CN117460833A - 表达抗ror1/抗cd3双特异性抗体的溶瘤病毒 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了与ROR1和CD3结合的双特异性抗体，以及编码核酸构建体的溶瘤病毒，所述核酸构建体编码此类双特异性抗体。还包括使用所述双特异性抗体和编码其的溶瘤病毒治疗癌症的方法。

Description

表达抗ROR1/抗CD3双特异性抗体的溶瘤病毒
本申请根据35 U.S.C.§119要求于2021年4月9日提交的美国临时申请第63/173,205号的优先权权益，所述美国临时申请的全部内容通过引用整体并入。
技术领域
本公开提供了同时与ROR1和CD3两者结合的双特异性抗体。本公开提供了抗ROR1/抗CD3双特异性抗体、编码抗ROR1/抗CD3双特异性抗体的核酸、包括编码抗ROR1/抗CD3双特异性抗体的构建体的溶瘤病毒以及用于治疗癌症的方法。
背景技术
受体酪氨酸激酶孤儿受体-1和-2(ROR1和ROR2)已被描述为与特定癌症特异性相关(Rebagay等人,2012,《肿瘤学前沿(Front Oncol)》,2(34))，而在健康组织上的表达很大程度上不存在，只有少数例外(Balakrishnan等人,2017,《临床癌症研究(Clin.CancerRes)》,23(12),3061-3071)。由于ROR家族成员的肿瘤选择性表达，其代表了靶向癌症疗法的相关靶标。
受体酪氨酸激酶孤儿受体-1(ROR1)在B细胞慢性淋巴细胞白血病(CLL)和套细胞淋巴瘤(MCL)中异常表达。ROR1与慢性淋巴细胞白血病(CLL)表现出近100％的相关性(Cui等人,2016,《血液(Blood)》,128(25),2931)，并且已被确定为一些急性淋巴细胞白血病(ALL)、套细胞淋巴瘤和其它一些血液恶性肿瘤的标志物。ROR1也在某些实体瘤，如肺癌和乳腺癌的实体瘤中表达(Balakrishnan等人,2017,《临床癌症研究》,23(12),3061-3071)。ROR1已被发现参与许多实体瘤的进展，如神经母细胞瘤、肉瘤、肾细胞癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌、头颈癌和黑色素瘤，并已被证明抑制细胞凋亡，增强EGFR信号传导，诱导上皮间充质转化(EMT)和促进肺泡形成。
ROR1主要在胚胎组织中可检测到，并且通常在成人组织中不存在，这使所述蛋白成为癌症疗法的理想药物靶标。ROR1因此已被认为是开发ROR1特异性抗体的靶标。然而，由于ROR1在不同哺乳动物物种之间的高度同源性，其在人与食蟹猴之间的氨基酸水平上是100％保守的，在人与小鼠之间是96.7％同源的，并且在人与兔之间是96.3％同源的，因此很难通过标准技术，如动物免疫接种产生针对此靶标的高亲和力抗体。
溶瘤病毒是选择性感染和裂解癌细胞的病毒。溶瘤病毒已经成为用于治疗各种癌症的临床试验的对象，所述癌症包括黑素瘤、神经胶质瘤、头颈癌、卵巢癌、肺癌、肝癌、膀胱癌、前列腺癌和胰腺癌(Aghi和Martuza(2005)《癌基因(Oncogene)》24:7802-7816)。多个临床试验已经证明溶瘤单纯疱疹病毒(HSV)通过缺失至少一个拷贝的编码ICP34.5的基因而使其在正常细胞中复制的能力弱化的安全性(Rampling等人,(2000)《基因疗法(GeneTherapy)》7:859-866；Papanastassiou等人,(2002)《基因疗法》9:398-406；Makie等人,(2001)《柳叶刀(Lancet)》357:525-526；Markert等人,(2000)《基因疗法》7:867-874；Markert等人,(2009)《分子疗法(Molecular Therapy)》17:199-207；Senzer等人,(2009)《临床肿瘤学杂志(J Clin Oncol)》27:5763-5771)。
除了通过裂解癌细胞直接攻击肿瘤之外，溶瘤HSV可以在患者体内诱导抗肿瘤免疫应答(Papanastassiou等人,(2002)；Markert等人,(2009)；Senzer等人,(2009))，因为病毒抗原在受感染癌细胞上表达，并且当癌细胞被裂解时释放肿瘤抗原。病毒还调动(engage)先天免疫应答的介体，作为病毒感染的宿主识别的一部分，产生炎性应答(Hu等人,(2006)《临床癌症研究》12:6737-6747)。对溶瘤病毒治疗的这些免疫应答可以为癌症患者提供全身性益处，从而抑制未被病毒感染的肿瘤，包括转移性肿瘤，并且可以预防疾病复发。
发明内容
本申请描述了同时与ROR1和CD3结合的双特异性抗体(αROR1/αCD3 Bsp Ab)。将编码如本文所描述的αROR1/αCD3 Bsp Ab的构建体克隆到衍生自HSV 17的不包括功能性RL-1基因的溶瘤HSV-1病毒(“Seprehvec”)中。使用病毒感染的细胞产生包括双特异性抗体的无病毒细胞培养基(VFCM)，所述抗体测试其增强T细胞对表达ROR1的肿瘤细胞的细胞毒性的能力。本文所公开的αROR1/αCD3 BspAb在临床前研究中证明了具有特异性抗肿瘤活性的强效的T细胞靶向性。溶瘤Seprehvec HSV表达的αROR1/αCD3 BspAb以抗原依赖性方式显著增加了病毒治疗的抗肿瘤活性。
本文在第一方面中提供了一种双特异性抗体，其包括与ROR1结合的第一单链可变片段抗体(ScFv)和与CD3结合的第二单链可变片段抗体(ScFv)，其中所述抗RORI scFv和所述抗CD3 scFv通过接头连接。所述接头可以是例如GS接头，如但不限于(G4S)n接头，其中n可以是1-20的整数，例如1-8。所述抗ROR1/抗CD3双特异性抗体(αROR1/αCD3 BspAb)可以是分离的蛋白，并且在一些实施方式中是部分或基本上纯化的。
所述双特异性抗体的所述抗ROR1 scFv可以具有通过接头，如(G4S)n接头连接的重链可变结构域(VH)序列和轻链可变结构域(VL)序列，并且所述VH和所述VL序列可以衍生自与ROR1结合，例如与人ROR1蛋白结合的单克隆抗体。例如，所述双特异性抗体的所述抗ROR1 scFv可以包括与SEQ ID NO:1具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的VH结构域序列，以及与SEQ ID NO:5具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的VH结构域序列。在另一个实施方式中，所述双特异性抗体的所述抗ROR1 scFv可以包括与SEQ ID NO:10具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的VH结构域序列，以及与SEQ ID NO:14具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的VH结构域序列。在另外的实施方式中，所述双特异性抗体的所述抗ROR1 scFv可以包括与SEQ ID NO:19具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的VH结构域序列，以及与SEQ ID NO:23具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的VH结构域序列。
在另外的实施方式中，所述双特异性抗体的所述抗ROR1 scFv可以包括与SEQ IDNO:52具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的VH结构域序列，以及与SEQ ID NO:56具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的VH结构域序列；或者所述双特异性抗体的所述抗ROR1 scFv可以包括与SEQ ID NO:60具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的VH结构域序列，以及与SEQ IDNO:64具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的VH结构域序列。
在各个实施方式中，如本文所提供的抗ROR1/抗CD3双特异性抗体(αROR1/αCD3BspAb)的所述抗ROR1 scFv可以具有与SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:27具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。
在非限制性实施方式中，本文所提供的所述αROR1/αCD3 BspAb的所述抗CD3 scFv可以是包括与SEQ ID NO:32具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的重链可变结构域和与SEQ ID NO:33具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的轻链可变结构域的抗CD3 scFv。在一些实施方式中，所述抗CD3 scFv包括与SEQ ID NO:34具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。
本文所提供的另外的方面是编码本文所公开的任何所述αROR1/αCD3 BspAb的核酸构建体。由核酸构建体编码的αROR1/αCD3 BspAb可以包括在双特异性抗体构建体的N末端处的信号肽，例如SEQ ID NO:28的信号肽或任何合适的信号肽。所述核酸构建体可以是包括与所述αROR1/αCD3 BspAb编码序列可操作地连接的启动子的DNA构建体。作为非限制性实施方式，所述启动子可以是EF1α启动子、CMV启动子(例如，SEQ ID NO:42)、JeT启动子、RSV启动子、SV40启动子、CAG启动子，β-肌动蛋白启动子、HTLV启动子或EF1α/HTLV杂合启动子(例如，SEQ ID NO:41)。所述核酸构建体可以进一步包括BspAb编码序列的聚腺苷酸化序列3'，例如，SV40 3'序列。所述核酸构建体可以在载体中提供，并且在一些实施方式中可以克隆到重组病毒基因组中。
本文所提供的另外的方面是一种重组溶瘤病毒，其包括核酸构建体，所述核酸构建体包括编码根据本文所公开的任一项的αROR1/αCD3 BspAb的核酸序列。在各个实施方式中，所述重组溶瘤病毒是例如重组单纯疱疹病毒(HSV)，以及HSV-1病毒，如衍生自HSV-1病毒株17、HSV-1病毒株F、HSV-1病毒株KOS或HSV-1病毒株JS1的病毒。在一些实施方式中，包括如本文所提供的用于表达αROR1/αCD3 BspAb的遗传构建体的重组溶瘤HSV不包括功能性ICP34.5编码基因，并且在一些实施方式中，可以缺失所述ICP34.5编码基因的全部或一部分。例如，所述重组溶瘤HSV可以衍生自HSV 17病毒株，并且可以将编码αROR1/αCD3 BspAb的所述核酸构建体插入到ICP34.5编码基因座中。
在某些实施方式中，包括核酸构建体的重组溶瘤病毒可以进一步包括编码细胞因子的核酸序列，所述核酸构建体包括编码αROR1/αCD3 BspAb的核酸序列。例如，溶瘤病毒可以包括编码αROR1/αCD3 BspAb的基因和编码IL-12的基因。在本文所公开的具体实施方式中，溶瘤病毒包括编码αROR1/αCD3 BspAb的基因，如本文所公开的任何基因，以及编码IL-12的基因，例如与SEQ ID NO:46具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的人IL-12。在一些实施方式中，溶瘤病毒可以包括编码αROR1/αCD3 BspAb的基因和编码不同抗体的基因，例如与生长因子或生长因子受体(如VEGFR2)结合的scFv。在本文所公开的具体实施方式中，溶瘤病毒包括编码αROR1/αCD3 BspAb的基因，如本文所公开的任何基因，以及编码抗VEGFR2 scFv的基因，例如与SEQ ID NO:49具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的抗VEGFR2 scFV。在一些实施方式中，如本文所公开的溶瘤病毒编码1)αROR1/αCD3 BspAb；2)IL-12多肽，以及3)抗VEGFR2 scFv。
进一步包括一种药物组合物，其包含重组溶瘤病毒以及药学上可接受的赋形剂，所述重组溶瘤病毒可以是重组溶瘤HSV，其包括用于表达αROR1/αCD3 BspAb的遗传构建体，以及任选地，一种或多种另外的转基因。所述溶瘤病毒可以在盐水溶液中提供，例如，如PBS、林格氏(Ringer's)或HBSS，并且作为非限制性实施方式，调配物可以任选地进一步包括一种或多种防腐剂或冷冻保护剂(例如，DMSO或甘油)。在一些实施方式中，所述药物组合物中病毒的浓度为至少106/ml、至少107/ml、至少5x 107/ml或至少108/ml。
又另一个方面是通过施用如本文所提供的编码αROR1/αCD3 BspAb的溶瘤病毒来治疗癌症的方法，包括如本文所提供的药物组合物。所述溶瘤病毒可以包括一种或多种另外的转基因，如但不限于编码IL-12多肽的基因和/或编码与VEGFR2结合的抗体的基因。所述对象可以是被诊断为患有癌症的对象，所述癌症可以是血液癌或实体瘤。作为非限制性实施方式，所述对象可以是狗、马或灵长类动物，并且可以是人类对象。所述溶瘤病毒可以是溶瘤HSV，并且所述施用可以是例如静脉内、动脉内、腔内、腹膜内、瘤内或瘤周递送。例如，所述溶瘤病毒可以通过注射、通过输注或通过导管递送。所述方法可以包括多次施用，其中给药可以间隔几天、几周或几月。
还提供了使用VFCM治疗对象的方法，所述VFCM通过培养被本文所公开的任何溶瘤病毒感染的细胞而产生。
本文还提供了被溶瘤病毒感染的宿主细胞，所述溶瘤病毒包括如本文所提供的用于表达αROR1/αCD3 BspAb的遗传构建体。所述宿主细胞可以是例如哺乳动物宿主细胞，并且可以是细胞系。在一些实施方式中，所述宿主细胞是Vero细胞、BHK细胞或HEK293细胞。还提供了使用VFCM治疗患有癌症的对象的方法，所述VFCM通过培养被本文所公开的任何溶瘤病毒感染的细胞而产生。所述VCFM可以通过例如离心和过滤细胞上清液来制备，其中所述VFCM可以包括由所述溶瘤病毒编码的一种或多种重组多肽，例如如本文所提供的αROR1/αCD3 BspAb，以及任选地IL-12和/或抗VEGFR2抗体。在一些实施方式中，待治疗的所述对象可以是非人对象。
在另外的方面中，提供了用于产生双特异性抗体的方法，包括产生本文所公开的任何αROR1/αCD3双特异性抗体，所述方法通过培养被溶瘤病毒感染的宿主细胞，所述溶瘤病毒包括用于表达双特异性抗体的遗传构建体以产生包括双特异性抗体的无病毒条件细胞培养基(VFCM)，并从VFCM中分离双特异性抗体。所述VFCM可以包括一种或多种另外的多肽或抗体，如但不限于与VEGFR2结合的IL-12多肽和/或抗体。进一步包括药物组合物，其包括如本文所公开的αROR1/αCD3双特异性抗体和通过向患有癌症的对象施用如本文所公开的αROR1/αCD3双特异性抗体来治疗所述对象的方法。在一些实施方式中，所述方法包括用VFCM治疗对象，如但不限于非人类对象，所述VFCM可以使用例如离心和过滤从细胞培养物中制备。
附图说明
图1是示出编码抗ROR1/抗CD3双特异性抗体(从右至左转录)的构建体的实施方式的示意图。
图2A展示了抗ROR1/抗CD3双特异性抗体的ELISA检测测定的形式。
图2B提供了被HSV SepGI-189、SepGI-201和SepGI-203感染的细胞产生的抗ROR1/抗CD3双特异性抗体的结合曲线。对细胞培养物的VFCM进行了测定。
图3A展示了抗ROR1/抗CD3双特异性抗体的细胞结合测定的形式。野生型A549细胞表达ROR1；还测试了针对ROR1基因而被敲除的A549细胞作为对照。
图3B提供了抗ROR1/抗CD3双特异性抗体的细胞结合测定结果。对被抗ROR1/抗CD3BspAb编码病毒SepGI-189、SepGI-201和SepGI-203感染的细胞的培养物的VFCM进行了测定。
图4A展示了T细胞-肿瘤细胞相互作用测定的形式。
图4B提供了被HSV SepGI-189、SepGI-201和SepGI-203感染的培养物的VFCM中存在的αROR1/αCD3 BsAb介导的T细胞-肿瘤细胞相互作用的流式细胞术分析的结果。
图5A展示了抗ROR1/抗CD3双特异性抗体的基于荧光素酶的细胞信号传导测定的形式。
图5B提供了使用被HSV SepGI-189、SepGI-201和SepGI-203感染的培养物的VFCM的细胞信号传导测定的结果。
图6提供了包括T细胞和具有被HSV SepGI-189、SepGI-201和SepGI-203感染的培养物的VFCM的细胞毒性测定中的杀伤百分比。右侧的图中还提供了T细胞分泌的干扰素γ(IFNγ)。
图7A提供了抗ROR1抗体与A549、A549/ROR1 KO、MCF-7和HepG2肿瘤细胞的结合图。
图7B提供了包括T细胞和具有被表达αROR1/αCD3 BsAb的SepGI-201HSV感染的培养物的VFCM，使用A549、MCF-7和HepG2肿瘤细胞作为靶标的细胞毒性测定中的杀伤百分比图。对照包括在没有T细胞的情况下的测定，以及被不表达αROR1/αCD3 BsAb的SepGI-Null病毒感染的细胞产生的VFCM的测定。还提供了共培养物的IFNγ测定的结果。
图8A提供了通过表达αROR1/αCD3 BsAb的HSV杀伤A549肿瘤细胞的测定步骤。
图8B提供的图表明了用于以各种MOI感染培养物的病毒对ROR1阳性肿瘤细胞和ROR1敲除细胞的增强杀伤。
图9A展示了通过抗ROR1/抗CD3双特异性抗体与小鼠ROR1的结合的ELISA检测测定的形式。
图9B提供了针对小鼠ROR1的抗体s10和jlv1011的结合曲线。
图10A提供了用HSV SepGI-189和SepGI-201处理肿瘤的体内研究的肿瘤接种和处理时间表。
图10B提供了用HSV SepGI-189和SepGI-201处理的A549肿瘤接种的小鼠的肿瘤体积图。
图10C提供了用HSV SepGI-Null、SepGI-189和SepGI-201处理的小鼠的肿瘤生长抑制百分比图。
图10D提供了图10A、B和C所示研究过程中的体重图。
图11A是示出编码抗ROR1/抗CD3双特异性抗体(从右至左转录)和人IL-12多肽(从左至右转录)的构建体的实施方式的示意图。
图11B是显示编码抗ROR1/抗CD3双特异性抗体(从右至左转录)和抗VEGFR2 scFv以及人IL-12多肽的构建体的实施方式的示意图。抗VEGFR2 scFv和人IL-12多肽通过相同的启动子从左到右转录，并且其编码序列通过T2A自切割肽编码序列连接。
图12A提供了用于检测被不同HSV感染的细胞的VFCM中的抗RSV抗体的ELISA结果。所述图示出SepGI-207和SepGI-218VFCM包括了抗RSV抗体。
图12B提供了用于检测被不同HSV感染的细胞的VFCM中的抗ROR1抗体的ELISA结果。所述图示出SepGI-201、SepGI-212和SepGI-216VFCM包括了抗ROR1抗体。
图12C提供了用于检测被不同HSV感染的细胞的VFCM中的人IL-12的ELISA结果。所述图示出SepGI-212、SepGI-216和SepGI-218VFCM包括了人IL-12。
图13提供了用于检测被不同HSV感染的细胞的VFCM中的抗VEGFR2抗体的ELISA结果。所述图示出SepGI-212的分离物的VFCM包括了抗VEGFR2抗体。
图14为条形图，提供了检测被HSV SepGI-Null、SepGI-201、SepGI-207、SepGI-212、SepGI-214、SepGI-216和SepGI-218感染的细胞的VFCM中的IL-12活性的测定结果。
图15A提供了未标记的肿瘤细胞的流式细胞术结果。
图15B提供了用eFluor 450标记的肿瘤细胞的流式细胞术结果。
图15C提供了用eFluor 670标记的人T细胞的流式细胞术结果。
图15D提供了包括抗ROR1-抗CD3双特异性抗体的经标记的肿瘤细胞和与VFCM共温育的经标记的T细胞的流式细胞术结果。
图16A提供了当肿瘤细胞是Hepa 1-6、A549和A549 ROR1敲除细胞时，通过流式细胞术测定确定的由SepGI-218VFCM(αRSV-αCD3 bsp抗体加IL-12)介导的肿瘤细胞-T细胞相互作用相对于所分析细胞的百分比的结果的条形图。
图16B提供了当肿瘤细胞是Hepa 1-6和A549细胞时，通过流式细胞术测定确定的由SepGI-201VFCM(αROR1-αCD3 bsp抗体)介导的肿瘤细胞-T细胞相互作用相对于所分析细胞的百分比的结果的条形图。
图16C提供了当肿瘤细胞是Hepa 1-6和A549细胞时，通过流式细胞术测定确定的由SepGI-216VFCM(αROR1-αCD3 bsp抗体加IL-12和VEGFR2抗体)介导的肿瘤细胞-T细胞相互作用相对于所分析细胞的百分比的结果的条形图。
图17A是示出3天内T细胞激活测定中使用的活CD3+T细胞的百分比的图，其中T细胞已在存在ROR1敲除肿瘤靶细胞的情况下温育(每天的条形图从左至右排列)：未感染细胞的VFCM、被SepGI-Null感染的细胞的VFCM、被SepGI-207感染的细胞的VFCM、被SepGI-201感染的细胞的VFCM和CD3/CD28珠粒。每对条形图中的第一个条形图提供以10:1的E:T比率进行的测定的值，并且每对条形图中的第二个条形图提供以5:1的E:T比率进行的测定的值。
图17B是提供T细胞激活测定中的每一种的CD3+CD4+细胞计数的图。测定VFCM和E:T比率如图17A所示。
图17C提供了激活测定中CD25+T细胞相对于CD3+CD4+细胞的百分比，其中T细胞已在存在ROR1+肿瘤靶细胞的情况下温育(每天的条形图从左至右排列)：未感染细胞的VFCM、被SepGI-Null感染的细胞的VFCM、被SepGI-207感染的细胞的VFCM、被SepGI-201感染的细胞的VFCM和CD3/CD28珠粒。每对条形图中的第一个条形图提供以10:1的E:T比率进行的测定的值，并且每对条形图中的第二个条形图提供以5:1的E:T比率进行的测定的值。
图17D提供了激活测定中CD69+T细胞相对于CD3+CD4+细胞的百分比，其中T细胞已在存在ROR1+肿瘤靶细胞的情况下温育(每天的条形图从左至右排列)：未感染细胞的VFCM、被SepGI-Null感染的细胞的VFCM、被SepGI-207感染的细胞的VFCM、被SepGI-201感染的细胞的VFCM和CD3/CD28珠粒。每对条形图中的第一个条形图提供以10:1的E:T比率进行的测定的值，并且每对条形图中的第二个条形图提供以5:1的E:T比率进行的测定的值。
图17E是示出3天内T细胞激活测定中使用的活CD3+T细胞的百分比图，其中T细胞已在存在ROR1+肿瘤靶细胞的情况下温育(每天的条形图从左至右排列)：未感染细胞的VFCM、被SepGI-Null感染的细胞的VFCM、被SepGI-207感染的细胞的VFCM、被SepGI-201感染的细胞的VFCM和CD3/CD28珠粒。每对条形图中的第一个条形图提供以10:1的E:T比率进行的测定的值，并且每对条形图中的第二个条形图提供以5:1的E:T比率进行的测定的值。
图17F是提供T细胞激活测定中的每一种的CD3+CD4+细胞计数的图。测定VFCM和E:T比率如图17E所示。
图17G提供了激活测定中CD25+T细胞相对于CD3+CD4+细胞的百分比，其中T细胞已在存在ROR1+肿瘤靶细胞的情况下温育(每天的条形图从左至右排列)：未感染细胞的VFCM、被SepGI-Null感染的细胞的VFCM、被SepGI-207感染的细胞的VFCM、被SepGI-201感染的细胞的VFCM和CD3/CD28珠粒。每对条形图中的第一个条形图提供以10:1的E:T比率进行的测定的值，并且每对条形图中的第二个条形图提供以5:1的E:T比率进行的测定的值。
图17H提供了激活测定中CD69+T细胞相对于CD3+CD4+细胞的百分比，其中T细胞已在存在ROR1+肿瘤靶细胞的情况下温育(每天的条形图从左至右排列)：未感染细胞的VFCM、被SepGI-Null感染的细胞的VFCM、被SepGI-207感染的细胞的VFCM、被SepGI-201感染的细胞的VFCM和CD3/CD28珠粒。每对条形图中的第一个条形图提供以10:1的E:T比率进行的测定的值，并且每对条形图中的第二个条形图提供以5:1的E:T比率进行的测定的值。
图18A是示出3天内T细胞激活测定中使用的活CD3+T细胞的百分比图，其中T细胞已在存在A549野生型(ROR1+)肿瘤靶细胞的情况下温育(每天的条形图从左至右排列)：被SepGI-Null感染的细胞的VFCM、被SepGI-207感染的细胞的VFCM、被SepGI-201感染的细胞的VFCM、被SepGI-218感染的细胞的VFCM和被SepGI-216感染的细胞的VFCM。以5:1的E:T比率进行了测定。
图18B是示出3天内T细胞激活测定中使用的活CD3+T细胞的百分比图，其中T细胞已在存在A549 ROR1敲除肿瘤靶细胞的情况下温育(每天的条形图从左至右排列)：被SepGI-Null感染的细胞的VFCM、被SepGI-207感染的细胞的VFCM、被SepGI-201感染的细胞的VFCM、被SepGI-218感染的细胞的VFCM和被SepGI-216感染的细胞的VFCM。以5:1的E:T比率进行了测定。
图19A是示出在不存在和存在T细胞的情况下基于荧光素酶的毒性测定结果的图，其中靶标是表达荧光素酶的A549野生型细胞，并且在存在未感染的细胞或被SepGI-Null、SepGI-201、SepGI-207、SepGI-212、SepGI-214、SepGI-216和SepGI-218感染的细胞的VFCM的情况下进行了测定。
图19B是示出在不存在和存在T细胞的情况下基于荧光素酶的毒性测定结果的图，其中靶标是表达荧光素酶的A549 ROR1敲除细胞，并且在存在未感染的细胞或被SepGI-Null、SepGI-201、SepGI-207、SepGI-212、SepGI-214、SepGI-216和SepGI-218感染的细胞的VFCM的情况下进行了测定。
图19C是提供图17C的测定的杀伤百分比的图。
图19D是提供图17B的测定的杀伤百分比的图。
图20示出了在使用A549野生型细胞作为靶标的基于阻抗的细胞毒性测定中细胞随时间的细胞指数。参见实施例18。
图21示出了在使用A549敲除细胞作为靶标的基于阻抗的细胞毒性测定中细胞随时间的细胞指数。参见实施例18。
具体实施方式
在整个申请中，引用各种公开、专利和/或专利申请。所述公开、专利和/或专利申请的公开内容特此以全文引用的方式并入本申请中，以便更充分地描述本公开所涉及的领域的现状。
定义：
除非另外定义，否则本文使用的技术和科学术语具有本领域普通技术人员通常理解的含义。通常，适合于本文所描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、基因学、转基因细胞产生、蛋白质化学和核酸化学以及杂交的术语是本领域众所周知和常用的。除非另外说明，否则通常根据本领域众所周知的常规步骤以及如本文中引用和讨论的各个一般和更具体的参考文献中所描述的执行本文所提供的方法和技术。参见例如Sambrook等人,《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)》,第2版,纽约冷泉港的冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,N.Y.)(1989)以及Ausubel等人,《分子生物学实验指南(CurrentProtocols in Molecular Biology)》,格林出版协会(1992)。许多基础文本都描述了标准抗体产生过程，包括Borrebaeck(编辑)《抗体工程化(Antibody Engineering)》,第2版纽约弗里曼公司(Freeman and Company,NY),1995；McCafferty等人,《抗体工程化实用方法(Antibody Engineering,A Practical Approach)》英国牛津牛津出版社(Oxford Press,Oxford,England)IRL,1996；以及Paul(1995)《抗体工程化方案(Antibody EngineeringProtocols)》新泽西托托瓦哈门那出版社(Humana Press,Towata,N.J.),1995；Paul(编辑),《基础免疫学(Fundamental Immunology)》,纽约瑞文出版社(Raven Press,N.Y),1993；Coligan(1991)《当代免疫学实验指南(Current Protocols in Immunology)》纽约威利/格林(Wiley/Greene,NY)；Harlow和Lane(1989)《抗体：实验室手册(Antibodies:ALaboratory Manual)》,纽约冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Press,NY)；Stites等人,(编辑)《基础和临床免疫学(Basic and Clinical Immunology)》(第4版)加利福尼亚州洛思阿图斯的朗格医学公开(Lange Medical Publications,Los Altos,Calif.)以及其中引用的参考文献；《编码单克隆抗体：原理与实践(Coding MonoclonalAntibodies:Principles and Practice)》(第2版)纽约州纽约市的学术出版社(AcademicPress,New York,N.Y.),1986，以及Kohler和Milstein《自然(Nature)》256:495-497,1975。本文中所引用的所有参考文献通过引用整体并入本文中。酶促反应和富集/纯化技术也是众所周知的并且如本领域通常实现的或如本文所描述的根据制造商的说明书执行。与本文所描述的分析化学、合成有机化学以及医药和药物化学结合使用的术语和实验室步骤和技术是本领域众所周知和常用的。标准技术可以用于化学合成、化学分析、药物制备、调配和递送以及患者的治疗。
本文提供的标题不是对本公开的各个方面的限制，所述方面可以通过整体参考本说明书来理解。
除非本文中上下文另外要求，否则单数术语应包括复数含义，并且复数术语应包括单数含义。除非明确地并且肯定地限于一个指示物，否则单数形式“一个/一种(a或an)”和“所述”和任何词的单数用途包括多个指示物。
应理解，替代方案(例如“或”)在本文中的使用用于意指替代方案中的任一个或两个或其任何组合。
在本文中使用的术语“和/或”将被视为意指在有或没有另一者的情况下明确公开了指定特征或组分中的每个特征或组分。例如，本文中在如“A和/或B”等短语中使用的术语“和/或”旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独)以及“B”(单独)。同样，在如“A、B和/或C”等短语中使用的术语“和/或”旨在涵盖以下方面中的每个方面：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；以及C(单独)。
如本文所使用的，如本文所使用的术语“包括/包含(comprising)”、“包括(including)”、“具有(having)”和“含有(containing)”以及其语法变体旨在是非限制的，使得列表中的一个项或多个项不排除可以被替代或添加到所列项的其它项。应理解的是，当在本文中无论何处用语言“包括”来描述方面时，还提供了关于“由……组成”和/或“基本上由……组成”描述的其它类似方面。
如本文所使用的，术语“约(about)”是指如由本领域普通技术人员所确定的在具体值或组合物的可接受的误差范围内的值或组合物，这将部分地取决于如何测量或确定值或组合物，即，测量系统的限制。例如，“约”或“大约”可以意指按照本领域的实践在一个或超过一个标准差内。可替代地，根据测量系统的限制，“约”或“大约”可以意指至多10％(即，±10％)或更多的范围。例如，约5mg可以包括在4.5mg与5.5mg之间的任何数字。此外，特别是关于生物系统或过程，所述术语可以意指值的至多一个数量级或至多5倍。当在本公开中提供了具体值或组合物时，除非另外陈述，否则“约”或“大约”的含义应被假定在所述具体值或组合物的可接受误差范围之内。
术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”和本文所使用的其它相关术语可互换使用，并且是指氨基酸的聚合物并且不限于任何特定长度。多肽可以包括天然和非天然氨基酸。多肽包括重组形式或化学合成形式。多肽还包括尚未经历切割，例如在某些氨基酸残基处通过分泌信号肽切割或通过非酶切割的前体分子。多肽包括已经历切割的成熟分子。这些术语涵盖天然和人工蛋白质、蛋白质片段和蛋白质序列的多肽类似物(如突变蛋白、变体、嵌合蛋白和融合蛋白)以及翻译后或以其它方式共价或非共价修饰的蛋白质。两个或更多个多肽(例如，3条多肽链)可以经由共价和/或非共价缔合彼此缔合以形成多肽复合物。多肽链的缔合还可以包括肽折叠。因此，多肽复合物可以是二聚体、三聚体、四聚体或高阶复合物，这取决于形成复合物的多肽链的数量。
术语“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”以及本文中使用的其它相关术语可互换使用并且指代核苷酸的聚合物，并且不限于任何特定长度。核酸包括重组形式和化学合成形式。核酸包括DNA分子(cDNA或基因组DNA)、RNA分子(例如，mRNA)、使用核苷酸类似物(例如，肽核酸和非天然存在的核苷酸类似物)产生的DNA或RNA的类似物以及其杂交物。核酸分子可以是单链或双链的。在一个实施方式中，本公开的核酸分子包括编码抗体或其片段或scFv、衍生物、突变蛋白或变体的连续开放阅读框。在一个实施方式中，核酸包括一种类型的多核苷酸或两种或更多种不同类型的多核苷酸的混合物。本文描述了编码双特异性抗体的核酸。
术语“回收(recover/recovery/recovering)”和其它相关术语是指从宿主细胞培养基或从宿主细胞裂解物或从宿主细胞膜中获得蛋白质(例如，抗体或其抗原结合部分)。在一个实施方式中，蛋白质通过宿主细胞表达为融合到介导来自宿主细胞(例如，来自哺乳动物宿主细胞)的表达蛋白的分泌的分泌信号肽(前导肽序列)序列的重组蛋白。分泌蛋白可以从宿主细胞培养基回收。在一个实施方式中，蛋白质通过宿主细胞表达为缺乏可以从宿主细胞裂解物中回收的分泌信号肽序列的重组蛋白。在一个实施方式中，蛋白质通过宿主细胞表达为可以使用去污剂从宿主细胞膜中释放表达蛋白而回收的膜结合蛋白。在一个实施方式中，不考虑用于回收蛋白质的方法，蛋白质可以经历从所回收的蛋白质中去除细胞碎片的步骤。例如，回收的蛋白质可以经历色谱法、凝胶电泳和/或透析。在一个实施方式中，色谱法包括任何一个步骤或两个或更多个步骤的任何组合，包括亲和色谱法、羟基磷灰石色谱法、离子交换色谱法、反相色谱法和/或二氧化硅色谱法。在一个实施方式中，亲和色谱法包括蛋白A或G(来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的细胞壁组分)。
术语“分离的”是指基本上不含其它细胞材料的蛋白质(例如，抗体或其抗原结合部分)或多核苷酸。蛋白质可以通过使用本领域众所周知的蛋白质纯化技术进行分离，使其大体上不含天然相关组分(或与细胞表达系统或用于产生抗体的化学合成方法相关的组分)。术语“分离的”还指代基本上不含相同物种的其它分子的蛋白质或多核苷酸，例如分别具有不同氨基酸或核苷酸序列的其它蛋白质或多核苷酸。所需分子的均一性纯度可以使用本领域中众所周知的技术测定，包括如凝胶电泳等低分辨率方法和如HPLC或质谱法等高分辨率方法。在各个实施方式中，本公开的双特异性抗体是分离的。
术语“信号肽”、“[肽]信号序列”、“前导序列”、“前导肽”或“分泌信号肽”是指位于多肽的N末端处的肽序列。前导序列将多肽链引导到细胞分泌路径并且可以引导膜蛋白到细胞膜的脂质双分子层的整合和锚定。典型地，前导序列的长度为约10-60个氨基酸，更常见的长度为15-50个氨基酸。前导序列可以引导前体多肽从细胞溶质运输到内质网。在各个实施方式中，前导序列包括含CD8α、CD28或CD16前导序列或小鼠或人Igγ分泌信号肽的信号序列。在一个实施方式中，前导序列包括小鼠Igγ前导肽序列MEWSWVFLFFLSVTTGVHS(SEQ IDNO：)。
本文中使用的“抗原结合蛋白”以及相关术语是指包括与抗原结合的部分的蛋白质以及任选地使抗原结合部分采用促进抗原结合蛋白与抗原结合的构象的支架或框架部分。抗原结合蛋白的实施方式包括抗体、抗体片段(例如，抗体的抗原结合部分)、抗体衍生物和抗体类似物。抗原结合蛋白可以包括例如具有移植CDR或CDR衍生物的替代性蛋白质支架或人工支架。此类支架包括但不限于包括例如引入突变以稳定抗原结合蛋白的三维结构的抗体源性支架以及包括例如生物相容性聚合物的完全合成支架。参见例如Korndorfer等人,2003,《蛋白质：结构、功能和生物信息学(Proteins:Structure,Function,andBioinformatics)》,第53卷,第1期:121-129；Roque等人,2004,《生物技术进展(Biotechnol.Prog.)》20:639-654。另外，可以使用肽抗体模拟物(“PAM”)以及基于利用纤维蛋白连接素组分作为支架的抗体模拟物的支架。
抗原结合蛋白可以具有例如天然存在的免疫球蛋白的结构。在一个实施方式中，“免疫球蛋白”是指由两对相同的多肽链构成的天然存在的四聚体分子，每一对具有一条“轻”链(约25kDa)和一条“重”链(约50-70kDa)。每条链的氨基末端部分包括主要负责抗原识别的具有约100至110个或更多个氨基酸的可变区。每条链的羧基端部分限定了主要负责效应子功能的恒定区。人轻链被分类为κ或λ轻链。重链被分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链中，可变区和恒定区通过约12个或更多个氨基酸的“J”区连接，其中重链还包括约10个更多氨基酸的“D”区。通常参见《基础免疫学(Fundamental Immunology)》,第7章(Paul,W.编辑,第2版,纽约雷文出版社(RavenPress,N.Y.)(1989))(所述文献出于所有目的通过引用整体并入本文)。重链和/或轻链可以包括或可以不包括用于分泌的前导序列。每个轻/重链对的可变区形成抗体结合位点，使得完整的免疫球蛋白具有两个抗原结合位点。在一个实施方式中，抗原结合蛋白可以是具有不同于四聚体免疫球蛋白分子但仍与靶抗原结合或与两个或更多个靶抗原结合的结构的合成分子。例如，合成抗原结合蛋白可以包括抗体片段、1-6个或更多个多肽链、多肽的非对称组合件或其它合成分子。在各个实施方式中，本公开的双特异性抗体表现出免疫球蛋白样特性并与两种不同的靶抗原(ROR1和CD3)特异性结合。
免疫球蛋白链的可变区展示出由三个高变区接合的相对保守的构架区(FR)(也称为互补性决定区或CDR)的相同一般结构。从N末端到C末端，轻链和重链都包括结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。
可以将一个或多个CDR共价或非共价地并入分子中以使其成为抗原结合蛋白。抗原结合蛋白可以将CDR作为较大多肽链的一部分并入，可以将CDR与另一多肽链共价连接或可以非共价地并入CDR。CDR允许抗原结合蛋白与相关特定抗原特异性结合。
将氨基酸分配给每个结构域将根据以下定义进行：Kabat等人《具有免疫学意义的蛋白质序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)》,第5版,美国卫生和人类服务部(USDept.of Health and Human Services),公共卫生署(PHS),美国国立卫生研究院(NIH),NIH公开第91-3242,1991(“Kabat编号”)。免疫球蛋白链中氨基酸的其它编号系统包括IMGT.RTM.(国际免疫遗传学信息系统(international ImMunoGeneTicsinformation system)；Lefranc等人,《发展竞争免疫学(Dev.Comp.Immunol.)》29:185-203；2005)以及AHo(Honegger和Pluckthun,《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》309(3):657-670；2001)；Chothia(Al-Lazikani等人,1997《分子生物学杂志》273:927-948)；Contact(Maccallum等人,1996《分子生物学杂志》262:732-745)以及Aho(Honegger和Pluckthun2001《分子生物学杂志》309:657-670)。
本文中使用的“抗体(antibody/antibodies)”以及相关术语是指与抗原特异性结合的完整免疫球蛋白或其抗原结合部分。抗原结合部分可以通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学切割产生。抗原结合部分尤其包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、结构域抗体(dAb)和互补决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、嵌合抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体以及含有足以赋予与多肽特异性抗原结合的免疫球蛋白的至少一部分的多肽。
抗体包括重组产生的抗体和抗原结合部分。抗体包括非人抗体、嵌合抗体、人源化抗体和完全人抗体。抗体包括单特异性、多特异性(例如，双特异性、三特异性和高阶特异性)。抗体包括四聚体抗体、轻链单体、重链单体、轻链二聚体、重链二聚体。抗体包括F(ab')2片段、Fab'片段和Fab片段。抗体包括单结构域抗体、单价抗体、单链抗体、单链可变片段(scFv)、骆驼化(camelized)抗体、亲和体、二硫键连接的Fv(sdFv)、抗独特型抗体(抗Id)、微型抗体。抗体包括单克隆群体和多克隆群体。在本文所描述的一些实施方式中，双特异性抗体包括两种单链可变片段抗体，其可被描述为通过接头连接的双特异性抗体分子的“scFv部分”或简单地“scFv”。
“抗原结合结构域”、“抗原结合区”或“抗原结合位点”以及本文中使用的其它相关术语是指包括与抗原相互作用并且有利于抗原结合蛋白对抗原的特异性和亲和力的氨基酸残基(或其它部分)的抗原结合蛋白的一部分。对于与其抗原特异性结合的抗体，所述术语将包括其CDR结构域中的至少一个结构域的至少部分。本文提供了来自单克隆抗体和双特异性抗体的抗原结合结构域。
如本文中在抗体或抗原结合蛋白(例如，异二聚体抗体)或抗体片段的上下文中使用的术语“特异性结合(specific binding、specifically binds或specificallybinding)”以及其它相关术语是指，相对于其它分子或部分，与抗原非共价或共价优选地结合(例如，相对于其它可用抗原，抗体与特定抗原特异性结合)。在一个实施方式中，如果抗体以10-5M或更少、或10-6M或更少、或10-7M或更少、或10-8M或更少、或10-9M或更少、或10-10M或更少、或10-11M或更少的解离常数KD与抗原结合，那么所述抗体与靶抗原特异性结合。本文描述了与ROR1和CD3特异性结合的双特异性抗体。
在一个实施方式中，结合特异性可以通过ELISA、放射免疫测定(RIA)、电化学发光测定(ECL)、免疫放射测定(IRMA)或酶免疫测定(EIA)来测量。
在一个实施方式中，解离常数(KD)可以使用BIACORE表面等离子体共振(SPR)测定来测量。表面等离子体共振是指允许通过例如使用BIACORE系统(新泽西州皮斯卡塔韦通用医疗集团Biacore生命科学事业部(Biacore Life Sciences division of GEHealthcare,Piscataway,NJ)检测生物传感器基质内的蛋白质浓度的变化来分析实时相互作用的光学现象。
如本文所使用的，“表位”以及相关术语是指通过抗原结合蛋白(例如，通过抗体或其抗原结合部分)结合的抗原的一部分。表位可以包括通过抗原结合蛋白结合的两个或更多个抗原的一部分。表位可以包括一个抗原或两个或更多个抗原的非连续部分(例如，在抗原的初级序列中不连续但在抗原的三级和四级结构的上下文中彼此足够接近以通过抗原结合蛋白结合的氨基酸残基)。通常，抗体的可变区，具体地是CDR与表位相互作用。本文描述了与ROR1多肽的表位结合和与CD3多肽的表位结合的双特异性抗体。
本文中使用的“抗体片段”、“抗体部分”、“抗体的抗原结合片段”或“抗体的抗原结合部分”以及其它相关术语是指除了完整抗体之外包括结合完整抗体所结合的抗原的完整抗体的部分的分子。抗体片段的实施方式包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；Fd；和Fv片段，以及dAb；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如，scFv)；包括足以赋予与多肽特异性抗原结合的抗体的至少一部分的多肽。抗体的抗原结合部分可以通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学切割产生。抗原结合部分尤其包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、结构域抗体(dAb)和互补决定区(CDR)片段、嵌合抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体以及包括足以赋予抗体片段抗原结合特性的免疫球蛋白的至少一部分的多肽。
术语“Fab”、“Fab片段”以及其它相关术语是指包括可变轻链区(VL)、恒定轻链区(CL)、可变重链区(VH)和第一恒定区(CH1)的单价片段。Fab能够结合抗原。F(ab')2片段是包括在铰链区由二硫桥键连接的两个Fab片段的二价片段。F(Ab')2具有抗原结合能力。Fd片段包括VH区和CH1区。Fv片段包括VL区和VH区。Fv可以与抗原结合。dAb片段具有VH结构域、VL结构域或VH或VL结构域的抗原结合片段(美国专利6,846,634和6,696,245；美国公开申请第2002/02512号、第2004/0202995号、第2004/0038291号、第2004/0009507号、第2003/0039958号；以及Ward等人,《自然》341:544-546,1989)。
单链抗体(scFv)是VL和VH区通过接头(例如，氨基酸残基的合成序列)接合以形成连续蛋白质链的抗体。优选地，接头足够长以允许蛋白质链自身折叠并且形成单价抗原结合位点(参见例如Bird等人,1988,《科学(Science)》242:423-26以及Huston等人,1988,《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)》85:5879-83)。本文描述了与ROR1特异性结合的单链抗体和与CD3特异性结合的单链抗体。
双功能抗体是包括两条多肽链的二价抗体，其中每条多肽链包括由太短以致于不能在同一链上的两个结构域之间配对的接头连接的VH和VL结构域，因此使得每个结构域与另一条多肽链上的互补结构域配对(参见例如Holliger等人,1993《美国国家科学院院刊》90:6444-48以及Poljak等人,1994,《结构(Structure)》2:1121-23)。如果双功能抗体的两条多肽链相同，那么由其配对产生的双功能抗体将具有两个相同的抗原结合位点。具有不同序列的多肽链可以用于制备具有两个不同抗原结合位点的双功能抗体。类似地，三功能抗体和四功能抗体是分别包括三个和四个多肽链并且分别形成三个和四个抗原结合位点的抗体，所述抗体可以相同或不同。
术语“人抗体”是指具有源自人免疫球蛋白序列的一个或多个可变区和恒定区的抗体。在一个实施方式中，所有可变结构域和恒定结构域都源自人免疫球蛋白序列(例如，全人抗体)。这些抗体可以通过各种方式制备，所述方式的实施方式如下描述，包括通过重组方法或通过用小鼠的所关注抗原进行免疫，所述所关注抗原经基因修饰以表达衍生自人重链和/或轻链编码基因的抗体。
“人源化抗体”是指具有通过一种或多种氨基酸取代、缺失和/或添加而与源自非人物种的抗体的序列不同的序列的抗体，使得与非人物种抗体相比，在将人源化抗体施用于人对象时，所述人源化抗体不太可能诱导免疫应答和/或诱导较不严重的免疫应答。在一个实施方式中，非人物种抗体的重链和/或轻链的框架结构域和恒定结构域中的某些氨基酸发生突变以产生人源化抗体。在另一实施方式中，来自人抗体的一个或多个恒定结构域与非人物种的一个或多个可变结构域融合。在另一个实施方式中，改变非人抗体的一个或多个CDR序列中的一个或多个氨基酸残基以降低在将非人抗体施用于人对象时所述非人抗体的可能的免疫原性，其中改变的氨基酸残基对于抗体与其抗原的免疫特异性结合不是关键性的，或者对氨基酸序列作出的改变是保守性改变，使得人源化抗体与抗原的结合并不比非人抗体与抗原的结合明显更差。如何制备人源化抗体的实施方式可以在美国专利第6,054,297号、第5,886,152号和第5,877,293号中找到。
本文中使用的术语“嵌合抗体”以及相关术语是指包括来自第一抗体的一个或多个区和来自一个或多个其它抗体的一个或多个区的抗体。在一个实施方式中，一个或多个CDR衍生自人抗体。在另一个实施方式中，所有CDR衍生自人抗体。在另一实施方式中，来自多于一个人抗体的CDR在嵌合抗体中混合并匹配。例如，嵌合抗体可以包括来自第一人抗体的轻链的CDR1、来自第二人抗体的轻链的CDR2和CDR3以及来自第三抗体的重链的CDR。在另一个实施方式中，CDR来源于如人和小鼠、或人和兔、或人和山羊等不同物种。本领域的技术人员应理解，其它组合是可能的。
进一步地，框架区可以衍生自同一个抗体、衍生自一个或多个不同抗体(如人抗体)或衍生自人源化抗体。在嵌合抗体的一个实施方式中，重链和/或轻链的一部分与来自特定物种或属于特定抗体种类或亚类的抗体相同、同源或源自所述抗体，而所述链的其余部分与来自另一物种或属于另一抗体种类或亚类的抗体相同、同源或源自所述抗体。还包括表现出期望的生物活性(即，与靶抗原特异性地结合的能力)的此类抗体的片段。
如本文所使用的，术语“变体”多肽和多肽的“变体”是指包括具有相对于参考多肽序列插入、缺失和/或取代到氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列的多肽。多肽变体包括融合蛋白。以相同方式，变体多核苷酸包括具有相对于另一多核苷酸序列插入、缺失和/或取代到核苷酸序列中的一个或多个核苷酸的核苷酸序列。多核苷酸变体包括融合多核苷酸。
如本文所使用的，术语多肽的“衍生物”是已经化学修饰的多肽(例如，抗体)，通过与例如与另一个化学部分(如聚乙二醇、白蛋白(例如，人血清白蛋白))缀合、磷酸化和糖基化。除非另有指示，否则术语“抗体”包括除了包括两条全长重链和两条全长轻链的抗体以外的其衍生物、变体、片段以及突变蛋白，所述抗体的实施方式如下描述。
如本文所使用的，术语“Fc”或“Fc区”是指在铰链区中开始或在铰链区之后开始并且在重链的C末端结束的抗体重链恒定区的部分。Fc区包括CH和CH3区的至少一部分，并且可以包括或可以不包括铰链区的一部分。两条各自携带半Fc区的多肽链可以二聚合以形成Fc区。Fc区可以与Fc细胞表面受体以及免疫补体系统的一些蛋白质结合。Fc区表现出效应子功能，所述效应子功能包括包含补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性吞噬作用(ADP)、调理作用和/或细胞结合中的任何一种活性或两种或更多种活性的任何组合。Fc区可以与包括FcγRI(例如，CD64)、FcγRII(例如，CD32)和/或FcγRIII(例如，CD16a)的Fc受体结合。
如本文所使用的，术语“标记抗体”或相关术语是指未标记的或与用于检测的可检测标记或部分接合的抗体及其抗原结合部分，其中可检测标记或部分是放射性的、比色的、抗原性的、酶促的、可检测珠粒(如磁性或电子致密(例如，金)珠粒)、生物素、链霉亲和素或蛋白A。可以采用多种标记，包括但不限于放射性核素、荧光剂、酶、酶底物、酶辅因子、酶抑制剂和配体(例如，生物素、半抗原)。本文所描述的任何双特异性抗体可以是未标记的或者可以与可检测标记或部分连接。
本文中使用的“同一性百分比”或“同源性百分比”以及相关术语是指两个多肽之间或两个多核苷酸序列之间相似性的定量测量。两个多肽序列之间的同一性百分比是在所述两个多肽序列之间共享的比对位置处的相同氨基酸的数量的函数，考虑了可能需要被引入以优化所述两个多肽序列的比对的空位的数量和每个空位的长度。以类似方式，两个多核苷酸序列之间的同一性百分比是在所述两个多核苷酸序列之间共享的比对位置处的相同核苷酸的数量的函数，考虑了可能需要被引入以优化所述两个多核苷酸序列的比对的空位的数量和每个空位的长度。序列比较和两个多肽序列或两个多核苷酸序列之间同一性百分比的确定可以使用数学算法来实现。例如，两个多肽或两个多核苷酸序列的“同一性百分比”或“同源性百分比”可以通过使用GAP计算机程序(GCG Wisconsin Package，10.3版本(加利福尼亚州圣地亚哥的Accelrys公司(Accelrys,San Diego,Calif.))使用其默认参数比较序列来确定。关于测试序列的如“包括与Y具有至少X％同一性的序列”的表达意指当如上描述与序列Y比对时，测试序列包括与Y的残基至少X％相同的残基。
在一个实施方式中，测试抗体的氨基酸序列可以与构成本文所描述的双特异性抗体的多肽的任何氨基酸序列类似但不相同。测试抗体与多肽之间的相似性可以为至少95％，或与构成本文所描述的双特异性抗体的任何多肽至少96％相同、或至少97％相同、或至少98％相同或至少99％相同。在一个实施方式中，类似多肽可以包括重链和/或轻链内的氨基酸取代。在一个实施方式中，氨基酸取代包括一个或多个保守的氨基酸取代。“保守氨基酸取代”是其中一个氨基酸残基被具有化学性质(例如，电荷或疏水性)类似的侧链(R基团)的另一个氨基酸残基取代的氨基酸取代。总体而言，保守氨基酸取代不会实质上改变蛋白质的功能性质。在两个或更多个氨基酸序列因保守取代而彼此不同的情况下，可以向上调整序列同一性百分比或相似性程度以纠正取代的保守性质。用于作出此调整的方法是本领域的技术人员所熟知的。参见例如Pearson,(1994)《分子生物学方法(MethodsMol.Biol.)》24:307-331，所述文献通过引用整体并入本文。具有类似化学性质的侧链的氨基酸基团的实施方式包括：(1)脂肪族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；(2)脂肪族-羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；(3)含酰胺的侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；(4)芳香族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；(5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；(6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸；以及(7)含硫侧链是半胱氨酸和甲硫氨酸。
抗体可以从如包括具有各种抗原特异性的免疫球蛋白的血清或血浆等来源中获得。如果此类抗体经受亲和纯化，那么这些抗体可以被富集特定抗原特异性。此类富集抗体制剂通常由对于具体抗原具有特异性结合活性的少于约10％的抗体构成。使这些制剂经受若干轮亲和纯化可以增加对于抗原具有特异性结合活性的抗体的比例。以此方式制备的抗体通常被称为“单特异性的”。单特异性抗体制剂可以由对于具体抗原具有特异性结合活性的约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或99.9％的抗体构成。抗体可以使用如下文所描述的重组核酸技术产生。
本文中使用的术语“载体”以及相关术语是指可以可操作地与外部遗传物质(例如，核酸转基因)连接的核酸分子(例如，DNA或RNA)。载体可以用作媒剂以将外部遗传物质引入到细胞(例如，宿主细胞)中。载体可以包括至少一个限制性核酸内切酶识别序列以将转基因插入到载体中。载体可以包括赋予抗生素抗性或可选择的特性的至少一种基因序列，以帮助选择携带载体-转基因构建体的宿主细胞。载体可以是单链或双链的核酸分子。载体可以是线性或环状核酸分子。用于采用锌指核酸酶、TALEN或CRISPR/Cas的基因编辑方法的供体核酸可以是一种类型的载体。一种类型的载体是“质粒”，其是指线性或环状的双链染色体外DNA分子，其可以与转基因连接，并能够在宿主细胞中复制，且转录和/或翻译转基因。病毒载体通常包括可以与转基因连接的病毒RNA或DNA主链序列。病毒主链序列可以被修饰以停止感染但保留病毒主链和共连接转基因插入到宿主细胞基因组中。病毒载体的实施方式包括逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关载体、杆状病毒载体、乳多空病毒载体、牛痘病毒载体、单纯性疱疹病毒载体和爱泼斯坦·巴尔病毒(Epstein Barrviral)载体。某些载体能够在其被引入到其中的宿主细胞中进行自主复制(例如，包括细菌复制起点的细菌载体以及附加型哺乳动物载体)。其它载体(例如，非附加型哺乳动物载体)在引入到宿主细胞中时被整合到宿主细胞的基因组中，并且由此与宿主基因组一起复制。
“表达载体”是一种可以包括如诱导型和/或组成型启动子和增强子等一个或多个调控序列的载体。表达载体可以包括核糖体结合位点和/或聚腺苷酸化位点。表达载体可以包括一个或多个复制起点序列。调控序列引导与转导到宿主细胞中的表达载体连接的转基因的转录或转录和翻译。调控序列可以控制转基因的表达水平、时机和/或位置。调控序列可以例如直接或通过一个或多个其它分子(例如，与调控序列和/或核酸结合的多肽)的作用向转基因施加其效应。调控序列可以是载体的一部分。在以下中描述了调控序列的另外的实施方式：例如Goeddel,1990,《基因表达技术：酶学方法(Gene ExpressionTechnology:Methods in Enzymology)》185,加利福尼亚州圣地亚哥学术出版社(AcademicPress,San Diego,Calif.)以及Baron等人,1995,《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》23:3605-3606。表达载体可以包括编码本文中所描述的任何双特异性抗体的至少一部分的核酸。
当转基因与载体之间存在连接以允许载体中包括的转基因序列发挥功能或表达时，转基因与载体“可操作地连接”。在一个实施方式中，当调控序列影响转基因的表达(例如，表达水平、时机和/或位置)时，转基因与调控序列“可操作地连接”。
本文所使用的术语“经转染的”或者“经转化的”或“经转导的”或其它相关术语是指将外源核酸(例如，转基因)转移或引入到宿主细胞中的过程。“经转染的”或“经转化的”或“经转导的”的宿主细胞是已经用外源核酸(转基因)转染、转化或转导的宿主细胞。宿主细胞包括原代对象细胞和其后代。编码本文中所描述的任何双特异性抗体的至少一部分的外源核酸可以被引入到宿主细胞中。包括本文中所描述的任何双特异性抗体的至少一部分的表达载体可以被引入到宿主细胞中，并且宿主细胞可以表达包括双特异性抗体的至少一部分的多肽。
如本文所使用的，术语“宿主细胞”或“宿主细胞群体”或相关术语是指其中已经引入外来(外源性或转基因)核酸的细胞(或其群体)。外部核酸可以包括与转基因可操作地连接的表达载体，并且宿主细胞可以用于表达由外部核酸(转基因)编码的核酸和/或多肽。宿主细胞(或其群体)可以是培养的细胞或可以是从对象提取的。在不考虑传代的数量的情况下，宿主细胞(或其群体)包括原代对象细胞和其后代。与亲本细胞相比，后代细胞可能携带或可能不携带相同的遗传物质。宿主细胞涵盖后代细胞。在一个实施方式中，宿主细胞描述已经以任何方式被修饰、转染、转导、转化和/或操纵以表达如本文所公开的抗体的任何细胞(包括其后代)。在一个实施方式中，宿主细胞(或其群体)可以引入有与编码本文所描述的所需抗体或其抗原结合部分的核酸可操作地连接的表达载体。宿主细胞和其群体可以携带稳定整合到宿主基因组中的表达载体或可以携带染色体外表达载体。在一个实施方式中，宿主细胞及其群体可以携带染色体外载体，所述染色体外载体在几次细胞分裂后存在，或暂时存在并在几次细胞分裂后消失。
转基因宿主细胞可以使用非病毒方法来制备，包括众所周知的设计师核酸酶(designer nucleases)，包括锌指核酸酶、TALENS或CRISPR/Cas。可以使用如锌指核酸酶等基因组编辑技术将转基因引入到宿主细胞的基因组中。锌指核酸酶包括嵌合蛋白质对，每个嵌合蛋白质对含有与来自工程化锌指基元的DNA结合结构域融合的限制性核酸内切酶(例如，FokI)的非特异性核酸内切酶结构域。DNA结合结构域可以工程化以与宿主的基因组中的特定序列结合并且核酸内切酶结构域进行双链切割。供体DNA携带转基因，例如编码本文所描述的CAR或DAR构建体的任何核酸，和与宿主细胞的基因组中的预期插入位点的任一侧上的区同源的侧接序列。宿主细胞的DNA修复机制能够实现通过同源DNA修复的转基因的精确插入。已经使用锌指核酸酶制备了转基因哺乳动物宿主细胞(美国专利第9,597,357号、第9,616,090号、第9,816,074号和第8,945,868号)。可以使用TALEN(转录激活剂样效应子核酸酶)制备转基因宿主细胞，所述TALEN类似于锌指核酸酶，因为这两种方法包括融合到可以精准递送转基因插入的DNA结合结构域的非特异性核酸内切酶结构域。如同锌指核酸酶，TALEN也将双链切割引入到宿主的DNA中。转基因宿主细胞可以使用CRISPR(成簇的规律间隔的短回文重复序列，Clustered Regularly Interspaced Short PalindromicRepeat)来制备。CRISPR使用与向导RNA偶联的Cas核酸内切酶进行靶特异性供体DNA整合。向导RNA包括含有靶DNA中的gRNA结合区上游的原型间隔相邻基序列(PAM)的保守多核苷酸并且与宿主细胞靶位点杂交，在所述宿主细胞靶位点中，Cas核酸内切酶切割双链靶DNA。向导RNA可以被设计成与特异性靶位点杂交。类似于锌指核酸酶和TALEN，CRISPR/Cas系统可以用于引入具有与插入位点同源的侧翼序列的供体DNA的位点特异性插入。用于修饰基因组的CRISPR/Cas系统的实施方式描述于例如美国专利第8,697,359号、第10,000,772号、第9,790,490号和美国专利申请公开第US 2018/0346927号。在一个实施方式中，可以使用锌指核酸酶、TALEN或CRISPR/Cas系统制备转基因宿主细胞，并且宿主靶位点可以是TRAC基因(T细胞受体α常数)。供体DNA可以包括例如编码本文所描述的CAR或DAR构建体的任何核酸。电穿孔、核转染或脂质体转染可以用于将供体DNA以及锌指核酸酶、TALEN或CRISPR/Cas系统共递送到宿主细胞中。
宿主细胞可以是原核生物，例如大肠杆菌(E.coli)，或者可以是真核生物，例如单细胞真核生物(例如，酵母或其它真菌)、植物细胞(例如，烟草或番茄植物细胞)、哺乳动物细胞(例如，人细胞、猴细胞、仓鼠细胞、大鼠细胞、小鼠细胞或昆虫细胞)或杂交瘤。在一个实施方式中，宿主细胞可以引入与编码所需抗体的核酸可操作地连接的表达载体，由此产生经转染的/经转化的宿主细胞，所述宿主细胞在适合于通过经转染的/经转化的宿主细胞表达抗体的条件下培养，并且任选地从经转染的/经转化的宿主细胞中回收抗体(例如，从宿主细胞裂解物中回收或从培养基中回收)。在一个实施方式中，宿主细胞包括包含CHO、BHK、NS0、SP2/0和YB2/0的非人细胞。在一个实施方式中，宿主细胞包括包含HEK293、HT-1080、Huh-7和PER.C6的人细胞。宿主细胞的实施方式包括猴肾细胞的COS-7系(ATCC CRL1651)(参见Gluzman等人,1981,《细胞(Cell)》23:175)、L细胞、C127细胞、3T3细胞(ATCCCCL 163)、中国仓鼠卵巢CHO)细胞或其衍生物，如在无血清培养基中生长的Veggie CHO和相关细胞系(参见Rasmussen等人,1998,《细胞技术学(Cytotechnology)》28:31)或在DHFR中缺乏的CHO病毒株DX-B 11(参见Urlaub等人,1980,《美国国家科学院院刊》77:4216-20)、HeLa细胞、BHK(ATCC CRL 10)细胞系、源自非洲绿猴肾细胞系CV1(ATCC CCL 70)的CV1/EBNA细胞系(参见McMahan等人,1991,《欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J.)》10:2821)、如293、293EBNA或MSR 293等人胚胎肾细胞、人表皮A431细胞、人Colo 205细胞、其它转化的灵长类细胞系、正常二倍体细胞、源自原代组织体外培养的细胞病毒株、原代外植体、HL-60、U937、HaK或Jurkat细胞。在一个实施方式中，宿主细胞包括如Y0、NS0或Sp20等淋巴细胞。在一个实施方式中，宿主细胞是哺乳动物宿主细胞，但不是人宿主细胞。通常，宿主细胞是可以用编码多肽的核酸转化或转染的培养细胞，所述编码多肽的核酸接着可以在宿主细胞中表达。短语“转基因宿主细胞”或“重组宿主细胞”可以用于表示已经用要表达的核酸转化或转染的宿主细胞。宿主细胞也可以是包括核酸，但除非将调控序列引入宿主细胞，使其与核酸可操作地连接，否则不以所需的水平表达核酸的细胞。应当理解，术语宿主细胞不仅指特定对象细胞，而且还指此类细胞的后代或潜在后代。因为某些修饰可能由于例如突变或环境影响而在后续世代中发生，所以此类后代实际上可能不与亲本细胞相同，但仍包括在如本文中所使用的术语的范围内。本文描述了一种宿主细胞或宿主细胞群体，所述宿主细胞或宿主细胞群体携带与编码一种或多种双特异性抗体的至少一种核酸可操作地连接的载体(例如，表达载体)。
本公开的多肽(例如，抗体和抗原结合蛋白)可以使用本领域已知的任何方法产生。在一个实施方式中，多肽通过将编码多肽的核酸序列(例如，DNA)插入到重组表达载体中而通过重组核酸方法产生，所述重组表达载体引入到宿主细胞中并且由宿主细胞在促进表达的条件下表达。
用于重组核酸操纵的通用技术例如在Sambrook等人,《分子克隆：实验室手册》,第1-3卷,冷泉港实验室出版社,第2版,1989或F.Ausubel等人,《当代分子生物学实验指南(Current Protocols in Molecular Biology)》(纽约格林出版社和威利国际科学出版社(Green Publishing and Wiley-Interscience:New York),1987)以及定期更新内容中描述，所述文献通过引用整体并入本文。编码多肽的核酸(例如，DNA)可操作地连接到携带源自哺乳动物、病毒或昆虫基因的一个或多个合适的转录或翻译调控元件的表达载体。此类调控元件包括转录启动子、控制转录的任选的操纵子序列、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列以及控制转录和翻译终止的序列。表达载体可以包括在宿主细胞中赋予复制能力的复制起点。表达载体可以包括赋予选择以促进转基因宿主细胞(例如，转化体)识别的基因。
重组DNA还可以编码可以用于纯化蛋白质的任何类型的蛋白质标签序列。蛋白质标签的实施方式包括但不限于组氨酸标签、FLAG标签、myc标签、HA标签或GST标签。适用于细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞宿主的适当的克隆和表达载体可以在《克隆载体：实验室手册(Cloning Vectors:ALaboratory Manual)》,(纽约爱思唯尔公司(Elsevier,N.Y.),1985)中找到。
可以使用适合于宿主细胞的方法将表达载体构建体引入到宿主细胞中。用于将核酸引入到宿主细胞中的各种方法是本领域已知的，所述方法包括但不限于：电穿孔；使用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、DEAE-葡聚糖或其它物质进行的转染；病毒转染；非病毒转染；微粒轰击；脂质转染；以及感染(例如，其中载体是感染原)。合适的宿主细胞包括原核生物、酵母、哺乳动物细胞或细菌细胞。
合适的细菌包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物，例如大肠杆菌或芽孢杆菌(Bacillus spp.)酵母，优选地来自酵母菌属(Saccharomyces)，如酿酒酵母(S.cerevisiae)，也可以用于产生多肽。各种哺乳动物或昆虫细胞培养系统也可以用于表达重组蛋白。Luckow和Summers,(《生物/技术(Bio/Technology)》,6:47,1988)综述了用于在昆虫细胞中产生异源蛋白质的杆状病毒系统。合适的哺乳动物宿主细胞系的实施方式包括内皮细胞、COS-7猴肾细胞、CV-1、L细胞、C127、3T3、中国仓鼠卵巢(CHO)、人胚胎肾细胞、HeLa、293、293T和BHK细胞系。通过培养合适的宿主/载体系统以表达重组蛋白来制备纯化的多肽。对于许多应用，本文所公开的许多多肽的小尺寸将使得在大肠杆菌中的表达成为优选的表达方法。接着从培养基或细胞提取物纯化蛋白质。本文所公开的任何双特异性抗体都可以通过转基因宿主细胞表达。
本文所公开的抗体和抗原结合蛋白也可以使用细胞翻译系统产生。出于此目的，编码多肽的核酸必须被修饰以允许体外转录以产生mRNA并且允许对被使用的具体无细胞系统中的mRNA进行无细胞翻译(真核的，如无哺乳动物细胞或酵母细胞的翻译系统；或原核的，如无细菌细胞的翻译系统)。
编码本文所公开的各种多肽中的任何一种的核酸可以被化学合成。可以选择密码子使用以改善细胞中的表达。此类密码子使用将取决于所选择的细胞类型。已经为大肠杆菌和其它细菌，以及哺乳动物细胞、植物细胞、酵母细胞和昆虫细胞开发了专门的密码子使用模式。参见例如：Mayfield等人,《美国国家科学院院刊》2003 100(2):438-42；Sinclair等人,《蛋白质表达与纯化(Protein Expr.Purif.)》2002(1):96-105；Connell N D.《现代生物技术评论(Curr.Opin.Biotechnol.)》2001 12(5):446-9；Makrides等人,《微生物学评论(Microbiol.Rev.)》1996 60(3):512-38；以及Sharp等人,《酵母(Yeast)》.1991 7(7):657-78。
本文中描述的抗体和抗原结合蛋白还可以通过化学合成(例如，通过《固相肽合成(Solid Phase Peptide Synthesis)》,第2版,1984,伊利诺州罗克福德皮尔斯化学公司(Pierce Chemical Co.,Rockford,Ill.)中描述的方法)产生。对蛋白质的修饰还可以通过化学合成来产生。
本文所描述的抗体和抗原结合蛋白可以通过蛋白质化学领域中通常已知的用于蛋白质的分离/纯化方法来纯化。非限制性实施方式包括提取、再结晶、盐析(例如，使用硫酸铵或硫酸钠)、离心、透析、超滤、吸附色谱法、离子交换色谱法、疏水色谱法、正相色谱法、反相色谱法、凝胶过滤、凝胶渗透色谱法、亲和色谱法、电泳、逆流分布或这些的任何组合。纯化后，多肽可以交换到不同的缓冲液中和/或通过本领域已知的多种方法中的任一种进行浓缩，所述方法包括但不限于过滤和透析。
本文所描述的纯化的抗体和抗原结合蛋白优选地为至少65％纯的、至少75％纯的、至少85％纯的、更优选地至少95％纯的、并且最优选地至少98％纯的。不管纯度的确切数值如何，多肽对于用作药物产物足够纯。本文中描述的任何双特异性抗体可以通过转基因宿主细胞表达并且然后使用本领域已知的任何方法纯化到约65％-98％的纯度或高水平纯度。
在某些实施方式中，本文中的抗体和抗原结合蛋白可以进一步包括翻译后修饰。示例性翻译后蛋白质修饰包括磷酸化、乙酰化、甲基化、ADP-核糖基化、泛素化、糖基化、羰基化、苏素化、生物素化或添加多肽侧链或疏水性基团。因此，经修饰的多肽可以包括非氨基酸元件，如脂质、多糖或单糖以及磷酸盐。糖基化的优选形式是唾液酸化，其将一个或多个唾液酸部分与多肽结合。唾液酸部分改善了溶解度和血清半衰期，同时还降低了蛋白质的可能免疫原性。参见Raju等人,《生物化学(Biochemistry.)》2001 31；40(30):8868-76。
在一个实施方式中，本文所描述的抗体和抗原结合蛋白可以被修饰成可溶性多肽，所述可溶性多肽包括将抗体和抗原结合蛋白与非蛋白质聚合物连接。在一个实施方式中，非蛋白性聚合物包括聚乙二醇(“PEG”)、聚丙二醇或聚氧化烯，其方式如美国专利第4,640,835号；第4,496,689号；第4,301,144号；第4,670,417号；第4,791,192号或第4,179,337号中所示。
本公开提供了包含本文所描述的任何双特异性抗体与药学上可接受的赋形剂的混合物的治疗组合物。赋形剂涵盖载剂、稳定剂和赋形剂。药学上可接受的赋形剂的实施方式包括例如惰性稀释剂或填充剂(例如，蔗糖和山梨醇)、润滑剂、助流剂以及抗粘合剂(例如，硬脂酸镁、硬脂酸锌、硬脂酸、二氧化硅、氢化植物油或滑石粉)。另外的实施方式包括缓冲剂、稳定剂、防腐剂、非离子型去污剂、抗氧化剂和等渗剂。
治疗组合物以及用于制备治疗组合物的方法是本领域众所周知的并且在例如《雷明顿：药学技术与实践(“Remington:The Science and Practice of Pharmacy”)》(第20版,A.R.Gennaro AR.编辑,2000,宾夕法尼亚州费城利平科特·威廉斯·威尔金斯出版公司(Lippincott Williams&Wilkins,Philadelphia,Pa.))中找到。治疗组合物可以被调配用于肠胃外施用，可能并且可以例如包括赋形剂、无菌水、生理盐水、如聚乙二醇等聚亚烷基二醇、植物来源的油或氢化萘。生物相容性、可生物降解的丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物可以用于控制本文所描述的抗体(或其抗原结合蛋白)的释放。纳米粒子调配物(例如，生物可降解的纳米粒子、固体脂质纳米粒子、脂质体)可以用于控制抗体(或其抗原结合蛋白)的生物分布。其它潜在有用的肠胃外递送系统包括乙烯-乙酸乙烯酯共聚物颗粒、渗透泵、可植入输注系统和脂质体。调配物中抗体(或其抗原结合蛋白)的浓度取决于多种因素，包括要施用的药物剂量和施用途径而变化。
任何双特异性抗体(或其抗原结合蛋白)可以任选地作为药学上可接受的盐施用，如作为通常用于制药业的无毒酸加成盐或金属络合物施用。酸加成盐的实施方式包括如乙酸、乳酸、双羟萘酸、顺丁烯二酸、柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、丁二酸、苯甲酸、棕榈酸、辛二酸、水杨酸、酒石酸、甲磺酸、甲苯磺酸或三氟乙酸等有机酸；如鞣酸、羧甲基纤维素等聚合酸；以及如盐酸、氢溴酸、硫酸磷酸等无机酸。金属复合物包括锌、铁等。在一个实施方式中，抗体(或其抗原结合蛋白)在存在乙酸钠的情况下调配以增强热稳定性。
任何双特异性抗体(或其抗原结合蛋白)可以被调配成用于口服使用，包括含有与无毒的药学上可接受的赋形剂混合的活性成分的片剂。用于口服使用的调配物也可以提供为咀嚼片剂，或硬明胶胶囊，其中活性成分与惰性固体稀释剂混合，或提供为软明胶胶囊，其中活性成分与水或油介质混合。
如本文所使用的，术语“对象”是指人和非人动物，包括脊椎动物、哺乳动物和非哺乳动物。在一个实施方式中，对象可以是人、非人灵长类动物、猿、类人猿、鼠类(例如，小鼠和大鼠)、牛、猪、马、犬、猫科动物、山羊、狼、蛙科动物或鱼。
术语“施用(administering或administered)”以及语法变体是指使用本领域技术人员已知的各种方法和递送系统中的任何一种将药剂物理引入到对象。本文所公开的调配物的示例性施用途径包括静脉内、肌内、皮下、腹膜内、脊髓或其它肠胃外施用途径，例如通过注射或输注。如本文所使用的，短语“肠胃外施用”意指除了肠内施用和局部施用之外的施用模式(通常通过注射)，并且包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、淋巴管内、病灶内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注以及体内电穿孔。在一个实施方式中，调配物通过非肠胃途径(例如，口服)施用。其它非肠胃外途径包括局部、表皮或粘膜施用途径，例如，经鼻内、经阴道、经直肠、舌下或局部。施用也可以进行例如一次、多次和/或历时一个或多个延长的时段。本文中描述的任何双特异性抗体(或其抗原结合蛋白)可以使用本领域已知的方法和递送途径施用于对象。
术语“有效量”、“治疗有效量”或“有效剂量”或相关术语可以互换使用并且是指抗体或抗原结合蛋白(例如，双特异性抗体)在施用于对象时足以影响与肿瘤或癌症抗原表达相关的疾病或病症的可测量的改善或预防的量。本文所提供的抗体的治疗有效量在单独使用或组合使用时将根据抗体和组合的相对活性(例如，在抑制细胞生长方面)以及根据所治疗的对象和疾病状况、对象的体重、年龄和性别、对象疾病状况的严重程度、施用方式等而变化，这些可以由本领域普通技术人员容易地确定。
在一个实施方式中，治疗有效量将取决于被治疗的对象和被治疗的病症的某些方面并且可以由本领域技术人员使用已知技术查明。通常，多肽以每天约0.01g/kg至约50mg/kg、优选地每天0.01mg/kg至约30mg/kg、最优选地每天0.1mg/kg至约20mg/kg施用。多肽可以每天(例如，每天一次、两次、三次或四次)或优选地以较低频率(例如，每周、每两周、每三周、每月或每季度)施用。另外，如本领域已知，可能需要根据年龄以及体重、一般健康状况、性别、饮食、施用时间、药物相互作用和疾病的严重程度进行调整。
本公开提供了用于治疗患有与一种或多种肿瘤相关抗原的表达相关联的疾病的对象的方法。疾病包括表达肿瘤相关抗原，例如，CD38或CD3抗原的癌症和/或肿瘤细胞。在一个实施方式中，癌症或肿瘤包括以下癌症：前列腺癌、乳癌、卵巢癌、头颈癌、膀胱癌、皮肤癌、结直肠癌、肛门癌、直肠癌、胰腺癌、肺癌(包括非小细胞肺癌和小细胞肺癌)、平滑肌瘤癌、脑癌、神经胶质瘤癌、胶质母细胞瘤癌、食道癌、肝癌、肾癌、胃癌、结肠癌、宫颈癌、子宫癌、子宫内膜癌、外阴癌、喉癌、阴道癌、骨癌、鼻腔癌、鼻旁窦癌、鼻咽癌、口腔癌、口咽癌、喉癌、下喉癌、唾液腺癌、输尿管癌、尿道癌、阴茎癌和睾丸癌。
在一个实施方式中，癌症包括血液癌症，包括白血病、淋巴瘤、骨髓瘤和B细胞淋巴瘤。血液癌症包括多发性骨髓瘤(MM)、包括伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma，BL)的非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma，NHL)、B慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)、全身性红斑狼疮(SLE)、B和T急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤、慢性髓细胞性白血病(CML)、毛细胞白血病(HCL)、滤泡性淋巴瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(Waldenstrom's Macroglobulinemia)、套细胞淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤(HL)、浆细胞骨髓瘤、前体B细胞淋巴细胞白血病/淋巴瘤、浆细胞瘤、巨细胞性骨髓瘤、浆细胞骨髓瘤、重链骨髓瘤、轻链或本斯-琼斯骨髓瘤(Bence-Jonesmyeloma)、淋巴瘤样肉芽肿病、移植后淋巴组织增殖性病症、免疫调节病症、类风湿性关节炎、重症肌无力、特发性血小板减少性紫癜、抗磷脂综合征、恰加斯氏病(Chagas'disease)、格雷夫氏病(Grave's disease)、韦格纳氏肉芽肿病(Wegener's granulomatosis)、结节性多动脉炎、干燥综合征(Sjogren's syndrome)、寻常性天疱疮、硬皮病、多发性硬化症、抗磷脂综合征、ANCA相关血管炎、古德帕斯丘氏病(Goodpasture's disease)、川崎病(Kawasakidisease)、自身免疫性溶血性贫血、以及急进性肾小球肾炎、重链疾病、原发性或免疫细胞相关淀粉样变性以及显著性未确定的单克隆丙种球蛋白病。
编码抗ROR1/抗CD3双特异性抗体的重组溶瘤病毒
本公开尤其提供了表达与ROR1和CD3结合的双特异性抗体的溶瘤病毒、感染此类病毒的细胞以及使用表达双特异性抗体的病毒治疗癌症的方法。还提供了由感染的细胞产生的无病毒条件培养基(VFCM)和使用VFCM产生药物调配物的方法。
溶瘤病毒提供了癌症疗法的靶向方法，因为所述溶瘤病毒选择性地在肿瘤细胞中复制并裂解肿瘤细胞。各种类型的溶瘤病毒是本领域已知的，包括包含细小病毒、粘液瘤病毒、呼肠孤病毒、新城疫病毒(NDV)、塞内加谷病毒(SVV)、脊髓灰质炎病毒(PV)、麻疹病毒(MV)、痘苗病毒(VACV)、腺病毒、水疱性口炎病毒(VSV)和单纯疱疹病毒(HSV)。这些病毒在肿瘤细胞中复制并且引起细胞裂解和/或诱导对所述病毒感染的肿瘤细胞的免疫应答。本公开提供了重组溶瘤病毒，所述重组溶瘤病毒包括编码如本文所公开的任何抗ROR1/抗CD3双特异性抗体(αROR1/αCD3 BspAb)的异源基因构建体。构建体可以包括在哺乳动物细胞中有活性的启动子，所述启动子与αROR1/αCD3 BspAb编码序列可操作地连接，并且构建体可以插入到溶瘤病毒的基因组中。
在各个实施方式中，针对αROR1/αCD3 BspAb的表达的经修饰的溶瘤病毒可以是单纯疱疹病毒(人α疱疹病毒；HSV)，如HSV-1、HSV-2或具有HSV-1或HSV-2两者的序列的重组HSV。例如，可以使用HSV-1或HSV-2病毒株的实验室病毒株或临床分离株。HSV-1和HSV-2的多种经分离的和经修饰的病毒株是本领域已知的，并且可以考虑用于本文所公开的组合物和方法中，作为非限制性实施方式包括HSV-1病毒株A44、HSV-1病毒株Angelotti、HSV-1病毒株CL101、HSV-1病毒株CVG-2、HSV-1病毒株H129、HSV-1病毒株HFEM、HSV-1病毒株HZT、HSV-1病毒株JS1、HSV-1病毒株MGH10、HSV-1病毒株MP、HSV-1病毒株Patton、HSV-1病毒株R15、HSV-1病毒株R19、HSV-1病毒株RH2、HSV-1病毒株SC16、HSV-1病毒株KOS、HSV-1病毒株F和HSV-1病毒株17、HSV-2病毒株186、HSV-2病毒株333、HSV-2病毒株B4327UR、HSV-2病毒株G、HSV-2病毒株G、HSV-2病毒株HG52、HSV-2病毒株SA8、HSV-2病毒株SD90、HSV-2病毒株SN03、HSV-2病毒株SS01和HSV-2病毒株ST04。还考虑用于本文所提供的组合物和方法的是这些病毒株或本领域可以已知的或分离的其它病毒株的衍生物或突变体。
病毒株的衍生物包括但不限于可以具有一个或多个被突变的内源基因(包括一个或多个部分或完全缺失的内源基因)、可以具有插入到病毒基因组中的转基因(异源基因)(包括但不限于一种或多种可选择标志物、阴性可选择标志物(“自杀基因”)和/或可检测标志物(例如，编码荧光蛋白的基因或编码产生可检测产物的酶的基因))和/或可以具有一个或多个修饰，如但不限于限制性位点、重组位点或“着陆垫(landing pad)”、外源启动子等的病毒。衍生物可以具有其它修饰，如但不限于非基因序列的缺失或突变，例如，基因调节区(如启动子)或非编码序列(如但不限于正向或反向重复序列)。作为非限制性实施方式，病毒株的衍生物可以是可替代地或除了其它修饰之外还包括支持或调节病毒生长或活力的一种或多种转基因、影响宿主细胞功能的一个或多个基因或编码治疗蛋白的一种或多种转基因的病毒。
在一些非限制性实施方式中，HSV是HSV-1，如HSV-1病毒株17、HSV-1病毒株KOS或HSV-1病毒株F、或者HSV-1病毒株17、HSV-1病毒株KOS或HSV-1病毒株F中的任何一种的衍生物。例如，用于引入ScFv-Fc-TGFβtrap构建体的病毒株可以是HSV-1病毒株17突变体1716、HSV-1病毒株F突变体R3616(Chou和Roizman(1992)《美国国家科学院院刊》89:3266-3270)、HSV-1病毒株F突变体G207(Toda等人,(1995)《人类基因疗法(Human Gene Therapy)》9:2177-2185)、HSV-1病毒株F突变体G47Δ(Toda等人,(2001)《美国国家科学院院刊》98:6396-6401)、HSV-1突变体NV1020(Geevarghese等人,(2010)《人类基因疗法》21:1119-28)、RE6(Thompson等人,(1983)《病毒学(Virology)》131:171-179)、KeM34.5(Manservigi等人,(2010)《开放病毒学杂志(The Open Virology Journal)》4:123-156)、M032(Campadelli-Fiume等人,(2011)《医学病毒学综述(Rev Med.Virol)》21:213-226)、Baco(Fu等人,(2011)《国际癌症杂志(Int.J.Cancer)》129:1503-10)、M032或C134(Cassady等人,(2010)《开放病毒学杂志》4:103-108)或Talimogene laherparepvec(“TVec”，先前为Liu等人,(2003)《基因疗法》10:292-303)或这些病毒株中的任何病毒株的另外的衍生物或突变体。
内源病毒基因的突变可以包括影响病毒在非癌细胞中复制或繁殖的基因的突变或缺失，或病毒避免宿主防御的能力。例如，可以在任何ICP34.5编码基因、ICP6编码基因、ICP0编码基因、vhs编码基因或ICP27编码基因中缺失包括αROR1/αCD3 BspAb的HSV。不产生由一个或多个基因(其中基因是多拷贝的)编码的功能性蛋白的突变体在本文中被称为具有功能性缺失的基因。ICP34.5编码基因、ICP6编码基因、ICP0编码基因和vhs编码基因中的一者或多者的功能性缺失可能导致HSV在非癌细胞中复制受损。
ICP34.5编码基因RL1位于HSV-1基因组的长重复序列(RL)中，并且以两个拷贝存在。在一些实施方式中，ICP34.5编码基因的一个或两个拷贝突变或部分或完全缺失，使得不产生功能蛋白。在优选实施方式中，包括编码ScFv-Fc-TGFβtrap蛋白的转基因和任选地IL12基因的溶瘤HSV功能性缺失负责神经毒性的ICP34.5编码基因(Chou等人,(1990)《科学》250:1262-1266)，例如，HSV病毒基因组的ICP34.5编码基因的两个拷贝都是失活的。例如，用于引入ScFv-Fc-TGFβtrap构建体的溶瘤HSV可以是HSV-1病毒株17的突变体，并且可以是HSV1716(Brown等人,(1994)《普通病毒学杂志(Journal of General Virology)》75:2367-2377；MacLean等人,(1991)《普通病毒学杂志》72:631-639)或其突变体或衍生物，或可以是SeprehvecTM或其衍生物或突变体。HSV1716和SeprehvecTM两者在ICP34.5编码基因的两个拷贝中都具有缺失，因此它们不产生功能性基因产物，但在其它方面各自具有与HSV病毒株17基本上类似的基因组，所述HSV病毒株17已经被完全测序(Pfaff等人(2016)《普通病毒学杂志》97:2732-2741；ncbi.nlm.nih.gov/genome，登录号：JN555585)。
如本文所提供的重组HSV可以具有插入到ICP34.5基因座、ICP6基因座、ICP0基因座或vhs基因座中的一个或多个转基因。在一些优选实施方式中，如本文所提供的重组溶瘤HSV可以具有插入到缺失的ICP34.5编码基因座中的αROR1/αCD3 BspAb基因。在一些优选实施方式中，如本文所提供的重组溶瘤HSV针对ICP34.5是功能性缺失的(即，是ICP34.5无效的)，并且具有插入到ICP34.5编码基因座的两个拷贝中的αROR1/αCD3 BspAb基因。
本文所提供的能够感染多种肿瘤细胞类型的重组溶瘤病毒包括编码与ROR1(一种在许多肿瘤细胞上表达的蛋白质)和CD3(在T细胞上表达)结合的新型双特异性抗体的表达构建体，其中双特异性抗体可以由编码其的重组病毒感染的细胞表达和分泌。αROR1/αCD3BspAb的ROR1 scFv部分与免疫检查点蛋白特异性结合并且CD3 scFv部分与T细胞结合，使得T细胞接近靶肿瘤细胞，以增强对肿瘤细胞的杀伤。
编码本文所描述的αROR1/αCD3 BspAbs的示例性构建体使用衍生自ROR1单克隆抗体o11的scFv，所述ROR1单克隆抗体o11具有SEQ ID NO:1的可变重链区或与其具有至少95％同一性的序列，具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的重链可变区CDR，以及SEQ ID NO:5的可变轻链区或与其具有至少95％同一性的序列，具有SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:7和SEQ ID NO:8的轻链可变区CDR。
编码本文所描述的αROR1/αCD3 BspAbs的另外的示例性构建体使用衍生自ROR1单克隆抗体s10的scFv，所述ROR1单克隆抗体s10具有SEQ ID NO:10的可变重链区或与其具有至少95％同一性的序列，具有SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13的重链可变区CDR，以及SEQ ID NO:14的可变轻链区或与其具有至少95％同一性的序列，具有SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17的轻链可变区CDR。
编码本文所描述的αROR1/αCD3 BspAbs的另外示例性构建体使用衍生自ROR1单克隆抗体jlv1011的scFv，所述ROR1单克隆抗体jlv1011具有SEQ ID NO:19的可变重链区或与其具有至少95％同一性的序列，具有SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22的重链可变区CDR，以及SEQ ID NO:23的可变轻链区或与其具有至少95％同一性的序列，具有SEQID NO:24、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26的轻链可变区CDR。
在具体实施方式中，αROR1/αCD3 BspAb可以具有SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38或SEQ ID NO:40的序列，或者可以具有与SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38或SEQ ID NO:40中任一者具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的氨基酸序列。
αROR1/αCD3 BspAb可以具有格式：重链可变区-接头-轻链可变区或轻链可变区域-接头-重链可变区域。αROR1/αCD3 BspAb的抗ROR1 scFv可以是抗CD3 scFv部分的N末端，或者反之亦然。
编码αROR1/αCD3 BspAb、IL-12多肽或抗VEGFR抗体(例如，抗VEGFR scFv)的构建体可以与启动子可操作地连接以用于在真核细胞中表达。可以在重组病毒中使用以用于表达αROR1/αCD3 BspAb的启动子的实施方式包括但不限于巨细胞病毒(CMV)启动子(例如，SEQ ID NO:33)、杂合CMV启动子(例如，U.S 9,777,290)、HTLV启动子、EF1α启动子、杂合EF1α/HTLV启动子(例如，SEQ ID NO:32)、JeT启动子(美国专利第6,555,674号)、SPARC启动子(例如，US 8,436,160)、RSV启动子、SV40启动子或逆转录病毒LTR启动子如MMLV启动子或衍生自这些启动子中的任何启动子的启动子。构建体还可以包括聚腺苷酸化序列，例如，BGH、SV40、HGH或RBG聚腺苷酸化序列。在一些实施方式中，聚腺苷酸化序列具有SEQ ID NO:38的序列。
溶瘤病毒，例如本文所描述的那些，包括编码αROR1/αCD3 BspAb、IL-12和/或抗VEGFR抗体的转基因，可以用于感染可以培养用于产生VFCM的宿主细胞，以及可以用于治疗目的的任选地双特异性抗体或其它重组多肽。可以使用例如细胞上清液的离心，随后使用例如0.22微米、0.2微米和/或0.1微米过滤器进行过滤来产生VFCM。对象，如患有癌症的对象可以用包括例如αROR1/αCD3 BspAb的VFCM治疗。在一些实施方式中，对象可以是非人动物，并且作为非限制性实施方式，可以是狗、马、猫、猴、猿、农场动物或濒危物种的成员。
本公开提供了使用编码αROR1/αCD3 BspAb的重组HSV治疗癌症的方法。所述方法可以包括向患有癌症的对象施用重组HSV，所述重组HSV包括编码如本文所提供的αROR1/αCD3 BspAb的核酸构建体。在一些实施方式中，所述癌症可以是实体瘤。重组HSV可以是本文所公开的任一种，例如，任何编码αROR1/αCD3 BspAb的HSV。所述对象可以是人或可以是非人动物，例如，狗、猫、牛、公牛或马。所述癌症可以是但不限于膀胱癌、骨癌、乳腺癌、眼癌、胃癌、头颈癌、肾癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌或子宫癌、间皮瘤、神经胶质瘤、神经细胞瘤或软骨肉瘤。所述施用可以通过任何方式进行，并且作为非限制性实施方式，可以是肠胃外施用、全身施用、腔内施用(例如，胸膜内施用、腹膜内施用)、瘤周施用或瘤内施用，并且可以通过注射、静脉内或动脉内输注或其它递送方式进行。注射可以是例如肠胃外注射、皮下注射、肌内注射、静脉内注射、动脉内注射、瘤内注射或瘤周注射。治疗方案可以包括多于一次施用所述病毒，并且可以包括在数天、数周或数月的时间段内多次给药。
在一些实施方式中，所述方法中使用的由HSV编码的αROR1/αCD3 BspAb是与SEQID NO:36、SEQ ID NO:38或SEQ ID NO:40具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的αROR1/αCD3 BspAb(或具有不同信号肽或缺乏信号肽的其它同源αROR1/αCD3 BspAb)。HSV可以进一步包括一种或多种另外的转基因，作为非限制性实施方式，所述一种或多种另外的转基因可以编码与SEQ ID NO:47具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的IL-12多肽，或与SEQ ID NO:49具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的抗VEGFR scFV(或具有不同信号肽或缺乏信号肽的其它同源多肽)。
实施例
实施例1.α-ROR1/α-CD3 BspAb单纯疱疹病毒(HSV)构建体。
三种构建体被设计成用于表达双特异性抗体(BspAb)，其包括从N末端到C末端排列的：信号肽(SEQ ID NO:28)、与ROR1特异性结合的scFv抗体、GS接头(SEQ ID NO:29)和抗CD3 scFv抗体(hum291，SEQ ID NO:34)。图1提供了表示编码αROR1/αCD3双特异性抗体(αROR1/αCD3 BspAb)的构建体的一般图。所有构建体均包括与BspAb编码序列可操作地连接的EF1α/HTLV杂合启动子(SEQ ID NO:41)。制备了编码三种不同的αROR1/αCD3BspAb的构建体，其仅在ROR1 scFv上不同：包括o11 ROR1 scFv的αCD3/αROR1 BspAb(SEQ ID NO:9)、包括s10 ROR1 scFv的αCD3/αROR1 BspAb(SEQ ID NO:18)和包括jlv1011 ROR1 scFv的αCD3/αROR1 BspAb(SEQ ID NO:27)。
为了将这些构建体克隆到病毒基因组中，通过PCR克隆产生侧接attL位点的BspAb构建体，并且将其插入到HSV-1基因组的内部缺失的RL1基因座中。/>是衍生自HSV病毒株17的HSV-1载体，其中编码负责神经毒性的γ34.5kd(ICP34.5)多肽的RL1基因的两个拷贝被使RL1基因失活的695bp缺失(RL1序列内的核苷酸125975至125221)破坏。RL1缺失位点包括用于插入侧接attL序列的任何所关注基因或构建体的attR重组位点。基本上根据制造商的说明书，使用体外重组克隆，将侧接attL序列的抗CD3/抗ROR1BspAb构建体在缺失位点处插入到两个RL1基因座中，所述重组克隆使用LR ClonaseTM加上整合酶和整合宿主因子的酶混合物(加利福尼亚州卡尔巴斯德的赛默飞世尔公司(ThermoFisher,Carlsbad,CA))。
重组反应后，将病毒基因组DNA转染到BHK(幼仓鼠肾成纤维细胞)细胞中用于产生重组病毒。从经转染的BHK细胞收获病毒，然后用于感染Vero(非洲绿猴(绿猴属(Chlorocebus sp.))肾上皮)细胞。收集来自受感染的Vero细胞的单个噬斑并且传代到新的Vero细胞。重复此过程，总共四轮噬斑分离。然后通过用约3.2x105个噬斑形成单位(PFU)的病毒感染约3.2x107个BHK细胞并且培养三天来产生病毒储备液。三天后，将上清液以2,100g旋转两次，以沉淀细胞和碎片。在细胞沉淀之后，将包括病毒的上清液以17,200g旋转以沉淀病毒。将病毒重悬、过滤，并且在Vero细胞上滴定。由纯化的αROR1/αCD3 BspAb病毒SepGI-189(o11αROR1 scFv)、SepGI-201(s10αROR1 scFv)和SepGI-203(jlv1011αROR1scFv)产生病毒种子储液和研究储液。
表1.ROR1抗体、scFv、双特异性抗体和工程化病毒。
实施例2.由表达αROR1/αCD3 BspAb构建体的HSV产生无病毒条件培养基(VFCM)。
为了从αROR1/α-CD3BspAb病毒SepGI-189、SepGI-201和SepGI-203产生无病毒条件培养基(VFCM)，在37℃、5％ CO2下，用3x105个A431细胞接种12孔板，或者在单独的板中，将HepG2细胞接种在1mL培养基中。第二天，用重组HSV以MOI(感染复数)0.5感染A431细胞和HepG2细胞，并且在1.25mL培养基中温育3天。3天后，去除细胞上清液，并且通过0.1μm膜(颇尔Acrodisc注射器过滤器(Pall Acrodisc Syringe filter)部件编号4611)过滤以去除病毒。然后将VFCM等分并储存在-80℃下。还将SepGI-Null(即不包括外源转基因的HSV载体)的VFCM制备为对照。
实施例3.VFCM中αROR1/αCD3双特异性抗体的检测。
将96孔板用50μL/孔的重组人ROR1 Fc融合蛋白以2μg/mL涂覆(R&D系统公司(R&DSystems)，目录号9490-RO-050)。然后将板密封并在4℃下温育过夜。第二天，将板用150μL/孔的洗涤缓冲液(含0.05％ V/V Tween20的杜尔贝科氏磷酸缓冲盐水(Dulbecco'sphosphate-buffered saline)1X)洗涤。使用80μL/孔的封闭缓冲液(含2％ BSA+0.05％Tween20的杜尔贝科氏磷酸缓冲盐水)封闭非特异性结合，并将板在37℃下温育1小时。三次洗涤后，将SepGI-189、SepGI-201或SepGI-203的含αROR1/αCD3 BspAb的无病毒培养基(VFCM)以及对照VFCM(SepGI-Null)在封闭缓冲液中连续稀释，并在缓慢振荡条件下在室温(RT)下以50μL/孔温育2小时。将板用洗涤缓冲液洗涤三次，并添加以(1:80稀释度)稀释于封闭缓冲液中的50μL/孔的抗CD3 Hum291抗独特型克隆5A2。将板在37℃下温育1小时。三次洗涤后，添加以1:120,000稀释度稀释于封闭缓冲液中的50μL/孔的山羊抗兔IgG HRP抗体(艾博抗公司(abcam)；目录号ab6721)。将板在黑暗中在37℃下温育1小时。将板用洗涤缓冲液洗涤三次，并将SureBlue Reserve TMB 1-组分微孔过氧化物酶底物溶液(SeraCare公司，目录号5120-0082)添加到孔中(80μL/孔)。将板在黑暗中在室温下温育10-15分钟。通过添加50μL/孔的TMB Blue STOP溶液(SeraCare公司，目录号5150-0022)来使信号产生停止，随后使用TecanSpark或其它装置在450nm处读取信号(SeraCare TMB BlueSTOP溶液所特定的)。图2A提供了测定的示意图。图2B示出了所有三种双特异性构建体均由工程化SepGI溶瘤病毒SepGI-189、SepGI-201和SepGI-203表达，并且能够与ROR1结合。
实施例4.来自病毒感染的培养物的VFCM的αROR1/αCD3 BspAb与ROR1阳性肿瘤细胞的结合。
使用CRISPR/Cas-9方法敲除A549人肺泡腺癌(非小细胞肺癌)细胞的ROR1基因。将A549/ROR1敲除(A549/ROR1-KO)细胞或A549野生型(WT)细胞转移到V型底96孔板(80,000个细胞/孔)中。将如实施例2中所描述的产生的无病毒培养基(VFCM)的制剂在FACS缓冲液(PBS1X+2％ FCS/FBS)中连续稀释(1:5至1:3,125稀释度)，添加到孔中(100μL/孔)，并在室温下与细胞一起温育1小时。三次洗涤后，将细胞重悬于在FACS缓冲液中以10μg/mL稀释的100μL/孔的单克隆兔抗CD3 Hum291抗独特型抗体(克隆5A2)中。将板用板密封覆盖，并在37℃下温育1小时。
然后将细胞重悬于100μL/孔的包含以1:1000稀释的驴抗兔APC(南方生物技术公司(Southern Biotech)；目录号6441-31-31，批号K2916-Z779B)的FACS缓冲液中，并将板在黑暗中在37℃下温育1小时。最后将细胞重悬于120μL/孔的FACS缓冲液中，并在AttuneNxt流式细胞仪上分析信号。图3A提供了测定的形式，其中表达ROR1的A549 WT细胞与VFCM中存在的BspAb结合，VFCM进而被抗独特型抗CD3抗体识别。使用别藻蓝蛋白(APC)标记的驴抗兔抗体揭示了所述复合物。VFCM中存在的BspAb与A549/ROR1-KO细胞的结合预期不会发生。图3B提供了流式细胞术结果，示出了包括双特异性构建体的病毒的所有VFCM都包括αROR1/αCD3双特异性抗体，所述双特异性抗体与表达ROR1的A549肿瘤细胞结合，但未能与A549/ROR1-KO细胞结合。由用不包括双特异性构建体(SepGI-Null)的对照病毒感染的细胞的培养物制备的VFCM不包括能够与细胞和抗独特型CD3抗体结合的抗体。
实施例5.来自病毒感染的培养物的VFCM的αROR1/αCD3双特异性抗体与ROR1阳性肿瘤细胞的结合。
将A549-WT和A549-ROR1 KO细胞用如制造商所推荐的eFluor450染料(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)；目录号50-246-096)染色。使用如制造商所推荐的PAN T细胞分离试剂盒从健康血液供体人中新鲜分离纯化的人T细胞(美天旎生物技术公司(Miltenyi Biotec)；目录号130-096-535)，并用eFluor670染料(赛默飞世尔科技公司；目录号65-0840-85)染色。在37℃下将细胞以1.0E+07细胞/mL重悬于杜尔贝科氏1X磷酸盐缓冲盐水(DPBS)中。将eFluor450标记的A549-WT或A549-ROR1 KO肿瘤细胞与纯化的eFluor670标记的T细胞以1:1的比率(30,000个肿瘤细胞和30,000个T细胞/孔)混合于U型底低粘附96孔板中(在100μL/孔的包括10％ FBS的完全RPMI 1640培养基中)。将细胞以1,500rpm离心3分钟，并通过快速轻弹板去除上清液。将细胞沉淀重悬于50μL的未经稀释的无病毒培养基(VFCM)中，所述培养基包括αCD3/αROR1双特异性构建体(SepGI-189、SepGI-201或SepGI-203)。将细胞在37℃下温育1小时。随后，将细胞用直接添加到孔中的100μL固定缓冲液(百进生物公司(Biolegend)；目录号420801，批号B295965)固定，并将细胞加抗体在黑暗中在室温下温育20分钟，而不破坏细胞或移液。将样品立即在Attune NxT细胞仪上进行分析，而不洗涤或移液。图4A示出了测定设计，其中与ROR1(在WT A549细胞上表达)和CD3(在T细胞上表达)两者结合的BspAb能够与eFluor 450标记的WT A549细胞和eFluor 670标记的T细胞两者结合(但不能够与A549/ROR1-KO细胞结合)。
图4B示出了荧光象限，其中在流式细胞术后发现经标记的T细胞(单独)和经标记的WT A549细胞(单独)。最右边的图显示，当将细胞在存在VFCM的情况下混合时，细胞出现在图的新区域中，从而指示两个荧光团在空间上紧密接触。所述图示出了针对由被SepGI-189病毒、SepGI-201病毒和SepGI-203病毒感染的培养物制成的VFCM，T细胞与WT A549细胞和A549/ROR1-KO细胞的相互作用百分比，每种培养物均包括αROR1/αCD3 BspAb构建体。在每种情况下，WT A549细胞与CD3细胞的相互作用显著高于A549/ROR1-KO细胞与CD3细胞的相互作用，表明所有三种双特异性抗体均能够以抗原特异性方式同时与肿瘤和T细胞结合。
实施例6.VFCM的功能活性αROR1/αCD3双特异性抗体。
为了测试双特异性αROR1/αCD3抗体在T细胞中诱导信号传导的能力，使用在NFAT应答元件(Jurkat-NFAT-Luc)控制下具有荧光素酶基因的Jurkat细胞进行测定。图5A描绘了测定设置，其中与表达ROR1的A549细胞结合的BspAb也与Jurkat细胞上的CD3结合，从而产生导致荧光素酶表达和发光信号的信号传导。不与αROR1/αCD3 BspAb结合的A549/ROR1-KO细胞不刺激Jurkat细胞信号传导。
为了进行测定，将20,000个A549-WT或A549-ROR1 KO细胞在白色不透明平底96孔测定板(康宁公司(Corning)，目录号3917)中平板接种于100μL的完全RPMI-1640(包含10％FCS的RPMI-1640)中。将板以1,500rpm旋转1分钟，并在37℃下温育过夜以使细胞粘附。然后将板以1,500rpm旋转3分钟，并通过快速轻弹板丢弃上清液。然后将在NFAT应答元件(Jurkat-NFAT-Luc)的控制下表达荧光素酶的Jurkat细胞平板接种于孔中(30,000个细胞在50μL的完全RPMI-1640培养基/孔中)。通过添加50μL/孔的以1:1,000稀释的αROR1/αCD3(SepGI-189、SepGI-201或SepGI-203)或阴性对照VFCM(SepGI-Null)来诱导细胞激活。将纯化的抗CD3克隆Hum291抗体以2μg/mL添加到单独的孔中，作为T细胞激活的阳性对照。将板在37℃下在加湿细胞温育箱中温育5小时。通过添加100μL/孔的如制造商所推荐的荧光素酶测定底物(普洛麦格公司(Promega)；目录号G7940；批号0000422404)，并将板在缓慢振荡条件下在黑暗中在室温下温育5分钟来显示发光信号。用TECAN装置读取发光信号(积分时间：500毫秒)。图5B示出，所有三种VFCM均诱导T细胞激活，其中SepGI-201和SepGI-203VFCM以ROR1依赖性方式诱导强效T细胞激活。
实施例7.使用包括αROR1/αCD3双特异性抗体的VFCM进行细胞毒性测定。
为了测试在存在αROR1/αCD3双特异性抗体的情况下T细胞对表达ROR1的肿瘤细胞的杀伤作用，进行了如下细胞毒性测定。在第0天，将10,000个A549-FLuc WT和A549-FLucROR1 KO细胞(靶细胞)平板接种于白色不透明平底96孔测定板(康宁公司，目录号3917)中的100μL完全RPMI1640(补充有10％ FCS的RPMI1640)中。将板以1,500rpm旋转1分钟，并在37℃下温育过夜以使细胞粘附。
在第1天，从人健康全血中分离人外周血单核细胞(hPBMC)，并使用如制造商所推荐的pan T细胞分离试剂盒(美天旎生物技术公司；目录号130-096-535，批号519115439)从hPBMC中分离人T细胞。
通过快速轻弹板去除来自包括靶细胞的96孔板的上清液，并将包括α-ROR1/α-CD3双特异性抗体的VFCM在完全RPMI1640中稀释，并以100μL/孔添加到靶细胞中。随后，将100μL/孔的纯化人T细胞(效应细胞)(以5,000个细胞/孔)添加到靶细胞的顶部，以达到0.5:1的E:T比率。作为对照，一些孔没有接受效应细胞。将细胞轻轻混合，以1,500rpm旋转1分钟并在37℃下温育3天。第4天，收集上清液(100μL/孔)以使用根据制造商推荐的来自MesoScale Discovery公司(MSD；目录号K15049D)的促炎性小组1(人)试剂盒测量每种情况下的IFNγ表达水平。通过测量发光信号来评估杀伤活性，所述发光信号通过添加100μL/孔的如制造商所推荐的荧光素酶测定底物(普洛麦格公司；目录号G7940；批号0000422404)并在缓慢振荡条件下在黑暗中在室温下温育8分钟来显示。用TECAN装置读取发光信号(积分时间：500毫秒)。样品的杀伤百分比计算如下：100-([发光样品/基线发光无VFCM对照])×100。
图6中提供的结果示出，被SepGI-189和SepGI-201感染的细胞的VFCM能够刺激T细胞对表达ROR1的肿瘤细胞的杀伤，并且这种高效的杀伤对表达ROR1的肿瘤细胞具有特异性。在存在αROR1/αCD3双特异性抗体的情况下与靶细胞共培养的T细胞也分泌大量干扰素γ。
实施例8.使用具有不同ROR1表达水平的肿瘤系的包括包含αROR1/αCD3双特异性抗体的VFCM的细胞毒性测定。
通过流式细胞术评估表达萤火虫荧光素酶(Fluc)的肿瘤细胞系A549-Fluc WT、A459-Fluc/ROR1 KO、MCF-7-Fluc和HepG2-Fluc上的ROR1表达。简而言之，将细胞以80,000个细胞/孔平板接种于V型底的96孔板中，并使用170μL/孔的FACS缓冲液(PBS 1X+2％ FCS/FBS+0.1％叠氮化钠)洗涤两次。将纯化的人抗人ROR1抗体在FACS缓冲液中以不同浓度稀释(范围为10至0.00061μg/mL；稀释度1:4)，然后将细胞重悬于100μL/孔的经稀释抗体中，并在4℃下温育30分钟。在170μL/孔的FACS缓冲液中洗涤2次后，将细胞与AF647缀合的山羊抗人IgG次级抗体(南方生物技术公司；目录号2040-31，批号K471X873C；FACS缓冲液中稀释度1:2,000)在4℃下以80μL/孔温育20分钟。将细胞沉淀洗涤两次，并且随后用120μL固定缓冲液(百进生物公司；目录号420801，批号B306498)重悬，并在黑暗中在室温下温育15分钟。然后，将细胞以1,500rpm离心2分钟，并通过快速轻弹板去除上清液。将细胞洗涤两次，重悬于150μL/孔的FACS缓冲液中，并在Attune NxT上通过流式细胞术获得。通过使用FlowJo v10分析数据。图7A示出，在人肿瘤细胞系中，A549(肺泡腺癌)具有最高水平的ROR1表达，并且HepG2(肝癌)表达很少的ROR1，其中检测到的ROR1抗体标记与A549-ROR1敲除细胞的标记相当。MCF-7(乳腺癌)细胞表达中等水平的ROR1。
为了进行杀伤测定，从人健康全血中分离人外周血单核细胞(hPBMC)，然后使用如制造商推荐的EasySep人T细胞分离试剂盒(干细胞技术公司(StemCell Technology)；目录号17951，批号1000024139)从hPBMC中分离人T细胞。将A549-Fluc WT、A459-Fluc/ROR1 KO、MCF-7-Fluc和HepG2-Fluc靶细胞以10,000个细胞/孔平板接种于白色不透明平底96孔测定板(康宁公司，目录号3917)中的100μL的完整培养基中。将板以1,500rpm旋转1分钟，并在37℃下温育过夜以使细胞粘附。通过快速轻弹板去除来自包括靶细胞的96孔板中的上清液。将纯化的效应T细胞(100μL/孔)以2:1的E:T比率平板接种于靶细胞的顶部。作为对照，一些孔没有接受效应细胞。将具有SepGI-201感染的培养物或SepGI-Null感染的培养物的VFCM在完全RPMI1640中稀释，并以100μL/孔添加到细胞中。SepGI-201病毒包括αROR1/αCD3BspAb构建体，并且SepGI-Null病毒不包括BspAb构建体。将细胞轻轻混合，以1,500rpm旋转1分钟，并在37℃下温育3天，之后收集上清液(100μL/孔)。使用根据制造商的推荐的来自Meso Scale Discovery公司(MSD；目录号K15049D)的促炎性小组1(人)试剂盒测量上清液中存在的IFNγ表达水平。通过添加100μL/孔的如制造商所推荐的荧光素酶测定底物(普洛麦格公司；目录号G7940；批号0000422404)，并在缓慢振荡条件下在黑暗中在室温下温育5分钟来测量来自孔的发光信号来评估杀伤活性。用TECAN装置读取发光信号(积分时间：500毫秒)。样品的杀伤百分比计算如下：100-([发光样品/基线发光无VFCM对照])×100。图7B展示了即使T细胞在高VFCM浓度下被激活(如IFNγ表达增加所示)，当A549和MCF-7细胞在存在SepGI-201VCFM的情况下被T细胞杀伤时，HepG2细胞也被保留(由于低ROR1表达)。/>
实施例9.表达双特异性抗体的溶瘤病毒SepGI-189、SepGI-201和SepGI-203的杀伤活性。
图8A提供了用于评估分别表达“o11”αROR1/αCD3、“s10”αROR1/αCD3和“jlv1011”αROR1/αCD3 BspAb构建体的溶瘤病毒SepGI-189、SepGI-201和SepGI-203对A549肿瘤细胞杀伤的实验计划(表1)。在第0天，将A549-FLuc WT和A549-FLuc ROR1 KO靶细胞以10,000个细胞/孔平板接种于白色不透明平底96孔测定板(康宁公司，目录号3917)中的100μL完全RPMI-1640+10％ FCS中。将板以1,500rpm旋转1分钟，并在37℃下温育过夜以使细胞粘附。在第1天，将靶细胞用αROR1/αCD3病毒(SepGI-189、SepGI-201或SepGI-203，参见表1)或阴性对照SepGI-Null病毒以1、0.33、0.11、0.04和0.01的感染复数(MOI)感染。在第2天，使用如制造商所推荐的pan T细胞分离试剂盒(美天旎生物技术公司；目录号130-096-535，批号519115439)从新鲜分离的PBMC中纯化T细胞。通过快速轻弹96孔板从靶细胞中去除上清液并以100μL/孔平板接种20,000个效应T细胞以达到2:1的E:T比率。将细胞轻轻混合，以1,500rpm旋转1分钟，并在37℃下温育4天。在第6天，通过使用100μL/孔的如制造商所推荐的荧光素酶测定底物(普洛麦格公司；目录号G7940；批号0000422404)，并在缓慢振荡条件下在黑暗中在室温下温育5分钟来测量发光信号来评估杀伤活性。用TECAN装置读取发光信号(积分时间：500毫秒)。样品的杀伤百分比计算如下：100-([发光样品/基线发光无病毒])×100。
图8B示出，与被SepGI-null病毒感染的肿瘤细胞相比，以低至0.11的MOI被每种表达BspAb的病毒感染的肿瘤细胞以显著的百分比被杀伤。以0.04MOI被SepGI-201感染的肿瘤细胞导致显著更高的肿瘤细胞杀伤，而以0.01的MOI被SepGI-203感染的肿瘤细胞则导致显著更高的肿瘤细胞杀伤。当将ROR1敲除肿瘤细胞用病毒感染并用作靶标时，未观察到同样的效果。在这种情况下，仅用SepGI-203病毒感染导致显著更高的杀伤，这表明SepGI-203在高于0.11的MOI下显示出一定程度的非特异性杀伤。所有这些数据表明，与αROR1/αCD3BspAb组合的溶瘤活性以抗原特异性依赖性方式显著增加了抗肿瘤活性。
实施例10.s10和jlv1011单克隆抗体的小鼠交叉反应性。
为了测试在工程化αROR1/αCD3双特异性抗体中使用的s10(RO6D8-s10)和jlv1011(RO6D8-jlv1011)单克隆抗体是否识别除人ROR1外的小鼠ROR1，采用了图9A所描绘的测定。将96孔板用50μL/孔的重组小鼠ROR1 IgG2-Fc融合蛋白以2μg/mL(R&D系统公司，目录号9910-RO-050，批号DIWM0120121)涂覆，然后将板密封并在4℃下温育过夜。第二天，将板用150μL/孔的洗涤缓冲液(含0.05％ V/V Tween20的杜尔贝科氏磷酸盐缓冲盐水1X)洗涤。通过使用80μL/孔的封闭缓冲液(含2％ BSA+0.05％ Tween20的杜尔贝科氏磷酸缓冲盐水)封闭非特异性结合，并将板在37℃下温育1小时。三次洗涤后，将两种抗人ROR1抗体(s10和jlv1011)在封闭缓冲液(80μL/孔)中连续稀释，并在缓慢振荡的情况下在室温(RT)下温育2小时。将板用洗涤缓冲液洗涤三次，并且然后添加在封闭缓冲液(1:2,000稀释)中稀释的80μL/孔的次级HRP标记的山羊抗人IgG Fc(南方生物技术公司；目录号2081-05；批号L5311-TE40)。将板在黑暗中在37℃下温育1小时。将板用洗涤缓冲液洗涤三次，并将SureBlueReserve TMB单一组分微孔过氧化物酶底物溶液(SeraCare公司，目录号5120-0082)添加到孔中(80μL/孔)。将板在黑暗中在室温下温育10-15分钟。通过添加50μL/孔的TMB BlueSTOP溶液(SeraCare公司，目录号5150-0022)来使信号产生停止，并且随后使用TecanSpark或其它装置在450nm处读取信号(SeraCare TMB BlueSTOP溶液所特定的)。图9B示出，用于产生SepGI-201和SepGI-203的BspAb构建体的抗ROR1抗体均表现出小鼠交叉反应性。
实施例11.用表达BspAb的病毒处理肿瘤的体内研究。
图10A提供了用于测试表达αROR1/αCD3双特异性抗体的溶瘤病毒的有效性的小鼠接种和处理时间表的图。在第-6天(D-6)，向雌性NSG-Tg(Hu-IL-15)小鼠(6周龄)腹膜内(I.P.)注射含1.0E+07新鲜纯化的人外周血单核细胞(PBMC)的1×杜尔贝科氏磷酸盐缓冲盐水(DPBS)。在第0天(D0)，向小鼠右胁腹皮下(S.C.)注射于100μL的1×DPBS中稀释的5.0E+06A549-WT肿瘤细胞。在第6天(D6)，将小鼠随机分为四组(三个“病毒处理”组和一个“无病毒处理”对照组)，并开始病毒处理：在第6天、第10天和第12天，以50μL/小鼠/注射，SepG1-189、SepG1-201、SepGI-Null或无病毒中的任一者在瘤周(P.T.)递送。每周两次监测肿瘤生长和体重。使用卡尺测量肿瘤体积并使用公式V＝(长度×宽度2)/2计算。研究在第31天终止，并且肿瘤生长抑制(TGI)百分比计算如下：[1-(处理组的相对肿瘤体积)/(对照组的相对肿瘤体积)]×100。
图10B和10C提供了处理组和未处理组的肿瘤体积和所计算的肿瘤生长抑制(TGI)，并且图10D提供了实验过程中小鼠的体重。与未处理或用不表达αROR1/αCD3 BspAb的病毒(SepGI-Null)处理相比，用表达αROR1/αCD3双特异性抗体的病毒(SepGI-189和SepGI-201)处理更加抑制肿瘤生长。
实施例12.用于表达ROR1/CD3双特异性抗体以及编码IL-12或IL-12的另外的基因加上抗VEGFR抗体的构建体。
制备了另外的构建体以用于合成编码ROR1-CD3双特异性抗体以及细胞因子IL-12的HSV。SepGI-216构建体(双基因构建体，图11A)包括在EF1α/HTLV启动子(SEQ ID NO:41)控制下的αROR1(s10)-αCD3双特异性抗体(SEQ ID NO:18)和在CMV启动子(SEQ ID NO:42)控制下的编码人IL-12的基因(SEQ ID NO:46)。人IL-12基因编码单个多肽(SEQ ID NO:47)，所述单个多肽涵盖IL-12的通过2x弹性蛋白接头(SEQ ID NO:66)连接的p40和p35亚基。SepGI-212构建体(三重基因构建体，图11B)包括在EF1α/HTLV启动子(SEQ ID NO:41)控制下的编码αROR1(s10)-αCD3双特异性抗体(SEQ ID NO:37)的基因和与Fc1区(SEQ ID NO:50)和人IL-12基因(SEQ ID NO:46)连接的编码抗VEGFR2 scFv的基因，其中编码αVEGFR2scFv-Fc1的序列(SEQ ID NO:48)和编码人IL-12的序列(SEQ ID NO:46)被编码T2A自切割肽的序列(SEQ ID NO:51)分开，并且涵盖编码人IL-12多肽和VEGFR2 scFv-Fc1多肽的序列的连续开放阅读框处于CMV启动子(SEQ ID NO:42)的控制下(参见图11B)。
另外，为了用作对照，设计了类似构建体，其中编码αROR1(s10)-αCD3双特异性抗体的基因被编码包括与呼吸道合胞病毒的F蛋白(SEQ ID NO:43)和CD3结合的scFv的双特异性抗体(本文中称为“αRSV-αCD3双特异性抗体”)的基因替代。这些构建体的克隆以及重组病毒的产生和分离基本上如实施例1中所阐述地进行。
表2.SepGI HSV构建体。
测试由病毒产生的VFCM(参见实施例2)以通过基本上如实施例3所描述的ELISA评估转基因的表达，其中将板的孔用ROR1、RSV蛋白或人VEGFR涂覆。
图12A、B和C中提供了ELISA的结果。第一个图(图12A)示出，包括编码RSV蛋白抗体的基因的所有三种病毒(SepGI-207、SepGI-214和SepGI-218)均产生了RSV抗体，而其它病毒(缺乏RSV蛋白抗体)均未产生。图12B示出，如所预期的，SepGI-201、SepGI-216和SepGI-212病毒均表达ROR1抗体，而缺乏编码αROR1(s10)-αCD3双特异性抗体基因的对照病毒则不表达。图12C示出了用于检测IL-12的ELISA的结果。在这种情况下，来自被SepGI-212、SepGI-216和SepGI-218感染的细胞的VFCM均被发现包括IL-12蛋白，而用SepGI-214感染的两个细胞分离物则不包括。(后来发现SepGI-214的后续分离物产生IL-12。)正如所预期的，在未感染的培养物或被SepGI Null病毒或SepGI-207病毒感染的培养物的VFCM中未检测到IL-12。
用于检测VEGFR2 scFv抗体的ELISA结果示出于图13中，其中将96孔ELISA板的孔用重组人VEGFR2(VEGFR2/KDR蛋白(ECD，His标签)(义翘神州公司(Sino Biological))涂覆。在将抗原涂覆的孔洗涤后，将VFCM在封闭缓冲液中连续稀释8倍，并以50μL/孔添加，并将板在室温下在振荡器上温育2小时。将板用洗涤缓冲液和50μL/孔的山羊抗人IgG(H+L)次级抗体洗涤3X，添加HRP(在封闭缓冲液中稀释1:5,000x)(英杰公司(Invitrogen))并将板在37℃下温育1小时。在将板用洗涤缓冲液洗涤板3X后，通过使用50μL/孔的SureBlueReserve TMB 1-组分微孔过氧化物酶底物溶液(目录号5120-0082，SeraCare公司)检测信号。将板在黑暗中在室温下温育10-12分钟。然后添加50μL/孔的TMB BlueSTOP溶液(目录号5150-0022，SeraCare公司)，并使用TecanSpark在450nm处读取吸光度(SeraCare TMBBlueSTOP溶液所特定的)。图13的图示出，具有三重基因病毒SepGI-212的一个分离物的VFCM证明了αVEGFR2-Fc抗体的表达，而不包括αVEGFR2-Fc抗体基因(SepGI Null、SepGI-201、SepGI-207、SepGI-216和SepGI-218)的病毒的任何VCFM都没有结合。
实施例13.IL-12活性测定。
IL-12活性的测定基本上如实施例9中所描述地进行，其中在基于荧光素酶的测定中测试了被SepGI-Null、SepGI-201、SepGI-207、SepGI-212、SepGI-214、SepGI-216和SepG1-218感染的细胞的VFCM。使用了基于细胞的测定，在所述测定中，将具有异二聚体IL-12受体并且被工程化成具有在IL-12应答启动子的控制下的荧光素酶基因的细胞(IL-12测定就绪细胞(新罕布什尔州阿姆赫斯特的鹰生物科学公司(Eagle Biosciences,Amherst,NH)))与被重组HSV感染的细胞的裂解物一起温育。使用普洛麦格公司One-Glo荧光素酶系统进行检测。
简而言之，通过将来自未感染的细胞或被各种HSV感染的细胞的稀释的VFCM添加到96孔板的孔中来进行测定。如实施例2中所描述的，产生感染的细胞培养物(VFCM)的裂解物。将重组IL-12(R&D系统公司)的稀释系列添加到另外的孔中以生成标准曲线。基本上根据制造商的说明书，使用IL-12报告基因细胞。将40K iLite细胞解冻、稀释，并且将40μl添加到96孔板的每个孔中。然后将40μl稀释系列的VFCM添加到测定孔中，将孔中的内含物混合，并且将板在37℃、5％ CO2下温育五小时。将重组IL-12以稀释系列添加到单独的孔中以产生标准曲线。然后将One-Glo荧光素酶试剂(威斯康星州麦迪逊的普洛麦格公司(PromegaCorp.,Madison,WI))添加到每个孔(40μL)中，并且在室温下10分钟后，使用Tecan Spark酶标仪测量萤火虫荧光素酶发光。结果示出于图14，所述图提供了使用未感染的细胞条件培养基、来自被不包括外源转基因的病毒感染的细胞的条件培养基(SepGI-Null)以及来自被包括IL12基因的病毒SepGI-201和SepGI-207(无IL12基因)、SepGI-212和SepGI-214(具有IL-12基因的三重基因病毒)以及SepGI-216和SepGI-216(具有IL-12基因的双基因病毒)感染的细胞的条件培养基来进行测定的发光图。值得注意的是，被包括IL-12基因的病毒感染的所有细胞均表达功能性IL-12，其中除在ELISA中也没有显示出IL-12蛋白产生的三重基因病毒SepGI-214的分离物外(实施例12)。
实施例14.细胞-细胞相互作用测定。
为了评估由工程化HSV编码的αROR1-αCD3双特异性抗体与靶向表达ROR1的肿瘤细胞和T细胞缀合的能力，用荧光团分别地标记小鼠肿瘤细胞和人T细胞。使用eFluor 450(赛默飞世尔公司)标记Hepa 1-6细胞和A549细胞(两者均表达ROR1)(图15B)，并用eFluor 670预标记从PBMC分离的人T细胞(图15C)，并通过流式细胞术测定和分析细胞-细胞相互作用，基本上如实施例5所描述的。图15D示出了流式细胞术结果的实施例，其中在图的右上象限中可以看到缀合的细胞(在两个波长处都发出荧光)。
αROR1-αCD3双特异性抗体介导的T细胞与表达ROR1的肿瘤细胞缀合的流式细胞术测定结果在图16A、B和C以图形方式呈现。图16A从左至右示出了在存在表达编码αRSV-αCD3双特异性抗体以及IL-12的构建体的SepGI-218VFCM的情况下共温育后与T细胞缀合的Hepa1-6细胞、A549野生型细胞和A549 ROR1敲除细胞的百分比。图16B从左至右示出了在存在表达编码αROR1-αCD3双特异性抗体的构建体的SepGI-201VFCM的情况下共温育后Hepa 1-6细胞以及然后A549野生型细胞的百分比。图16C从左至右示出了在存在表达编码αROR1-αCD3双特异性抗体以及IL-12的构建体的SepGI-216VFCM的情况下共温育后Hepa 1-6细胞以及然后A549野生型细胞的百分比。在存在SROR1+肿瘤细胞的情况下观察到微小的细胞-细胞相互作用-在存在SepGI-201感染的细胞和SepGI-216感染的细胞的VFCM的情况下观察到T细胞相互作用，其中在SepGI-201感染的细胞与SepGI-216感染的细胞之间没有观察到显著差异。
实施例15.T细胞激活测定。
为了确定αROR1-αCD3双特异性抗体对T细胞激活的影响，进行了测定，在所述测定中，表达ROR1的肿瘤细胞与T细胞在存在被编码αROR1–αCD3双特异性抗体的病毒感染的细胞的VFCM的情况下温育，之后评估了T细胞表面上的激活标志物。简而言之，将野生型A549细胞或ROR1敲除A549细胞(作为对照)以104个细胞/孔平板接种于96孔板的孔中。第二天，将用CFSE染色的新鲜分离的CD3+T细胞以10:1或5:1的E:T比率添加到孔中。将VFCM以1,000倍稀释度添加到孔中或者将CD3/CD28珠粒(作为阳性对照)添加到孔(珠粒与细胞的比率为1:20)中。一天、两天和三天后，去除上清液以用于T细胞的染色以用于表达激活标记物并通过流式细胞术进行分析。
图17A-D提供了以ROR1敲除A549细胞为靶标的测定结果。图17A示出，无论细胞是用未感染培养物的VFCM(第一个两个条形图)还是用SepGI-Null病毒(第二个两个条形图)、SepGI-207病毒(第二个两个条形图)、SepGI-201病毒(第三个两个条形图)或CD3/CD28珠粒(第四个两个条形图)感染的细胞的VFCM培养，CD3+T细胞在测定的第1天、第2天和第3天的活力都接近100％。图17B提供了每个测定组在测定的连续几天的CD3+CD4+细胞计数。图17C提供了基于流式细胞术的测定的连续几天中每个测定组的CD25+细胞的百分比，并且图17D提供了测定的连续几天中每个测定组的CD69+细胞的百分比。尽管CD3/CD38珠粒导致T细胞的激活，如在测定过程中CD25和CD69的表达增加所证明的，但当ROR1敲除细胞用作靶标时，无论VFCM的存在如何，都没有观察到T细胞的激活，如通过CD25和CD69的表达所评估的。
图17E-H提供了用表达ROR1的野生型A549细胞作为靶标的测定结果。图17E示出，无论细胞是用未感染培养物的VFCM(第一个两个条形图)还是用SepGI-Null病毒(第二个两个条形图)、SepGI-207病毒(第二个两个条形图)、SepGI-201病毒(第三个两个条形图)或CD3/CD28珠粒(第四个两个条形图)感染的细胞的VFCM培养，CD3+T细胞在测定的第1天、第2天和第3天的活力都接近100％。图17F提供了每个测定组在测定的连续几天的CD3+CD4+细胞计数。图17G提供了基于流式细胞术的测定的连续几天中每个测定组的CD25+细胞的百分比，并且图17H提供了测定的连续几天中每个测定组的CD69+细胞的百分比。值得注意的是，被工程化以表达αROR1-αCD3双特异性抗体的SepGI-201病毒感染的培养物中VFCM的存在导致共培养物中T细胞表达CD25和CD69两者。对于另外包括SepGI-207感染的细胞的VFCM、与SepGI-207感染的细胞的VFCM或与未感染细胞的VFCM的共培养物，没有观察到这种诱导表达。因此，使用表达ROR1的靶细胞，共培养物中T细胞的激活可以归因于αROR1-αCD3双特异性抗体的存在，所述抗体可以与T细胞接合，导致其激活。
实施例16.T细胞增殖/激活测定。
用单基因和双基因表达病毒进行另外的细胞培养物测定。在这些测定中，将A549野生型或A549 ROR1敲除细胞以104个细胞/孔平板接种于96孔板的孔中。将用celltraceviolet(CTV)染料染色的纯化的人T细胞以10:1和5:1的效应子:靶标比率添加到孔中，并将1:1,000稀释度的VFCM添加到孔中。VFCM属于被SepGI-207(αRSV-αCD3双特异性抗体基因)、SepGI-201(αROR1-αCD3双特异性抗体基因)、SepGI-216(αROR1-αCD3双特异性抗体基因加上IL-12基因)和SepGI-218(αROR1-αCD3双特异性抗体基因加上IL-12基因)感染的细胞。将板温育3天，其中在1天、2天或3天后进行流式细胞术以通过CTV+T细胞的百分比来确定细胞增殖。图18示出了效应子与靶标比率为5:1的测定结果，其中仅对ROR+靶细胞和仅当培养物中包括SepGI-201和SepGI-216感染的培养物的含αROR1-αCD3双特异性抗体的VFCM时观察到特异性T细胞增殖。
实施例17.使用被工程化以表达αROR1-αCD3双特异性抗体的单基因、双基因和三重基因HSV感染的细胞的VFCM进行基于荧光素酶的杀伤测定。
进行测定以评估被工程化以表达αROR1-αCD3双特异性抗体的HSV感染的细胞的VFCM对T细胞杀伤ROR1+肿瘤细胞的影响。对于这些测定，通过用逆转录病毒转导细胞以表达GFP和萤火虫荧光素酶来标记靶细胞(A549野生型细胞或用作对照的A549 ROR1敲除细胞)。将表达荧光素酶的靶细胞以104个细胞/孔平板接种于96孔板中的100μlRPMI-1640+10％ FCS中，并在37℃下温育两天。然后以0.5:1的比率将从PBMC新鲜分离的新鲜分离的人T细胞添加到孔中，并将1,000或1:8,000的稀释度的VFCM添加到每个测定孔中。将板在37℃下温育四天，之后通过添加80μl Bio-Glo荧光素酶测定试剂(普洛麦格公司)、将板在黑暗中温育5分钟并用TECAN装置读取发光来评估表达荧光素酶的细胞的数量(积分时间，500毫秒)。图19A示出，在不存在T细胞(效应子)的情况下，A549野生型细胞的数量接近107，无论添加到培养物中的VCFM是否存在或类型如何。然而，在存在T细胞的情况下，A549野生型靶细胞的减少在培养物中是明显的，所述培养物包括被工程化以表达αROR1-αCD3双特异性抗体的以下病毒的VFCM：SepGI-201、SepGI-212和SepGI-216(参见表2)。在包括未被工程化以表达αROR1-αCD3双特异性抗体的SepGI-207、SepGI-214和SepGI218病毒的VFCM的培养物中未观察到靶细胞的杀伤，如图19C所示，提供了杀伤百分比的图所示。图19B和19D提供了使用ROR1敲除A549靶细胞时的结果，表明无论共培养物中的VCFM(或双特异性抗体)如何，T细胞效应子都缺乏对不表达ROR1的细胞的杀伤。
实施例18.使用具有单基因、双基因、三重基因表达因子(VFCM)的549WT细胞的Xcellgence杀伤测定。
还使用实时细胞分析仪(加利福尼亚州圣地亚哥的艾森生物公司(Acea Biosciences,San Diego,CA)进行了杀伤测定。对于这些实验，将A549野生型和A549ROR1敲除细胞在50μl的RPMI-1640+10％ FCS中以10,000个细胞/孔接种于96孔E板(艾森生物公司)的孔中。以0.5:1的效应子与靶标的比率添加T细胞，并添加被HSV SepGI-Null、SepGI-207、SepGI-212、SepGI-216和SepGI-218感染的细胞培养物的1:1,000稀释的VFCM。连续三天对板进行读取。图20示出，包括不包括αROR1-αCD3双特异性抗体构建体的以下HSV的VFCM的测定的增殖程度和模式与完全缺乏VFCM的培养物的增殖程度和模式基本上相同：SepGI-207、SepGI-214、SepGI-218和SepGI-123(仅IL-12基因)。另一方面，包括被工程化以表达αROR1-αCD3双特异性抗体构建体的以下HSV的VFCM的测定显示增殖减少，指示在这些培养物中ROR1+靶细胞被杀伤：SepGI-201、SepGI-212和SepGI-216。图21示出了平行测定的结果，其中靶细胞是ROR1敲除细胞。在这种情况下，没有观察到增殖损伤。
实施例19.SepGI-201VFCM在NOD/Scid伪人源化小鼠模型中抗肿瘤活性的体内研究。
设计了一项研究，以评估用被工程化以表达αROR1-αCD3双特异性抗体的SepGI-201HSV感染的细胞的VFCM处理荷瘤NOD/Scid伪人源化小鼠的效果。作为对照，用被工程化以表达αRSV-αCD3双特异性抗体的SepGI-207HSV感染的细胞的VFCM处理一些荷瘤小鼠。用表3所示的处理方案确立了六组的八只小鼠。
表3.用于VFCM处理研究的小鼠组。
组 肿瘤细胞 PBMC VFCM
1 4x106A549 wt 4x106hPBMC 无
2 4x106A549 wt 4x106hPBMC αRSV-αCD3(SepGI-207)
3 4x106A549 wt 4x106hPBMC αROR1-αCD3(SepGI-201)
4 4x106A549 ROR1 KO 4x106hPBMC 无
5 4x106A549 ROR1 KO 4x106hPBMC αRSV-αCD3(SepGI-207)
6 4x106A549 ROR1 KO 4x106hPBMC αROR1-αCD3(SepGI-201)
在所有小鼠中，将A549野生型或A549 ROR1敲除的肿瘤细胞与人PBMC皮下共注射。四周后，开始处理，其中组2-6的小鼠每四至五天瘤周注射50μl的VFCM，总共五次处理。每周两次监测肿瘤生长和体重。使用卡尺测量肿瘤体积，并在大约9周研究终止时，肿瘤生长抑制(TGI)计算如下：[1-(处理组的相对肿瘤体积)/(对照组的相对肿瘤体积)]×100。
实施例20.SepGI-201 VFCM在NSG-B2m KO伪人源化小鼠模型中抗肿瘤活性的体内研究。
设计了一项研究，以评估用被工程化以表达αROR1-αCD3双特异性抗体的SepGI-201 HSV处理荷瘤NSG-B2m敲除伪人源化小鼠的效果。作为对照，用被工程化以表达αRSV-αCD3双特异性抗体的SepGI-207 HSV处理一些小鼠组。用表4所示的处理确立了六组的八只小鼠。
表4.用于VFCM处理研究的小鼠组。
组 肿瘤细胞 PBMC 病毒
1 5x106A549 wt 5x106hPBMC 无
2 5x106A549 wt 5x106hPBMC SepGI-207(αRSV-αCD3)
3 5x106A549 wt 5x106hPBMC SepGI-201(αROR1-αCD3)
4 5x106A549 ROR1 KO 5x106hPBMC SepGI-207(αRSV-αCD3)
5 5x106A549 ROR1 KO 5x106hPBMC SepGI-201(αROR1-αCD3)
在所有小鼠中，将A549野生型或A549 ROR1敲除的肿瘤细胞与人PBMC皮下共注射。四周后，开始处理，其中组2-5的小鼠每四至五天瘤周注射50μl的溶瘤病毒，总共三次处理。每周两次监测肿瘤生长和体重。使用卡尺测量肿瘤体积，并在大约9周研究终止时，肿瘤生长抑制(TGI)计算如下：[1-(处理组的相对肿瘤体积)/(对照组的相对肿瘤体积)]×100。
序列
SEQ ID NO:1
蛋白质
人工
o11抗ROR1抗体重链可变区
SEQ ID NO:2
蛋白质
人工
o11抗ROR1抗体重链可变区CDR1：
NYYMH
SEQ ID NO:3
蛋白质
人工
o11抗ROR1抗体重链可变区CDR2：
IINPTSGRTSYAQKFQG
SEQ ID NO:4
蛋白质
人工
o11抗ROR1抗体重链可变区CDR3：
DSSSWYSGWYFDL
SEQ ID NO:5
蛋白质
人工
o11抗ROR1抗体ROR1抗体轻链可变区
SEQ ID NO:6
蛋白质
人工
o11抗ROR1抗体轻链可变区CDR1
RASQGIRTDLA
SEQ ID NO:7
蛋白质
人工
o11抗ROR1抗体轻链可变区CDR2
AASSLQS
SEQ ID NO:8
蛋白质
人工
o11抗ROR1抗体轻链可变区CDR3
QQYYGYPIA
SEQ ID NO:9
蛋白质
人工
o11抗ROR1单链抗体(scFv)
SEQ ID NO:10
蛋白质
人工
s10抗ROR1抗体重链可变区
SEQ ID NO:11
蛋白质
人工
s10抗ROR1抗体重链可变区CDR1
NYYMH
SEQ ID NO:12
蛋白质
人工
s10抗ROR1抗体重链可变区CDR2
IINPSGGSTSYAQKFQG
SEQ ID NO:13
蛋白质
人工
s10抗ROR1抗体重链可变区CDR3
SSRSSYYLWVLDL
SEQ ID NO:14
蛋白质
人工
s10抗ROR1抗体轻链可变区
SEQ ID NO:15
蛋白质
人工
s10抗ROR1抗体轻链可变区CDR1
RASQGVSTEIA
SEQ ID NO:16
蛋白质
人工
s10抗ROR1抗体轻链可变区CDR2
AASSLQS
SEQ ID NO:17
蛋白质
人工
s10抗ROR1抗体轻链可变区CDR3
QQFNSYPIT
SEQ ID NO:18
蛋白质
人工
s10抗ROR1单链抗体(scFv)
SEQ ID NO:19
蛋白质
人工
jlv1011抗ROR1抗体重链可变区：
SEQ ID NO:20
蛋白质
人工
jlv1011抗ROR1抗体重链可变区CDR1：
SKYYH
SEQ ID NO:21
蛋白质
人工
jlv1011抗ROR1抗体重链可变区CDR2：
IINPTSGSTSYAQKFQG
SEQ ID NO:22
蛋白质
人工
jlv1011抗ROR1抗体重链可变区CDR3：
DSSRYSGWYFDL
SEQ ID NO:23
蛋白质
人工
jlv1011抗ROR1抗体轻链可变区：
SEQ ID NO:24
蛋白质
人工
jlv1011抗ROR1抗体轻链可变区CDR1
RASQGVSTEIA
SEQ ID NO:25
蛋白质
人工
jlv1011抗ROR1抗体轻链可变区CDR2
AASSLQS
SEQ ID NO:26
蛋白质
人工
jlv1011抗ROR1抗体轻链可变区CDR3
QQYYGYPIA
SEQ ID NO:27
蛋白质
人工
jlv1011单链抗体(scFv)
SEQ ID NO:28
蛋白质
人工
信号肽
MEWSWVFLFFLSVTTGVHS
SEQ ID NO:29
蛋白质
人工
(G4S)4接头
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
SEQ ID NO:30
蛋白质
人工
可替代性GS接头
GGGSGGGSGGGSGGGSG
SEQ ID NO:31
蛋白质
人工
(G4S)1接头
GGGGS
SEQ ID NO:32
蛋白质
人工
Hum291抗CD3抗体重链可变区：
SEQ ID NO:33
蛋白质
人工
Hum291抗CD3抗体轻链可变区：
SEQ ID NO:34
蛋白质
人工
Hum291抗CD3单链抗体(scFv)
SEQ ID NO:35
DNA
人工
编码具有
信号肽-抗ROR1克隆O11 scFv-接头-抗CD3克隆hum291 scFv的o11抗ROR1/抗CD3双特异性抗体前体
SEQ ID NO:36
蛋白质
人工
o11抗ROR1/抗CD3双特异性抗体前体：
信号肽-抗ROR1克隆O11 scFv-接头-抗CD3克隆hum291 scFv
SEQ ID NO:37
DNA
人工
编码具有
信号肽-抗ROR1克隆s10 scFv-接头-抗CD3克隆hum291 scFv的s10抗ROR1/抗CD3双特异性抗体前体
SEQ ID NO:38
蛋白质
人工
s10抗ROR1/抗CD3双特异性抗体前体
信号肽-抗ROR1克隆s10 scFv-接头-抗CD3克隆hum291 scFv
SEQ ID NO:39
DNA
人工
编码具有
信号肽-抗ROR1克隆jlv1011 scFv-接头-抗CD3克隆hum291 scFv的jlv1011抗ROR1/抗CD3双特异性抗体前体
SEQ ID NO:40
蛋白质
人工
jlv1011抗ROR1/抗CD3双特异性抗体前体：
信号肽-抗ROR1克隆jlv1011 scFv-接头-抗CD3克隆hum291 scFv
SEQ ID NO:41
DNA
人工
EF1α/HTLV启动子
SEQ ID NO:42
DNA
巨细胞病毒
CMV启动子
SEQ ID NO:43
DNA
人工
编码呼吸道合胞病毒蛋白F(RSV)scFv抗体前体：信号肽、VH链-接头-VL链
SEQ ID NO:44
蛋白质
人工
呼吸道合胞病毒蛋白F(RSV)scFv抗体前体(信号肽-VH链-接头-VL链)
SEQ ID NO:45
蛋白质
人工
呼吸道合胞病毒蛋白F(RSV)scFv抗体：(VH链-接头-VL链)
SEQ ID NO:46
DNA
人工
编码人IL-12(p40-2x弹性蛋白-p35)
SEQ ID NO:47
蛋白质
人工
人IL-12(p40-2x弹性蛋白-p35)
SEQ ID NO:48
DNA
人工
编码抗VEGFR-2VKB8 scFv抗体前体(信号肽-VH链-接头-VL链-IgG1-Fc区)
SEQ ID NO:49
蛋白质
人工
抗VEGFR-2VKB8 scFv-Fc1抗体前体(信号肽-VH链-接头-VL链-IgG1 Fc区)
SEQ ID NO:50
DNA
人工
抗VEGFR-2VKB8 scFv-Fc1抗体(VH链-接头-VL链-IgG1 Fc区)
SEQ ID NO:51
蛋白质
T2A自切割肽
GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP
SEQ ID NO:52
蛋白质
人工
A7抗ROR1抗体重链可变区
SEQ ID NO:53
蛋白质
人工
A7抗ROR1抗体重链CDR1
DYYMT
SEQ ID NO:54
蛋白质
人工
A7抗ROR1抗体重链CDR2
YISGSSAYSNYADSVKG
SEQ ID NO:55
蛋白质
人工
A7抗ROR1抗体重链CDR3
DPLLYGWLTD
SEQ ID NO:56
蛋白质
人工
A7抗ROR1抗体轻链可变区
SEQ ID NO:57
蛋白质
人工
A7抗ROR1抗体轻链CDR1
TGTSS
SEQ ID NO:58
蛋白质
人工
A7抗ROR1抗体轻链CDR2
EVSKRPS
SEQ ID NO:59
蛋白质
人工
A7抗ROR1抗体轻链CDR3
SSYINDAVF
SEQ ID NO:60
蛋白质
人工
A8抗ROR1抗体重链可变区
SEQ ID NO:61
蛋白质
人工
A8抗ROR1抗体重链CDR1
DYYMT
SEQ ID NO:62
蛋白质
人工
A8抗ROR1抗体重链CDR2
YISGSSAYSNYADSVKG
SEQ ID NO:63
蛋白质
人工
A8抗ROR1抗体重链CDR3
DPLLYGWLTD
SEQ ID NO:64
蛋白质
人工
A8抗ROR1抗体轻链可变区
SEQ ID NO:65
蛋白质
人工
A8抗ROR1抗体轻链CDR1
TGTSSDGGGYDSVS
SEQ ID NO:66
蛋白质
人工
A8抗ROR1抗体轻链CDR2
DVNKRPS
SEQ ID NO:67
蛋白质
人工
A8抗ROR1抗体轻链CDR3
SSFTSDVMV
SEQ ID NO:68
蛋白质
人工
2x弹性蛋白接头
VPGVGVPGVG
SEQ ID NO:69
蛋白质
人工
(GGGGS)3接头
GGGGSGGGGSGGGGS
序列表
<110> 索伦托药业有限公司（SORRENTO THERAPEUTICS, INC.）
<120> 表达抗ROR1/抗CD3双特异性抗体的溶瘤病毒
<130> 01223-0096-00PCT
<150> US 63/173,205
<151> 2021-04-09
<160> 69
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：o11抗ROR1抗体重链可变区
<400> 1
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Thr Ser Gly Arg Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Ser Ser Ser Trp Tyr Ser Gly Trp Tyr Phe Asp Leu Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 2
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：o11抗ROR1抗体重链可变区CDR1
<400> 2
Asn Tyr Tyr Met His
1 5
<210> 3
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：o11抗ROR1抗体重链可变区CDR2
<400> 3
Ile Ile Asn Pro Thr Ser Gly Arg Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 4
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：o11抗ROR1抗体重链可变区CDR3
<400> 4
Asp Ser Ser Ser Trp Tyr Ser Gly Trp Tyr Phe Asp Leu
1 5 10
<210> 5
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：o11抗ROR1抗体ROR1抗体轻链可变区
<400> 5
Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Thr Asp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Gly Tyr Pro Ile
85 90 95
Ala Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 6
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：o11抗ROR1抗体轻链可变区CDR1
<400> 6
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Thr Asp Leu Ala
1 5 10
<210> 7
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：o11抗ROR1抗体轻链可变区CDR2
<400> 7
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：o11抗ROR1抗体轻链可变区CDR3
<400> 8
Gln Gln Tyr Tyr Gly Tyr Pro Ile Ala
1 5
<210> 9
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：o11抗ROR1单链抗体（scFv）
<400> 9
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Thr Ser Gly Arg Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Ser Ser Ser Trp Tyr Ser Gly Trp Tyr Phe Asp Leu Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ile
130 135 140
Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg
145 150 155 160
Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Thr Asp Leu Ala
165 170 175
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala
180 185 190
Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly
195 200 205
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp
210 215 220
Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Gly Tyr Pro Ile Ala Phe
225 230 235 240
Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
245
<210> 10
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：s10抗ROR1抗体重链可变区
<400> 10
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Ser Arg Ser Ser Tyr Tyr Leu Trp Val Leu Asp Leu Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 11
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：s10抗ROR1抗体重链可变区CDR1
<400> 11
Asn Tyr Tyr Met His
1 5
<210> 12
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：s10抗ROR1抗体重链可变区CDR2
<400> 12
Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 13
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：s10抗ROR1抗体重链可变区CDR3
<400> 13
Ser Ser Arg Ser Ser Tyr Tyr Leu Trp Val Leu Asp Leu
1 5 10
<210> 14
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：s10抗ROR1抗体轻链可变区
<400> 14
Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Val Ser Thr Glu
20 25 30
Ile Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Ile
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 15
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：s10抗ROR1抗体轻链可变区CDR1
<400> 15
Arg Ala Ser Gln Gly Val Ser Thr Glu Ile Ala
1 5 10
<210> 16
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：s10抗ROR1抗体轻链可变区CDR2
<400> 16
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 17
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：s10抗ROR1抗体轻链可变区CDR3
<400> 17
Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Ile Thr
1 5
<210> 18
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：s10抗ROR1单链抗体（scFv）
<400> 18
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Ser Arg Ser Ser Tyr Tyr Leu Trp Val Leu Asp Leu Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ile
130 135 140
Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg
145 150 155 160
Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Val Ser Thr Glu Ile Ala
165 170 175
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala
180 185 190
Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly
195 200 205
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp
210 215 220
Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Ile Thr Phe
225 230 235 240
Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
245
<210> 19
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：jlv1011抗ROR1抗体重链可变区
<400> 19
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Lys
20 25 30
Tyr Tyr His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Thr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Ser Ser Arg Tyr Ser Gly Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 20
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：jlv1011抗ROR1抗体重链可变区CDR1
<400> 20
Ser Lys Tyr Tyr His
1 5
<210> 21
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：jlv1011抗ROR1抗体重链可变区CDR2
<400> 21
Ile Ile Asn Pro Thr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 22
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：jlv1011抗ROR1抗体重链可变区CDR3
<400> 22
Asp Ser Ser Arg Tyr Ser Gly Trp Tyr Phe Asp Leu
1 5 10
<210> 23
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：jlv1011抗ROR1抗体轻链可变区：
<400> 23
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Val Ser Thr Glu
20 25 30
Ile Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Gly Tyr Pro Ile
85 90 95
Ala Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 24
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：jlv1011抗ROR1抗体轻链可变区CDR1
<400> 24
Arg Ala Ser Gln Gly Val Ser Thr Glu Ile Ala
1 5 10
<210> 25
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：jlv1011抗ROR1抗体轻链可变区CDR2
<400> 25
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 26
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：jlv1011抗ROR1抗体轻链可变区CDR3
<400> 26
Gln Gln Tyr Tyr Gly Tyr Pro Ile Ala
1 5
<210> 27
<211> 248
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：jlv1011单链抗体（scFv）
<400> 27
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Lys
20 25 30
Tyr Tyr His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Thr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Ser Ser Arg Tyr Ser Gly Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ile Gln
130 135 140
Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val
145 150 155 160
Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Val Ser Thr Glu Ile Ala Trp
165 170 175
Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala
180 185 190
Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
195 200 205
Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe
210 215 220
Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Gly Tyr Pro Ile Ala Phe Gly
225 230 235 240
Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
245
<210> 28
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：信号肽
<400> 28
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser
<210> 29
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：(G4S)4接头
<400> 29
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 30
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：替代性GS接头
<400> 30
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly
<210> 31
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：(G4S)1接头
<400> 31
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 32
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：Hum291抗CD3抗体重链可变区
<400> 32
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ile Ser Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Arg Ser Gly Tyr Thr His Tyr Asn Gln Lys Leu
50 55 60
Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Ala Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 33
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：Hum291抗CD3抗体轻链可变区
<400> 33
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 34
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：Hum291抗CD3单链抗体（scFv）
<400> 34
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ile Ser Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Arg Ser Gly Tyr Thr His Tyr Asn Gln Lys Leu
50 55 60
Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Ala Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser
130 135 140
Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
145 150 155 160
Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
165 170 175
Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser
180 185 190
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
195 200 205
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
210 215 220
Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val
225 230 235 240
Glu Ile Lys
<210> 35
<211> 1548
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：编码具有信号肽-抗ROR1克隆O 11 scFv接头-抗CD3克隆
hum291 scFv的o11抗ROR1/抗CD3双特异性抗体前体
<400> 35
atggaatgga gttgggtttt cttgtttttc cttagtgtca ccacgggagt ccacagccaa 60
gtacaactgg tgcagagtgg tgcagaagtc aagaaacctg gcgctagcgt gaaggtctcc 120
tgtaaagcaa gtggatatac gttcacaaat tattacatgc actgggtccg ccaagctccc 180
ggtcaagggc tggaatggat gggcattata aaccccacgt caggccgaac ctcctatgca 240
caaaaattcc agggtagagt gaccatgacc agggatacgt ccacaagtac agtttacatg 300
gagctttctt cactccggtc tgaagacact gctgtttatt attgcgcccg cgatagctca 360
agctggtact ctggatggta ctttgacctg tggggacagg ggaccaccgt gacagtatct 420
tcaggaggcg gcggttcagg tggcggtgga agcgggggag gaggctccgg aggcggcgga 480
tccgcgattc agatgacgca atccccaagc agcctcagtg caagtgtagg cgaccgcgtt 540
accatcactt gccgagccag tcaaggaata cgaaccgacc tcgcctggta tcagcagaaa 600
cctgggaagg cgcccaaact tcttatttac gccgcgtcct ctctccagag cggagtgccg 660
agtcgatttt caggaagtgg atctgggacc gatttcacac ttacaatttc aagtcttcag 720
cccgaggact tcgcgacgta ttattgccaa caatattatg gctatcctat agcattcgga 780
caaggaacca ggctcgagat taaaggcggg gggggctctc aagttcaact tgttcaatct 840
ggagcagagg taaagaagcc cggcgcgagc gtaaaggtct catgtaaagc ctcaggttat 900
acattcattt cctacacaat gcactgggtc cggcaggcac ccggtcaagg tctcgaatgg 960
ataggatata tcaatcctcg cagtggctat actcactata accagaagct caaggatcga 1020
gccacgttga ctgcagataa gtctgcaagt accgcatata tggaactttc ctccctccgc 1080
tcagaggaca ctgcagtgta ctactgtgca cggtcagcat attacgatta tgacggattc 1140
gcctactggg gacaaggtac actggtcacc gtaagtagtg gtggcggtag tggtggtgga 1200
agcggtgggg gttccggagg cggttcaggt gacatccaaa tgactcagag cccaagctca 1260
ctttccgcct cagtagggga tcgcgttaca ataacgtgca gtgcctcctc atccgtgagc 1320
tatatgaact ggtaccaaca gaaacctggt aaagctccga agcgcttgat atatgacacg 1380
tcaaagctgg ctagtggagt acccagtagg tttagtggga gcgggagcgg tacagatttc 1440
actctgacaa tatcatcact gcaacctgag gactttgcta cctactattg ccagcaatgg 1500
agtagtaatc cgccgacgtt tggtggggga acgaaggtgg agatcaaa 1548
<210> 36
<211> 516
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：o11抗ROR1/抗CD3双特异性抗体前体：
信号肽-抗ROR1克隆O 11 scFv接头-抗CD3克隆hum291 scFv
<400> 36
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Thr Asn Tyr Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Met Gly Ile Ile Asn Pro Thr Ser Gly Arg Thr Ser Tyr Ala
65 70 75 80
Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser
85 90 95
Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Ser Ser Trp Tyr Ser Gly Trp Tyr Phe
115 120 125
Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
145 150 155 160
Ser Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
165 170 175
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Thr
180 185 190
Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
195 200 205
Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
210 215 220
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
225 230 235 240
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Gly Tyr Pro
245 250 255
Ile Ala Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly
260 265 270
Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly
275 280 285
Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ile Ser
290 295 300
Tyr Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp
305 310 315 320
Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Arg Ser Gly Tyr Thr His Tyr Asn Gln Lys
325 330 335
Leu Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala
340 345 350
Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
355 360 365
Cys Ala Arg Ser Ala Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Phe Ala Tyr Trp Gly
370 375 380
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
385 390 395 400
Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln
405 410 415
Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr
420 425 430
Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys
435 440 445
Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala
450 455 460
Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
465 470 475 480
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr
485 490 495
Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys
500 505 510
Val Glu Ile Lys
515
<210> 37
<211> 1548
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：编码具有信号肽-抗ROR1克隆s10 scFv接头-抗CD3克隆
hum291 scFv的s10抗ROR1/抗CD3双特异性抗体前体
<400> 37
atggaatggt cctgggtgtt cctgttcttc ctgagcgtga ccacaggcgt gcactctcag 60
gttcagctgg ttcagtctgg cgccgaagtg aagaaacctg gcgcctctgt gaaggtgtcc 120
tgcaaggcca gcggctacac ctttaccaac tactacatgc actgggtccg acaggcccct 180
ggacaaggac ttgagtggat gggcatcatc aaccctagcg gcggcagcac aagctacgcc 240
cagaaattcc agggcagagt gaccatgacc agagacacca gcacctccac cgtgtacatg 300
gaactgagca gcctgagaag cgaggacacc gccgtgtact actgcgccag aagcagcaga 360
tccagctact acctgtgggt gctcgatctg tggggccagg gaacaaccgt gacagtctct 420
tctggtggcg gaggatctgg cggaggtgga agcggcggag gcggtagcgg aggtggtgga 480
tctgcaattc agctgacaca gagccccagc agcctgtctg cctctgtggg agacagagtg 540
acaatcacct gtagagccag ccagggcgtg tccacagaga tcgcttggta tcagcagaag 600
cccggcaagg cccctaagct gctgatctat gctgcctcca gtctgcagag cggcgtgcca 660
tctagatttt ctggcagcgg ctccggcacc gacttcaccc tgacaatatc tagcctgcag 720
ccagaggact tcgccaccta ctactgccag cagttcaaca gctaccccat caccttcggc 780
cagggcacca gactggaaat caaaggtggt ggtggcagcc aggtgcagct cgttcaaagc 840
ggagctgaag tgaaaaagcc aggggccagc gtgaaagtgt cttgcaaagc ctctggctac 900
acattcatca gctacaccat gcattgggtt cgccaggctc caggccaggg actcgaatgg 960
atcggctaca tcaatcccag aagcggctat acccactaca accagaagct gaaggaccgg 1020
gccacactga ccgccgataa gtctgccagc accgcctata tggaactgtc ctctctgcgg 1080
agcgaagata cagccgtgta ttattgtgcc cgcagcgcct actacgacta cgacggcttt 1140
gcctattggg gacagggcac cctggtcacc gtttcttctg gcggaggaag tggcggcgga 1200
agcggtggtg gttctggcgg tggtagtggc gacatccaga tgacccagtc tccaagctct 1260
ctgagcgcca gcgtgggcga tagagtcacc atcacatgta gcgcctccag cagcgtgtcc 1320
tacatgaact ggtatcaaca aaagcctggg aaagctccca agcgcctgat ctacgacaca 1380
agcaaactgg ccagcggagt gcccagcaga ttttccggat ctggcagtgg cacagacttt 1440
acactcacca taagctcact gcagcccgaa gattttgcca cgtactattg tcagcaatgg 1500
tccagcaatc ctcctacctt cggaggcggc accaaggtcg agatcaag 1548
<210> 38
<211> 516
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：s10抗ROR1/抗CD3双特异性抗体前体信号肽-抗ROR1克隆
s10 scFv接头-抗CD3克隆hum291 scFv
<400> 38
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Thr Asn Tyr Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Met Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala
65 70 75 80
Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser
85 90 95
Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Ser Arg Ser Ser Tyr Tyr Leu Trp Val Leu
115 120 125
Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
145 150 155 160
Ser Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
165 170 175
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Val Ser Thr
180 185 190
Glu Ile Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
195 200 205
Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
210 215 220
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
225 230 235 240
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro
245 250 255
Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly
260 265 270
Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly
275 280 285
Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ile Ser
290 295 300
Tyr Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp
305 310 315 320
Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Arg Ser Gly Tyr Thr His Tyr Asn Gln Lys
325 330 335
Leu Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala
340 345 350
Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
355 360 365
Cys Ala Arg Ser Ala Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Phe Ala Tyr Trp Gly
370 375 380
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
385 390 395 400
Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln
405 410 415
Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr
420 425 430
Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys
435 440 445
Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala
450 455 460
Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
465 470 475 480
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr
485 490 495
Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys
500 505 510
Val Glu Ile Lys
515
<210> 39
<211> 1545
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：编码具有信号肽-抗ROR1克隆jlv1011 scFv接头-抗CD3克隆
hum291 scFv的jlv1011抗ROR1/抗CD3双特异性抗体前体
<400> 39
atggaatggt cctgggtgtt cctgttcttc ctgagcgtga ccacaggcgt gcactctcag 60
gttcagctgg ttcagtctgg cgccgaagtg aagaaacctg gcgcctctgt gaaggtgtcc 120
tgcaaggcca gcggctacac ctttaccagc aagtactacc actgggtccg acaggcccct 180
ggacaaggac ttgagtggat gggcatcatc aaccccacca gcggcagcac aagctacgcc 240
cagaaattcc agggcagagt gaccatgacc agagacacca gcacctccac cgtgtacatg 300
gaactgagca gcctgagaag cgaggacacc gccgtgtact actgcgccag agacagctct 360
agatacagcg gctggtactt cgacctgtgg ggccagggaa caaccgtgac agtttcttct 420
ggcggcggag gatctggcgg aggtggaagc ggaggcggag gaagcggtgg cggcggatct 480
gctattcagc tgacacagag ccctagcagc ctgtctgcct ctgtgggcga cagagtgaca 540
atcacctgta gagcctctca gggcgtgtcc acagagatcg cctggtatca gcagaagcct 600
ggcaaggccc ctaagctgct gatctatgcc gctagctctc tgcagtccgg cgtgccatct 660
agattttccg gctctggcag cggcaccgac ttcaccctga ccatatctag cctgcagcca 720
gaggacttcg ccacctacta ctgtcagcag tactacggct accctatcgc cttcggccag 780
ggcaccagac tggaaatcaa aggtggcggt ggcagccagg tgcagctcgt tcaaagcgga 840
gctgaagtga aaaagccagg ggccagcgtg aaagtgtctt gcaaagcctc tggctacaca 900
ttcatcagct acaccatgca ttgggttcgc caggctccag gccagggact cgaatggatc 960
ggctacatca atcccagaag cggctatacc cactacaacc agaagctgaa ggaccgggcc 1020
acactgaccg ccgataagtc tgccagcacc gcctatatgg aactgtcctc tctgcggagc 1080
gaagatacag ccgtgtatta ttgtgcccgc agcgcctact acgactacga cggctttgcc 1140
tattggggac agggcaccct ggtcaccgtt tcttctggcg gaggaagtgg cggcggaagc 1200
ggtggtggtt ctggcggtgg tagtggcgac atccagatga cccagtctcc aagctctctg 1260
agcgccagcg tgggcgatag agtcaccatc acatgtagcg cctccagcag cgtgtcctac 1320
atgaactggt atcaacaaaa gcctgggaaa gctcccaagc gcctgatcta cgacacaagc 1380
aaactggcca gcggagtgcc cagcagattt tccggatctg gcagtggcac agactttaca 1440
ctcaccataa gctcactgca gcccgaagat tttgccacgt actattgtca gcaatggtcc 1500
agcaatcctc ctaccttcgg aggcggcacc aaggtcgaga tcaag 1545
<210> 40
<211> 515
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：jlv1011抗ROR1/抗CD3双特异性抗体前体：信号肽-抗ROR1克隆jlv1011scFv
接头-抗CD3克隆hum291 scFv
<400> 40
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Thr Ser Lys Tyr Tyr His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Met Gly Ile Ile Asn Pro Thr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Ala
65 70 75 80
Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser
85 90 95
Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Ser Arg Tyr Ser Gly Trp Tyr Phe Asp
115 120 125
Leu Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
145 150 155 160
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
165 170 175
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Val Ser Thr Glu
180 185 190
Ile Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
195 200 205
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
210 215 220
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
225 230 235 240
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Gly Tyr Pro Ile
245 250 255
Ala Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
260 265 270
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
275 280 285
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ile Ser Tyr
290 295 300
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
305 310 315 320
Gly Tyr Ile Asn Pro Arg Ser Gly Tyr Thr His Tyr Asn Gln Lys Leu
325 330 335
Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
340 345 350
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
355 360 365
Ala Arg Ser Ala Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
370 375 380
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
385 390 395 400
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser
405 410 415
Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
420 425 430
Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
435 440 445
Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser
450 455 460
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
465 470 475 480
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
485 490 495
Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val
500 505 510
Glu Ile Lys
515
<210> 41
<211> 525
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：EF1-α/HTLV启动子
<400> 41
aaggatctgc gatcgctccg gtgcccgtca gtgggcagag cgcacatcgc ccacagtccc 60
cgagaagttg gggggagggg tcggcaattg aacgggtgcc tagagaaggt ggcgcggggt 120
aaactgggaa agtgatgtcg tgtactggct ccgccttttt cccgagggtg ggggagaacc 180
gtatataagt gcagtagtcg ccgtgaacgt tctttttcgc aacgggtttg ccgccagaac 240
acagctgaag cttcgagggg ctcgcatctc tccttcacgc gcccgccgcc ctacctgagg 300
ccgccatcca cgccggttga gtcgcgttct gccgcctccc gcctgtggtg cctcctgaac 360
tgcgtccgcc gtctaggtaa gtttaaagct caggtcgaga ccgggccttt gtccggcgct 420
cccttggagc ctacctagac tcagccggct ctccacgctt tgcctgaccc tgcttgctca 480
actctacgtc tttgtttcgt tttctgttct gcgccgttac agatc 525
<210> 42
<211> 603
<212> DNA
<213> 巨细胞病毒
<220>
<221> misc_feature
<223> CMV启动子
<400> 42
aagcttggga gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca 60
acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga 120
ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc 180
aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct 240
ggcattatgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat 300
tagtcatcgc tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg cgtggatagc 360
ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt 420
ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca ttgacgcaaa 480
tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct atataagcag agctcgttta gtgaaccgtc 540
agatcgcctg gagacgccat ccacgctgtt ttgacctcca tagaagacac cgactctact 600
aga 603
<210> 43
<211> 780
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：编码呼吸道合胞病毒蛋白F（RSV）scFv抗体前体：信号肽，
VH链接头VL链
<400> 43
atggaatggt cctgggtgtt cctgttcttc ctgagcgtga ccacaggcgt gcacagccaa 60
gtgacactga gagagtctgg ccccgctctg gtcaagccta cacagaccct gacactgacc 120
tgcaccttca gcggctttag cctgagcaca agcggcatga gcgtcggctg gattagacag 180
cctcctggca aagccctgga atggctggcc gacatttggt gggacgacaa gaaggactac 240
aaccccagcc tgaagtcccg gctgaccatc agcaaggaca ccagcaagaa ccaggtggtg 300
ctgaaagtga ccaacatgga ccctgccgac accgccacct actactgtgc cagatccatg 360
atcaccaact ggtacttcga cgtgtgggga gccggcacca cagtgacagt ttctagcgga 420
ggcggaggat ctggtggcgg aggaagtggc ggaggcggtt ctgatatcca gatgacacag 480
agccccagca cactgtctgc cagcgtggga gacagagtga ccatcacatg caagtgccag 540
ctgagcgtgg gctacatgca ctggtatcag cagaagcctg gcaaggcccc taagctgctg 600
atctacgaca caagcaagct ggcctctggc gtgcccagca gattttctgg cagcggcagc 660
ggaaccgagt tcaccctgac catctcaagc ctgcagcctg acgacttcgc tacgtactac 720
tgcttccaag gcagcggcta ccccttcaca tttggaggcg gcaccaagct ggaaatcaag 780
<210> 44
<211> 260
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：呼吸道合胞病毒蛋白F（RSV）scFv抗体前体（信号肽-VH链接头VL链）
<400> 44
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys
20 25 30
Pro Thr Gln Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu
35 40 45
Ser Thr Ser Gly Met Ser Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys
50 55 60
Ala Leu Glu Trp Leu Ala Asp Ile Trp Trp Asp Asp Lys Lys Asp Tyr
65 70 75 80
Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys
85 90 95
Asn Gln Val Val Leu Lys Val Thr Asn Met Asp Pro Ala Asp Thr Ala
100 105 110
Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Met Ile Thr Asn Trp Tyr Phe Asp Val
115 120 125
Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln
145 150 155 160
Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr
165 170 175
Cys Lys Cys Gln Leu Ser Val Gly Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys
180 185 190
Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala
195 200 205
Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe
210 215 220
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr
225 230 235 240
Cys Phe Gln Gly Ser Gly Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys
245 250 255
Leu Glu Ile Lys
260
<210> 45
<211> 241
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：呼吸道合胞病毒蛋白F（RSV）scFv抗体：（VH链接头VL链）
<400> 45
Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Met Ser Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala Asp Ile Trp Trp Asp Asp Lys Lys Asp Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Lys Val Thr Asn Met Asp Pro Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Ser Met Ile Thr Asn Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser
130 135 140
Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Cys
145 150 155 160
Gln Leu Ser Val Gly Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
165 170 175
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val
180 185 190
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr
195 200 205
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln
210 215 220
Gly Ser Gly Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
225 230 235 240
Lys
<210> 46
<211> 1605
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：编码人IL-12（p40-2x弹性蛋白-p35）
<400> 46
atgtgccacc agcagctggt catcagctgg tttagcctgg tgtttctggc ctctccactg 60
gtggccatct gggagctgaa gaaagacgta tacgtggtgg aactggactg gtatcccgat 120
gctcctggcg agatggtggt gctgacctgc gatacccctg aggaagatgg catcacctgg 180
actctggacc agtcctctga ggtgctcgga agcggcaaga ccctgaccat ccaagtgaaa 240
gagtttggcg acgccggcca gtacacctgt cacaaaggcg gagaagtgct gagccacagc 300
ctgctgctgc tccacaagaa agaggacggc atctggtcca ccgacatcct gaaggaccag 360
aaagagccta agaacaagac cttcctgcgc tgcgaggcca agaactacag cggcagattc 420
acctgttggt ggctgaccac aatcagcacc gacctgacct tctccgtgaa gtctagcagg 480
ggcagcagtg atcctcaggg cgttacatgt ggcgccgcta cactgtctgc cgaaagagtg 540
cggggcgaca acaaagaata cgagtacagc gtggaatgcc aagaggacag cgcctgtcca 600
gccgccgaag agtctctgcc tatcgaagtg atggtggacg ccgtgcacaa gctgaagtac 660
gagaactaca cctccagctt tttcatccgg gacatcatca agcccgatcc tccaaagaac 720
ctgcagctca agcccctgaa gaacagcaga caggtggaag tgtcttggga gtaccccgac 780
acctggtcta cccctcactc ctacttcagc ctgacctttt gcgtgcaagt gcagggcaag 840
tccaagcgcg agaaaaagga ccgggtgttc accgataaga ccagcgccac cgtgatctgc 900
cgaaagaacg ccagcatcag cgtcagagcc caggaccggt actacagcag ctcttggagc 960
gaatgggcca gcgtgccatg ttctgtgcct ggcgttggag ttcctggcgt gggcagaaat 1020
ctgccagtgg ccacgcctga tcctggcatg tttccttgtc tgcaccactc ccagaacctg 1080
ctgagagccg tgtccaatat gctgcagaag gcccggcaga cactggaatt ctacccctgc 1140
accagcgagg aaatcgacca cgaggatatc accaaggaca agaccagcac cgtggaagcc 1200
tgcctgcctc tggaactgac aaagaacgag agctgcctga acagccggga aaccagcttc 1260
atcaccaacg gctcttgcct ggcctccaga aagacctcct tcatgatggc cctgtgcctg 1320
agcagcatct acgaggacct gaagatgtac caggtggaat tcaagaccat gaacgccaag 1380
ctgctgatgg accccaagag acagatcttc ctggaccaga acatgctggc cgtgatcgat 1440
gagctgatgc aggccctgaa cttcaacagc gagacagtgc cccagaagtc cagcctggaa 1500
gaacccgact tctataagac caagatcaag ctgtgcatcc tgctgcacgc cttccggatc 1560
agagccgtga ccatcgacag agtgatgagc tacctgaacg cctcc 1605
<210> 47
<211> 535
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：人IL-12（p40-2x弹性蛋白-p35）
<400> 47
Met Cys His Gln Gln Leu Val Ile Ser Trp Phe Ser Leu Val Phe Leu
1 5 10 15
Ala Ser Pro Leu Val Ala Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val
20 25 30
Val Glu Leu Asp Trp Tyr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu
35 40 45
Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gln
50 55 60
Ser Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys
65 70 75 80
Glu Phe Gly Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val
85 90 95
Leu Ser His Ser Leu Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp
100 105 110
Ser Thr Asp Ile Leu Lys Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe
115 120 125
Leu Arg Cys Glu Ala Lys Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp
130 135 140
Leu Thr Thr Ile Ser Thr Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser
165 170 175
Ala Glu Arg Val Arg Gly Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser Val Glu
180 185 190
Cys Gln Glu Asp Ser Ala Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile
195 200 205
Glu Val Met Val Asp Ala Val His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr
210 215 220
Ser Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn
225 230 235 240
Leu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val Ser Trp
245 250 255
Glu Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr
260 265 270
Phe Cys Val Gln Val Gln Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys Asp Arg
275 280 285
Val Phe Thr Asp Lys Thr Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg Lys Asn Ala
290 295 300
Ser Ile Ser Val Arg Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser
305 310 315 320
Glu Trp Ala Ser Val Pro Cys Ser Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly
325 330 335
Val Gly Arg Asn Leu Pro Val Ala Thr Pro Asp Pro Gly Met Phe Pro
340 345 350
Cys Leu His His Ser Gln Asn Leu Leu Arg Ala Val Ser Asn Met Leu
355 360 365
Gln Lys Ala Arg Gln Thr Leu Glu Phe Tyr Pro Cys Thr Ser Glu Glu
370 375 380
Ile Asp His Glu Asp Ile Thr Lys Asp Lys Thr Ser Thr Val Glu Ala
385 390 395 400
Cys Leu Pro Leu Glu Leu Thr Lys Asn Glu Ser Cys Leu Asn Ser Arg
405 410 415
Glu Thr Ser Phe Ile Thr Asn Gly Ser Cys Leu Ala Ser Arg Lys Thr
420 425 430
Ser Phe Met Met Ala Leu Cys Leu Ser Ser Ile Tyr Glu Asp Leu Lys
435 440 445
Met Tyr Gln Val Glu Phe Lys Thr Met Asn Ala Lys Leu Leu Met Asp
450 455 460
Pro Lys Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln Asn Met Leu Ala Val Ile Asp
465 470 475 480
Glu Leu Met Gln Ala Leu Asn Phe Asn Ser Glu Thr Val Pro Gln Lys
485 490 495
Ser Ser Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr Lys Thr Lys Ile Lys Leu Cys
500 505 510
Ile Leu Leu His Ala Phe Arg Ile Arg Ala Val Thr Ile Asp Arg Val
515 520 525
Met Ser Tyr Leu Asn Ala Ser
530 535
<210> 48
<211> 1491
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：编码抗VEGFR-2 VKB8 scFv抗体前体
（信号肽-VH链接头VL链-IgG1 Fc区）
<400> 48
atggaatggt cctgggtgtt cctgttcttc ctgagcgtga ccacaggcgt gcactctgaa 60
gtgcagctgg ttcagtctgg cgccgaagtg aagaaacctg gcagcagcgt gaaggtgtcc 120
tgcaaggctt acggcggcac ctttggctct tatggcgtgt cctgggttcg cagagcacct 180
ggacaaggcc tggaatggat gggcagactg atccccatct tcggcaccag agactacgcc 240
cagaaattcc agggcagagt gaccctgaca gccgacgagt ctaccaacac cgcctacatg 300
gaactgagca gcctgagaag cgaggacacc gccgtgtact actgtgccag agatggcgac 360
tactacggca gcggcagcta ctatggcatg gatgtgtggg gccagggcac cctggttaca 420
gtttcttctg gtggcggagg atctggcgga ggtggaagcg gcggaggcgg atctgaaaca 480
acactgacac agagccccgc cacactgagt gtgtctccag gcgaaagggc caccgtgtct 540
tgtcgagcct ctcagagcct gggcagcaac ctcggatggt tccagcagaa accaggacag 600
gcccctcggc tgctgatcta tggcgcttct acaagagcca caggcatccc cgccagattt 660
tctggctctg gcagcggaac cgagttcacc ctgacaatct ctagcctgca gtccgaggac 720
ttcgctgtgt acttctgcca gcagtacaac gactggccca tcacattcgg ccaggggacc 780
aagctggaaa tcaaagagcc caagagcagc gacaagaccc acacctgtcc tccatgtcct 840
gctcctgaac tgctcggcgg accttccgtg tttctgttcc ctccaaagcc taaggacacc 900
ctgatgatca gcagaacccc tgaagtgacc tgcgtggtgg tggatgtgtc ccacgaggac 960
ccagaagtga agttcaactg gtatgtggac ggcgtggaag tgcacaacgc caagaccaag 1020
cctagagagg aacagtacaa cagcacctac agagtggtgt ccgtgctgac cgtgctgcac 1080
caggattggc tgaacggcaa agagtacaag tgcaaggtgt ccaacaaggc cctgcctgct 1140
cctatcgaga aaaccatcag caaggccaag ggccagccta gggaacccca ggtttacaca 1200
ctgcctccaa gcagggacga gctgaccaag aatcaggtgt ccctgacctg cctggtcaag 1260
ggcttctacc cttccgatat cgccgtggaa tgggagagca atggccagcc agagaacaac 1320
tacaagacca ctcctcctgt gctggacagc gacggctcat tcttcctgta ctccaagctg 1380
acagtggaca agagcagatg gcagcagggc aacgtgttca gctgcagcgt gatgcacgag 1440
gccctgcaca accactacac acagaagtcc ctgtctctga gccccggcaa g 1491
<210> 49
<211> 497
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：抗VEGFR-2 VKB8 scFv-Fc1抗体前体
（信号肽-VH链接头VL链-IgG1 Fc区）
<400> 49
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Tyr Gly Gly Thr Phe
35 40 45
Gly Ser Tyr Gly Val Ser Trp Val Arg Arg Ala Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Met Gly Arg Leu Ile Pro Ile Phe Gly Thr Arg Asp Tyr Ala
65 70 75 80
Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Thr Asn
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Asp Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Tyr Tyr
115 120 125
Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Thr
145 150 155 160
Thr Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg
165 170 175
Ala Thr Val Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Leu Gly Ser Asn Leu Gly
180 185 190
Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly
195 200 205
Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly
210 215 220
Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp
225 230 235 240
Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Asp Trp Pro Ile Thr Phe
245 250 255
Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys
260 265 270
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
275 280 285
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
290 295 300
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
305 310 315 320
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
325 330 335
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
340 345 350
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
355 360 365
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
370 375 380
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
385 390 395 400
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
405 410 415
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
420 425 430
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
435 440 445
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
450 455 460
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
465 470 475 480
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
485 490 495
Lys
<210> 50
<211> 478
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：抗VEGFR-2 VKB8 scFv-Fc1抗体（VH链接头VL链-IgG1 Fc区）
<400> 50
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Tyr Gly Gly Thr Phe Gly Ser Tyr
20 25 30
Gly Val Ser Trp Val Arg Arg Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Leu Ile Pro Ile Phe Gly Thr Arg Asp Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Thr Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gly Asp Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Tyr Tyr Gly Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Thr Thr Leu Thr
130 135 140
Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Val
145 150 155 160
Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Leu Gly Ser Asn Leu Gly Trp Phe Gln
165 170 175
Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr
180 185 190
Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
195 200 205
Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val
210 215 220
Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Asp Trp Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly
225 230 235 240
Thr Lys Leu Glu Ile Lys Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr
245 250 255
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
260 265 270
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
275 280 285
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
290 295 300
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
305 310 315 320
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
325 330 335
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
340 345 350
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
355 360 365
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
370 375 380
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
385 390 395 400
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
405 410 415
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
420 425 430
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
435 440 445
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
450 455 460
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470 475
<210> 51
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：T2A自切割肽
<400> 51
Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu
1 5 10 15
Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 52
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：A7抗ROR1抗体重链可变区
<400> 52
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Thr Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Gly Ser Ser Ala Tyr Ser Asn Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Pro Leu Leu Tyr Gly Trp Leu Thr Asp Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 53
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：A7抗ROR1抗体重链CDR1
<400> 53
Asp Tyr Tyr Met Thr
1 5
<210> 54
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：A7抗ROR1抗体重链CDR2
<400> 54
Tyr Ile Ser Gly Ser Ser Ala Tyr Ser Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 55
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：A7抗ROR1抗体重链CDR3
<400> 55
Asp Pro Leu Leu Tyr Gly Trp Leu Thr Asp
1 5 10
<210> 56
<211> 102
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：A7抗ROR1抗体轻链可变区
<400> 56
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Val Ser Trp Tyr Gln
20 25 30
Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr Glu Val Ser Lys
35 40 45
Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn
50 55 60
Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp
65 70 75 80
Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Ile Asn Asp Ala Val Phe Phe Gly Gly Gly
85 90 95
Thr Lys Leu Thr Val Leu
100
<210> 57
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：A7抗ROR1抗体轻链CDR1
<400> 57
Thr Gly Thr Ser Ser
1 5
<210> 58
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：A7抗ROR1抗体轻链CDR2
<400> 58
Glu Val Ser Lys Arg Pro Ser
1 5
<210> 59
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：A7抗ROR1抗体轻链CDR3
<400> 59
Ser Ser Tyr Ile Asn Asp Ala Val Phe
1 5
<210> 60
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：A8抗ROR1抗体重链可变区
<400> 60
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Thr Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Gly Ser Ser Ala Tyr Ser Asn Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Pro Leu Leu Tyr Gly Trp Leu Thr Asp Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 61
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：A8抗ROR1抗体重链CDR1
<400> 61
Asp Tyr Tyr Met Thr
1 5
<210> 62
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：A8抗ROR1抗体重链CDR2
<400> 62
Tyr Ile Ser Gly Ser Ser Ala Tyr Ser Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 63
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：A8抗ROR1抗体重链CDR3
<400> 63
Asp Pro Leu Leu Tyr Gly Trp Leu Thr Asp
1 5 10
<210> 64
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：A8抗ROR1抗体轻链可变区
<400> 64
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Gly Gly Gly Tyr
20 25 30
Asp Ser Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Asp Val Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Gly Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Phe Thr Ser Asp
85 90 95
Val Met Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 65
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：A8抗ROR1抗体轻链CDR1
<400> 65
Thr Gly Thr Ser Ser Asp Gly Gly Gly Tyr Asp Ser Val Ser
1 5 10
<210> 66
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：A8抗ROR1抗体轻链CDR2
<400> 66
Asp Val Asn Lys Arg Pro Ser
1 5
<210> 67
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：A8抗ROR1抗体轻链CDR3
<400> 67
Ser Ser Phe Thr Ser Asp Val Met Val
1 5
<210> 68
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：2x弹性蛋白接头
<400> 68
Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly
1 5 10
<210> 69
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：(GGGGS)3接头
<400> 69
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15

Claims (54)

1.一种双特异性抗体，其包括与ROR1结合的单链可变片段抗体(ScFv)和与CD3结合的单链可变片段抗体(ScFv)，其中抗ROR1 scFv和抗CD3 scFv通过接头连接，并且进一步地其中：
所述抗ROR1 ScFv具有与SEQ ID NO:1具有至少95％同一性的重链可变结构域和与SEQID NO:5具有至少95％同一性的轻链可变结构域；
所述抗ROR1 ScFv具有与SEQ ID NO:10具有至少95％同一性的重链可变结构域和与SEQ ID NO:14具有至少95％同一性的轻链可变结构域；
所述抗ROR1 ScFv具有与SEQ ID NO:19具有至少95％同一性的重链可变结构域和与SEQ ID NO:23具有至少95％同一性的轻链可变结构域；
所述抗ROR1 ScFv具有与SEQ ID NO:52具有至少95％同一性的重链可变结构域和与SEQ ID NO:56具有至少95％同一性的轻链可变结构域；或者
所述抗ROR1 ScFv具有与SEQ ID NO:60具有至少95％同一性的重链可变结构域和与SEQ ID NO:64具有至少95％同一性的轻链可变结构域。
2.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述抗ROR1 scFv具有与SEQ ID NO:1具有至少95％同一性的重链可变结构域和与SEQ ID NO:5具有至少95％同一性的轻链可变结构域。
3.根据权利要求2所述的双特异性抗体，其中所述抗ROR1 scFv包括与SEQ ID NO:9具有至少95％同一性的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述抗ROR1 ScFv具有与SEQ ID NO:10具有至少95％同一性的重链可变结构域和与SEQ ID NO:14具有至少95％同一性的轻链可变结构域。
5.根据权利要求4所述的双特异性抗体，其中所述抗ROR1 scFv包括与SEQ ID NO:18具有至少95％同一性的氨基酸序列。
6.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述抗ROR1 ScFv具有与SEQ ID NO:19具有至少95％同一性的重链可变结构域和与SEQ ID NO:23具有至少95％同一性的轻链可变结构域。
7.根据权利要求6所述的双特异性抗体，其中所述抗ROR1 scFv包括与SEQ ID NO:27具有至少95％同一性的氨基酸序列。
8.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述抗CD3 scFv包括与SEQ ID NO:32具有至少95％同一性的重链可变结构域和与SEQ ID NO:33具有至少95％同一性的轻链可变结构域。
9.根据权利要求8所述的双特异性抗体，其中所述抗CD3 scFv包括与SEQ ID NO:34具有至少95％同一性的氨基酸序列。
10.根据前述权利要求中任一项所述的双特异性抗体，其中scFv抗体的所述重链可变结构域和所述轻链可变结构域通过GS接头连接。
11.一种核酸构建体，其编码根据权利要求1至10中任一项的抗ROR1/抗CD3双特异性抗体。
12.根据权利要求11所述的核酸构建体，其中抗ROR1/抗CD3双特异性抗体编码序列包括在其N-末端处的编码信号肽的序列。
13.根据权利要求11所述的核酸构建体，其中所述抗ROR1/抗CD3双特异性抗体编码序列与启动子可操作地连接。
14.根据权利要求13所述的核酸构建体，其中所述启动子是EF1α启动子、CMV启动子、JET启动子、RSV启动子、SV40启动子、CAG启动子、β-肌动蛋白启动子、HTLV启动子或EF1α/HTLV杂合启动子。
15.根据权利要求13所述的核酸构建体，其进一步包括聚腺苷酸化序列，所述聚腺苷酸化序列与所述抗ROR1/抗CD3双特异性抗体编码序列的3’端连接。
16.一种重组病毒基因组，其包括根据权利要求11至15中任一项所述的核酸构建体。
17.一种重组溶瘤病毒，其包括根据权利要求11至15中任一项所述的核酸构建体。
18.根据权利要求17所述的重组溶瘤病毒，其中所述溶瘤病毒是单纯疱疹病毒(HSV)。
19.根据权利要求18所述的重组溶瘤病毒，其中所述溶瘤病毒是HSV-1。
20.根据权利要求19所述的重组溶瘤HSV，其中所述溶瘤HSV进一步包括编码IL-12的核酸序列。
21.根据权利要求20所述的重组溶瘤HSV，其中所述IL-12是人IL-12。
22.根据权利要求20所述的重组溶瘤HSV，其中所述IL-12包括SEQ ID NO:47的氨基酸序列。
23.根据权利要求19所述的重组溶瘤HSV，其中所述溶瘤HSV进一步包括编码抗VEGFR抗体的核酸序列。
24.根据权利要求23所述的重组溶瘤HSV，其中所述抗VEGFR抗体包括SEQ ID NO:49。
25.根据权利要求19所述的重组溶瘤HSV，其中所述溶瘤HSV衍生自HSV-1病毒株17、HSV-1病毒株F、HSV-1病毒株KOS或HSV-1病毒株JS1。
26.根据权利要求25所述的重组溶瘤HSV，其中所述溶瘤HSV衍生自HSV病毒株17。
27.根据权利要求19至26中任一项所述的重组溶瘤HSV，其中所述溶瘤HSV不编码功能性ICP34.5编码基因。
28.根据权利要求27所述的重组溶瘤HSV，其中缺失所述ICP34.5编码基因的全部或一部分。
29.根据权利要求27所述的重组溶瘤HSV，其中将编码所述抗ROR1/抗CD3双特异性抗体的所述核酸构建体插入到ICP34.5编码基因座中。
30.一种在治疗癌症的方法中使用的重组溶瘤病毒，其中所述方法包括向患有癌症的对象施用根据权利要求17至29中任一项所述的溶瘤病毒。
31.根据权利要求30所述的重组溶瘤HSV，其中所述溶瘤病毒是溶瘤HSV。
32.根据权利要求31所述的重组溶瘤HSV，其中所述方法包括通过静脉内、腔内、腹膜内、瘤内或瘤周递送来施用所述溶瘤HSV。
33.根据权利要求32所述的重组溶瘤HSV，其中所述递送通过导管、输注或注射进行。
34.根据权利要求30至33中任一项所述的重组溶瘤HSV，其中所述方法包括向所述对象施用多于一个剂量的所述溶瘤HSV。
35.根据权利要求30至34中任一项所述的重组溶瘤HSV，其中所述癌症是实体瘤。
36.根据权利要求30至35中任一项所述的重组溶瘤HSV，其中所述对象是狗、马或灵长类动物。
37.根据权利要求36所述的重组溶瘤HSV，其中所述对象是人。
38.一种药物组合物，其包含根据权利要求17至37中任一项的所述重组溶瘤HSV以及药学上可接受的赋形剂。
39.根据权利要求33所述的药物组合物，其中所述溶瘤HSV的浓度为至少106/ml。
40.根据权利要求34所述的药物组合物，其中所述溶瘤HSV的浓度为至少107/ml。
41.一种治疗对象的癌症的方法，所述方法包括向患有癌症的对象施用根据权利要求17至40中任一项所述的溶瘤HSV或所述的药物组合物。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述对象是狗、马或灵长类动物。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述对象是人。
44.根据权利要求41所述的方法，其包括通过静脉内、动脉内、腔内、瘤内或瘤周递送来施用所述溶瘤HSV。
45.根据权利要求44所述的方法，其中递送通过导管、通过输注或通过注射进行。
46.根据权利要求32至36中任一项所述的方法，其包括向所述对象施用多于一个剂量的所述溶瘤HSV。
47.根据权利要求41至46中任一项所述的方法，其中所述癌症是实体瘤。
48.一种宿主细胞，其被根据权利要求17至29中任一项所述的溶瘤病毒感染。
49.根据权利要求48所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是Vero细胞、HEK293细胞或BHK细胞。
50.一种产生药物病毒组合物的方法，所述方法包括：培养根据权利要求48所述的宿主细胞以产生病毒上清液，以及从所述病毒上清液中分离病毒以产生药物病毒组合物。
51.一种无病毒条件培养基(VCFM)，其包括根据权利要求1至10中任一项所述的双特异性抗体。
52.一种治疗癌症的方法，所述方法包括用药物组合物治疗对象，所述药物组合物包含根据权利要求1至10中任一项的抗ROR1/抗CD3双特异性抗体。
53.一种治疗癌症的方法，所述方法包括用药物组合物治疗对象，所述药物组合物包含根据权利要求51所述的VFCM。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述对象是非人对象。
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