2c. mAb 2c ligado a peptídeos foi detectado utilizando um fragmento Fab de IgG anticamundongo marcado com peroxidase e um substrato quimioluminescente do tipo luminol. MAb 2c demonstrou ligar-se a um tripleto (peptídeos 49-51) e a dupleto (peptídeos 90-91) de peptídeos consecutivos da gB, designados sítios de ligação A e B. A sequência da gB comum aos peptídeos de cada sítio está realçada por letras em negrito (abaixo) e representa a sequência da gB dos resíduos 181 ao 189 e dos resíduos 301 ao 312.

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34/111 [0091] A figura 23 mostra a varredura de peptídeos na sequência da gB do HSV-1 do aminoácido 296 ao 315. Peptídeos 13-mer ligados à membrana de celulose, cada peptídeo desviando-se ao longo da sequência por um aminoácido (varredura 13/12) e sintetizado em duplicata, foram incubados com MAb 2c, seguido por detecção da quimioluminescência por Western Blotting. A ligação de MAb 2c foi observada a uma série de cinco peptídeos. A sequência comum aos cinco peptídeos reativos é 300FYGYREGSH308.

[0092] A figura 24 mostra a varredura do principal motivo na sequência de gB do resíduo 295 ao 315. A sequência da gB do HSV-1 do aminoácido 295 ao 315 foi dissecada em peptídeos hexaméricos, cada um desviando-se ao longo da sequência por um aminoácido, resultando no total em 16 peptídeos. A sequência derivada de gB era estruturada por quatro resíduos aleatórios em cada terminal, N e C. Foram identificados dois peptídeos consecutivos representando a sequência de gB, 300FYGYRE305 e 301YGYREG306, que se ligam ao MAb 2c. A sequência comum a estes peptídeos está realçada por letras em negrito (peptídeo 6 e 7).

[0093] A figura 25 mostra a cinética de eliminação de HSV-1 nas membranas mucosas genitais de camundongos C57BL/6 que receberam passivamente a transferência de soro imune policlonal (quadrado vazado, quadrado escuro), MAb 2c (círculo vazado, círculo escuro) ou de meio de cultura precipitado como controle (triângulo vazado, triângulo escuro) 24 horas antes da inoculação do vírus. Os dados de camundongos inoculados com a cepa F do tipo selvagem (wt) e com seus derivados mutantes R126 (Y303N), R1375 (R304Q), R1435 (H308Y) e R233 (R328H) são fornecidos por símbolos vazados, os dados de camundongos inoculados com a cepa do tipo selvagem KOS 321 e com seu derivado mutante B4.1 (E305K) são fornecidos por símbolos escuros. Intervalo de S.E. (logw) e n^o de camundongos

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35/111 inoculados: cepa F wt, quadrado vazado, ± 1,5 a 0, 12 camundongos; círculo vazado, ± 0,4 a 0, 7 camundongos; triângulo vazado, ± 1,3 a 0, 9 camundongos; cepa KOS wt, quadrado escuro, ± 1,4 a 0, 8 camundongos; círculo escuro, ± 0,6 a 0, 8 camundongos; triângulo escuro, ± 1,4 a 0, 8 camundongos; cepa F mutante R126 (Y303N), quadrado vazado, ± 0,6 a 0, 5 camundongos; círculo vazado, ± 0,6 a 0, 6 camundongos; triângulo vazado, ± 0,5 a 0, 6 camundongos; cepa F mutante R1375 (R304Q), quadrado vazado, ± 1,2 a 0, 11 camundongos; círculo vazado, ± 1,3 a 0, 10 camundongos; triângulo vazado, ± 1,2 a 0, 11 camundongos; cepa KOS mutante B4.1 (E305K), quadrado escuro, ± 0,9 a 0, 12 camundongos; círculo escuro, ± 0,7 a 0, 12 camundongos; triângulo escuro, ± 0,9 a 0, 10 camundongos; cepa F mutante R1435 (H308Y), quadrado vazado, ± 1,4 a 0,6, 6 camundongos; círculo vazado, 0, 5 camundongos; triângulo vazado, ± 1,0 a 0,6, 6 camundongos; cepa F mutante R233 (R328H), quadrado vazado, ± 1,0 a 0, 5 camundongos; círculo vazado, ± 0,1 a 0, 5 camundongos; triângulo vazado, ± 1,1 a 0, 6 camundongos.

[0094] A figura 26 mostra a comparação da reatividade de MAb 2c ao peptídeo 90 (consultar a figura 22, sequência de gB 298SPFYGYREGSHTEHT312; esquerda), e a um peptídeo criado para compreender os resíduos críticos do sítio B, um ligante glicina e o motivo FEDF derivado do sítio A (PFYGYRE-G-FEDF; direita).

Exemplos [0095] A presente invenção é descrita mais detalhadamente pelos exemplos a seguir, os quais não devem ser interpretados como limitações ao âmbito da invenção.

Exemplo 1

Preparo de anticorpo monoclonal murino (mAb) 2c com especificidade para glicoproteína B (gB) do vírus Herpes simplex tipo 1 e tipo 2 (HSV1, HSV2)

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36/111 [0096] Para a geração de um mAb específico anti-HSV, camundongos BALB/c foram imunizados com a cepa 342 hv do HSV1 inativada por UV. Subsequentemente, esplenócitos murinos foram imortalizados por fusão somática à linhagem celular de mieloma X63Ag8.653, e uma linhagem de células do hibridoma, secretora do mAb 2c especifica anti-HSV (IgG2a) foi isolada rastreando os sobrenadantes de clones de células únicas, utilizando imunoensaios enzimáticos, ensaios por imunofluorescência, bem como ensaios de neutralização de HSV. Os estudos de ligação revelaram que o mAb 2c reconhece um epitopo descontínuo compartilhado da glicoproteína gB do HSV1 e HSV2. A glicoproteína B contém em torno de 904 aminoácidos de comprimento e está integrada como trímero na membrana viral e na membrana de células infectadas pelo HSV1/2. É de particular importância que o mAb 2c não só neutraliza a disseminação de partículas virais extracelulares, mas também inibe a via direta de infecção a partir da célula inicialmente infectada para células adjacentes não infectadas (disseminação célula a célula), o que é característico do HSV. O último processo em geral não é inibido pelo repertório de anticorpos naturais específicos contra o HSV em humanos.

[0097] A fim de examinar a eficácia in vivo do mAb 2c, uma via de infecção no modelo de camundongo foi escolhida, a qual se assemelha proximamente com as relações naturais da infecção em humanos. Por conseguinte, camundongos C57BL/6J foram infectados pela aplicação da cepa 342 hv do HSV1 sobre a membrana mucosa vaginal intacta. Para inibição da replicação do HSV in vivo, mAb 2c foi administrado por via intraperitoneal (i.p.) a camundongos em diferentes momentos após a infecção. Tanto em animais imunocompetentes como naqueles com depleção de células T CD4⁺, mAb 2c é capaz de inibir a propagação viral na membrana mucosa

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37/111 vaginal e a formação de lesões inflamatórias dentro de curto período de tempo (figura 1).

[0098] Ao contrário do soro policlonal contra HSV, mAb 2c foi capaz de inibir a replicação viral, bem como de impedir doença generalizada progressiva letal com alta eficiência em animais imunossuprimidos com depleção completa de células T (CD4+ e CD8+) (figura 2). A administração de mAb 2c, 24 h antes da inoculação viral, protegeu eficientemente os animais contra infecção (Eis-Hübinger et al., 1993).

[0099] A fim de examinar a influência do número de sítios de ligação a antígenos (valência) e da parte Fc sobre as propriedades neutralizantes, fragmentos Fab e F(ab’)₂ do mAb 2c foram gerados por digestão convencional por proteases, bem como um “Fv de cadeia única” (scFv) recombinante de mAb 2c foi clonado, produzido e purificado (figura 3) utilizando métodos bem conhecidos no estado da técnica.

[00100] As constantes de afinidade (KD) foram determinadas por citometria de fluxo, utilizando células Vero infectadas por HSV expressando a proteína gB como glicoproteína associada à membrana na superfície celular durante o ciclo natural de replicação do HSV, um método bem conhecido no estado da técnica. Os resultados são mostrados na Tabela 1 abaixo.

Tabela 1 - Constantes de afinidade (Kd) do mAb 2c murino e dos fragmentos 2c gerados a partir do anticorpo

Cepa: Valência:	HSV-1 F		HSV-2 G
bivalente		monovalente		bivalente
	2c IgG	2c- F(ab’)2		2c-Fab	2c-scFv	2c IgG
KD [nM]	10	7		17	19	10

[00101] Em comparação ao mAb 2c precursor, o fragmento F(ab’)2

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38/111 exibe afinidade ligeiramente aumentada. Os fragmentos Fab e scFv apresentam afinidade quase idêntica, a qual, no entanto, devido à sua monovalência, é em torno de 1,7 a 1,9 vezes mais fraca do que a afinidade do mAb precursor.

[00102] A atividade neutralizante de anticorpos foi determinada por um ensaio padrão de diluição final, utilizando células Vero cultivadas em forma de monocamadas em placas de microtitulação. Resumidamente, 100 TCID50 de HSV foram incubados previamente em 100 pL de meio de cultura celular por 1 h a 37°C com diluições em série de anticorpos (2c-IgG e F(ab)2: 0,98 nM - 125 nM; Fab: 23 nM 3000 nM) antes da inoculação de células Vero. Depois de 72 h de incubação a 37°C, a concentração necessária de anticorpo para impedir 100% que fosse formado CPE induzido pelo vírus foi determinada como título de neutralização completa. Adicionalmente, a capacidade para neutralização do vírus de fragmentos monovalentes 2c-Fab foi determinada na presença de anticorpos de ligação cruzada.

Tabela 2 - Neutralização completa de uma quantidade definida do vírus de 100 TCID50

Cepa: Valência:	HSV-1 F	HSV-2 G
bivalente		monovalente	bivalente		monovalente
	2c igG	2c- F(ab')2		2c-Fab	2c igG	2c- F(ab')2	2c-Fab
Concentração [nM]	8	4		3000	31	16	3000

[00103] Pôde ser demonstrado que o mAb 2c precursor e seus fragmentos F(ab')2 e Fab são capazes de neutralização completa de HSV1 e HSV2. Contudo, os fragmentos monovalentes do anticorpo mostraram eficiência significativamente menor de neutralização do HSV1/2, em comparação ao mAb 2c. É necessária concentração 375 a 97 vezes mais alta do fragmento Fab para neutralização 100% de

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HSV1 e HSV2, respectivamente. O scFv revelou efeito redutor de placas, mas não foi capaz de inibir completamente o CPE na concentração mais alta testada de 3000 nM (dados não mostrados). A capacidade de neutralização viral do fragmento monovalente 2c Fab pôde ser dobrada pela adição em excesso de IgG específica anti-Fab (Jackson ImmunoResearch, Newmarket, Inglaterra) à etapa da préincubação (não mostrado). Por outro lado, o fragmento bivalente F(ab')2 exibe atividade de neutralização virtualmente duas vezes mais eficiente para HSV1 e HSV2, em comparação ao mAb 2c precursor. Em conclusão, a valência do anticorpo contribui de modo importante para suas propriedades de neutralização. As concentrações mais altas exigidas do anticorpo para neutralização completa do HSV-2 podem ser explicadas pela quantidade maior de partículas não infecciosas produzidas pelo HSV-2, quando comparado ao HSV-1, conforme confirmado pelo número de cópias do DNA, determinado por RT-PCR, para HSV-1 e HSV-2 (dados não mostrados).

[00104] Detalhes adicionais sobre as propriedades de mAb 2c e sua produção são fornecidos em Eis-Hübinger et al., 1991, e Eis-Hübinger et al., 1993.

Exemplo 2

Quimerização e humanização de mAb 2c [00105] A fim de ser utilizado como agente terapêutico, o anticorpo monoclonal murino 2c foi modificado utilizando métodos de engenharia genética com o objetivo de reduzir ou eliminar sua imunogenicidade durante a administração a humanos, enquanto retendo integralmente a especificidade do anticorpo precursor. Dessa forma, um anticorpo monoclonal quimérico e um humanizado tendo a mesma especificidade do mAb 2c foram gerados (figura 3).

[00106] Primeiramente, os genes autênticos da cadeia variável pesada e da leve (VH, VL) do mAb 2c foram isolados e amplificados a

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40/111 partir da linhagem de células do hibridoma, utilizando a técnica 5'RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends, amplificação rápida das extremidades do cDNA)-PCR. Um anticorpo quimérico IgG1 (ch2c) foi gerado pela clonagem dos genes amplificados de VH e VL em vetores de expressão, construídos pelo parceiro de cooperação dos inventores, Dr. Grosse-Hovest (Universitat Tübingen), o qual contém as regiões constantes da cadeia leve e da cadeia pesada de um isotipo IgG1 humano. O anticorpo foi finalmente secretado em sobrenadantes de culturas celulares de células do mieloma murino Sp2/0, estavelmente transfectadas.

[00107] A fim de reduzir mais ainda a imunogenicidade, um anticorpo humanizado foi construído. Por conseguinte, os segmentos gênicos codificadores das seis regiões determinantes de complementaridade (CDRs) do mAb 2c (2c Vl-CDR1/2/3 e 2c VhCDR1/2/3) foram clonados em esqueletos adequados que aceitavam a região do arcabouço de imunoglobulinas humanas dos genes das linhagens germinativas de Vh e Vl humanas, respectivamente (enxerto de CDR). Esqueletos aceitadores adequados da linhagem germinativa humana para clonagem das regiões CDRs da cadeia leve e da cadeia pesada do mAb 2c foram determinados por alinhamento de sequências com as regiões do arcabouço humanas correspondentes do banco de dados V-Base (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/). DP28 revelou a identidade mais alta de sequência do arcabouço com a sequência correspondente da Vh da cadeia pesada do mAb 2v murino (88,5% de identidade de sequência); DPK13 revelou a identidade mais alta de sequência do arcabouço com a sequência correspondente da Vl da cadeia leve do mAb 2c murino (88,9% de identidade de sequência). Dessa forma, os segmentos gênicos codificadores das CDR do anticorpo 2c murino doador (ou seja, 2c Vl-CDR1/2/3 e 2c VhCDR1/2/3) foram clonados em esqueletos aceitadores codificadores

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41/111 de DP28 e DPK13, respectivamente.

[00108] No contexto de humanização de anticorpo monoclonais, é necessário identificar aqueles aminoácidos nas regiões do arcabouço humanas que poderiam ser nocivos à integridade estrutural das CDRs murinas que foram introduzidas e, portanto, às propriedades de ligação a antígenos. Normalmente, tais aminoácidos são identificados utilizando modelos de homologia gerados por computador, e posições que parecem ser estericamente essenciais sofrem mutações para a sequência murina correspondente, visando reter as propriedades de ligação a antígenos do mAb murino doador (conforme Queen et al., 1989). Contudo, aminoácidos potencialmente essenciais podem ser identificados também utilizando banco de dados de repertórios de anticorpos e avaliando sua significância essencial com base em anticorpos de referência com estrutura tridimensional conhecida (conforme Krauss et al., 2003). Dessa forma, diversos aminoácidos potencialmente essenciais na região do arcabouço de VH e VL foram determinados (figura 4), e quatro variantes humanizadas do mAb 2c, em que a mutação reversa destes aminoácidos potencialmente essenciais é bem sucedida e resulta em seus resíduos murinos correspondentes, foram gerados por PCR de extensão sobreposta (overlap extension PCR) (consultar a tabela 3 abaixo).

Tabela 3 - Variantes humanizadas de mAb 2c com mutações reversas em regiões do arcabouço para sequência do doador murino

Variante humanizada do mAb	Enxerto de 2c CDR	Mutação reversa para sequência do arcabouço do doador 2c murino
	Vl	Vh	VL	VH
h2c-V1	CDR1/2/3	CDR1/2/3	-	-
h2c-V2	CDR1/2/3	CDR1/2/3	-	N76K

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Variante humanizada do mAb	Enxerto de 2c CDR	Mutação reversa para sequência do arcabouço do doador 2c murino
h2c-V3	CDR1/2/3	CDR1/2/3	-	N76K, V79F
h2c-V4	CDR1/2/3	CDR1/2/3	I2V	N76K, V79F

[00109] As variantes humanizadas do anticorpo h2c-V1-4 foram construídas pela clonagem dos genes humanizados de Vh e Vl no vetor de expressão citado acima, construído pelo parceiro de cooperação dos inventores, Dr. Grosse-Hovest (Universitat Tübingen). O anticorpo foi finalmente expresso após a transfecção estável da linhagem de células do mieloma murino Sp2/0. Após a seleção de clones com altas taxas de produção específica, os anticorpos foram produzidos quantitativamente e purificados do sobrenadante da cultura celular para caracterização mais detalhada.

Caracterização do anticorpo quimérico e humanizado IgG1 anti-HSV [00110] A constante de afinidade (Kd) foi determinada igualmente por citometria de fluxo, conforme descrito para o mAb 2c precursor e fragmentos 2c do anticorpo (conforme o Exemplo 1), utilizando células Vero infectadas pelo HSV. Os resultados são mostrados na figura 5. [00111] O anticorpo quimérico ch2c reteve a afinidade do anticorpo precursor mAb 2c. No caso das variantes humanizadas, o enxerto apenas de CDRs, como para a variante h2c-V1, foi suficiente para preservar uma afinidade comparável à do mAb 2c murino. Por conseguinte, não foram necessárias mutações reversas sucessivas adicionais de resíduos da região do arcabouço humana para a sequência murina correspondente para melhorar a integridade estrutural do sítio de ligação a antígeno. A variante h2c-V2 exibe ainda afinidade duas vezes mais baixa em comparação a mAb 2c.

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43/111 [00112] A fim de demonstrar que o mAb 2c quimérico e as variantes humanizadas do anticorpo mAb h2c 1-4 reconhecem o mesmo epitopo que o mAb 2c precursor, estudos de competição foram conduzidos. Células Vero infectadas pelo HSV-1 (3 moi, 20 h) foram incubadas primeiramente por 1 hora com concentrações crescentes do mAb quimérico ch2c ou os mAbs humanizados hu2c V1-V4, respectivamente. Em uma segunda etapa de incubação, 100 nM do mAb 2c precursor foram adicionados, e sua ligação foi detectada por citometria de fluxo utilizando um anticorpo marcado com fluorescência contra os domínios constantes murinos (figura 6).

[00113] O estudo de competição mostra que o sinal de fluorescência representando a ligação do competidor é inversamente proporcional à concentração de anticorpos não marcados aplicados na primeira etapa de incubação. Isso prova que o mAb quimérico e as variantes humanizadas do mAb competem com o mAb 2c pelo mesmo sítio de ligação a antígeno e, portanto, reconhecem o mesmo epitopo.

[00114] A habilidade para neutralização viral do mAb ch2c e das quatro variantes humanizadas h2c foi examinada com preparados purificados dos anticorpos, conforme descrito acima. Os resultados são mostrados na Tabela 4 abaixo. As respectivas concentrações necessárias para neutralização de 50% e completa do HSV de uma quantidade viral definida de 100 TCID50 estão indicadas.

Tabela 4 - Concentrações de anticorpo necessárias para neutralização de 50% e completa de uma quantidade viral definida de 100 TCID50

mAb Concentração necessária [nM] para	2c	ch2c	h2c- V1	h2c- V2	h2c- V3	h2c- V4
Neutralização de 50%	4,3	3,5	3,7	5,1	3,3	3,7

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mAb Concentração necessária [nM] para	2c	ch2c	h2c- V1	h2c- V2	h2c- V3	h2c- V4
Neutralização de 100%	7,8	7,8	7,8	15,6	7,8	7,8

[00115] O mAb quimérico ch2c e todos os mAbs humanizados h2c, com exceção de mAb h2c-V2, neutralizam o HSV com a mesma eficiência que o mAb 2c precursor. A eficiência da neutralização, duas vezes menor, do mAb h2c-V2 correlaciona-se com a afinidade mais baixa desta variante. Para caracterização experimental mais detalhada e avaliação pré-clínica, o mAb h2c-V1 foi escolhido, pois esta variante possui a mesma afinidade e propriedades neutralizantes do vírus que o anticorpo precursor mAb 2c. Adicionalmente, o mAb h2c-V1 não possui, nas regiões do arcabouço, mutações reversas para a sequência doadora murina e, portanto, prevê-se que possua baixo potencial imunogênico em humanos.

[00116] A influência de complemento sobre a atividade de neutralização do mAb humanizado h2c-V1 e do mAb 2c murino foi investigada utilizando o ensaio de redução de placas. Ao contrário de soro contendo globulina hiperimune humana (Cytotect®, Biotest AG), o mAb 2c precursor e a variante humanizada mAb h2c-V1 neutralizam o HSV de modo independente de complemento (Figura 7). Anticorpos neutralizantes independentes de complemento contra gB do HSV-1 foram descritos na literatura neutralizarem 50% da entrada viral com títulos entre 0,8 - 160 pg/mL (Navarro et al, 1992, Virology 186). Os títulos necessários para neutralizar o HSV-1 (F) em 50%, utilizando o ensaio de diluição final do mAb 2c murino, o mAb quimérico ch2c e das variantes humanizadas do mAb, são 3,3 - 5,1 nM, o que corresponde a 0,49 - 0,78 pg/mL (consultar a tabela 4).

[00117] Ensaios de neutralização de isolados clínicos de HSV-1 e

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HSV-2 demonstram as mesmas suscetibilidades à inativação pela variante humanizada h2c-V1 do mAb, quando comparada a cepas de laboratório do HSV-1 e HSV-2. Adicionalmente, o mAb h2c-V1 neutraliza o HSV de isolados de pacientes clinicamente resistentes ao aciclovir (ACV), a ACV e Foscarnet (PFA) ou a ACV, PFA e Cidovir (CDV) com a mesma eficiência que cepas de laboratório não resistentes ou isolados clínicos com resistência desconhecida (figura 8). Por esse motivo, o mAb humanizado h2c-V1 representa um novo potente agente antiviral que supera as limitações impostas por cepas do HSV indutoras de resistência aos fármacos anti-herpéticos convencionais.

[00118] Para disseminar-se em um hospedeiro, o HSV faz uso de dois mecanismos: liberação de partículas livres de células e disseminação direta célula a célula. A disseminação célula a célula do HSV pode conferir vantagens sobre a disseminação livre de células, tal como replicação viral e disseminação mais rápida, além de resistência a elementos da resposta imune humoral. A fim de examinar a disseminação célula a célula pelos anticorpos anti-HSV, células Vero foram semeadas sobre lamínulas de vidro em uma placa de cultura de tecido de vinte e quatro poços, cultivadas para confluência e inoculadas com HSV-1 F a 400 TCID50 por poço por 4 h a 37°C. O inóculo viral foi aspirado, as células Vero foram lavadas duas vezes com PBS e cultivadas adicionalmente por 48 h a 37°C em 1 mL de DMEM contendo FBS 2%, antibióticos e excesso de anticorpos neutralizantes, soro anti-HSV policlonal humano ou sem anticorpos neutralizantes para fins de controle. Depois de 48 h, o meio de cultura foi retirado, as monocamadas de células Vero foram lavadas duas vezes com solução salina com tampão HEPES e fixadas em paraformaldeído 4% em PBS por 15 min à temperatura ambiente. As monocamadas de células foram enxaguadas duas vezes com PBS e

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46/111 incubadas por 15 min em 500 pL de tampão de bloqueio contendo Tween 20 0,05% em solução salina com tampão HEPES. Antígenos virais foram detectados por coloração de monocamadas de células infectadas pelo HSV-1 com soro anti-HSV policlonal de cabra conjugado a FITC (BETHYL, Montgomery, TX, USA), diluído 1:100 em tampão de bloqueio. Monocamadas de células foram lavadas três vezes com PBS e montadas com Mowiol (Calbiochem, San Diego, CA, EUA). Células positives para imunofluorescência foram adquiridas com microscópio confocal DM IRE2 Leica em ampliação de 40 vezes (figura 9).

[00119] Soro anti-HSV policlonal humano (1:20) não possui efeito inibidor sobre a disseminação célula a célula do HSV (figura 9A). O mAb 2c precursor e seu fragmento F(ab)2 inibem completamente a disseminação célula a célula, a uma concentração de 500 nM, e somente células isoladas infectadas pelo HSV são detectáveis (figura 9B e C). O fragmento Fab, que foi aplicado em concentração seis vezes mais alta do mAb 2c precursor, reduz ligeiramente a disseminação célula a célula, em comparação ao soro anti-HSV policlonal humano, mas não consegue inibir completamente a disseminação célula a célula (figura 9D). Como já mostrado no ensaio de neutralização, esses resultados confirmam que a bivalência de anticorpos neutralizantes contribui de modo fundamental para sua habilidade em inibir a disseminação pelo HSV. O mAb quimérico ch2c e o mAb variante humanizado mAb h2c-V1 inibem a disseminação célula a célula pelo HSV a uma concentração de 500 nM tão eficiente quanto o mAb 2c precursor (figura 9E e F). Um ensaio convencional de inibição de placas (Highlander et al., 1988), conduzido adicionalmente, confirmou os resultados obtidos pela avaliação com o microscópio confocal.

[00120] Experimentos iniciais in vivo da proteção contra HSV

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47/111 mostram que uma dose i.v. única de 5 mg/kg do mAb humanizado h2c-V1, do mesmo modo que o mAb 2c precursor, prolonga significativamente a sobrevida de camundongos (NOD/SCID) imunocomprometidos gravemente infectados por HSV-1 F por via intravaginal (figura 10). Camundongos recebendo 15 mg/kg do mAb humanizado h2c-V1 ou do mAb 2c precursor estão completamente protegidos contra encefalite letal (figura 10). Além disso, o mAb humanizado 2c-V1 confere também proteção da disseminação viral e encefalite letal na presença de infecção periférica estabelecida pelo HSV. Camundongos NOD/SCID com alto título de HSV-1 em irrigações vaginais, 24 h depois de desafio viral, foram completamente protegidos do desfecho letal da infecção quando tratados repetidamente em 24 h, 40 h e 56 h por via intravenosa com 15 mg/kg de mAb humanizado 2c-V1 ou mAb 2c (figura 11). Além disso, o anticorpo humanizado mAb 2c-V1 impediu também a ocorrência de encefalite letal em camundongos NOD/SCID com infecção estabelecida por uma cepa multirresistente do HSV. Por outro lado, todos os camundongos que receberam aciclovir morreram (figura 12). Mapeamento de epitopos [00121] Estudos de ligação, utilizando células COS-1 transfectadas com plasmídeos de expressão codificando gB completa gB (31-904) ou gB mutantes com truncagens em C-terminal nas posições 720, 630, 503, 487 e 470, localizaram o epitopo reconhecido pelo mAb 2c murino precursor dentro dos primeiros 487 aminoácidos da gB. Investigações adicionais, utilizando peptídeos sintéticos com 15 aminoácidos (aa) de comprimento, ligados à fase sólida, com sobreposições de 12 aa entre peptídeos em sequência, mostraram que o mAbs 2c correlaciona-se com um epitopo conformacional. O mAb 2c liga-se a três peptídeos consecutivos, representando a sequência da glicoproteína B do aa 175 ao 195 (região A). Adicionalmente, o mAb 2c liga-se fortemente a um

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48/111 peptídeo representando os aminoácidos 298-312 (298SPFYGYREGSHTEHT312) (SEQ ID NO: 17) e liga-se moderadamente ao peptídeo subsequente representando os aminoácidos 301-315. (figura 13A e figura 22). A caracterização de mAb 2c de acordo com sua reatividade em Western blots com gB recombinante (gB(730)t, gentilmente fornecida por Florent Bender, Universidade da Pensilvânia, Filadélfia, EUA), e separado em condições nativas ou desnaturantes de SDS-PAGE, confirma que o mAb 2c reconhece um epitopo descontínuo que é parcialmente resistente à desnaturação ou que se reformou durante as condições de Western blot e é, portanto, denominado epitopo “pseudocontínuo” (Consultar Bender, F et al. J. Virol. 2007, 81 p3872-3841) (figura 13B) [00122] A fim de identificar epitopos em proteína relevante gB do HSV-1 para a atividade neutralizante do vírus do mAb2c, mutantes de HSV-1 resistente a anticorpo monoclonal (mar) com trocas únicas de aminoácidos (aa) em sua glicoproteína foram estudados (tabela 5).

Tabela 5 - Atividade de neutralização e ligação de mAb 2c contra mutantes de HSV-1 resistentes a anticorpo monoclonal (mar)

Mutante mar	Troca de aminoácido na proteína gB do mutante mar ^a	Neutralização %	Ligação
R126(1;2)	Y->N303	0	-
R1375(3)	R->Q304	0	-
B4.1(4)	E->K305	0	-
R1435(3)	H->Y308	100	+++
R233(1)	R->H328	100	+++
(a) numeração de acordo com a glicoproteína	B madura,

incluindo sequência de sinalização (figura 13A) (1) Kousoulas et al., 1984 (2) Pellett et al., 1985 (3) Kousoulas et al., 1988

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49/111 (4) Highlander et al., 1989 [00123] mAb 2c não neutralizou os mutantes mar R126, R1375 e B4.1, mas neutralizou completamente a infectividade dos mutantes R1435 e R233, respectivamente. Além disso, ensaios de imunofluorescência confirmaram que mAb 2c não se liga a células Vero infectadas pelos mutantes mar R126, R1375 e B4.1. Esses resultados indicam que os aminoácidos Y303, R304 e E305 são essenciais para a atividade de neutralização de mAb2c. Um forte sinal de fluorescência foi obtido utilizando células Vero infectadas pelos mutantes mar A R1435 e R233.

[00124] Em especial, o reconhecimento e a ligação de mAb 2c aos aminoácidos 303-305 de gB demonstraram ser essenciais para sua função (neutralização viral, inibição de disseminação célula a célula). Essa região da gB é altamente conservada entre cepas do HSV-1 e do HSV-2, portanto, supõe-se que estes aminoácidos pertençam ao mecanismo de fusão central da gB e que sejam essenciais para a entrada do vírus. Por conseguinte, a ocorrência de mutantes naturais de gB, aos quais o mAb 2c não se liga, provavelmente não está sob alta pressão de seleção.

Exemplo 3

Determinação de afinidade de anticorpos [00125] Monocamadas de células Vero foram infectadas em confluência de 80-90% com HSV-1 ou HSV-2 a MOI 3 e colhidas no dia seguinte por tripsinização, seguida por lavagem em PBS. A ligação à superfície celular de anticorpos 2c foi medida conforme descrito previamente (1). Resumidamente, mAb 2c purificado ou fragmentos derivados do anticorpo 2c-F(ab')2, 2c-Fab e 2c-scFv foram incubados em triplicata as concentrações de 0,03 nM - 500 nM com 5 x 10⁵células Vero em 100 pL de tampão FACS (PBS, FBS 2%, azida sódica 0,1%) por 1 hora à temperatura ambiente. As células foram lavadas

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50/111 duas vezes com 200 pL de tampão FACS e incubadas com IgG de cabra anticamundongo específica para Fab marcada com FITC (15 pg/mL, Jackson ImmunoResearch, Newmarket, Suffolk, Inglaterra) para detecção de mAb 2c, 2c-F(ab')2 e 2c-Fab ligados. scFv ligado foi detectado, primeiramente, por incubação com concentrações saturantes do mAb 9E10 anti-c-myc (10 pg/mL; Roche, Indianapolis, IN, EUA), seguido por duas lavagens e incubação com IgG de cabra anticamundongo marcada com FITC específica para Fcy (15 pg/mL; Jackson ImmunoResearch). As células foram lavadas duas vezes e ressuspensas em tampão FACS. A fluorescência foi medida em FACScalibur (BD Bioscience, San Jose, CA, EUA), e a mediana da intensidade de fluorescência (MFI) foi calculada utilizando o software CellQuest^TM (BD Biosciences). A fluorescência de fundo foi subtraída e as constantes de ligação no equilíbrio foram determinadas utilizando o método de Marquardt e Levenberg para regressão não linear com o GraphPad Prism versão 4.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA). Caracterização de epitopos [00126] A imunorreatividade de mAb 2c com glicoproteína B nativa ou truncada desnaturada, gB(730)t (4), gentilmente fornecida por

Roselyn J. Eisenberg e Gary H. Cohen (Universidade da Pensilvânia, Filadélfia, EUA) foi realizada essencialmente conforme descrita (4): gB(730)t purificada (0,75 pg) foi resolvida em SDS-PAGE 8% SDSPAGE em condições não redutoras (tampão de amostra contendo SDS 0,2%) ou desnaturantes (tampão de amostra contendo SDS 2% SDS e β-Mercaptoetanol 155 mM, 2 min a 95°C) e transferida para membrana de nitrocelulose. Tiras da membrana foram bloqueadas com leite 2% em tampão TNT (Tris.HCl 0,1 M, pH 7,5, NaCl 0,15 M, Tween-20 0,05%) por 1 hora, seguido por incubação com 5 pg/mL de anticorpos mAb 2c específicos contra glicoproteína B, H126 (Novus Biologicals, Littleton, CO, EUA) e H1817 (Novus) em leite 2%/tampão

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TNT por 2 horas à temperatura ambiente. Anticorpos ligados foram detectados com anticorpo policlonal de cabra anticamundongo conjugado à peroxidase de rábano (1:20.000 QED Bioscience Inc. San Diego, CA, EUA) e por quimioluminescência (Thermo Scientific,), utilizando o Analisador de Imagens Luminescentes LAS 3000 (Fujifilm, Tóquio, Japão).

[00127] Células COS-1 foram transfectadas transitoriamente pelo método DEAE-dextrana com plasmídeos codificando gB completa do HSV-1 (31-904, pRB9221) ou mutantes com deleção em C-terminal, truncados nas posições 720 (pTS690), 630 (pPS600), 503 (pRB9510), 487 (pRB9509) e 470 (pRB9508). Os plasmídeos foram gentilmente fornecidos por L. Pereira (52, 55). Ensaios de imunofluorescência com células transfectadas, utilizando mAb2c ou anticorpos de controle, foram conduzidos conforme descritos em outro lugar (53).

Mapeamento de peptídeos [00128] Peptídeos 13méricos e duótopos sobrepostos, ligados à celulose, foram automaticamente preparados de acordo com protocolos padrão de SPOT-Síntese conforme descritos (20, 34) (JPT Peptide Technologies, Berlim, Alemanha). Adicionalmente, peptídeos acoplados com tag (etiqueta) de reatividade e um ligante foram imobilizados por meio de seletividade química sobre uma superfície modificada de vidro em três subarranjos idênticos e purificados pela remoção de sequências truncadas e acetiladas por etapas subsequentes de lavagem. Microarranjos de peptídeos foram bloqueados com TBS contendo tampão de bloqueio (Pierce International) por 2 h e incubados com mAb 2c 10 pg/mL em tampão de bloqueio por 2 horas. Os microarranjos de peptídeos foram lavados com tampão TBS contendo Tween 0,1% (T-TBS), e anticorpo ligado a peptídeos na membrana peptídica foi transferido para uma membrana de PVDF. IgG anticamundongo, marcada com peroxidase (Sigma) ou

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52/111 com fluorescência (Pierce), foi utilizada como anticorpo secundário em concentração final de 1 μg/mL em tampão de bloqueio. Depois de 2 horas de incubação e lavagem final com T-TBS, as membranas de PVDF foram analisadas utilizando substrato de quimioluminescência (Roche Diagnostics). Microarranjos de peptídeos em lâminas de vidro foram lavados abundantemente com T-TBS e tampão SSC 3 mM (JPT Peptide Technologies), secos sob nitrogênio e submetidos à varredura com detector de fluorescência de alta resolução (Axon GenePix 4200 AL). As intensidades do sinal de fluorescência (Unidades de luz, LU) foram analisadas utilizando software de reconhecimento de pontos (GenePix 6.0) e corrigidas para intensidades de fundo de incubações de controle com IgG secundária anticamundongo.

Ensaio de neutralização de vírus.

[00129] A atividade neutralizante de anticorpos foi determinada por ensaio de diluição final conforme descrito previamente (16). Resumidamente, diluições em série de anticorpos foram incubadas com 100 TCID50 de HSV-1 ou de HSV-2 por 1 hora a 37°C em meio de cultura celular. O inóculo viral do anticorpo foi aplicado a monocamadas de células Vero, cultivadas em placas de microtitulação, e o efeito citopático (CPE) foi pontuado depois de 72 h de incubação a 37°C. A concentração do anticorpo, necessária para reduzir o CPE induzido pelo vírus em 100%, foi determinada como o título de neutralização completa. Adicionalmente, a capacidade de neutralização de vírus de fragmentos monovalentes 2c-Fab foi investigada na presença de anticorpos de ligação cruzada, adicionando excesso de IgGs anti-Fab murino (2600 nM, Jackson ImmunoResearch, Newmarket, Suffolk, Inglaterra) à etapa de préincubação. Para fins de controle, vírus sem anticorpo e apenas anticorpo foram utilizados para induzir CPE máximo ou ausência de CPE, respectivamente. Ensaios de neutralização de vírus foram

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53/111 repetidos pelo menos duas vezes com resultados similares.

Ensaio de neutralização pós-adesão.

[00130] Monocamadas de células Vero pré-resfriadas (4°C por 15 min) foram infectadas com 100 TCID50 de HSV-1 F a 4°C por 1 h para permitir a absorção do vírus antes de diluições em série de mAb 2c ou IgG polivalente preparada a partir de plasma humano (Intratect®, Biotest AG, Dreieich, Alemanha) serem adicionadas (neutralização pós-adesão). A fim de comparar a eficácia da neutralização préadesão contra pós-adesão de mAb 2c em condições experimentais idênticas, 100 TCID50 de HSV-1 F foram incubados por 1 hora a 4°C com as mesmas diluições do anticorpo antes de adicionados a monocamadas de células Vero pré-resfriadas. Células Vero inoculadas de ambos os ensaios foram incubadas por mais 1 h a 4°C antes de transferidas para 37°C. Títulos de neutralização foram determinadas depois de 72 h, conforme descrito no ensaio de neutralização acima.

Ensaio de disseminação célula a célula.

[00131] Células Vero cultivadas sobre lamínulas de vidro para confluência foram inoculadas com HSV-1 F a 400 TCID50 por poço em 500 pL por 4 h a 37°C. O inóculo do vírus foi aspirado, as células Vero foram lavadas duas vezes com PBS e cultivadas por mais 48 h a 37°C na presença ou ausência de excesso de anticorpos neutralizantes em 1 mL de meio de crescimento com FBS 2%. Soros humanos agrupados derivados de doadores imunizados com altos títulos de imunoglobulinas anti-HSV-1 foram utilizados como controle a uma diluição de 1:20, as concentrações dos anticorpos bivalentes mAb 2c e 2c-F(ab')2 eram de 500 nM e do 2c-Fab monovalente de 3000 nM. Depois de 48 h, o meio de cultura foi retirado, as monocamadas de células Vero foram lavadas duas vezes com solução salina com tampão HEPES e fixadas com paraformaldeído 4% em PBS por 15 min à temperatura ambiente. A fim de visualizar a disseminação viral,

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54/111 as células foram enxaguadas duas vezes com PBS, incubadas por 15 min em 500 μL de solução salina com tampão HEPES contendo Tween 20 0,05% e coradas com soro de cabra anti-HSV policlonal conjugado a FITC (1:100, BETHYL, Montgomery, TX, EUA). Células coradas, lavadas três vezes com PBS, foram montadas em meio de montagem contendo Mowiol 4-88 0, g/ml (Calbiochem, San Diego, CA, EUA). Imagens por imunofluorescência foram adquiridas com microscópio confocal DM IRE2 Leica em ampliação de 40 vezes. A inibição da disseminação célula a célula foi testada adicionalmente por ensaio de neutralização viral pós-adsorção. Células Vero cultivadas para confluência em placas de seis poços foram incubadas por 4 h a 37°C com 200 TCID50 de HSV-1 F em 3 mL de DMEM contendo FBS 2% e antibióticos. Monocamadas de células foram lavadas duas vezes com PBS e revestidas com meio aquecido para formação de placas (DMEM, agarose 5% (p/v), FBS 10%, antibióticos) contendo excesso de anticorpos neutralizantes ou soros neutralizantes policlonais humanos de HSV-1. A formação de placas foi analisada por microscopia de luz depois de 48 h de incubação a 37°C. Quantificação de DNA.

[00132] Genomas de HSV-1 e HSV-2 foram quantificados por PCR em tempo real (RT). DNA foi purificado a partir de amostras contendo quantidade equivalente de partículas infecciosas de HSV-1 e HSV-2, utilizando o Sistema automático de extração de ácido nucleico MagNA Pure LC System (Roche) de acordo com as instruções do fabricante. O DNA viral foi então quantificado por RT-PCR (Lightcycler, Roche), utilizando o kit de quantificação de RealArt HSV-1 / HSV-2 (Qiagen). Experimentos de proteção de camundongos.

[00133] Fêmeas anestesiadas de camundongos diabéticos não obesos com imunodeficiência grave combinada (NOD-SCID) (NOD.CB17-Prkdc^scid /J, Charles River Laboratories, Research Models

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55/111 and Services, Sulzfeld, Alemanha), 6 a 8 semanas de idade, foram expostas por via intravaginal a 20 μL de inóculo contendo 1x10⁶TCID50 de HSV-1 F por camundongo. Cola de pele (Epiglu, MeyerHaake Medical Innovations, Wehrheim, Alemanha) foi aplicada sobre a vulva para impedir a saída do inóculo viral. O inóculo liberado induziu taxas de infecção > 94%, conforme avaliado por cultura de lavado vaginal. Os camundongos foram examinados diariamente depois da inoculação viral quanto à perda de peso, a ocorrência de vulvite/vaginite (hiperemia, secreção mucopurulenta e sinais de inflamação) e doença neurológica. Camundongos exibindo qualquer um desses sintomas eram sacrificados imediatamente. Os camundongos foram imunizados passivamente por injeção intravenosa (i.v.) de mAb 2c purificado, 24 h antes da inoculação viral, para profilaxia imune, ou 24 h, 40 h e 56 h depois da infecção viral para tratamento terapêutico. Os camundongos foram avaliados quanto à infecção por determinação de títulos do vírus de irrigações vaginais obtidas nos Dias 1, 2, 4, 6 e 8 depois da infecção e quando da morte, utilizando o ensaio de diluição final em células virais. Cargas virais em órgãos (baço, glândula adrenal, pulmão, coração, fígado, rim, medula espinhal e cérebro) de camundongos sacrificados foram determinadas, depois da homogeneização de órgãos, por titulação em monocamadas de células Vero, conforme descrito em outro lugar (41). Cada porção de teste e de controle continha 9-10 animais com infecção detectável pelo HSV-1.

Resultados

Mapeamento e análise do epitopo de gB reconhecido por mAb 2c. [00134] A estrutura em cristal recentemente determinada do ectodomínio de gB do HSV tipo 1 (HSV-1) revelou um trímero de múltiplos domínios com cinco domínios estruturais distintos: domínio I (base), domínio II (meio), domínio III (central), domínio IV (coroa) e

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56/111 domínio V (braço) (24). A fim de caracterizar o epitopo neutralizante de mAb 2c, os inventores testaram sua reatividade com gB recombinante (730t) (4) em análise por Western Blotting em condições redutoras ou não redutoras. Como controles, foram utilizados mAb H1817, reconhecendo um epitopo linear (4) e mAb H126 reconhecendo um epitopo descontínuo (33). Um padrão típico de coloração para epitopo linear foi obtido em análise por Western Blotting com mAb H1817, mostrando detecção de formas monoméricas e triméricas de gB em condições não redutoras, e coloração única predominante de monômero de gB em condições redutoras (figura 13B). Como previsto, mAb H126 somente reagiu com gB em condições nativas. Surpreendentemente, o reconhecimento exclusivamente da banda superior da proteína gB > 170 kDa sugere que o mAb H126 é específico para trímero (figura 13B). O mAb 2c reagiu com gB nativa e desnaturada, contudo, a reatividade em condições desnaturantes foi muito mais fraca, quando comparado com o mAb H1817 (figura 13B). A fraca reatividade com monômeros de gB em condições desnaturantes foi previamente relatada para um conjunto de outros anticorpos neutralizantes que se ligam a epitopos descontínuos que parecem ser resistentes à desnaturação ou que se redobram durante eletroforese SDS-PAGE e, portanto, denominados epitopos “pseudocontínuos” (4).

[00135] A fim de identificar o epitopo específico envolvido na ligação de mAb 2c, foram utilizados peptídeos derivados de gB exibidos em microarranjos peptídicos. Primeiramente, a sequência de gB exibindo os aminoácidos 31 ao 505 foi preparada por Spot-Síntese em forma de peptídeos 13méricos sobrepostos ligados com extremidades de aminoácidos terminais acetilados a uma membrana contínua de celulose com compensação de 3 aminoácidos. Para evitar o desvio do equilíbrio de ligação para o anticorpo não complexado,

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57/111 peptídeos do mAb 2c, obtidos por varredura, foram imobilizados em uma membrana de PVDF antes da detecção por quimioluminescência. Como mostrado na representação esquemática da gB completa com os domínios funcionais indicados (figura 14A), a reatividade do mAb 2c restringiu-se a peptídeos abrangendo duas regiões separadas dentro do domínio I, três peptídeos consecutivos compreendendo os resíduos 175 ao 193 (região de ligação A) e dois peptídeos sobrepondo-se, compreendendo os resíduos 295 ao 310 (região de ligação B). A fim de validar as duas regiões identificadas de ligação, foi utilizado um conjunto adicional de peptídeos 13méricos purificados, imobilizados em lâminas de vidro por intermédio de um ligante flexível. Comparado à tela de celulose, a leitura deste microarranjo, submetido à varredura por fluorescência, confirmou as mesmas regiões de ligação de epitopos (figura 14B). Graças à aplicação de peptídeos purificados e de um sistema de varredura de microarranjos de alta resolução, peptídeos consecutivos adicionais em ambos os sítios de ligação foram reconhecidos por mAb2c neste microarranjo de peptídeos (figura 14B).

[00136] Os inventores mapearam os sítios de ligação identificados para mAb 2c contra a estrutura resolvida da gB (24). Curiosamente, o peptídeo 172QVWFGHRYSQFMG184 (SEQ ID NO: 18), mostrando a reatividade mais forte com mAb 2c sobreposto com uma das duas supostas alças de fusão (alças de fusão 173VWFGHRY179) (SEQ ID NO: 19), situado em um subdomínio em curva do domínio I (22) (figura 15). Contudo, a localização do sítio de ligação A na base do trímero de gB, faz com que este seja inacessível ao mAb 2c na estrutura disponível de gB, mais possivelmente representando a conformação pós-fusão (24). Resíduos do sítio de ligação B são expostos e situados na parte superior do domínio I (figura 15).

[00137] A fim de avaliar mais detalhadamente o epitopo dependente

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58/111 de conformação do mAb 2c, sequências de consenso das duas regiões de ligação foram unidas em várias combinações como duótopos, quer diretamente ou separadas por um ou dois espaçadores β-alanina (figura 16). Foi recentemente mostrado que inserções de ligantes em grande proximidade à alça de fusão 1 depois do resíduo E187 resultam em mutantes de gB com deficiência de fusão (40,61), apesar da gB dobrar-se em conformação pós-fusão (61). Por conseguinte, os inventores incluíram o motivo 186FED188 da região de ligação A, adicionalmente ao motivo de consenso 179YSQFMG184 (SEQ ID NO: 20) da região de ligação A, em duas varreduras separadas de duótopos. Quando comparada ao peptídeo 172QVWFGHRYSQFMG184 (SEQ ID NO: 18), exibindo a reatividade de ligação mais forte com mAb 2c nas varreduras de peptídeos 13méricos (Figura 16), a combinação dos dois motivos do sítio de ligação A com o peptídeo de consenso 300FYGYRE305 (SEQ ID NO: 21) do sítio de ligação B resultou em dois duótopos com intensidades incrementadas do sinal (figura 16, conjuntos de duótopos I e II). Enquanto que a força de ligação de mAb 2c ao duótopo 179YSQFMG184-I.3A-300FYGYRE305 (SEQ ID NO: 22) foi apenas ligeiramente aumentada, uma quase saturação da intensidade de sinal fluorescente foi obtida com o duótopo 186FED188-3A-3A-300FYGYRE305 (SEQ ID NO: 23).

[00138] Por conseguinte, os resultados obtidos dos microarranjos peptídicos correspondem aos resultados do Western Blotting e demonstram que mAb 2c reconhece um epitopo dependente da conformação. Para impedir a fusão do envelope do vírion com a membrana celular, o mAb 2c deve ligar-se à conformação pré-fusão de gB. Contudo, o epitopo neutralizante de mAb 2c mapeia correlacionase apenas em parte à superfície da conformação de gB presente na estrutura em cristal disponível de gB (24) e indica que gB poderia adotar conformações distintas durante a entrada.

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Caracterização de anticorpos bivalentes e monovalentes derivados de mAb 2c.

[00139] Anticorpos monoclonais têm sido utilizados por diversos investigadores para identificar regiões em gB essenciais para sua função na entrada do vírus (4, 25, 39, 52). Foi sugerido que anticorpos neutralizantes, que foram mapeados quanto à região funcional única na base do trímero de gB compreendendo resíduos da extremidade Cterminal do domínio V e resíduos do domínio I de um promotor próximo, interferem com a atividade fusogênica de gB (4). Os inventores, por conseguinte, sugeriram a hipótese de que a ligação de anticorpo monovalente ao epitopo do mAb 2c dentro do domínio I próximo ao C terminal do domínio V deve bloquear suficientemente alterações conformacionais cooperativas quando da ativação de gB. Em vista de mAb 2c neutralizar o HSV-1 sem complemento in vitro (16), os inventores geraram fragmentos convencionais F(ab')2 e Fab e um fragmento variável recombinante de cadeia única (scFv) como ferramentas de valor para estudar a hipótese do mecanismo mediado por mAb 2c. A homogeneidade dos preparados de anticorpos gerados foi monitorada por cromatografia de exclusão por tamanho (dados não mostrados).

[00140] A análise por citometria de fluxo, utilizando células Vero infectadas ou não com HSV-1 ou HSV-2, respectivamente, demonstrou ligação específica de mAb 2c e de fragmentos de anticorpo derivados de mAb 2c (dados não mostrados). Os inventores utilizaram ainda citometria por fluorescência para determinar curvas de ligação no equilíbrio dos anticorpos a células Vero infectadas pelo HSV-1 e HSV-2 (figura 17). Os resultados destes estudos demonstraram afinidades aparentes mais altas para a IgG completa e o F(ab')2 do que para o Fab e o scFv, respectivamente (tabela 6). O incremento em afinidade funcional (avidez) para os anticorpos

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60/111 bivalentes, em relação às afinidades determinadas dos anticorpos monovalentes, indica que os anticorpos bivalentes eram capazes de ligarem dois epitopos de gB sobre a superfície celular simultaneamente. mAb 2c e 2c-F(ab')2 bivalentes mostraram afinidade aparente 1,7 - 2,8 vezes mais alta, quando comparados a seus homólogos monovalentes. O ligeiro incremento na KD aparente do fragmento F(ab')2 contra a IgG poderia dever-se à flexibilidade mais alta dos sítios de ligação a antígenos dentro do construto F(ab% As afinidades aparentes similares de mAb 2c, 2c-F(ab')2 e 2c-Fab para células Vero infectadas pelo HSV-1 e pelo HSV-2 confirmaram que o epitopo reconhecido de gB não difere estruturalmente entre os dois vírus (tabela 6).

Tabela 6 - Constantes aparentes no equilíbrio de mAb 2c e de fragmentos derivados do anticorpo para ligação a células Vero infectadas pelo HSV-1 F ou HSV-2 G

	IgG	F(ab')2	Fab	scFv
^aKD (nM)		bivalente		monovalente
HSV-1 F	10,2	6,9	17,3	19,2
HSV-2 G	10,7	8,8	17,7	n.d.

[00141] Os valores de ^aKD para ligação a gB em células infectadas por HSV foram determinados ajustando os dados das curvas de ligação no equilíbrio por citometria de fluxo (figura 17) à equação de Marquardt-Levenberg.

Atividade de neutralização de anticorpos monovalentes e bivalentes in vitro.

[00142] A eficácia igual de neutralização de mAb 2c, independentemente se o anticorpo fosse adicionado antes (préadesão) ou após (pós-adesão) de vírions do HSV-1 interagirem com células Vero (figura 18A), indicou que mAb 2c não interfere com a ligação do vírus a células alvo. Por outro lado, a gama globulina

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61/111 policlonal humana Intratect® neutralizou claramente por inibição da adesão de vírions a células alvo (figura 18B). As atividades neutralizantes de fragmentos derivados de mAb 2c F(ab')2, Fab e scFv foram comparados com seu homólogo IgG precursor em ensaio padrão de neutralização em células Vero. O mAb 2c precursor reduziu o efeito citopático (CPE) induzido por HSV-1 em 100% a uma concentração de 8 nM. Curiosamente, uma concentração 4 vezes mais alta de mAb 2c foi necessária para reduzir CPE induzido por HSV-2 (figura 19A). O 2c-F(ab')2 bivalente reduziu o CPE induzido por HSV-1 e por HSV-2 duas vezes mais eficientemente do que o mAb 2c precursor. Surpreendentemente, os inventores observaram uma diferença fundamental na habilidade dos fragmentos monovalentes 2c do anticorpo para neutralizar HSV-1 e HSV-2. Quando comparado ao mAb 2 c precursor, concentrações aproximadamente 375 vezes e 94 vezes mais altas de 2c-Fab foram necessárias para reduzir o CPE induzido por HSV-1 e HSV-2 em 100%, respectivamente (figura 19A). O 2c-scFv recombinante mostrou efeito redutor de placas sob o microscópio de luz, mas não foi capaz de reduzir o CPE induzido pelo HSV em 100% mesmo na concentração mais alta testada de 3.000 nM (dados não mostrados).

[00143] Em vista de anticorpos bivalentes, mAb 2c e 2c-F(ab% neutralizarem o HSV-2 em torno de quatro vezes menos eficientemente do que o HSV-1 (figura 19A), os inventores analisaram os números de cópias de genoma de preparados de HSV-1 e HSV-2 contendo quantidades iguais de partículas infecciosas por PCR quantitativa em tempo real. Quando comparado ao HSV-1, um número quatro vezes mais alto de equivalentes de genoma foi encontrado para o HSV-2 (dados não mostrados), correlacionando-se bem com o título mais alto de anticorpo de mAb 2c e 2c-F(ab')2, necessário para neutralização de HSV-2.

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62/111 [00144] Ensaios de neutralização como mostrados na figura 19A indicaram forte correlação entre valência de anticorpo e eficiência de neutralização. Consequentemente, os inventores investigaram se a habilidade de fragmentos 2c-Fab para eliminar infecção pelo vírus poderia ser restaurada por ligação cruzada dos fragmentos Fab. O ensaio de neutralização de vírus foi repetida para 2c-Fab na ausência ou presença de IgGs reagindo com fragmentos Fab murinos. Como mostrado na figura 19B, a ligação cruzada de 2c-Fab aumentou drasticamente a atividade neutralizante, mas não pôde restaurá-la para a mesma eficácia que a do mAb 2c precursor. IgGs anti-Fab murinos apenas não mostraram efeito sobre a neutralização de vírus (dados não mostrados).

Inibição da disseminação célula a célula [00145] Embora fragmentos 2c-Fab não neutralizem eficientemente vírions livres, não obstante foi relatado que fragmentos de anticorpo de pequeno tamanho possuem propriedades mais favoráveis de difusão (66), portanto, os inventores investigaram a atividade destes fragmentos no sentido de impedir que HSV-1 atravesse junções celulares de células infectadas para não infectadas. Os dois anticorpos bivalentes, mAb 2c e 2c-F(ab')2, anularam completamente a disseminação de HSV-1 em monocamadas de células Vero, e somente células infectadas isoladas puderam ser visualizadas por imunofluorescência indireta (figura 9). Apesar de ser capaz de neutralizar vírions livres, o soro policlonal humano falhou completamente em inibir a disseminação viral célula a célula. Esse resultado mais possivelmente decorre da população heterogênea de anticorpos neutralizantes direcionados contra inúmeros epitopo do HSV. Quando comparado a soro imune policlonal humano, o fragmento monovalente 2c-Fab foi capaz de controlar a disseminação célula a célula em alguma medida. Contudo, ao contrário de seus

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63/111 homólogos bivalentes, o fragmento monovalente 2c-Fab não foi capaz de anular completamente a disseminação viral, mesmo quando testado a uma concentração 6 vezes mais alta (figura 9). Portanto, a valência do anticorpo desempenha também uma importante função em inibir a disseminação de HSV-1 entre células adjacentes.

Imunoproteção de camundongos imunodeficientes contra infecção disseminada pelo HSV.

[00146] Os inventores mostraram previamente que camundongos com depleção de células T CD4+ e CD8+ T ficavam totalmente protegidos da encefalite letal pela transferência passiva de mAb 2c após infecção por via intravaginal pelo HSV-1 (17). Células natural killer (NK) acumulando-se no sítio da infecção pelo HSV-2 em humanos (28) representam a fonte inicial de interferon-γ (45), o com importante participação no controle da infecção pelo HSV (2, 45, 62). Mais recente, foi demonstrado pela primeira vez que células NK humanas fazem a mediação da proteção contra infecção genital primária pelo HSV em camundongos humanizados como resposta imune inata (37). A fim de investigar se mAb 2c confere atividade antiviral independentemente de resposta imune mediada por anticorpo, os inventores empregaram um modelo de camundongos NOD/SCID, os quais, além de deficiência SCID de células B e T, eram desprovidos de células NK e função de macrófagos e da capacidade para estimular a via do complemento. A infecção intravaginal pelo HSV-1 (1 x 10⁶TCID50) de camundongos NOD/SCID resultou em doença sistêmica rápida progressiva com mediana do tempo de sobrevida de 9 dias. Os títulos de HSV em órgãos foram determinados por ensaio de diluição final, mostrando altos títulos virais na medula espinhal (2,3 x 10⁶TCID50), no cérebro (3,8 x 10⁵ TCID50) em mucosa vaginal (1,4 x 10⁶TCID50), títulos moderados no rim (1,7 x 10⁴ TCID50) e nas glândulas adrenais (1,1 x 10⁴ TCID50) e baixos títulos no pulmão (1,1 x 10³

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TCIDõü) e no coração (1,9 x 102 TCID50) (dados não mostrados). A fim de avaliar a eficiência terapêutica de mAb 2c, camundongos NOD/SCID foram tratados por via intravenosa com 2,5 mg/kg, 5 mg/kg ou 15 mg/kg de anticorpo 24 horas antes da exposição intravaginal ao HSV-1 (figura 20). Camundongos recebendo as baixas doses do anticorpo não foram integralmente protegidos contra infecção letal pelo HSV-1. A mediana dos tempos de sobrevida de camundongos tratados com 5 mg/kg de mAb 2c, contudo, foi prolongada 2,6 vezes, quando comparada a de camundongos recebendo PBS. Os títulos de HSV-1 nos órgãos investigados de camundongos não protegidos contra encefalite letal foram comparáveis a da porção de controle sem tratamento. Por outro lado, a proteção total de animais foi conseguida a uma dose de 15 mg/kg de mAb 2c. Os títulos virais em órgãos de camundongos protegidos pelo anticorpo foram abaixo do limite de detecção de 1 x 102 TCID5ü.

[00147] Os inventores avaliaram em seguida se a imunização com mAb 2c após a exposição confere também proteção da disseminação viral e da encefalite letal na presença de infecção periférica estabelecida pelo HSV. Camundongos NOD/SCID com alto título de HSV-1 em irrigações vaginais em 24 horas após o desafio viral foram tratados repetidamente em 24 h, 40 h e 56 h por via intravenosa com 15 mg/kg de mAb 2c (figura 11 e figura 21). A porção de controle tratada com PBS mostrou disseminação constante do vírus pela vagina até que camundongos com sintomas neurológicos tiveram que ser sacrificados entre o dia 7 e o dia 9. Por outro lado, mAb 2c eliminou a infecção estabelecida pelo HSV-1 no dia 8 e impediu completamente o resultado letal da infecção (3x 300 pg; P = 0,0003, em comparação com PBS). Além disso, não foram detectados vírions em neurônios sensitivos e órgãos respectivos de animais tratados com mAb 2c um mês após a infecção (dados não mostrados).

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Discussão [00148] Após as etapas que vírus seguem para penetrarem em células alvo, mAbs neutralizantes de vírus podem inibir a entrada por diversos mecanismos. A interação específica de proteínas da superfície viral com proteínas, lipídios ou carboidratos celulares representa o estágio inicial de infecção, o qual pode ser bloqueado por anticorpos neutralizantes. Anticorpos que inibem a adesão do vírus, quer ligando-se diretamente ao sítio de ligação do receptor de vírions, tal como mAb F105 que reage com o sítio de ligação a CD4 de gp 120 do HIV-1 e Fab HC19 que cobre o sítio de ligação ao receptor da hemaglutinina (HA) do vírus Influenza (6, 19, 54), ou que interfere estericamente com o envolvimento do receptor, tal como Fab HC45 que se liga em proximidade de 17Â ao sítio de ligação do receptor de HA (18). Além da ligação essencial de gD do HSV gD a um de seus receptores celulares, gB participa na adesão de vírions a células alvo. Recentemente, a existência de dois receptores verdadeiros da superfície celular independentes do proteoglicano de heparan sulfato e/ou fatores de adesão para gB do HSV foram descritos (5, 23, 60). O receptor tipo 2 similar à imunoglobulina pareada (PILRa) foi caracterizado como um possível receptor proteico da gB pelo menos em certos tipos de células (60). Para pré versus pós-adesão comparativos de mAb 2c, ensaios de neutralização mostraram que o anticorpo pode não inibir a ligação do vírus à superfície celular, mas bloqueia a entrada viral. Foi demonstrado previamente que a interação de gB com membranas lipídicas, por intermédio de resíduos-chave hidrofóbicos e hidrófilos de seu domínio de fusão (22, 23), consegue ser bloqueada por mAbs que reconhecem epitopo em grande proximidade às alças de fusão (4, 22). Tendo em vista que o epitopo conformacional de mAb 2c se sobrepõe parcialmente à alça de fusão 1, os inventores consideraram logicamente que a ligação de mAb 2c

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66/111 interfere mais possivelmente com a transmissão do sinal fusogênico no estágio pós-ligação/pré-fusão como possível modo de ação.

[00149] O rearranjo estrutural desencadeado é uma característica fundamental de glicoproteínas fusogênicas virais, resultando em conformações distintas pré e pós-fusão. Epitopos de diferentes mAbs neutralizantes foram mapeados juntamente com os domínios laterais dos picos e da ponta da coroa da estrutura em cristal da gB (4, 24). O epitopo de mAb 2c correlaciona-se com uma região funcional única (FR1) na base do trímero de gB, consistindo em resíduos dentro da hélice aF no C-terminal do domínio V e resíduos dentro do domínio I de um promotor próximo (4). O modelo de homologia dos inventores mostra que uma parte do epitopo descontínuo (F300 a E305) reconhecido por mAb 2c situa-se na seção superior do domínio I da gB, o qual possui características de domínio de homologia à plekstrina (PH) (7, 38). A outra parte do epitopo (F175 a A190) situada também no domínio I, estando, contudo, enterrada e seria inacessível à ligação do mAb 2c a menos que a gB sofra uma mudança importante em sua conformação. Os inventores, por conseguinte, sugeriram a hipótese de que o mAb 2c impede a transição da gB, de preferência, na conformação pré-fusão. Com base na localização do epitopo de mAb 2c e na suposição de que alterações na conformação quando da ativação sejam cooperativas, os inventores argumentaram que a interação monovalente de mAb 2c não seria suficiente para bloquear a justaposição do domínio fusogênico de gB e a membrana celular. Surpreendentemente, contudo, nenhum dos fragmentos monovalentes gerados do anticorpo (Fab e scFv) foi capaz de neutralizar eficientemente vírions livres ou de inibir a disseminação viral célula a célula. Por outro lado, as duas moléculas bivalentes, mAb 2c e 2cF(ab')2, foram altamente eficazes para neutralização do vírus e inibição da disseminação célula a célula. A retenção de atividade específica e

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67/111 comparável de ligação de todos os anticorpos derivados de mAb 2c neste estudo exclui diferenças funcionais de anticorpos monovalentes e bivalentes decorrentes do reconhecimento comprometido de antígenos. A ligação multivalente de imunoglobulinas aumenta sua afinidade funcional (26). O ganho em afinidade funcional, no entanto, correlaciona-se inversamente com a afinidade intrínseca do sítio de ligação do anticorpo (49). O único incremento em constantes no equilíbrio entre 1,7 e 2,8 para os anticorpos 2c bivalentes, IgG e F(ab')2, quando comparados a seus homólogos monovalentes, scFv e Fab, é, portanto, incomum para anticorpos com afinidades intrínsecas no baixo intervalo nanomolar. Por conseguinte, a finidade aparente mais alta de fato indica que a ligação multivalente (avidez mais alta) ao antígeno de gB não ocorre e sugere que a atividade antiviral do mAb 2c e do 2c-F(ab')2 é uma consequência de ligação cruzada de gB. A eficiência inferior de neutralização de anticorpos monovalentes contra bi ou multivalentes com especificidade para o antígeno de gH do vírus Varicella-Zoster (VZV) foi discutida como matéria de obstáculo estérico resultante dos diferentes tamanhos destes anticorpos (15). Embora os inventores não possam excluir completamente essa possibilidade como mecanismo adicional potencial de neutralização para as variantes de mAb 2c, isso parece improvável por não ter sido observada uma correlação direta entre tamanho de anticorpo, eficácia de neutralização e inibição de disseminação célula a célula. Ademais, os dados dos inventores mostram que o 2c-F(ab')2 de menor tamanho apresentou atividade de neutralização do vírus ainda melhor do que a 2c-IgG de maior tamanho. Por conseguinte, as presentes observações indicam que a ligação cruzada de gB é o mecanismo fundamental para a atividade antiviral de mAb 2c e sugerem que a estabilização da conformação pré-fusão de gB através da imobilização de trímero de gB inibe a ativação do sinal fusogênico. Um estudo mais recente por

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Silverman et al. (61) propôs que um fenótipo deficiente de fusão do ectodomínio de gB do HSV-1 gB, quando da inserção de cinco aminoácidos depois do resíduo E187 próximo da alça de fusão 1, pode não resultar da interferência com alterações conformacionais de gB, mas antes da interferência com outras funções do mecanismo de gB. Duótopos de mAb 2c, em varreduras pelos inventores, reagiram mais forte com o duótopo do sítio de ligação A/B i86FEDi88-3A-3A300FYGYRE305 (SEQ ID NO: 23), abrangendo o sítio de inserção específico E187, o que parece ser crítico para a função de gB. É, portanto, tentador especular que a reticulação cruzada de mAb 2c compromete a habilidade de gB para interagir com os outros componentes do mecanismo de fusão do HSV. Contudo, é necessária pesquisa futura, uma vez que os resultados obtidos pelos inventores não permitem distinguir se a ligação cruzada bloqueia sozinho a alteração conformacional de gB ou se bloqueia a interação entre gB, gD e gH/gL, o que ocorre durante a fusão celular (3) e é essencial para concluir o processo de fusão (65). A conformação observada de gB do HSV-1 gB nos cristais resolvidos (24) sugere representar a forma pósfusão, e um modelo pré-fusão de gB não foi ainda caracterizado. Por conseguinte, estudos cristolagráficos por raios X de mAb 2c ou seu F(ab')2 em complexo com gB poderiam oferecer informações sobre a conformação nativa de gB e melhor entendimento sobre a transmissão do sinal fusogênico.

[00150] Estudos avaliando a eficácia protetora de anticorpos antigD e anti-gB aplicados topicamente para prevenir a transmissão vaginal de infecção pelo HSV-2 em camundongos demonstraram a viabilidade de anticorpos construídos por recombinação como novos microbicidas vaginais (67-69). Infecções graves e mesmo de risco à vida pelo HSV podem ocorrer em recém-nascidos infectados por transmissão materna, em pacientes com infecções oculares

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69/111 recorrentes ou em pacientes gravemente imunocomprometidos. A fim de investigar se a aplicação sistêmica do anticorpo anti-gB da presente invenção confere proteção também em cenário altamente imunodeficiente in vivo, foi empregado um modelo de camundongos NOD/SCID. A inoculação intravaginal de HSV-1 foi utilizada como via estabelecida de infecção ganglionar com disseminação axônica do vírus causando paralisia das patas traseiras e encefalite herpética fatal em camundongos imunocompetentes, bem como naqueles com depleção de células T (16, 17). Na presente invenção, é demonstrado que mAb 2c não só protege totalmente camundongos NOD/SCID na fase aguda da infecção primária pelo HSV-1, mas que também é eficaz em prevenir completamente a doença neurológica e morte, mesmo depois que disseminação do vírus tenha iniciado. A disseminação célula a célula do HSV é uma maneira muito eficiente de transferência viral através de sinapses neuronais e junções oclusivas, bem como para desviar-se de barreiras do sistema imune adaptivo. MAb 2c diminui a expressão do vírus de tecidos vaginais infectados e inibe a disseminação axônica do HSV. Outros relatos mostraram que a administração de IgGs anti-HSV após desafio viral consegue reduzir a quantidade de infecções ganglionares agudas em animais (16, 42). De modo coerente, IgG anti-gd humana recombinante administrada por via intraperitoneal a camundongos com infecção na córnea por HSV-1 demonstrou localizar fibras nervosas e neurônios sensitivos infectados pelo HSV (59). Além disso, a imunização passiva de animais imunocompetentes com mAbs específicos para gD, gC ou gB de HSV, administrados após a exposição em momentos apropriados, demonstrou proteção contra a doença neurológica induzida pelo HSV (13, 16). Contudo, foi concluído também a partir de diversos estudos animais que apenas a imunidade humoral é ineficaz no controle de infecções pelo HSV.

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A potência protetora in vivo do anticorpo de acordo com a presente invenção independe de funções imunes efetoras.

[00151] Foi concluído também a partir de diversos estudos animais na literatura que apenas a imunidade humoral é ineficaz no controle de infecções pelo HSV. De modo coerente com essa visão, foi relatado que a administração de soro hiperimune anti-HSV-1 é ineficaz para proteger camundongos imunossuprimidos ou imunodeficientes (47, 48, 50, 51, 56). O tratamento sistêmico de camundongos atímicos nude, 24 horas após a infecção pelo HSV-1, com um mAb humano anti-gD prolongou a sobrevida, quando comparados a controles sem tratamento, mas não impediu a morte (58). Outro estudo mostrou, em um modelo de ceratite estromal induzida pelo HSV-1 em camundongos, que um mAb anti-gD impediu a morte de camundongos com depleção de células T CD4⁺ ou CD8⁺, mas não impediu a morte quando camundongos com depleção simultânea dos dois subconjuntos de células T (64).

[00152] De acordo com as informações à sua disposição, os presentes inventores demonstraram pela primeira vez a eficácia protetora de um mAb anti-gB de ligação cruzada que impede a disseminação neuronal do HSV-1, completamente independente de mecanismos celulares efetores e do complemento. A especificidade do mAb 2c por um epitopo de tipo comum de gB, o qual é essencial para a replicação do HSV, e sua alta eficiência protetora sem exigir o recrutamento de funções imunes efetoras adicionais indica grande potencial para este anticorpo como novo agente imunoterapêutico. Listagem de referências

1. Arndt, M. A., J. Krauss, R. Schwarzenbacher, B. K. Vu, S. Greene, and S. M. Rybak. 2003. Generation of a highly stable, internalizing anti-CD22 single-chain Fv fragment for targeting nonHodgkin's lymphoma. Int J Cancer 107:822-829.

Petição 870200022455, de 14/02/2020, pág. 75/123

71/111

2. Ashkar, A. A., and K. L. Rosenthal. 2003. Interleukin-15 and natural killer and NKT cells play a critical role in innate protection against genital herpes simplex virus type 2 infection. J Virol 77:1016810171.

3. Atanasiu, D., J. C. Whitbeck, T. M. Cairns, B. Reilly, G. H. Cohen, and R. J. Eisenberg. 2007. Bimolecular complementation reveals that glycoproteins gB and gH/gL of herpes simplex virus interact with each other during cell fusion. Proc Natl Acad Sci U S A 104:18718-18723.

4. Bender, F. C., M. Samanta, E. E. Heldwein, M. P. de Leon, E. Bilman, H. Lou, J. C. Whitbeck, R. J. Eisenberg, and G. H. Cohen. 2007. Antigenic and mutational analyses of herpes simplex virus glycoprotein B reveal four functional regions. J Virol 81:38273841.

5. Bender, F. C., J. C. Whitbeck, H. Lou, G. H. Cohen, and R. J. Eisenberg. 2005. Herpes simplex virus glycoprotein B binds to cell surfaces independently of heparan sulfate and blocks virus entry. J Virol 79:11588-11597.

6. Bizebard, T., B. Gigant, P. Rigolet, B. Rasmussen, O. Diat, P. Bosecke, S. A. Wharton, J. J. Skehel, and M. Knossow. 1995. Structure of influenza virus haemagglutinin complexed with a neutralizing antibody. Nature 376:92-94.

7. Blomberg, N., E. Baraldi, M. Nilges, and M. Saraste. 1999. The PH superfold: a structural scaffold for multiple functions. Trends Biochem Sci 24:441-445.

8. Brown, Z. A., J. Benedetti, R. Ashley, S. Burchett, S. Selke, S. Berry, L. A. Vontver, and L. Corey. 1991. Neonatal herpes simplex virus infection in relation to asymptomatic maternal infection at the time of labor. N Engl J Med 324:1247-1252.

9. Burbelo, P. D., Y. Hoshino, H. Leahy, T. Krogmann, R. L.

Petição 870200022455, de 14/02/2020, pág. 76/123

72/111

Hornung, M. J. ladarola, and J. I. Cohen. 2009. Serological diagnosis of human herpes simplex virus type 1 and 2 infections by luciferase immunoprecipitation system assay. Clin Vaccine Immunol 16:366-371.

10. Carter, C., S. Savic, J. Cole, and P. Wood. 2007. Natural killer cell receptor expression in patients with severe and recurrent Herpes simplex virus-1 (HSV-1) infections. Cell Immunol 246:65-74.

11. Cook, M. L., and J. G. Stevens. 1973. Pathogenesis of herpetic neuritis and ganglionitis in mice: evidence for intra-axonal transport of infection. Infect Immun 7:272-288.

12. Cunningham, A. L., R. R. Turner, A. C. Miller, M. F. Para, and T. C. Merigan. 1985. Evolution of recurrent herpes simplex lesions. An immunohistologic study. J Clin Invest 75:226-233.

13. Dix, R. D., L. Pereira, and J. R. Baringer. 1981. Use of monoclonal antibody directed against herpes simplex virus glycoproteins to protect mice against acute virus-induced neurological disease. Infect Immun 34:192-199.

14. Donaghy, H., L. Bosnjak, A. N. Harman, V. Marsden, S. K. Tyring, T. C. Meng, and A. L. Cunningham. 2009. Role for plasmacytoid dendritic cells in the immune control of recurrent human herpes simplex virus infection. J Virol 83:1952-1961.

15. Drew, P. D., M. T. Moss, T. J. Pasieka, C. Grose, W. J. Harris, and A. J. Porter. 2001. Multimeric humanized varicella-zoster virus antibody fragments to gH neutralize virus while monomeric fragments do not. J Gen Virol 82:1959-1963.

16. Eis-Hubinger, A. M., K. Mohr, and K. E. Schneweis.

1991. Different mechanisms of protection by monoclonal and polyclonal antibodies during the course of herpes simplex virus infection. Intervirology 32:351-360.

17. Eis-Hubinger, A. M., D. S. Schmidt, and K. E.

Petição 870200022455, de 14/02/2020, pág. 77/123

73/111

Schneweis. 1993. Anti-glycoprotein B monoclonal antibody protects T cell-depleted mice against herpes simplex virus infection by inhibition of virus replication at the inoculated mucous membranes. J Gen Virol 74 ( Pt 3):379-385.

18. Fleury, D., B. Barrere, T. Bizebard, R. S. Daniels, J. J. Skehel, and M. Knossow. 1999. A complex of influenza hemagglutinin with a neutralizing antibody that binds outside the virus receptor binding site. Nat Struct Biol 6:530-534.

19. Fleury, D., S. A. Wharton, J. J. Skehel, M. Knossow, and T. Bizebard. 1998. Antigen distortion allows influenza virus to escape neutralization. Nat Struct Biol 5:119-123.

20. Frank, R., and H. Overwin. 1996. SPOT synthesis. Epitope analysis with arrays of synthetic peptides prepared on cellulose membranes. Methods Mol Biol 66:149-169.

21. Grubor-Bauk, B., A. Simmons, G. Mayrhofer, and P. G. Speck. 2003. Impaired clearance of herpes simplex virus type 1 from mice lacking CD1d or NKT cells expressing the semivariant V alpha 14-J alpha 281 TCR. J Immunol 170:1430-1434.

22. Hannah, B. P., T. M. Cairns, F. C. Bender, J. C. Whitbeck, H. Lou, R. J. Eisenberg, and G. H. Cohen. 2009. Herpes simplex virus glycoprotein B associates with target membranes via its fusion loops. J Virol 83:6825-6836.

23. Hannah, B. P., E. E. Heldwein, F. C. Bender, G. H. Cohen, and R. J. Eisenberg. 2007. Mutational evidence of internal fusion loops in herpes simplex virus glycoprotein B. J Virol 81:48584865.

24. Heldwein, E. E., H. Lou, F. C. Bender, G. H. Cohen, R.

J. Eisenberg, and S. C. Harrison. 2006. Crystal structure of glycoprotein B from herpes simplex virus 1. Science 313:217-220.

25. Highlander, S. L., W. H. Cai, S. Person, M. Levine, and

Petição 870200022455, de 14/02/2020, pág. 78/123

74/111

J. C. Glorioso. 1988. Monoclonal antibodies define a domain on herpes simplex virus glycoprotein B involved in virus penetration. J Virol 62:1881-1888.

26. Kaufman, E. N., and R. K. Jain. 1992. Effect of bivalent interaction upon apparent antibody affinity: experimental confirmation of theory using fluorescence photobleaching and implications for antibody binding assays. Cancer Res 52:4157-4167.

27. Kipriyanov, S. M., O. A. Kupriyanova, M. Little, and G. Moldenhauer. 1996. Rapid detection of recombinant antibody fragments directed against cell- surface antigens by flow cytometry. J Immunol Methods 196:51-62.

28. Koelle, D. M., C. M. Posavad, G. R. Barnum, M. L. Johnson, J. M. Frank, and L. Corey. 1998. Clearance of HSV-2 from recurrent genital lesions correlates with infiltration of HSV-specific cytotoxic T lymphocytes. J Clin Invest 101:1500-1508.

29. Kohl, S. 1991. Role of antibody-dependent cellular cytotoxicity in defense against herpes simplex virus infections. Rev Infect Dis 13:108-114.

30. Kohl, S., D. L. Cahall, D. L. Walters, and V. E. Schaffner. 1979. Murine antibody-dependent cellular cytotoxicity to herpes simplex virus-infected target cells. J Immunol 123:25-30.

31. Kohl, S., N. C. Strynadka, R. S. Hodges, and L. Pereira. 1990. Analysis of the role of antibody-dependent cellular cytotoxic antibody activity in murine neonatal herpes simplex virus infection with antibodies to synthetic peptides of glycoprotein D and monoclonal antibodies to glycoprotein B. J Clin Invest 86:273-278.

32. Kohl, S., M. S. West, C. G. Prober, W. M. Sullender, L.

S. Loo, and A. M. Arvin. 1989. Neonatal antibody-dependent cellular cytotoxic antibody levels are associated with the clinical presentation of neonatal herpes simplex virus infection. J Infect Dis 160:770-776.

Petição 870200022455, de 14/02/2020, pág. 79/123

75/111

33. Kousoulas, K. G., B. Huo, and L. Pereira. 1988. Antibody-resistant mutations in cross-reactive and type-specific epitopes of herpes simplex virus 1 glycoprotein B map in separate domains. Virology 166:423-431.

34. Kramer, A., and J. Schneider-Mergener. 1998. Synthesis and screening of peptide libraries on continuous cellulose membrane supports. Methods Mol Biol 87:25-39.

35. Krummenacher, C., V. M. Supekar, J. C. Whitbeck, E. Lazear, S. A. Connolly, R. J. Eisenberg, G. H. Cohen, D. C. Wiley, and A. Carfi. 2005. Structure of unliganded HSV gD reveals a mechanism for receptor-mediated activation of virus entry. EMBO J 24:4144-4153.

36. Kuhn, J. E., G. Dunkler, K. Munk, and R. W. Braun. 1987. Analysis of the IgM and IgG antibody response against herpes simplex virus type 1 (HSV-1) structural and nonstructural proteins. J Med Virol 23:135-150.

37. Kwant-Mitchell, A., A. A. Ashkar, and K. L. Rosenthal. 2009. Mucosal innate and adaptive immune responses against herpes simplex virus type 2 in a humanized mouse model. J Virol 83:1066410676.

38. Lemmon, M. A., and K. M. Ferguson. 2000. Signaldependent membrane targeting by pleckstrin homology (PH) domains. Biochem J 350 Pt 1:1-18.

39. Li, W., T. J. Minova-Foster, D. D. Norton, and M. I. Muggeridge. 2006. Identification of functional domains in herpes simplex virus 2 glycoprotein B. J Virol 80:3792-3800.

40. Lin, E., and P. G. Spear. 2007. Random linker-insertion mutagenesis to identify functional domains of herpes simplex virus type 1 glycoprotein B. Proc Natl Acad Sci U S A 104:13140-13145.

41. Lingen, M., F. Hengerer, and D. Falke. 1997. Mixed vaginal infections of Balb/c mice with low virulent herpes simplex type 1

Petição 870200022455, de 14/02/2020, pág. 80/123

76/111 strains result in restoration of virulence properties: vaginitis/vulvitis and neuroinvasiveness. Med Microbiol Immunol 185:217-222.

42. McKendall, R. R., T. Klassen, and J. R. Baringer. 1979. Host defenses in herpes simplex infections of the nervous system: effect of antibody on disease and viral spread. Infect Immun 23:305311.

43. Mester, J. C., J. C. Glorioso, and B. T. Rouse. 1991. Protection against zosteriform spread of herpes simplex virus by monoclonal antibodies. J Infect Dis 163:263-269.

44. Mikloska, Z., A. M. Kesson, M. E. Penfold, and A. L. Cunningham. 1996. Herpes simplex virus protein targets for CD4 and CD8 lymphocyte cytotoxicity in cultured epidermal keratinocytes treated with interferon-gamma. J Infect Dis 173:7-17.

45. Milligan, G. N., and D. I. Bernstein. 1997. Interferongamma enhances resolution of herpes simplex virus type 2 infection of the murine genital tract. Virology 229:259-268.

46. Milligan, G. N., D. I. Bernstein, and N. Bourne. 1998. T lymphocytes are required for protection of the vaginal mucosae and sensory ganglia of immune mice against reinfection with herpes simplex virus type 2. J Immunol 160:6093-6100.

47. Minagawa, H., S. Sakuma, S. Mohri, R. Mori, and T. Watanabe. 1988. Herpes simplex virus type 1 infection in mice with severe combined immunodeficiency (SCID). Arch Virol 103:73-82.

48. Nagafuchi, S., H. Oda, R. Mori, and T. Taniguchi. 1979. Mechanism of acquired resistance to herpes simplex virus infection as studied in nude mice. J Gen Virol 44:715-723.

49. Nielsen, U. B., G. P. Adams, L. M. Weiner, and J. D. Marks. 2000. Targeting of bivalent anti-ErbB2 diabody antibody fragments to tumor cells is independent of the intrinsic antibody affinity. Cancer Res 60:6434-6440.

Petição 870200022455, de 14/02/2020, pág. 81/123

77/111

50. Oakes, J. E. 1975. Invasion of the central nervous system by herpes simplex virus type 1 after subcutaneous inoculation of immunosuppressed mice. J Infect Dis 131:51-57.

51. Oakes, J. E. 1975. Role for cell-mediated immunity in the resistance of mice to subcutaneous herpes simplex virus infection. Infect Immun 12:166-172.

52. Pereira, L., M. Ali, K. Kousoulas, B. Huo, and T. Banks. 1989. Domain structure of herpes simplex virus 1 glycoprotein B: neutralizing epitopes map in regions of continuous and discontinuous residues. Virology 172:11-24.

53. Pereira, L., T. Klassen, and J. R. Baringer. 1980. Typecommon and type-specific monoclonal antibody to herpes simplex virus type 1. Infect Immun 29:724-732.

54. Posner, M. R., T. Hideshima, T. Cannon, M. Mukherjee,

K. H. Mayer, and R. A. Byrn. 1991. An IgG human monoclonal antibody that reacts with HIV-1/GP120, inhibits virus binding to cells, and neutralizes infection. J Immunol 146:4325-4332.

55. Qadri, I., C. Gimeno, D. Navarro, and L. Pereira. 1991. Mutations in conformation-dependent domains of herpes simplex virus 1 glycoprotein B affect the antigenic properties, dimerization, and transport of the molecule. Virology 180:135-152.

56. Rager-Zisman, B., and A. C. Allison. 1976. Mechanism of immunologic resistance to herpes simplex virus 1 (HSV-1) infection. J Immunol 116:35-40.

57. Reed, J. L., and H. Muench. 1938. A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am J Hyg 27:493-497.

58. Sanna, P. P., A. De Logu, R. A. Williamson, Y. L. Hom,

S. E. Straus, F. E. Bloom, and D. R. Burton. 1996. Protection of nude mice by passive immunization with a type-common human recombinant monoclonal antibody against HSV. Virology 215:101-106.

Petição 870200022455, de 14/02/2020, pág. 82/123

78/111

59. Sanna, P. P., T. J. Deerinck, and M. H. Ellisman. 1999. Localization of a passively transferred human recombinant monoclonal antibody to herpes simplex virus glycoprotein D to infected nerve fibers and sensory neurons in vivo. J Virol 73:8817-8823.

60. Satoh, T., J. Arii, T. Suenaga, J. Wang, A. Kogure, J. Uehori, N. Arase, I. Shiratori, S. Tanaka, Y. Kawaguchi, P. G. Spear, L.

L. Lanier, and H. Arase. 2008. PILRalpha is a herpes simplex virus-1 entry coreceptor that associates with glycoprotein B. Cell 132:935-944.

61. Silverman, J. L., S. Sharma, T. M. Cairns, and E. E. Heldwein. 2010. Fusion-deficient insertion mutants of herpes simplex virus type 1 glycoprotein B adopt the trimeric postfusion conformation. J Virol 84:2001-2012.

62. Smith, P. M., R. M. Wolcott, R. Chervenak, and S. R. Jennings. 1994. Control of acute cutaneous herpes simplex virus infection: T cell-mediated viral clearance is dependent upon interferongamma (IFN-gamma). Virology 202:76-88.

63. Spear, P. G., and R. Longnecker. 2003. Herpesvirus entry: an update. J Virol 77:10179-10185.

64. Staats, H. F., J. E. Oakes, and R. N. Lausch. 1991. Antiglycoprotein D monoclonal antibody protects against herpes simplex virus type 1-induced diseases in mice functionally depleted of selected T-cell subsets or asialo GM1+ cells. J Virol 65:6008-6014.

65. Subramanian, R. P., and R. J. Geraghty. 2007. Herpes simplex virus type 1 mediates fusion through a hemifusion intermediate by sequential activity of glycoproteins D, H, L, and B. Proc Natl Acad Sci U S A 104:2903-2908.

66. Yokota, T., D. E. Milenic, M. Whitlow, and J. Schlom.

1992. Rapid tumor penetration of a single-chain Fv and comparison with other immunoglobulin forms. Cancer Res 52:3402-3408.

67. Zeitlin, L., P. E. Castle, K. J. Whaley, T. R. Moench, and

Petição 870200022455, de 14/02/2020, pág. 83/123

79/111

R. A. Cone. 1998. Comparison of an anti-HSV-2 monoclonal IgG and its IgA switch variant for topical immunoprotection of the mouse vagina. J Reprod Immunol 40:93-101.

68. Zeitlin, L., S. S. Olmsted, T. R. Moench, M. S. Co, B. J. Martinell, V. M. Paradkar, D. R. Russell, C. Queen, R. A. Cone, and K. J. Whaley. 1998. A humanized monoclonal antibody produced in transgenic plants for immunoprotection of the vagina against genital herpes. Nat Biotechnol 16:1361-1364.

69. Zeitlin, L., K. J. Whaley, P. P. Sanna, T. R. Moench, R. Bastidas, A. De Logu, R. A. Williamson, D. R. Burton, and R. A. Cone. 1996. Topically applied human recombinant monoclonal IgG1 antibody and its Fab and F(ab')2 fragments protect mice from vaginal transmission of HSV-2. Virology 225:213-215.

Exemplo 4

Ensaio de neutralização de vírus [00153] Ensaios de neutralização foram realizados em placas de microtitulação em células Vero, seja em ensaio de redução de placas com quantidade excedente de anticorpos para determinar a sensibilidade de neutralização do vírus ou como método de diluição final para determinar o título de neutralização de uma solução de anticorpos. Os ensaios de redução de placas foram realizados por incubação de 250 unidades formadoras de placas com 20 pg de mAb 2c. Depois de duas horas, 50 pL/poço de suspensão de células Vero (1,5 x 10⁵ células/mL) foram adicionados. Após 3 dias, as células foram coradas pelo cristal violeta. Para titulação final, soluções diluídas do anticorpo (0,025 mL) foram incubadas com 100 TCID50 de HSV-1 em 0,025 mL e 0,025 mL de complemento de cobaia, diluído 1:10. Os títulos foram expressos em recíprocas da diluição sérica mais alta que impedia o efeito citopático induzido pelo vírus em 50% das culturas.

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Construção de mutantes de gB por deleção e expressão em células COS-1 [00154] A construção dos plasmídeos codificadores de gB completa de HSV-1 (gB(1-904) = pM(T2gB), gB(1-720), gB(1-630), gB(1-505), gB(1-503), gB(1-487) e gB(1-470) foi descrita em outro lugar [30, 31]. Os plasmídeos foram gentilmente fornecidos por Leonore Pereira, Universidade da Califórnia, São Francisco. Plasmídeos codificadores de gB(1-130), gB(1-223), gB(183-488) e gB(436-642) foram construídos clonando amplicons gerados por PCR, flanqueados pelos sítios das enzimas de restrição Bam HI e Xho I, no vetor eucariótico de expressão pSVL (Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemanha). Um clone de plasmídeo subgenômico da cepa 17⁺ de HSV-1 [33; GenBank X14112], contendo os nucleotídeos de gB 52588 a 60362 foi utilizado como modelo na PCR. Para expressão de construtos de gB truncados em N-terminal, o DNA codificador da sequência de sinalização de gB foi amplificado por PCR com um iniciador, contendo um sítio de XhoI em sua extremidade 5', e inserido em 5' ao DNA codificador de gB dos plasmídeos dos subfragmentos gB(183-488) e gB(436-642). A integração correta do inserto e sua sequência foram confirmadas por sequenciamento de nucleotídeos. Células COS-1 foram cultivadas em lamínulas (diâmetro: 10 mm), colocadas em placas de 24 poços, e transfectadas com plasmídeos pelo método DEAE-dextrana [34]. A expressão de gB e de seus derivados truncados foi verificada por microscopia de imunofluorescência indireta com uma mistura dos anticorpos monoclonais bem caracterizados de camundongos anti-gB de HSV-1, H1396 e H1781. Células COS-1 transfectadas e fixadas foram reagidas com MAb 2c e analisadas por microscopia de imunofluorescência.

Mutagênese sítio-dirigida de gB e construção de vírus recombinante [00155] Mutações de aminoácidos únicos foram introduzidas em gB

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81/111 de HSV-1 por mutagênese oligonucleotídeo-dirigida, utilizando o sistema de mutagênese Altered Sites® in vitro (Promega, Mannheim, Alemanha). Resumidamente, a sequência codificadora de gB dentro de pMT2gB [31] foi transferida para o vetor fagemídeo de mutagênese de E. coli pAlter-1. Moléculas de DNA de fita simples de pALTER-1gB foram preparadas por infecção de células JM109 de E. coli transformadas pelo pALTER-1gB com o fago R408. A mutagênese sítio dirigida foi realizada de acordo com o protocolo do fabricante com os iniciadores de mau pareamento (mismatch) (posição mutante sublinhada) como segue:

Y296N (N = mutação), 5’-GGGACATGTTCACAAAGTC-3’; (SEQ ID

NO: 24);

Y296F, 5’-GGGACATGAACACAAAGTC-3’ (SEQ ID NO:

25);

M297L, 5’-ACGGGGACAGGTACACAAA-3’

26);

M297T, 5’-AACGGGGACGTGTACACAA-3’

27);

M297V, 5’-ACGGGGACACGTACACAAA-3’

NO: 28);

S268A: 5'-AAAACGGGGCCATGTACAC-3

NO: 29);

P299S, 5’-CGTAAAACGAGGACATGTA-3’

30);

F300Y, 5’-TAGCCGTAATACGGGGACA-3’

31);

F300I: 5'-TAGCCGTAAATCGGGGACA-3'

32) ;

Y301N, 5’-GTAGCCGTTAAACGGGG-3’

33) ;

(SEQ ID NO:

(SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID NO:

(SEQ ID NO:

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82/111

G302R, 5’-CCCGGTAGCGGTAAAACGG-3’ (SEQ ID

NO: 34);

G302V, 5’-TCCCGGTAGACGTAAAACG-3’ (SEQ ID NO:

35);

Y303N, 5’-ACCCCTCCCGGTTGCCGTAAAACG-3’ (SEQ ID

NO: 36);

R304G, 5’-ACCCCTCCCCGTAGCCGTA-3’	(SEQ	ID	NO
37);
R304L, 5’-GACCCCTCCAGGTAGCCGT-3’	(SEQ	ID	NO
38);
E305K, 5’-GTGCGACCCCTTCCGGTAGCCGT-3’	(SEQ	ID	NO

39);

G306A, 5’-GTGTGCGACGCCTCCCGGT-3’ (SEQ ID

NO: 40);

G306V, 5’-GTGTGCGACACCTCCCGGT-3’ (SEQ ID

NO: 41);

S307A, 5’-CGGTGTGCGCCCCCTCCCG-3’ (SEQ ID

NO: 42).

[00156] Depois de alongamento pelo iniciador e ligação para formar moléculas circulares integralmente em duplex, fechadas covalentemente, o DNA heteroduplex foi transformado em E. coli BMH 71-18 mutS, o qual é incapaz de reparar o mau pareamento de nucleotídeos. Os plasmídeos resultantes de clones resistentes à ampicilina foram utilizados para transformação de E. coli JM109 (recA). A identidade das mutações nos plasmídeos resultantes pAlter-1gB foi confirmada pelo sequenciamento do DNA de gB. Depois da mutagênese, o inserto mutante foi clonado novamente no vetor de expressão pMT2gB, resultando nos respectivos construtos pMT2gBmut. A fim de analisar a reatividade de mAb 2c contra gB com mutações de aminoácidos únicos, células, COS-1, cultivadas em

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83/111 lamínulas (10 x 30 mm), foram transfectadas com os construtos pMT2gBmut pelo método Lipofectamine^TM/OPTI-MEM^TM (Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. As células foram fixadas depois de 44 horas de cultura por metanol/acetona. A expressão de gBmut foi verificada por análise de imunofluorescência indireta, utilizando IgG policlonal de coelho antiHSV-1 (Dako, Hamburgo, Alemanha).

[00157] Glicoproteína B com trocas de aminoácidos únicos foi inserida na cepa F do tipo selvagem do HSV-1 por recombinação homóloga entre genomas de HSV-1 e DNA do plasmídeo pMT2gBmut. DNA genômico do HSV-1 foi preparado a partir de estoques do vírus por SDS/lise por proteinase K durante 1 - 3 horas a 56°C, seguido por extração com fenol/clorofórmio/álcool iso-amílico e diálise por 65 horas (tampão I, NaCl 10 mM, EDTA 10 mM, Tris-HCl 50 mM, pH 8; tampão II, NaCl 10 mM, EDTA 1 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 7,5). Plasmídeos pMT2gBmut foram extraídos pelo kit Qiagen Plasmid Midi (Qiagen, Hilden, Alemanha). Vírus recombinantes foram preparados transfectando células Vero com DNA precipitado com fosfato de cálcio de acordo com o método de Graham e Van der Eb [35], modificado por Stow e Wilkie [36] ou pelo método Lipofectamine^®/OPTI-MEM^®(Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, para transfecção pelo método de fosfato de cálcio, aproximadamente 100 ng de DNA purificado de HSV-1 F foi precipitado com 500 ng de DNA de plasmídeo e 5 pg de DNA de timo de vitelo em 0,436 mL de A. bidest. por adição de 64 pL de CaCl2 1 M por 5 min. Após a incubação das células cultivadas em placas de Petri (diâmetro: 25 cm) com o precipitado de DNA durante 45 min e EMEM com soro bovino fetal 10% durante 3 horas, as células foram submetidas a choque por DMASO 25% em tampão HEBS por 2 min. Em seguida, o cultivo prosseguiu com EMEM contendo soro bovino

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84/111 fetal 10% e MAb 2c. Para transfecção com Lipofectamine, 1 pg de DNA de HSV-1 e 1 pg de DNA de plasmídeo foram utilizados. Placas bem separadas foram coletadas e rastreadas quanto à respectiva mutação por sequência em ciclos de amplicons gerados por PCR. No geral, o número de placas obtidas foi baixo, com experimentos que não conseguiram produzir qualquer placa na presença de gB codificada pelo plasmídeo (experimentos de controle sem a presença de plasmídeos codificadores de gB e de MAb 2c resultaram em inúmeras placas). A fim de testar a reatividade do anticorpo, 3x 10⁵células Vero cultivadas em lamínulas (8 x 16 mm) foram infectadas com 200 - 300 unidades formadoras de placas do vírus em 1 mL de EMEM. Depois de 1 hora, o meio de cultura celular foi substituído por EMEM com soro fetal bovino 10%. Depois de incubação por 2 dias, as células foram fixadas com metanol/acetona a -20°C.

Ensaio de imunofluorescência [00158] A ligação de anticorpos monoclonais de camundongos, específicos para gB de HSV, a células foi detectada utilizando IgG de cabra anticamundongo conjugada a DTAF (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Dianova, Hamburgo, Alemanha). Para a detecção de ligação de IgG de coelho anti-HSV-1, IgG de cabra anti-coelho conjugada a Cy3 ou TexasRed (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Dianova) foi utilizada. Para a detecção de anticorpos humanos, IgG de cabra anti-humano conjugada a DTAF (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Dianova) foi utilizada.

Síntese de peptídeos ligados à celulose e varredura (varreduras de peptídeos, varredura de motive principal e análise de substituições) [00159] Todos os peptídeos foram gerados por síntese semiautomática SPOT® em membranas de celulose Whatman 50, conforme descrito previamente [37, 38]. Depois da síntese, as membranas foram bloqueadas durante a noite em tampão de bloqueio

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85/111 contendo reagente de bloqueio (1X, Cambridge Research Biochemicals, Northwich, Reino Unido) em solução salina com tampão Tris (Tris 50 mM, NaCl 125 mM, KCl 4 mM, pH 8,0), Tween 20 0,05% (v/v) e sacarose 5% (p/v) (TBST). Depois de uma lavagem em TBST, as folhas foram incubadas simultaneamente com MAb 2c (0,5 - 1,0 pg/mL) e fragmentos Fab anti-IgG de camundongo conjugados a POD (excesso de cinco vezes; Roche Applied Science, Mannheim, Alemanha) em tampão de bloqueio por 3 horas à temperatura ambiente. Depois de duas lavagens em TBST, a ligação de anticorpos foi detectada utilizando o kit Chemiluminescence Western Blotting (Roche Applied Science, Mannheim, Alemanha) de acordo com o protocolo do fabricante.

[00160] Varreduras de peptídeos sobrepondo-se (varreduras de peptídeos) [39] foram sintetizados em 15-mers com sobreposição de 12 aminoácidos (ou seja, desvio ao longo da sequência de gB em 3 aminoácidos), correspondentes a resíduos de gB do aminoácido 31 ao 505 (cepa 17+ de HSV-1 [33] GenBank X14112), e em 13-mers com sobreposição de 12 aminoácidos (ou seja, desvio ao longo da sequência de gB em um aminoácido), correspondentes aos resíduos de gB 296 ao 315.

[00161] A fim de identificar o motivo mínimo de ligação dentro do sítio de ligação B do MAb 2c B, uma varredura de motivo fundamental foi efetuada utilizando 14-mers, compostos por um hexâmetro central derivado de gB, abraçado por quatro resíduos aleatórios em cada terminal, N e C (X1X2X3X4B1B2B3B4B5B6X11X12X13X14; x, posição aleatória, B, posição fixa derivada de gB) [40]. Com cada peptídeo, a sequência heXamérica foi deslocada em um aminoácido, iniciado na posição V295 da gB e abrangendo a sequência até a posição A315 da gB.

[00162] A relevância de aminoácidos únicos para a ligação de MAb 2c dentro do sítio de ligação A de gB foi analisada por uma análise de

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86/111 substituições do peptídeo 178RYSQFMGIFEDRAPV192, (SEQ ID NO: 43), realizada pela troca sucessivamente de cada aminoácido por todos os outros 19 aminoácidos naturais, conforme previamente descrito [40-42].

Experimentos de proteção de camundongos e camundongo [00163] Fêmeas de camundongos C57BL/6J (H-2^b) foram obtidas do Charles River Wiga (Charles River Laboratories, Sulzfeld, Alemanha) e utilizadas quando atingiam 33 a 37 dias de idade. Os experimentos foram conduzidos conforme previamente descritos [1, 2]. Resumidamente, os camundongos foram inoculados por via intravaginal com 2 x 10⁶ TCID50 de HSV-1 em 0,1 mL de EMEM com soro fetal bovino 10%. Vinte e quatro horas antes da inoculação viral, os camundongos receberam uma injeção intraperitoneal, contendo 0,5 mL de MAb 2c, soro imune policlonal ou de meio de cultura precipitado. O preparado padrão de soro imune humano utilizado (Beriglobin S^TM, CSL Behring, Alemanha) tinha título neutralizante independente de complemento de 1:1280 contra HSV-1 em 0,025 mL e foi diluído quatro vezes para aplicação em meio de Iscove. O preparado de estoque de MAb 2c tinha título neutralizante independente de complemento de 1:640 e foi diluído duas vezes para conter a mesma atividade neutralizante que o soro imune policlonal. O título por ELISA das diluições aplicadas de anticorpo era entre 104,5 e 10^5,5 quando determinado de acordo com o método de Kahlon e Whitley [43], utilizando IgG de coelho conjugada à peroxidase contra camundongo e humano. Para controles, volumes equivalentes de meio de Iscove foram tratados na mesma maneira. Camundongos de controle aos quais foi administrado meio de cultura eram equivalentes aos controles que receberam MAb não específico para HSV [1]. Esfregaços vaginais foram coletados a cada dois dias depois da inoculação viral e avaliados quanto ao vírus em monocamadas de

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87/111 células Vero. Títulos de vírus infecciosos eram determinados em placas de microtitulação de TCID50 por 0,05 mL de acordo com o método de Reed e Muench [44].

Resultados

Os primeiros 487 aminoácidos de gB são necessários para ligação de MAb 2c [00164] Para obter uma primeira visão sobre a região da glicoproteína B necessária para o dobramento apropriado do epitopo de MAb 2c, um construto gB completa de HSV-1 e um conjunto de construtos de gB, truncada no carbóxi terminal foram expressos em células COS-1, conforme fornecido na seção de Métodos. A expressão de gB foi verificada por microscopia de imunofluorescência indireta, utilizando uma mistura de MAbs murinos específicos para gB de HSV, H1396 e H1781. A ligação de MAb 2c foi visualizada também por ensaio de imunofluorescência indireta. Conforme mostrado na tabela 7, a proteína completa e os derivados truncados gB(1-720), gB(1-630), gB(1-505), gB(1-503) e gB(1-487) foram reconhecidos por MAb 2c. Por outro lado, MAb 2c não conseguiu se ligar a gB(1-470), gB(1-223) e gB(1-130). Além disso, não foi observada reação com dois construtos truncados no N e no C terminal (gB(183-488) e gB(436-642)). Esses resultados indicaram que o epitopo de MAb 2c está situado dentro dos primeiros 487 resíduos amino terminais.

Tabela 7 - Ligação de MAb 2c à glicoproteína B (gB) truncada de HSV-1 expressa em células COS-1

Construtos de gB*	Reatividade**
gB(1 -904) (gB completa)	+
gB(1 -720)	+
gB(1 -630)	+
gB(1 -505)	+
gB(1 -503)	+

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Construtos de gB*	Reatividade**
gB(1 -487)	+
gB(1 -470)	-
gB(1 -223)	-
gB(1 -130)	-
gB(183-488)	-
gB(436-642)	-
pSVL***	-

* A expressão de todos os construtos de gB foi confirmada por imunofluorescência indireta com os anticorpos monoclonais específicos para gB de HSV H1396 e H1781 [30-32].

** A ligação de MAb 2c foi detectada por imunofluorescência indireta. +, indica ligação de MAb 2c, -, indica falha de ligação de MAb 2c.

*** pSVL, vetor de expressão, utilizado como controle negativo.

MAb 2c reconhece sequências de duas diferentes regiões de gB [00165] Em vista de não ter sido possível o mapeamento fino do epitopo reconhecido por MAb 2c utilizando construtos de gB por deleção, expressos em células COS-1, peptídeos sobrepostos derivados por varredura de gB (varredura de peptídeos) foram sintetizados em suportes de membrana contínua de celulose por síntese SPOT^TM. Os peptídeos, abrangendo a região de gB do aminoácido 31 ao 505, foram sintetizados como 15-mers, com sobreposição de 12 aminoácidos (ou seja, desvio ao longo da sequência de gB em 3 aminoácidos), resultando no total em 155 peptídeos. A ligação de MAb 2c foi mostrada por incubação simultânea com o anticorpo primário (MAb 2c) e o secundário (Fab anti-IgG de camundongo conjugado a POD) e detecção por quimioluminescência.

[00166] Como mostrado na figura 22, MAb 2c demonstrou ligar-se a

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89/111 cinco peptídeos dentro de duas regiões distintas da gB, denominadas sítios A e B. O sítio A compreende três peptídeos consecutivos correspondentes aos resíduos de gB

175FGHRYSQFMGIFEDRAPVPFE195 (SEQ ID NO: 44) (sequência comum 181QFMGIFEDR189 (SEQ ID NO: 45), e o sítio B, dois peptídeos consecutivos abrangendo os resíduos 298SPFYGYREGSHTEHTSYA315 (SEQ ID NO: 46) (sequência comum 301YGYREGSHTEHT312 (SEQ ID NO: 47).

Identificação do comprimento mínimo do sítio de ligação B para MAb 2c [00167] Pelo fato do peptídeo 90 (figura 22;

298SPFYGYREGSHTEHT312 (SEQ ID NO: 48) ter exibido a intensidade mais forte de sinal, foi sugerida a hipótese pelos presentes inventores de que o sítio de ligação B é o determinante dominante para a ligação de MAb 2c. Dessa forma, os presentes inventores identificaram o comprimento mínimo do sítio B, necessário para a ligação de MAb 2c, utilizando varredura de peptídeos ligados à celulose em resolução mais alta. Peptídeos 13-mer, abrangendo os resíduos derivados de gB 296 a 315, com sobreposição de 12 aminoácidos (ou seja, desvio ao longo da sequência de gB por somente um único aminoácido) foram sintetizados em duplicata. A reatividade de MAb 2c com cinco peptídeos consecutivos foi observada, após um procedimento de incubação e detecção conforme descrito acima. Um alinhamento das sequências dos cinco peptídeos reativos é mostrado na figura 23. A sequência comum a todos os cinco peptídeos foi 300FYGYREGSH308 (SEQ ID NO: 49).

[00168] Em uma segunda abordagem, um método de varredura de motivo fundamental, utilizando 14-mers, cada um destes formado por seis aminoácidos derivado de gB, flanqueado nas duas extremidades por quatro posições aleatórias, foi aplicado. Nesse ensaio, as quatro

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90/111 posições terminais de cada molécula de peptídeo representou uma sequência aleatória na qual os aminoácidos foram incorporados estatisticamente. Cada ponto continha, portanto, uma vasta mistura de peptídeos com uma multiplicidade de sequências nas posições mais externas de peptídeos, mas todos com a mesma sequência derivada de gB nas posições cinco a dez de peptídeos. Os hexâmetros centrais derivados de gB abrangiam a região da gB do resíduo V295 ao A315 e desviavam ao longo por um único aminoácido. Uma sequência hexamérica de gB foi escolhida porque é sabido que mais de 75% dos epitopos não lineares compreendem um prolongamento em sequência de comprimento máximo de 4 a 7 resíduos [45]. A reatividade de MAb 2c foi vista com os dois peptídeos consecutivos XXXX300FYGYRE305XXXX (SEQ ID NO: 21) e XXXX301YGYREG306XXXX (SEQ ID NO: 50) (figura 24). Por conseguinte, a sequência 300FYGYREG306 (SEQ ID NO: 51) foi considerada o motivo mínimo de ligação de peptídeos do sítio B, necessário para interação com MAb 2c.

Identificação de resíduos individuais essenciais para ligação de MAb 2c no sítio B por gB mutante [00169] A fim de confirmar o sítio de ligação B para MAb 2c no contexto da proteína inteira e dobrada de modo nativo, os inventores alteraram a sequência de aminoácidos da gB completa, clonaram em pMT2gB, por trocas de aminoácidos únicos dentro do sítio de ligação B. Usando um sistema à base de fagemídeo para mutagênese sítio dirigida, alguns construtos de gB com trocas de aminoácidos únicos foram gerados. Após expressão da gB mutante em células COS-1, a ligação de MAb 2c foi analisada por ensaio de imunofluorescência. Como mostrado na tabela 8, uma série de resíduos de gB foi identificada como essencial para ligação de MAb 2c. Detalhadamente, a substituição do resíduo P na posição 299 de gB por S, F300 por Y e

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I, respectivamente, Y301 por N, G302 por R e V, respectivamente, Y303 por N, R304 por G e L, respectivamente, e E305 por K, resultou em perda completa de ligação de MAb 2c, indicando dessa forma que cada resíduo nas posições 299 a 305 estão crucialmente envolvidos na formação do epitopo, quer por representarem resíduos fundamentais interagindo mediante suas cadeias laterais com o anticorpo, quer por influenciarem o dobramento global ou local apropriado da proteína gB, necessário para formar a conformação do epitopo reconhecido pelo anticorpo. A expressão da gB mutante em células COS-1 foi verificada pela incubação concomitante das células com o MAb 2c murino e soro imune de IgG policlonal de coelho antiHSV, seguido pela identificação mediante a incubação concomitante com IGG anticamundongo conjugada a DTAF (fluorescência verde se o MAb 2c estivesse ligado) e anticorpos anti-coelho conjugados a TexasRed ou Cy3 (fluorescência vermelha das mesmas células). Ao contrário, a troca do resíduo único de gB Y296 por N e F, respectivamente, M297 por L, T e V, respectivamente, e S298 por A, bem como G306 por A e V, respectivamente, e S307 por A não afetou a ligação de MAb 2c.

Tabela 8 - Ligação de MAb 2c a variantes da glicoproteína B (gB) completa de HSV-1, contendo trocas de aminoácidos únicos e expressas em células COS-1

Variantes de gB	Reatividade**
Y296N*	+
Y296F	+
M297L	+
M297T	+
M297V	+
S298A	+
P299S	***

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Variantes de gB	Reatividade* ^*
F300Y	-
F300I	-
Y301N	-
G302R	-
G302V	-
Y303N	-
R304G	-
R304L	-
E305K	-
G306A	+
G306V	+
S307A	+

* O aminoácido do tipo selvagem é fornecido antes do número da posição em gB, enquanto o resíduo introduzido é fornecido atrás do número da posição. A expressão de todas as variantes de gB foi confirmada por imunofluorescência, obtida por incubação concomitante das células com soro contendo IgG policlonal de coelho anti-HSV-1 IgG.

** A ligação de MAb 2c foi testada por imunofluorescência indireta. +, indica ligação de MAb 2c, -, indica falha de ligação de MAb 2c.

*** Para avaliação deste resultado em particular, consultar a seção de Discussão.

Identificação de resíduos individuais essenciais para ligação de MAb 2c no sítio B por vírus mutantes [00170] A fim de se aproximar mais às situações in vivo, o impacto de aminoácidos individuais do sítio B foi analisado mais detalhadamente, utilizando variantes bem caracterizadas do HSV-1 (R126, R1375, B4.1, R1435, R233), cada um contendo uma mutação

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93/111 de aminoácido em gB [27-29] e por vírus mutantes (vY301N [Y na posição 301 substituído por N], vG302R, vG302V), gerados no presente estudo, conforme fornecido na seção de Métodos. Células Vero em lamínulas foram infectadas com 200 - 300 unidades formadoras de placas de cada um destes mutantes ou dos vírus precursores do tipo selvagem, HSV-1 F e KOS 321. Ensaios de imunofluorescência indireta demonstraram que MAb 2c não conseguiu se ligar a células infectadas pelos vírus vY301N, vG302R, vG302V, R126 (Y303 substituído por N), R1375 (R304Q) e B4.1 (E305K), enquanto MAb 2c foi reativo a células infectadas com os mutantes R1435 (H308Y), R233 (R328H), bem como os vírus do tipo selvagem (tabela 9).

Tabela 9 - Sensibilidade de vírus do tipo selvagem do HSV-1 e mutantes virais de gB à ligação e neutralização por MAb 2c

Vírus [Ref.] Ligação* Neutralização **

Cepa do tipo selvagem F [25]	+	+
Cepa do tipo selvagem KOS	+	+
321 [26]
Mutante F vY301N*** [este	-	-
estudo]
Mutante F vG302R [este	-	-
estudo]
Mutante F vG302V [este	-	-
estudo]
Mutante F R126 (Y303N) [27,	-	-
28]
Mutante F R1375 (R304Q) [27,	-	-

28]

Mutante KOS B4.1 (E305K) [29]

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Mutante F R1435 (H308Y) [27,	+	+
28]
Mutante F R233 (R328H) [27,	+	+

28] * A expressão de gB foi confirmada para todos os vírus por imunofluorescência obtida com soro contendo IgG policlonal de coelho anti-HSV-1. +, indica ligação de MAb 2c a células Vero infectadas, detectada por imunofluorescência indireta, -, indica falha de ligação de MAb 2c.

** +, indica neutralização do vírus por MAb 2c, -, indica falha da neutralização do vírus.

*** O aminoácido do tipo selvagem é fornecido antes do número da posição em gB, enquanto o resíduo introduzido é fornecido atrás do número da posição.

[00171] A fim de determinar se os resíduos identificados como críticos para a ligação de MAb 2c a gB eram também cruciais para a atividade neutralizante do anticorpo, ensaios de neutralização foram realizados utilizando 250 unidades formadoras de placas dos mutantes virais ou de vírus do tipo selvagem. Como mostrado na Tabela 9, as cepas do tipo selvagem F e KOS 321, bem como as mutantes R1435 (H308Y) e R233 (R328H) foram completamente neutralizadas por MAb 2c. Por outro lado, MAb 2c falhou completamente em neutralizar os vírus mutantes vY301N, vG302R, vG302V, R126 (Y303N), R1375 (R304Q) e B4.1 (E305K), indicando que cada um destes resíduos é um alvo essencial para formar o epitopo necessário para a capacidade neutralizante de MAb 2c. Considerados em conjunto, os resultados obtidos por análises de peptídeos e de proteínas mutantes revelaram que os resíduos 299 a 305 são importantes para formação do epitopo, bem como para a bioatividade in vitro de MAb 2c.

Mapeamento de epitopos por experimentos de proteção a

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95/111 camundongos [00172] A fim de analisar se o efeito protetor de MAb 2c in vivo é dependente também de aminoácidos específicos no sítio B, no total, 168 camundongos C57BL/6 foram inoculados por via intravaginal com os vírus mutantes ou as cepas precursoras do tipo selvagem, 24 horas depois de injeção intraperitoneal de MAb 2c. Para comparação, um soro imune policlonal ajustado para a mesma potência neutralizante foi fornecido. Os experimentos foram realizados conforme previamente descrito [1, 2]. Como mostrado na Figura 25, MAb 2c foi ineficaz em camundongos inoculados com os mutantes R126 (Y303N), R1375 (R304Q) e B4.1 (E305K), ao passo que foi eficaz em camundongos inoculados com os mutantes R1435 (H308Y) ou R233 (R328H) ou vírus do tipo selvagem. Todavia, os experimentos com os mutantes virais R126, B4.1 e R233 foram ligeiramente prejudicados pelo fato de que a replicação viral destes mutantes nas membranas mucosas dos camundongos foi ineficiente. Especificamente, o mutante R126 exibiu capacidade bem baixa de replicação. Portanto, a evolução da infecção não diferiu entre camundongos infectados por R126 e tratados com MAb 2c, soro imune policlonal ou o líquido de controle. Considerados em conjunto, os resultados dos experimentos de proteção em camundongos demonstraram claramente que os resíduos de gB Y303, R304 e E305 são essenciais para o MAb 2c exibir seu efeito protetor in vivo.

Caracterização do sítio A para ligação de MAb 2c [00173] Os resultados do mapeamento de epitopos de MAb 2c pela abordagem de varredura de peptídeos (figura 22) sugeriram inicialmente que o sítio de ligação A com a sequência comum 181QFMGIFEDR189 é constituinte de um epitopo descontínuo formado junto com o sítio B e potencialmente outras regiões que não poderiam ser detectadas na proteína dobrada de modo nativo. Contudo, o sítio A

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96/111 surpreendentemente não foi localizado na superfície da estrutura trimérica tridimensional de gB [21]. Além disso, os sítios A e B não estão em proximidade sobre a superfície de gB e não poderiam ser abrangidos simultaneamente pela área média de um parátope de anticorpo.

[00174] A fim de investigar a relevância do sítio A, os presentes inventores deram início à geração de construtos de gB e de mutantes virais com trocas de aminoácidos únicos. Todavia, esforços para demonstrar a significância destes aminoácidos no sistema biológico não foram recompensadoras porque a substituição de qualquer um destes resíduos em construtos de gB e em mutantes virais não foi seguida pela perda de ligação do anticorpo, mais provavelmente em decorrência da presença do motivo do sítio B na molécula (dados e iniciadores de mutagênese não mostrados).

[00175] A fim de estudar a importância relativa de cada aminoácido do peptídeo 50, 178RYSQFMGIFEDRAPV192 (SEQ ID NO: 43), identificado pela abordagem de varredura peptídeos, os presentes inventores realizaram uma análise completa de substituições. Por conseguinte, todos os análogos possíveis de substituição em um único sítio (ou seja, cada posição substituída por todos os outros 19 aminoácidos proteinogênicos) foram sintetizados por síntese SPOT^® e testados quanto à ligação de MAb 2c. A maioria das posições do peptídeo pôde ser trocada por diversos aminoácidos com diferenças físico-químicas sem perda da ligação. O motivo 186FED188, contudo, foi conservado, ou seja, a alteração destes aminoácidos foi associada com perda de ligação de anticorpo (dados não mostrados). Os presentes inventores sugeriram a hipótese de que o sítio A ou predominantemente o motivo 186FED188 imita uma parte do epitopo descontínuo de MAb 2c.

[00176] A fim de testar essa suposição, foi criado por computador

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97/111 um peptídeo 12-mer, PFYGYRE-G-FEDF (SEQ ID NO: 52), composto pelos resíduos situados no sítio B de ligação do MAb 2c (299PFYGYRE305 (SEQ ID NO: 53)), os quais demonstraram ser biologicamente importantes (tabela 8), um ligante glicina e um motivo FEDF em C-terminal derivado da sequência mais crítica do sítio A. A ligação de MAb 2c a este peptídeo foi medida em comparação ao peptídeo 298SPFYGYREGSHTEHT312 (SEQ ID NO: 48), o qual exibiu a reatividade mais forte na varredura de peptídeos de 15-mer (figura 22). Os dois peptídeos foram sintetizados em membrana de celulose e sondados com MAb 2c conforme descrito em Métodos. Como mostrado na Figura 26, o sinal do peptídeo combinado PFYGYRE-GFEDF (SEQ ID NO: 52) foi bem mais intenso, quando comparado ao peptídeo apenas do sítio B, embora o tempo de exposição do filme de raios X tenha sido somente um quarto daquele da varredura de peptídeos de 15-mer. Esse achado apoia fortemente a suposição de que o MAb 2c reconhece um epitopo descontínuo formado por i) sítio B do resíduo 299 ao resíduo 305 (PFYGYRE) (SEQ ID NO: 53), e ii) uma ou mais regiões descontínuas adicionais que podem ser mimetizadas pela sequência FEDF (SEQ ID NO: 54).

Discussão [00177] O objetivo do presente trabalho foi mapear o sítio de ligação para MAb 2c na glicoproteína B do vírus Herpes simplex e identificar resíduos fundamentais do epitopo. Com um conjunto de versões truncadas em C-terminal de proteína gB expressa por recombinação, os 487 resíduos em N-terminal demonstraram ser necessários para ligação de MAb2c. A deleção adicional de 17 ou mais aminoácidos do C-terminal levou a uma perda de ligação do anticorpo, embora a síntese em células transfectadas transitoriamente de todas as versões deletadas de gB pudesse ser rapidamente averiguada. A fim de estreitar a localização do epitopo, dois mutantes

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98/111 adicionais por deleção foram construídos, gB(183-488) e gB(436-642), cada um fundido à sequência peptídica de sinalização (aminoácidos 130). Dado que o MAb2c não conseguiu se ligar a qualquer uma destas últimas proteínas truncadas de gB, contradizendo dessa forma a suposição inicial dos inventores de que o epitopo de MAb 2c poderia estar situado entre os resíduos 470 e 487, os presentes inventores decidiram mudar para uma estratégia alternativa de mapeamento de epitopos, utilizando peptídeos sintéticos.

[00178] Muitos epitopos de células B são descontínuos por natureza [46]. O mapeamento destes epitopos descontínuos, utilizando fragmentos de proteínas, ou seja, peptídeos, gerados química ou biologicamente, sofrem da desvantagem de que peptídeos derivados de regiões isoladas de ligação possuem em geral afinidades muito baixas pelo parceiro de ligação, as quais não são geralmente mensuráveis em ensaios ELISA ou de ressonância plasmônica de superfície. Nas duas últimas décadas, diversos exemplos de investigações em estudos de mapeamento de epitopos descontínuos, utilizando peptídeos sintetizados em superfícies contínuas, foram descritos [47-50]. Em termos de sensibilidade, o método SPOT^TM é especialmente adequado [37] devido à alta densidade de peptídeos sobre as membranas de celulose (aprox. 50 nmol/cm²). Isso leva a efeitos de avidez e de nova ligação e, portanto, possibilita a identificação de interações peptídeo-anticorpo mesmo de baixa afinidade. Uma revisão abrangente, cobrindo 600 citações até 2006, resume extensamente estudos sobre o mapeamento de epitopos lineares e descontínuos, utilizando a tecnologia SPOT^TM para a síntese de peptídeos [51].

[00179] Depois da localização do epitopo de MAb 2c dentro dos 487 resíduos em N-terminal de gB, o mapeamento fino dos aminoácidos críticos para a ligação de anticorpo foi conseguida utilizando a

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99/111 abordagem de varredura de peptídeos, associada ao método de síntese SPOT^TM. Como mostrado na figura 20, MAb 2c reagiu mais forte ao peptídeo 15-mer 298SPFYGYREGSHTEHT312 (SEQ ID NO: 48), situado no sítio de ligação B, levando à suposição de que esta sequência está predominantemente envolvida no reconhecido por MAb 2c. Subsequentemente, a sequência de reconhecimento no sítio B poderia ser refinada por varredura de peptídeos de resolução mais alta para os aminoácidos 300 a 308 de gB. A confirmação final dos resíduos fundamentais do epitopo foi então conseguida por uma abordagem biológica, estudando a ligação de MAb 2c a células transfectadas com construtos de gB completa com mutações pontuais únicas, resultando na sequência 300FYGYRE305 (SEQ ID NO: 21). Além disso, o resíduo prolina 299 demonstrou ser importante in vivo apesar de sua exposição superficial muito limitada na estrutura tridimensional de gB [21]. Contudo, devido às restrições conformacionais impostas pela cadeia lateral da prolina - como resultado de sua natureza cíclica, a prolina estabiliza frequentemente uma sequência proteica em uma estrutura fixa - este resíduo é também supostamente essencial para o dobramento local de gB no sítio de ligação do anticorpo. O impacto dos resíduos fundamentais identificados foi corroborado por experimentos de proteção em camundongos, demonstrando que o efeito protetor de MAb 2c in vivo é abolido quando os resíduos fundamentais sofrem mutação. Em conjunto, esses dados comprovam que os aminoácidos 300 a 305 formam a parte essencial do epitopo energético de MAb 2c.

[00180] Como previsto, mutantes do HSV com mutações pontuais únicas dos resíduos fundamentais dentro do sítio B foram resistentes à ligação e a neutralização por MAb 2c. Todavia, a maioria dos mutantes virais encontrados era fortemente incapacitada, exibindo baixo crescimento em cultura celular ou membranas mucosas.

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Especialmente, o resíduo fenilalanina na posição 300 parece ser crucial para a função biológica de gB, pois tentativas para gerar mutantes virais viáveis com troca de aminoácido nesta posição não obtiveram êxito até o momento. Esse fato pode indicar uma função importante dese motivo de gB no ciclo lítico do vírus. Dessa forma, é intrigante especular se o epitopo de MAb2c pode representar um pouco do calcanhar de Aquiles da gB.

[00181] O mapeamento inicial de epitopos varredura de peptídeos indicou que o MAb 2c reconhece uma região adicional de gB, denominada sítio A. A determinação dos resíduos fundamentais neste sítio foi realizada por análise de substituições no peptídeo 178RYSQFMGIFEDRAPV192, demonstrando que os resíduos F186, E187 e D188 eram altamente sensíveis à substituição. A relevância destes aminoácidos no sistema biológico não pôde ser demonstrada porque a substituição destes resíduos em construtos de gB e em mutantes virais não afetou a ligação do anticorpo, mais provavelmente em decorrência da presença do motivo do sítio B na molécula.

[00182] Com base na estrutura em cristal, determinada recentemente, do domínio externo de gB [21], o monômero de gB foi dividido em seis domínios estruturais distintos. O domínio I compreende os aminoácidos 154 a 363. De acordo com os resultados apresentados neste relatório descritivo, os resíduos do epitopo energético mais importante de MAb 2c (sítio B) reside no domínio estrutural I. A sobreposição dos resíduos fundamentais do sítio B na estrutura em cristal de gB evidencia que estes resíduos estão situados na superfície de gB, dentro de um prolongamento do tipo alça de 22 aminoácidos entre as duas fitas β (β13, β14) no terço superior do domínio estrutural I. Os resíduos do sítio A 186FED188 estão também situados no domínio estrutural I, mas na base do domínio I da gB em uma pequena poço mal exposta, implicando que os dois sítios não

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101/111 estão em proximidade espacial. Não obstante, devido a similaridades estruturais de gB a outras glicoproteínas virais e de acordo com resultados da mutagênese pela inserção de ligante, é sugerido que a estrutura em cristal representa uma forma pós-fusão de gB [52-54]. O vírion, contudo, contém a forma pré-fusão de gB, sendo sugerido que anticorpos neutralizantes devem reconhecer a conformação pré-fusão de gB [21]. Não obstante, estudos recentes indicaram o reconhecimento de gB pré e pós-fusão por todos os MAbs testados, específicos para gB [55].

[00183] Uma explicação alternativa, mais atraente, com base nos dados experimentais associados à localização do sítio A, inserido na estrutura tridimensional de gB [21] e em relação ao sítio B, seria que o sítio A não é constituinte do epitopo descontínuo de MAb 2c. Os resultados da varredura de peptídeos e da análise de substituições sugerem que a mimetização de uma ou mais regiões do epitopo descontínuo, as quais obviamente não podem ser detectadas pelas metodologias aplicadas. O epitopo funcional inteiro, ou seja, todos os aminoácidos em contato com o MAb 2c, ao contrário do epitopo energético situado principalmente nos resíduos 300 a 305 do sítio B, somente pode ser detectado por raios X ou por técnicas de NMR do complexo anticorpo-antígeno [56, 57].

[00184] A hipótese de que o sítio A e, especialmente, o motivo FED mimetiza outra parte do epitopo descontínuo foi claramente apoiada pela tentativa de combinar os resíduos críticos do sítio B com a sequência FEDF derivada a partir do sítio, mediante um resíduo de glicina como elemento espaçador flexível, dentro de uma molécula ligada covalentemente (figura 26). Este peptídeo construído resultou em aumento imenso na intensidade de sinal, quando comparado ao peptídeo 90 do sítio B (consultar a figura 22), que se correlaciona com aumento em afinidade. A mimetização de sítios descontínuos de

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102/111 ligação por peptídeos, cobrindo regiões únicas de ligação reunidas em uma molécula sintética, foi descrita em diversas publicações, por exemplo, uma interleucina mimetiza um anticorpo que reconhece um epitopo descontínuo [49].

[00185] Diversos investigadores têm utilizado há anos anticorpos monoclonais para identificar domínios funcionais de gB do HSV [30, 32, 58-60]. Um estudo recente sugeriu a existência de pelo menos quatro regiões funcionais na estrutura inteira de gB, conforme definida pelo padrão de ligação de MAbs neutralizantes contra gB [55]. De acordo com esses resultados, o epitopo de MAb 2c está situado dentro da região funcional (FR) 1 que é formada pelo domínio estrutural I e a sequência do resíduo 697 ao 725 do domínio estrutural V, o último estendendo-se dos resíduos 670 a 727. Curiosamente, três dos MAbs neutralizantes mais potentes gerados por Bender et al. [55] foram mapeados também para o domínio I dentro da FR1, conforme determinado pela reatividade com um fragmento de clivagem proteolítica de gB, abrangendo os resíduos 98 a 472.

[00186] MAb 2c, suscitado pelo HSV tipo 1, reage de modo cruzado com o HSV tipo 2 [1, 2]. Os presentes autores compararam, portanto, as sequências de aminoácidos dos sítios A e B da gB do HSV-1 com a do HSV-2. Em todas as 53 gBs completas de HSV-2, encontradas no banco de dados de proteínas do NCBI (status em 30 de julho de 2010), as sequências de gB do HSV-1 178RYSQFMGIFEDRAPV192 (SEQ ID NO: 43) e 298SPFYGYREGSHTEHT312 (SEQ ID NO: 48) estavam presentes.

[00187] O principal objetivo da terapia com anti-HSV é eliminar rapidamente a replicação viral, portanto, o MAb 2c poderia propiciar uma ferramenta potencial para tratar infecções pelo HSV tipo 1 e 2. Em princípio, é possível buscar duas estratégias. Primeiramente, poderia ser demonstrado que anticorpos da especificidade e da

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103/111 bioatividade de MAb 2c podem ser induzidos por peptídeos derivados do sítio B ou do epitopo que mimetiza PFYGYRE-G-FEDF (SEQ ID NO: 52) e a imunização ativa poderia ser concebível. Uma abordagem alternativa para explorar o potencial profilático e terapêutico de MAb 2c seria converter o anticorpo de camundongo em uma molécula humanizada para imunização passiva, além de quimioterapia antiviral bem estabelecida.

Listagem de Referências

1. Eis-Hübinger AM, Mohr K, Schneweis KE (1992) Different mechanisms of protection by monoclonal and polyclonal antibodies during the course of herpes simplex virus infection. Intervirology 32:351-360

2. Eis-Hübinger AM, Schmidt DS, Schneweis KE (1993) Anti-glycoprotein B monoclonal antibody protects T cell-depleted mice against herpes simplex virus infection by inhibition of virus replication at the inoculated mucous membranes. J Gen Virol. 74:379-385

3. Whitley RJ, Roizman B (2001) Herpes simplex virus infections. Lancet 357:1513-1518

4. Roizman B, Knipe DM, Whitley RJ (2007) Herpes simplex viruses. In: Knipe DM, Howley (eds) Fields Virology, 5th edition Lippincott, pp 2501-2601

5. Gupta R, Warren T, Wald A (2007) Genital herpes. Lancet 370:2127-2137

6. Corey L, Wald A (2009) Maternal and neonatal herpes simplex virus infections. N Engl J Med 361:1376-1385

7. Pass RF, Whitley RJ, Whelchel JD, Diethelm AG, Reynolds DW, Alford CA (1979) Identification of patients with increased risk of infection with herpes simplex virus after renal transplantation. J Infect Dis 140:487-492

8. Siegal FC, Lopez C, Hammer GS, Brown AE, Kornfeld

Petição 870200022455, de 14/02/2020, pág. 108/123

104/111

SJ, Gold J, Hassett J, Hirschman SZ, Cunningham-Rundles C, Adelsberg BR, Parham DM, Siegal M, Cunningham-Rundles S, Armstrong D (1981) Severe acquired immunodeficiency in male homosexuals, manifested by chronic perianal ulcerative herpes simplex lesions. N Engl J Med 305:1439-1444

9. Bartlett JG (2004) Recent developments in the management of herpes simplex virus infection in HIV-infected persons. Clin Infect Dis 39 Suppl 5:S237-239

10. Cunningham AL, Diefenbach RJ, Miranda-Saksena M, Bosnjak L, Kim M, Jones C, Douglas MW (2006) The cycle of human herpes simplex virus infection: virus transport and immune control. J Infect Dis 194:S11-18

11. Cernik C, Gallina K, Brodell RT (2008) The treatment of herpes simplex infections: an evidence-based review. Arch Intern Med 168:1137-1144

12. Wilson SS, Fakioglu E, Herold BC (2009) Novel approaches in figurahting herpes simplex virus infections. Expert Rev Anti Infect Ther 7:559-568

13. Dasgupta G, Chentoufi AA, Nesburn AB, Wechsler SL, BenMohamed L (2009) New concepts in herpes simplex virus vaccine development: notes from the battlefield. Expert Rev Vaccines. 8:10231035

14. Pellett PE, Kousoulas KG, Pereira L, Roizman B (1985) Anatomy of the herpes simplex virus 1 strain F glycoprotein B gene: primary sequence and predicted protein structure of the wild type and of monoclonal antibody-resistant mutants. J Virol 53:243-253

15. Pereira L (1994) Function of glycoprotein B homologues of the family herpesviridae. Infect Agents Dis 3:9-28

16. Reske A, Pollara G, Krummenacher C, Chain BM, Katz DR (2007) Understanding HSV-1 entry glycoproteins. Rev Med Virol

Petição 870200022455, de 14/02/2020, pág. 109/123

105/111

17:205-215

17. Bzik DJ, Fox BA, DeLuca NA, Person S (1984) Sequência de nucleotídeos of a region of the herpes simplex virus type 1 gB glycoprotein gene: mutations affecting rate of virus entry and cell fusion. Virology 137:185-190

18. Cai WH, Gu B, Person S (1988) Role of glycoprotein B of herpes simplex virus type 1 in viral entry and cell fusion. J Virol 62:2596-2604

19. Butcher M, Raviprakash K, Ghosh HP (1990) Acid pHinduced fusion of cells by herpes simplex virus glycoproteins gB an gD. J Biol Chem 265:5862-5868

20. Bender FC, Whitbeck JC, Ponce de Leon M, Lou H, Eisenberg RJ, Cohen GH (2003) Specific association of glycoprotein B with lipid rafts during herpes simplex virus entry. J Virol. 77:9542-9552

21. Heldwein EE, Lou H, Bender FC, Cohen GH, Eisenberg RJ, Harrison SC (2006) Crystal structure of glycoprotein B from herpes simplex virus 1. Science 313:217-220

22. Hannah BP, Cairns TM, Bender FC, Whitbeck JC, Lou H, Eisenberg RJ, Cohen GH (2009) Herpes simplex virus glycoprotein B associates with target membranes via its fusion loops. J Virol. 83:6825-6836

23. Wright CC, Wisner TW, Hannah BP, Eisenberg RJ, Cohen GH, Johnson DC (2009) Fusion between perinuclear virions and the outer nuclear membrane requires the fusogenic activity of herpes simplex virus gB. J Virol 83:11847-11856

24. Atanasiu D, Whitbeck JC, de Leon MP, Lou H, Hannah BP, Cohen GH, Eisenberg RJ (2010) Bimolecular complementation defines functional regions of herpes simplex virus gB that are involved with gH/gL as a necessary step leading to cell fusion. J Virol 84:38253834

Petição 870200022455, de 14/02/2020, pág. 110/123

106/111

25. Ejercito PM, Kieff ED, Roizman B (1968) Characterization of herpes simplex virus strains differing in their effects on social behaviour of infected cells. J Gen Virol 2:357-364

26. Holland TC, Marlin SD, Levine M, Glorioso J (1983) Antigenic variants of herpes simplex virus selected with glycoproteinspecific monoclonal antibodies. J Virol 45:672-682

27. Kousoulas KG, Pellett PE, Pereira L, Roizman B (1984) Mutations affecting conformation or sequence of neutralizing epitopes identified by reactivity of viable plaques segregate from syn and ts domains of HSV-1(F) gB gene. Virology 135:379-394

28. Kousoulas KG, Huo B, Pereira L (1988) Antibodyresistant mutations in cross-reactive and type-specific epitopes of herpes simplex virus 1 glycoprotein B map in separate domains. Virology 166:423-431

29. Highlander SL, Dorney DJ, Gage PJ, Holland TC, Cai W, Person S, Levine M, Glorioso JC (1989) Identification of mar mutations in herpes simplex virus type 1 glycoprotein B which alter antigenic structure and function in virus penetration. J Virol 63:730-738

30. Pereira L, Ali M, Kousoulas K, Huo B, Banks T (1989) Domain structure of herpes simplex virus 1 glycoprotein B: neutralizing epitopes map in regions of continuous and discontinuous residues. Virology 172:11-24

31. Qadri I, Gimeno C, Navarro D, Pereira L (1991) Mutations in conformation-dependent domains of herpes simplex virus 1 glycoprotein B affect the antigenic properties, dimerization, and transport of the molecule. Virology 180:135-152

32. Navarro D, Paz P, Pereira L (1992) Domains of herpes simplex virus I glycoprotein B that function in virus penetration, cell-tocell spread, and cell fusion. Virology 186:99-112

33. McGeoch DJ, Dalrymple MA, Davison AJ, Dolan A,

Petição 870200022455, de 14/02/2020, pág. 111/123

107/111

Frame MC, McNab D, Perry LJ, Scott JE, Taylor P (1988) The complete DNA sequence of the long unique region in the genome of herpes simplex virus type 1. J Gen Virol 69:1531-1574

34. Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T (eds) (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY

35. Graham FL, van der Eb AJ (1973) A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA. Virology 52:456467

36. Stow ND, Wilkie NM (1976) An improved technique for obtaining enhanced infectivity with herpes simplex virus type 1 DNA. J Gen Virol 33:447-458

37. Frank R (1992) Spot synthesis: an easy technique for the positionally addressable, parallel chemical synthesis on a membrane support. Tetrahedron 48:9217-9232.

38. Kramer A and Schneider-Mergener J (1998) Synthesis and screening of peptide libraries on continuous cellulose membrane supports. Methods Mol Biol 87:25-39

39. Geysen HM, Rodda SJ, Mason TJ, Tribbick G, Schofs PG (1987) Strategies for epitope analysis using peptide synthesis. J Immunol Methods 102:259-274

40. Reineke U (2009) Antibody epitope mapping using de novo generated synthetic peptide libraries. Methods Mol Biol 524:203211

41. Pinilla C, Appel JR, Houghten RA (1993) Functional importance of amino acid residues making up peptide antigenic determinants. Mol Immunol 30:577-585

42. Reineke U, Ivascu C, Schlief M, Landgraf C, Gericke S, Zahn G, Herzel H, Volkmer-Engert R, Schneider-Mergener J (2002) Identification of distinct antibody epitopes and mimotopes from a

Petição 870200022455, de 14/02/2020, pág. 112/123

108/111 peptide array of 5520 randomly generated sequences. J Immunol Methods 267:37-51

43. Kahlon J, Whitley RJ (1988) Antibody response of the newborn after herpes simplex virus infection. J Infect Dis 158:925-933

44. Reed, LJ, Muench H. (1938) A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am J Hyg 27:493-497

45. Haste Andersen P, Nielsen M, Lund O (2006) Prediction of residues in discontinuous B-cell epitopes using protein 3D structures. Protein Sci 15:2558-2567

46. Van Regenmortel MHV (2009) What is a B-cell epitope? Methods Mol Biol 524 9;3-20

47. Korth C, Stierli B, Streit P, Moser M, Schaller O, Fischer R, Schulz-Schaeffer W, Kretzschmar H, Raeber A, Braun U, Ehrensperger F, Hornemann S, Glockshuber R, Riek R, Billeter M, Wüthrich K, Oesch B (1997) Prion (PrPSc)-specific epitope defined by a monoclonal antibody. Nature 390:74-77

48. Prodinger WM, Schwendinger MG, Schoch J, Kochle M, Larcher C, Dierich MP (1998) Characterization of C3dg binding to a recess formed between short consensus repeats 1 and 2 of complement receptor type 2 (CR2; CD21). J Immunol 161:4604-4610

49. Reineke U, Sabat R, Misselwitz R, Welfle H, Volk HD, Schneider-Mergener J (1999) A synthetic mimic of a discontinuous binding site on interleukin-10. Nat Biotechnol 3:271-275

50. Bian C, Zhang X, Cai X, Zhang L, Chen Z, Zha Y, Xu Y, Xu K, Lu W, Yan L, Yuan J, Feng J, Hao P, Wang Q, Zhao G, Liu G, Zhu X, Shen H, Zheng B, Shen B, Sun B (2009) Conserved amino acids W423 and N424 in receptor-binding domain of SARS-CoV are potential targets for therapeutic monoclonal antibody. Virology 383:3946

51. Reineke U, Schneider-Mergener J, Schutkowski M

Petição 870200022455, de 14/02/2020, pág. 113/123

109/111 (2006) Peptide arrays in proteomics and drug discovery. In: Ozkan M and Heller MJ (eds) BioMEMS and biomedical nanotechnology, volume II, micro/nano technology for genomics and proteomics, Springer, Berlin, pp161-282

52. Roche S, Bressanelli S. Rey FA, Gaudin (2006) Crystal structure of the low-pH form of the vesicular stomatitis virus glycoprotein G. Science 313:187-191

53. Roche S, Rey FA, Gaudin Y, Bressanelli S (2007) Structure of the prefusion form of the vesicular stomatitis virus glycoprotein G. Science 315: 843-848

54. Lin E, Spear PG (2007) Random linker-insertion mutagenesis to identify functional domains of herpes simplex virus type 1 glycoprotein B. Proc Natl Acad Sci U S A 104:13140-13145

55. Bender FC, Samanta M, Heldwein EE, de Leon MP, Bilman E, Lou H, Whitbeck JC, Eisenberg RJ, Cohen GH (2007) Antigenic and mutational analyses of herpes simplex virus glycoprotein B reveal four functional regions. J Virol 81:3827-3841

56. Sundberg EJ (2009) Structural basis of antibody-antigen interactions. Methods Mol Biol 524:23-36

57. Rosen O, Anglister J (2009) Epitope mapping of antibody-antigen complexes by nuclear magnetic resonance spectroscopy. Methods Mol Biol:524: 37-57

58. Highlander SL, Cai WH, Person S, Levine M, Glorioso JC (1988) Monoclonal antibodies define a domain on herpes simplex virus glycoprotein B involved in virus penetration. J Virol 62:1881-1888

59. Sanchez-Pescador L, Pereira L, Charlebois ED, Kohl S (1993) Antibodies to epitopes of herpes simplex virus type 1 glycoprotein B (gB) in human sera: analysis of functional gB epitopes defined by inhibition of anticorpos monoclonais murinos. J Infect Dis 168:844-853

Petição 870200022455, de 14/02/2020, pág. 114/123

110/111

60. Li W, Minova-Foster TJ, Norton DD, Muggeridge MI (2006) Identification of functional domains in herpes simplex virus 2 glycoprotein B. J Virol 80:3792-3800

REFERÊNCIAS

DK 187286

JP6135854

US 4,950,595

US 6,180,370

WO 2003/105782

WO 1997/26329

Eis-Hübinger, A.M., K. Mohr, and K.E. Schneweis, Different mechanisms of protection by monoclonal and polyclonal antibodies during the course of herpes simplex virus infection. Intervirology, 1991. 32(6): p. 351-360.

Eis-Hübinger, A.M., D.S. Schmidt, and K.E. Schneweis, Anti-glycoprotein B monoclonal antibody protects T cell-depleted mice against herpes simplex virus infection by inhibition of virus replication at the inoculated mucous membranes. J.Gen.Virol., 1993. 74 ( Pt 3): p. 379-385.

Highlander, S.L., et al., Monoclonal antibodies define a domain on herpes simplex virus glycoprotein B involved in virus penetration. J Virol, 1988. 62(6): p. 1881-8.

Queen, C., et al., A humanized antibody that binds to the interleukin 2 receptor. Proc Natl Acad Sci U S A, 1989. 86(24): p. 10029-33.

Krauss, J., et al., Specificity grafting of human antibody frameworks selected from a phage display library: generation of a highly stable humanized anti-CD22 single-chain Fv fragment. Protein Eng, 2003. 16(10): p. 753-9.

Koga, J., S. Chatterjee, and R.J. Whitley, Studies on herpes

Petição 870200022455, de 14/02/2020, pág. 115/123

111/111 simplex virus type 1 glycoproteins using monoclonal antibodies.

Virology, 1986. 151(2): p. 385-9.

Co, M.S., et al., Humanized antibodies for antiviral therapy. Proc Natl Acad Sci U S A, 1991.88(7): p. 2869-73.

Zeitlin, L., et al., A humanized monoclonal antibody produced in transgenic plants for immunoprotection of the vagina against genital herpes. Nat Biotechnol, 1998. 16(13): p. 1361-4.

Navarro, D., P. Paz, and L. Pereira, Domains of herpes simplex virus I glycoprotein B that function in virus penetration, cell-tocell spread, and cell fusion. Virology, 1992. 186(1): p. 99-112.

Kabat, EA, Wu TT, Perry H, Gottesman K, Foeller C. Sequences of Proteins of Immunological Interest (ed 5). Bethesda: NIH Publication No. 91-3242; 1991.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo, caracterizado pelo fato de que reconhece o mesmo epitopo que um anticorpo que compreende:

as regiões determinantes de complementaridade mostradas em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6 em que o anticorpo possui constante de dissociação KD de no máximo 40 nM, de preferência de no máximo 30 nM, mais preferivelmente de no máximo 20 nM, ainda mais preferivelmente de no máximo 15 nM, no máximo 13 nM, no máximo 10 nM e, o mais preferível, de no máximo 7 nM, e em que o referido epitopo está localizado nos aminoácidos 295 a 313 da glicoproteína gB do HSV1 e HSV2.
2. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende as regiões determinantes de complementaridade mostradas em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6.
3. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o anticorpo em concentração de no máximo 20 nM, de preferência de no máximo 16 nM, mais preferivelmente de no máximo 12 nM, de no máximo 10 nM, de no máximo 8 nM, de no máximo 6 nM e, o mais preferível, de no máximo 4 nM, é capaz de neutralizar uma quantidade definida de HSV de 100 TCID50.
4. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma sequência de aminoácidos com os resíduos de aminoácidos mostrados nas posições 1 a 30, 38 a 51, 68 a 99 e 112 a 122 da SEQ ID NO: 9 e nas posições 1 a 23, 40 a 54, 62 a 93 e 103 a 113 da SEQ ID NO: 10.

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5. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma sequência de aminoácidos com os resíduos de aminoácidos mostrados nas posições 1 a 30, 38 a 51, 68 a 99 e 112 a 122 da SEQ ID NO: 7 e nas posições 1 a 23, 41 a 55, 63 a 94 e 104 a 114 da SEQ ID NO: 8.
6. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é anticorpo bivalente ou multivalente.
7. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o anticorpo está conjugado a uma parte efetora, uma parte ativa terapêutica ou a um marcador detectável.
8. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende uma quantidade eficaz do anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7 e pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável.
9. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de ser para uso como fármaco.