CN116199781A - 一种靶向cd22的单域抗体、嵌合抗原受体及其应用 - Google Patents

一种靶向cd22的单域抗体、嵌合抗原受体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及免疫治疗技术领域，本发明提供了一种靶向CD22的单域抗体和利用该单域抗体构建的靶向CD22的嵌合抗原受体(CAR)以及工程化的免疫效应细胞。本发明还提供了该靶向CD22的单域抗体和CAR以及工程化的免疫效应细胞在制备治疗CD22相关疾病药物中的应用。

Description

一种靶向CD22的单域抗体、嵌合抗原受体及其应用
技术领域
本发明属于免疫治疗技术领域，具体涉及一种靶向CD22的单域抗体、其构建的靶向CD22的嵌合抗原受体以及工程化的免疫效应细胞。本发明还涉及一种治疗受试者疾病或障碍的方法，尤其涉及基于嵌合抗原受体的T细胞免疫疗法。
背景技术
CD22是一种B淋巴细胞系分化抗原，又称为BL-CAM、B3、Leu-14、Lyb-8和Siglec-2，已被证明由B淋巴细胞特异性表达，并且作为B淋巴细胞活化的负调节剂在功能上非常重要。CD22是一种抑制性共受体，可下调BCR信号，阻断B细胞过度刺激，在维持边缘区B细胞群、最佳B细胞抗原受体诱导增殖和B细胞更新等方面发挥重要作用，特别是CD22在B细胞恶性肿瘤中表达，使其成为癌症治疗的有希望的靶点。此外，还有研究者提出通过靶向CD22选择性调节B细胞活性来治疗自身免疫性疾病。
嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor，CAR)修饰的T细胞作为一种免疫治疗策略，在肿瘤治疗中受到广泛的重视和应用，尤其是在血液系统恶性肿瘤中。其原理为通过基因修饰，使T细胞表达可以特异性识别肿瘤细胞表面抗原的受体结构(单链抗体)，并在该受体与肿瘤细胞表面抗原特异性结合后，激活其下游的免疫共刺激因子与T细胞，从而活化T细胞分泌相关细胞因子，对肿瘤细胞进行特异性杀伤。CAR的结构一般由胞外抗原结合结构域(常为具有抗原识别功能的单链抗体)、铰链区、跨膜结构域和胞内信号转导结构域四部分组成。目前根据胞内信号转导结构域加入共刺激分子的数量，通常将CAR结构分为第一代(无共刺激分子)、第二代(包含一种共刺激分子)和第三代(包含两种共刺激分子)，目前在上市产品和临床研究阶段中应用最多的是第二代CAR结构。
尽管人类在儿童和成人急性淋巴细胞白血病(ALL)治疗方面已经取得了很大进展，但仍有相当数量的患者治疗效果不佳，并且目前的标准治疗存在相当程度的短期和长期毒性。基于单克隆抗体的治疗有望克服化疗耐药和治疗相关的潜在毒性。其中最有前景的是嵌合抗原受体修饰的T(CAR-T)细胞治疗，其可以突破MHC限制性，直接识别肿瘤抗原。目前CAR-T细胞在血液系统恶性肿瘤中已经被广泛应用，特别是以CD19作为靶抗原的CAR-T细胞免疫治疗已获得突破性进展。但靶向CD19 CAR-T也不是普遍有效的，并且靶抗原的丢失作为免疫治疗后的肿瘤逃逸机制，限制了细胞免疫治疗在血液系统恶性肿瘤中的治疗效果。CD19 CAR-T在治疗B-ALL期间的肿瘤细胞逃避机制主要包括CD19的选择性剪接、移码突变和错义突变。因此，今后还需考虑通过选择新的CAR-T治疗靶点或与CD19 CAR-T联合应用，或构建多靶点CAR-T，进一步增强CAR-T细胞的抗肿瘤靶向潜力，提高治疗效果，减少肿瘤治疗后的复发率。
与CD19抗原相似，CD22同样是B细胞限制性表达，不表达于其他实质细胞，亦不表达于造血干细胞，因此作为B细胞肿瘤抗原的特异性高，已经成为B细胞恶性肿瘤中的理想治疗靶点。另外，CD22与CD19在肿瘤细胞表面具有广泛的共表达，且在CD19 CAR-T细胞治疗引起CD19抗原丢失后，CD22抗原仍然保留。因此，CD22 CAR-T细胞既可以单独使用治疗B细胞恶性肿瘤，也可用于CD19 CAR-T治疗后因抗原变异而复发、肿瘤细胞表达CD22的患者的补救治疗，亦或与CD19 CAR-T细胞联合治疗，避免抗原变异，提高CAR-T治疗的有效性，减少肿瘤复发。
单域抗体(sdAb)由于具有单个单体抗体的可变域而不同于传统4链抗体。例如，骆驼科动物和鲨鱼产生天然缺乏轻链的抗体，其被称为仅重链抗体(hcAb，或简称为重链抗体)。骆驼科动物仅重链抗体的每个臂中的抗原结合片段具有单个重链可变域(VHH)，所述重链可变域可在无需轻链的帮助下，对抗原具有高亲和力。骆驼科动物VHH抗体被称为最小的功能性抗原结合片段，分子量仅为大约15kD，因而又被称为纳米抗体。VHH抗体具有可溶性好、稳定性高、穿透力强、结合表位广的天然优势。VHH抗体自发现以来，逐渐受到所属领域研究者的关注，对其的基础研究日趋成熟。在应用方面，针对自身免疫性疾病、血液疾病、病毒感染及骨科疾病等已逐渐进入临床研究阶段，在抗感染、抗炎症性疾病以及神经退行性疾病等方面也都表现出了极大的优势。
由于CAR-T细胞制造技术需要使用结合活性好、结合表位高效的单链抗体，因此，CAR-T细胞疗法的关键技术部分之一在于筛选特异性好、结合力强、结合表位有效的高亲和力抗体。但传统CD22抗体受限于分子量大、与抗原结合的结合力偏弱、亲和力较低、不易改造且稳定性差等劣势，还需要进一步进行单链化改造，使用传统CD22抗体(如单克隆抗体等)较难实现CAR-T细胞的有效构造。
因此，仍有广泛需求开发改进的靶向CD22的单域抗体、其构建的靶向CD22的嵌合抗原受体以及工程化的免疫效应细胞。例如，开发用于更有效以及更高效的CAR-T细胞疗法的稳定且小型的靶向CD22的单域抗体。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种靶向CD22的单域抗体，其结构为天然的单链结构，具有小分子量、高溶解性、高稳定性、低免疫原性、高组织渗透性以及不需要额外的折叠和组装步骤或连接子优化改造的优势，使其成为分子量较大的scFv单链抗体的有前途的替代方案，且使用所述单域抗体在构建成CAR-T细胞后，具备非常显著的肿瘤细胞杀伤能力。
本发明提供的靶向CD22的单域抗体，包含CDR1、CDR2和CDR3区；其中CDR1包含如SEQ ID NO:1-19所示的氨基酸序列，其中CDR2包含如SEQ ID NO:20-34所示的氨基酸序列，其中CDR3包含如SEQ ID NO:35-62所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的靶向CD22的单域抗体，包含CDR1、CDR2和CDR3区；其中CDR1包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，其中CDR2包含如SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列，其中CDR3包含如SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的靶向CD22的单域抗体，包含CDR1、CDR2和CDR3区；其中CDR1包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，其中CDR2包含如SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列，其中CDR3包含如SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的靶向CD22的单域抗体，包含CDR1、CDR2和CDR3区；其中CDR1包含如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，其中CDR2包含如SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列，其中CDR3包含如SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的靶向CD22的单域抗体，包含CDR1、CDR2和CDR3区；其中CDR1包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，其中CDR2包含如SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列，其中CDR3包含如SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的靶向CD22的单域抗体，包含CDR1、CDR2和CDR3区；其中CDR1包含如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，其中CDR2包含如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列，其中CDR3包含如SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的靶向CD22的单域抗体，包含CDR1、CDR2和CDR3区；其中CDR1包含如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，其中CDR2包含如SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列，其中CDR3包含如SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的靶向CD22的单域抗体，包含CDR1、CDR2和CDR3区；其中CDR1包含如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，其中CDR2包含如SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列，其中CDR3包含如SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的靶向CD22的单域抗体，包含CDR1、CDR2和CDR3区；其中CDR1包含如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列，其中CDR2包含如SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列，其中CDR3包含如SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的靶向CD22的单域抗体，包含CDR1、CDR2和CDR3区；其中CDR1包含如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列，其中CDR2包含如SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列，其中CDR3包含如SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的靶向CD22的单域抗体，包含CDR1、CDR2和CDR3区；其中CDR1包含如SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列，其中CDR2包含如SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列，其中CDR3包含如SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的靶向CD22的单域抗体，包含CDR1、CDR2和CDR3区；其中CDR1包含如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列，其中CDR2包含如SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列，其中CDR3包含如SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的靶向CD22的单域抗体，包含CDR1、CDR2和CDR3区；其中CDR1包含如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列，其中CDR2包含如SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列，其中CDR3包含如SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的靶向CD22的单域抗体，包含CDR1、CDR2和CDR3区；其中CDR1包含如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列，其中CDR2包含如SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列，其中CDR3包含如SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的靶向CD22的单域抗体，包含CDR1、CDR2和CDR3区；其中CDR1包含如SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列，其中CDR2包含如SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列，其中CDR3包含如SEQ ID NO:59所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的靶向CD22的单域抗体，包含CDR1、CDR2和CDR3区；其中CDR1包含如SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列，其中CDR2包含如SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列，其中CDR3包含如SEQ ID NO:60所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的靶向CD22的单域抗体，包含CDR1、CDR2和CDR3区；其中CDR1包含如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列，其中CDR2包含如SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列，其中CDR3包含如SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的靶向CD22的单域抗体，包含CDR1、CDR2和CDR3区；其中CDR1包含如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列，其中CDR2包含如SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列，其中CDR3包含如SEQ ID NO:62所示的氨基酸序列。
本发明提供的靶向CD22的单域抗体，包含CDR1、CDR2和CDR3区；其中CDR1、CDR2和CDR3的确定是根据IMGT编号方案、Kabat编号方案、AbM编号方案、Chothia编号方案或Contact编号方案。
本发明提供的靶向CD22的单域抗体，进一步包含FR1、FR2、FR3和FR4区；其中FR1包含如SEQ ID NO:63-72所示的氨基酸序列，其中FR2包含如SEQ ID NO:73-92所示的氨基酸序列，其中FR3包含如SEQ ID NO:93-118所示的氨基酸序列，其中FR4包含如SEQ IDNO:119所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的靶向CD22的单域抗体，进一步包含FR1、FR2、FR3和FR4区；其中FR1包含如SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列，其中FR2包含如SEQ ID NO:73所示的氨基酸序列，其中FR3包含如SEQ ID NO:93所示的氨基酸序列，其中所述FR4包含如SEQID NO:119所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的靶向CD22的单域抗体，进一步包含FR1、FR2、FR3和FR4区；其中FR1包含如SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列，其中FR2包含如SEQ ID NO:73所示的氨基酸序列，其中FR3包含如SEQ ID NO:97所示的氨基酸序列，其中所述FR4包含如SEQID NO:119所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的靶向CD22的单域抗体，进一步包含FR1、FR2、FR3和FR4区；其中FR1包含如SEQ ID NO:65所示的氨基酸序列，其中FR2包含如SEQ ID NO:77所示的氨基酸序列，其中FR3包含如SEQ ID NO:104所示的氨基酸序列，其中所述FR4包含如SEQ ID NO:119所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的靶向CD22的单域抗体，进一步包含FR1、FR2、FR3和FR4区；其中FR1包含如SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列，其中FR2包含如SEQ ID NO:78所示的氨基酸序列，其中FR3包含如SEQ ID NO:105所示的氨基酸序列，其中所述FR4包含如SEQ ID NO:119所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的靶向CD22的单域抗体，进一步包含FR1、FR2、FR3和FR4区；其中FR1包含如SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列，其中FR2包含如SEQ ID NO:80所示的氨基酸序列，其中FR3包含如SEQ ID NO:108所示的氨基酸序列，其中所述FR4包含如SEQ ID NO:119所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的靶向CD22的单域抗体，进一步包含FR1、FR2、FR3和FR4区；其中FR1包含如SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列，其中FR2包含如SEQ ID NO:81所示的氨基酸序列，其中FR3包含如SEQ ID NO:109所示的氨基酸序列，其中所述FR4包含如SEQ ID NO:119所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的靶向CD22的单域抗体，进一步包含FR1、FR2、FR3和FR4区；其中FR1包含如SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列，其中FR2包含如SEQ ID NO:82所示的氨基酸序列，其中FR3包含如SEQ ID NO:110所示的氨基酸序列，其中所述FR4包含如SEQ ID NO:119所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的靶向CD22的单域抗体，进一步包含FR1、FR2、FR3和FR4区；其中FR1包含如SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列，其中FR2包含如SEQ ID NO:84所示的氨基酸序列，其中FR3包含如SEQ ID NO:111所示的氨基酸序列，其中所述FR4包含如SEQ ID NO:119所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的靶向CD22的单域抗体，进一步包含FR1、FR2、FR3和FR4区；其中FR1包含如SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列，其中FR2包含如SEQ ID NO:85所示的氨基酸序列，其中FR3包含如SEQ ID NO:112所示的氨基酸序列，其中所述FR4包含如SEQ ID NO:119所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的靶向CD22的单域抗体，进一步包含FR1、FR2、FR3和FR4区；其中FR1包含如SEQ ID NO:69所示的氨基酸序列，其中FR2包含如SEQ ID NO:85所示的氨基酸序列，其中FR3包含如SEQ ID NO:111所示的氨基酸序列，其中所述FR4包含如SEQ ID NO:119所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的靶向CD22的单域抗体，进一步包含FR1、FR2、FR3和FR4区；其中FR1包含如SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列，其中FR2包含如SEQ ID NO:87所示的氨基酸序列，其中FR3包含如SEQ ID NO:113所示的氨基酸序列，其中所述FR4包含如SEQ ID NO:119所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的靶向CD22的单域抗体，进一步包含FR1、FR2、FR3和FR4区；其中FR1包含如SEQ ID NO:71所示的氨基酸序列，其中FR2包含如SEQ ID NO:89所示的氨基酸序列，其中FR3包含如SEQ ID NO:115所示的氨基酸序列，其中所述FR4包含如SEQ ID NO:119所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的靶向CD22的单域抗体，进一步包含FR1、FR2、FR3和FR4区；其中FR1包含如SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列，其中FR2包含如SEQ ID NO:90所示的氨基酸序列，其中FR3包含如SEQ ID NO:116所示的氨基酸序列，其中所述FR4包含如SEQ ID NO:119所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的靶向CD22的单域抗体，进一步包含FR1、FR2、FR3和FR4区；其中FR1包含如SEQ ID NO:72所示的氨基酸序列，其中FR2包含如SEQ ID NO:91所示的氨基酸序列，其中FR3包含如SEQ ID NO:117所示的氨基酸序列，其中所述FR4包含如SEQ ID NO:119所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的靶向CD22的单域抗体，进一步包含FR1、FR2、FR3和FR4区；其中FR1包含如SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列，其中FR2包含如SEQ ID NO:92所示的氨基酸序列，其中FR3包含如SEQ ID NO:118所示的氨基酸序列，其中所述FR4包含如SEQ ID NO:119所示的氨基酸序列。
其中，SEQ ID NO:1-119所示的具体氨基酸序列信息如表1中所示。
表1
Figure BDA0004090236180000051
/>
Figure BDA0004090236180000061
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Figure BDA0004090236180000071
/>
Figure BDA0004090236180000081
本发明提供的靶向CD22的单域抗体，包含与SEQ ID NO:120-136所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相似度的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的靶向CD22的单域抗体，包含与SEQ ID NO:120所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相似度的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的靶向CD22的单域抗体，包含与SEQ ID NO:121所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相似度的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的靶向CD22的单域抗体，包含与SEQ ID NO:122所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相似度的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的靶向CD22的单域抗体，包含与SEQ ID NO:123所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相似度的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的靶向CD22的单域抗体，包含与SEQ ID NO:124所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相似度的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的靶向CD22的单域抗体，包含与SEQ ID NO:125所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相似度的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的靶向CD22的单域抗体，包含与SEQ ID NO:126所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相似度的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的靶向CD22的单域抗体，包含与SEQ ID NO:127所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相似度的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的靶向CD22的单域抗体，包含与SEQ ID NO:128所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相似度的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的靶向CD22的单域抗体，包含与SEQ ID NO:129所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相似度的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的靶向CD22的单域抗体，包含与SEQ ID NO:130所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相似度的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的靶向CD22的单域抗体，包含与SEQ ID NO:131所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相似度的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的靶向CD22的单域抗体，包含与SEQ ID NO:132所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相似度的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的靶向CD22的单域抗体，包含与SEQ ID NO:133所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相似度的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的靶向CD22的单域抗体，包含与SEQ ID NO:134所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相似度的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的靶向CD22的单域抗体，包含与SEQ ID NO:135所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相似度的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的靶向CD22的单域抗体，包含与SEQ ID NO:136所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相似度的氨基酸序列。
本发明提供的靶向CD22的单域抗体，包含如表2所示或如SEQ ID NO:120-136所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的靶向CD22的单域抗体，包含如SEQ ID NO:120所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的靶向CD22的单域抗体，包含如SEQ ID NO:121所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的靶向CD22的单域抗体，包含如SEQ ID NO:122所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的靶向CD22的单域抗体，包含如SEQ ID NO:123所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的靶向CD22的单域抗体，包含如SEQ ID NO:124所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的靶向CD22的单域抗体，包含如SEQ ID NO:125所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的靶向CD22的单域抗体，包含如SEQ ID NO:126所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的靶向CD22的单域抗体，包含如SEQ ID NO:127所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的靶向CD22的单域抗体，包含如SEQ ID NO:128所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的靶向CD22的单域抗体，包含如SEQ ID NO:129所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的靶向CD22的单域抗体，包含如SEQ ID NO:130所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的靶向CD22的单域抗体，包含如SEQ ID NO:131所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的靶向CD22的单域抗体，包含如SEQ ID NO:132所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的靶向CD22的单域抗体，包含如SEQ ID NO:133所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的靶向CD22的单域抗体，包含如SEQ ID NO:134所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的靶向CD22的单域抗体，包含如SEQ ID NO:135所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的靶向CD22的单域抗体，包含如SEQ ID NO:136所示的氨基酸序列。
其中，SEQ ID NO:120-136所示的具体氨基酸序列信息如表2中所示。
表2
Figure BDA0004090236180000101
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Figure BDA0004090236180000111
/>
Figure BDA0004090236180000121
本发明的目的之一在于提供一种嵌合抗原受体，且所述嵌合抗原受体在转染制备CAR-T细胞后，具备非常显著的杀伤肿瘤细胞的能力。
本发明提供的嵌合抗原受体，包含(a)细胞外抗原结合结构域，(b)跨膜结构域，和(c)细胞内信号转导结构域；其中，所述细胞外抗原结合结构域包含如前所述靶向CD22的单域抗体。
在一些实施方式中，本发明提供的嵌合抗原受体，其中跨膜结构域源自于CD8α、CD28、CD4、CD137、CD80、CD86、CD152或PD-1。
在一些实施方式中，本发明提供的嵌合抗原受体，其中跨膜结构域源自于CD8α。
在一些实施方式中，本发明提供的嵌合抗原受体，其中跨膜结构域包含如SEQ IDNO:140所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的嵌合抗原受体，其中细胞内信号转导结构域源自于CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD22、CD79a、CD79b、CD66d、FcRγ、FcRβ。
在一些实施方式中，本发明提供的嵌合抗原受体，其中细胞内信号转导结构域源自于CD3ζ。
在一些实施方式中，本发明提供的嵌合抗原受体，其中细胞内信号转导结构域包含如SEQ ID NO:142所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的嵌合抗原受体，其中细胞内信号转导结构域进一步包含共刺激信号结构域。
在一些实施方式中，本发明提供的嵌合抗原受体，其中共刺激信号结构域源自于CD137(4-1BB)、CD27、CD28、ICOS、OX40、CD30、CD40、CD3、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83配体以及它们的组合。
在一些实施方式中，本发明提供的嵌合抗原受体，其中共刺激信号结构域源自于CD137(4-1BB)。
在一些实施方式中，本发明提供的嵌合抗原受体，其中共刺激信号结构域包含如SEQ IDNO:141所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的嵌合抗原受体，进一步包含位于细胞外抗原结合结构域C端和跨膜结构域N端之间的铰链区。
在一些实施方式中，本发明提供的嵌合抗原受体，其中铰链区源自于CD8α、CD28、IgG1或IgG4。
在一些实施方式中，本发明提供的嵌合抗原受体，其中铰链区源自于CD8α。
在一些实施方式中，本发明提供的嵌合抗原受体，其中铰链区包含如SEQ ID NO:139所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的嵌合抗原受体，进一步包含位于嵌合抗原受体多肽N端的信号肽。
在一些实施方式中，本发明提供的嵌合抗原受体，其中信号肽源自于HLA-A、CD8α、CD33、Igκ、IL-2、GM-CSFRα。
在一些实施方式中，本发明提供的嵌合抗原受体，其中信号肽源自于HLA-A。
在一些实施方式中，本发明提供的嵌合抗原受体，其中信号肽包含如SEQ ID NO:138所示的氨基酸序列。
其中，SEQ ID NO:138-142所示的具体氨基酸序列信息如表3中所示。
表3
Figure BDA0004090236180000131
本发明提供的嵌合抗原受体，包含与SEQ ID NO:143-159所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相似度的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的嵌合抗原受体，包含与SEQ ID NO:143所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相似度的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的嵌合抗原受体，包含与SEQ ID NO:144所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相似度的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的嵌合抗原受体，包含与SEQ ID NO:145所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相似度的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的嵌合抗原受体，包含与SEQ ID NO:146所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相似度的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的嵌合抗原受体，包含与SEQ ID NO:147所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相似度的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的嵌合抗原受体，包含与SEQ ID NO:148所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相似度的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的嵌合抗原受体，包含与SEQ ID NO:149所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相似度的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的嵌合抗原受体，包含与SEQ ID NO:150所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相似度的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的嵌合抗原受体，包含与SEQ ID NO:151所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相似度的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的嵌合抗原受体，包含与SEQ ID NO:152所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相似度的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的嵌合抗原受体，包含与SEQ ID NO:153所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相似度的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的嵌合抗原受体，包含与SEQ ID NO:154所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相似度的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的嵌合抗原受体，包含与SEQ ID NO:155所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相似度的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的嵌合抗原受体，包含与SEQ ID NO:156所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相似度的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的嵌合抗原受体，包含与SEQ ID NO:157所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相似度的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的嵌合抗原受体，包含与SEQ ID NO:158所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相似度的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的嵌合抗原受体，包含与SEQ ID NO:159所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相似度的氨基酸序列。
本发明提供的嵌合抗原受体，包含如表4所示或如SEQ ID NO:143-159所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的嵌合抗原受体，包含如SEQ ID NO:143所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的嵌合抗原受体，包含如SEQ ID NO:144所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的嵌合抗原受体，包含如SEQ ID NO:145所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的嵌合抗原受体，包含如SEQ ID NO:146所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的嵌合抗原受体，包含如SEQ ID NO:147所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的嵌合抗原受体，包含如SEQ ID NO:148所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的嵌合抗原受体，包含如SEQ ID NO:149所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的嵌合抗原受体，包含如SEQ ID NO:150所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的嵌合抗原受体，包含如SEQ ID NO:151所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的嵌合抗原受体，包含如SEQ ID NO:152所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的嵌合抗原受体，包含如SEQ ID NO:153所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的嵌合抗原受体，包含如SEQ ID NO:154所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的嵌合抗原受体，包含如SEQ ID NO:155所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的嵌合抗原受体，包含如SEQ ID NO:156所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的嵌合抗原受体，包含如SEQ ID NO:157所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的嵌合抗原受体，包含如SEQ ID NO:158所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的嵌合抗原受体，包含如SEQ ID NO:159所示的氨基酸序列。
其中，SEQ ID NO:143-159所示的具体氨基酸序列信息如表4中所示。
表4
Figure BDA0004090236180000151
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Figure BDA0004090236180000161
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Figure BDA0004090236180000171
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Figure BDA0004090236180000181
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Figure BDA0004090236180000191
本发明的目的之一在于提供一种核酸，其包含编码如前所述嵌合抗原受体的核酸序列。在一些实施方式中，本发明提供的核酸，包含如SEQ ID NO:161-178所示的核酸序列。其中，SEQ ID NO:161-178所示的具体核酸序列信息如表5中所示。
表5
Figure BDA0004090236180000192
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Figure BDA0004090236180000201
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Figure BDA0004090236180000211
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Figure BDA0004090236180000221
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Figure BDA0004090236180000231
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Figure BDA0004090236180000241
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Figure BDA0004090236180000251
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Figure BDA0004090236180000261
本发明的目的之一在于提供一种载体，其包含编码如前所述嵌合抗原受体的核酸序列的核酸。
本发明的目的之一在于提供一种工程化的免疫效应细胞，其包含如前所述的嵌合抗原受体、核酸、或载体。
在一些实施方式中，本发明提供的工程化的免疫效应细胞选自T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞、树突状细胞、诱导性多能干细胞(iPSC)。
本发明的目的之一在于提供一种药物组合物，其包含如前所述靶向CD22的单域抗体、工程化的免疫效应细胞以及药学上可接受的载体或赋形剂。
本发明的目的之一在于还提供一种治疗受试者疾病或障碍的方法，包括给予受试者治疗有效量的如前所述靶向CD22的单域抗体、工程化的免疫效应细胞或药物组合物。
在一些实施方式中，本发明提供的一种治疗受试者疾病或障碍的方法，其中疾病或障碍是B细胞相关疾病或障碍和/或CD22相关疾病或障碍。
在一些实施方式中，本发明提供的一种治疗受试者疾病或障碍的方法，其中疾病或障碍是癌症。
在一些实施方式中，本发明提供的一种治疗受试者疾病或障碍的方法，其中疾病或障碍是B细胞相关恶性肿瘤。例如，B细胞相关恶性肿瘤是B细胞白血病或B细胞淋巴瘤。更具体地，其中疾病或障碍选自边缘区淋巴瘤(例如脾边缘区淋巴瘤)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、原发性中枢神经系统(CNS)淋巴瘤、原发性纵隔淋巴瘤B细胞淋巴瘤(PMBL)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、B细胞幼淋巴细胞白血病(B-PLL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、伯基特淋巴瘤、原发性眼内淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、毛细胞白血病(HCL)、前体B淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、高级别B细胞淋巴瘤(HGBL)和多发性骨髓瘤(MM)。
在一些实施方式中，本发明提供的一种治疗受试者疾病或障碍的方法，其中疾病或障碍是B细胞相关自身免疫和/或炎性疾病。更具体地，其中B细胞相关自身免疫和/或炎性疾病与不适当或增强的B细胞数量和/或活化相关。
本发明的目的之一在于还提供一种如前所述的靶向CD22的单域抗体、工程化的免疫效应细胞、药物组合物在制备治疗B细胞相关恶性肿瘤、B细胞相关自身免疫性疾病和/或炎性疾病药物中的用途。
术语解释
本发明所用术语“抗体”包括单克隆抗体(包括全长抗体，其具有免疫球蛋白Fc区)，具有多表位特异性的抗体组合物，多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，双抗体和单链分子，以及抗体片段，尤其是抗原结合片段，例如Fab，F(ab’)2和Fv。在本发明一些实施例中，术语“免疫球蛋白(Ig)”和“抗体”可互换地使用。
抗体的“可变区”或“可变结构域”是指抗体的重链或轻链的氨基末端结构域。重链和轻链的可变结构域可分别称为“VH”和“VL”。这些结构域通常是抗体的最可变的部分(相对于相同类型的其它抗体)并含有抗原结合位点。
基本的4链抗体单元是由两条相同的轻链(L)和两条相同的重链(H)构成的异四聚体糖蛋白。IgM抗体由5个基本的异四聚体单元及称作J链的另外多肽组成，包含10个抗原结合位点；而IgA抗体包含2-5个基本的4链单元，其可与J链组合聚合形成多价装配物。在IgG的情况中，4链单元通常约150,000道尔顿。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而两条重链通过一个或多个二硫键彼此相连，二硫键的数目取决于重链的同种型。每条重链和轻链还具有间隔规律的链内二硫桥。每条重链在N-末端具有可变结构域(VH)，接着是三个(对于每种α和γ链，CH1、CH2和CH3)和四个(对于μ和ε同种型，CH1、CH2、CH3和CH4)恒定结构域(CH)以及位于CH1结构域与CH2结构域之间的绞链区(Hinge)。每条轻链在N-末端具有可变结构域(VL)，接着是其另一端的恒定结构域(CL)。VL与VH排列在一起，而CL与重链的第一恒定结构域(CH1)排列在一起。特定的氨基酸残基被认为在轻链和重链可变结构域之间形成界面。成对的VH和VL一起形成一个抗原结合位点。关于不同类别抗体的结构和性质，还可参见Basic and Clinical Immunology.Eighth edition.Daniel P.Sties，Abba I.Terrand Tristram G.Parsolw.Appleton&Lange,Norwalk,CT.1994,Page 71and Chapter 6。来自任何脊椎动物物种的轻链，根据其恒定结构域氨基酸序列，可归入两种称作κ和λ的截然不同型中的一种。根据其重链恒定结构域(CH)氨基酸序列，免疫球蛋白可归入不同的类或同种型。有五类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，分别具有称作α、δ、ε、γ和μ的重链。根据CH序列和功能的相对较小差异，γ和α类可进一步分为亚类，例如人表达下列亚类：IgG1、IgG2A、IgG2B、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。
重链抗体是源自骆驼科生物或软骨鱼科生物的抗体。相比上述4链抗体，重链抗体缺失轻链和重链恒定区1(CH1)，仅包含2条由可变区(VHH)和其他恒定区组成重链，可变区通过类似铰链区结构与恒定区相连。骆驼科重链抗体的每条重链包含1个可变区(VHH)和2个恒定区(CH2和CH3)，软骨鱼科重链抗体的每条重链含有1个可变区和5个恒定区(CH1-CH5)。重链抗体的抗原结合片段包括VHH和单链重链抗体。通过与人IgG Fc的恒定区融合，重链抗体可以具有人IgG Fc的CH2和CH3。
本发明所用术语“单域抗体”、“靶向CD22的单域抗体”、“重链抗体的重链可变区结构域”、“VHH”、“纳米抗体”可互换使用，均指特异性识别和结合于CD22的单域抗体。单域抗体是重链抗体的可变区。通常，单域抗体含有三个CDR区和四个FR区。单域抗体是最小的功能性抗原结合片段。通常先获得天然缺失轻链和重链恒定区1(CH1)的抗体后，再克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的单域抗体。
在不实质性影响抗体活性的前提下，本领域技术人员可以对本发明的序列改变一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个)氨基酸，以获得所述抗体或其功能性片段序列的变体。这些变体包括但并不限于：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行保守性取代时，通常不会改变蛋白质的功能。如在可变区的FR和/或CDR中将具有类似性质的氨基酸进行取代。可进行保守性取代的氨基酸残基为本领域所周知。这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的。又例如在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。它们都被视为包括在本发明保护的范围内。
在一些实施方式中，本发明所述变体的序列可以与其来源序列有至少有95％、96％、97％、98％或99％的一致性。本发明所述的序列一致性可以使用序列分析软件测量。例如使用缺省参数的计算机程序BLAST，尤其是BLASTP或TBLASTN。本发明还包括那些具有带CDR的抗体重链可变区的分子，只要其CDR与此处鉴定的CDR具有90％以上(较佳地95％以上，最佳地98％以上)的同源性。
可采用本领域常规的方法制备本发明的单域抗体、纳米抗体或重链抗体，例如本领域熟知的噬菌体展示技术。或者，本发明的各种抗体可在其他细胞系中表达。可用编码本发明各种抗体的序列转化合适的哺乳动物宿主细胞。转化可采用任何已知的方法进行，例如包括将多核苷酸包装在病毒(或病毒载体中)并用病毒(或载体)转导宿主细胞。所用的转化程序取决于将转化的宿主。用于将异源多核苷酸引入哺乳动物细胞中的方法为本领域所熟知，包括葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺介导的转染、原生质体融合、电穿孔、将多核苷酸包封在脂质体中和将DNA直接微注射至核中等。可用于表达的宿主哺乳动物细胞系为本领域所熟知，例如可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的多种永生化细胞系，包括但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如，HepG2)等。尤其优选的细胞系通过确定哪些细胞系具有高表达水平并产生具有基本CD 22结合特性的抗体来进行选择。
本发明所用术语“嵌合抗原受体(CAR)”，其包含细胞外抗原结合结构域，所述细胞外抗原结合结构域包含本发明公开的结合CD22的单域抗体(sdAb)，例如VHH。
在一些实施方案中，本发明公开的嵌合抗原受体(CAR)包含多肽，该多肽包含:(a)细胞外抗原结合结构域，其包含本发明公开的CD22的单域抗体(sdAb)；(b)跨膜结构域；(c)细胞内信号转导结构域。下面将更详细地描述每个结构域和附加区域。
本发明公开CAR包含细胞外抗原结合结构域，其包含一种或多种单域抗体。sdAb可以具有相同或不同的来源，并且具有相同或不同的大小。示例性的sdAb包括但不限于来自仅重链抗体的重链可变结构域(例如VHH)、天然没有轻链的结合分子、单结构域(例如VH或VL)衍生自常规4链抗体、仅人源化重链抗体、由表达人类重链片段的转基因小鼠或大鼠产生的人类单域抗体，以及非衍生自抗体的工程域和单域支架。本领域已知的或由本发明公开的任何sdAb，包括本发明公开的单域抗体，可用于构建本文所述的CAR。sdAb可以来源于任何物种，包括但不限于小鼠、大鼠、人、骆驼、美洲驼、七鳃鳗、鲨鱼、山羊、兔和牛。本发明考虑的单域抗体还包括来自骆驼科和鲨鱼以外的物种的天然存在的单域抗体分子。
在一些实施方案中，本发明公开的细胞外抗原结合结构域包含至少一个结合结构域，并且该至少一个结合结构域包含本发明公开的结合CD22的单域抗体。
在一些实施方案中，抗CD22 sdAb是骆驼的、嵌合的、人的或人源化的。
在一些实施方案中，本发明公开的包含多肽的CAR，所述多肽包含:(a)包含抗CD22sdAb的细胞外抗原结合结构域；(b)跨膜结构域；(c)细胞内信号传导结构域；其中抗CD22sdAb包含与序列SEQ ID NO:120-136具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相似性的多肽序列。
在一些实施方案中，本发明公开的包含多肽的CAR，所述多肽包含:(a)包含抗CD22sdAb的细胞外抗原结合结构域；(b)跨膜结构域；(c)细胞内信号传导结构域；其中抗CD22sdAb包含氨基酸序列SEQ ID NO:120-136。
除了本发明公开的抗原结合结构域之外，本发明公开的CAR还可包含以下中的一种或多种结构：接头(例如肽接头)、信号肽、铰链区、跨膜结构域、共刺激信号结构域、细胞内信号传导结构域，下文将详细地描述这些结构域。
在一些实施方案中，细胞内信号转导结构域包含免疫效应细胞(例如T细胞)的主要细胞内信号转导结构域。在一些实施方案中，主要细胞内信号传导结构域源自CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD22、CD79a、CD79b、CD66d、FcRγ、FcRβ。在一些实施方案中，主要细胞内信号传导结构域源自CD3ζ。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域进一步包含共刺激信号结构域。在一些实施方案中，共刺激信号结构域衍生自共刺激分子，该共刺激分子源自CD27、CD28、CD137(4-1BB)、OX40、CD30、CD40、CD3、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83配体中的一种或多种。在一些实施方案中，共刺激信号结构域源自CD137(4-1BB)。
在一些实施方案中，CD22 CAR还包含位于细胞外抗原结合结构域的C端和跨膜结构域的N端之间的铰链结构域(例如CD8α铰链结构域)。
在一些实施方案中，CD22 CAR还包含位于多肽N端的信号肽(例如HLA-A信号肽或CD8α信号肽)。在一些实施方案中，多肽从N端到C端包含：HLA-A信号肽或CD8α信号肽、细胞外抗原结合结构域、CD8α铰链区、CD8α跨膜结构域、源自CD137(4-1BB)的共刺激信号结构域，和源自CD3ζ的细胞内信号转导结构域。
在一些实施方案中，CAR的不同结构域也可以通过肽接头相互融合。这取决于单域抗体和/或各种域的结构和/或功能特征，CAR中的每个肽接头可以具有相同或不同的长度和/或序列。本领域技术人员可以独立地选择和优化每个肽接头。在一些实施方案中，肽接头包含柔性残基(例如，甘氨酸和丝氨酸)，使得相邻结构域可以相对于彼此自由移动。例如，甘氨酸-丝氨酸双联体可以是合适的肽接头。
肽接头可以具有任何合适的长度。在一些实施方案中，肽接头是至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50、75、100个或更多个氨基酸长度。在一些实施方案中，肽接头不超过为约100、75、50、40、35、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5个或更少的氨基酸长度。在一些实施方案中，肽接头的长度为约1个氨基酸至约10个氨基酸、约1个氨基酸至约20个氨基酸、约1个氨基酸至约30个氨基酸、约5个氨基酸至约15个氨基酸、约10个氨基酸至约25个氨基酸、约5个氨基酸至约30个氨基酸、约10个氨基酸至约30个氨基酸长、约30个氨基酸至约50个氨基酸、约50个氨基酸至约100个氨基酸、或约1个氨基酸至约100个氨基酸。
肽接头可以具有天然存在的序列或非天然存在的序列。例如，源自仅重链抗体的铰链区的序列可以用作接头。参见，例如WO1996/34103。在一些实施方案中，肽接头是柔性接头。示例性柔性接头包括但不限于甘氨酸聚合物(G)n，甘氨酸-丝氨酸聚合物(例如(GS)n、(GSG)n、(GGGS)n和(GGGGS)n，其中n是至少1的整数)、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物和本领域已知的其他柔性接头。
本发明还公开了编码上述各种抗体或嵌合抗原受体的核酸。本发明提供编码重链可变区、轻链可变区、重链、轻链以及各CDR的多核苷酸。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。
本领域技术人员所熟知，由于遗传密码的简并性，可制得极大量的核酸，它们全部编码本发明的抗体或嵌合抗原受体。因此，在已鉴定特定氨基酸序列的情况下，本领域技术人员可通过以不改变编码蛋白质的氨基酸序列的方式简单地修饰一个或多个密码子的序列来制得任何数量的不同的核酸。所以，本发明还涉及与上述多核苷酸序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严谨条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严谨条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明各种抗体或嵌合抗原受体的核酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可将重链的编码序列和表达标签(如6His)融合在一起，形成融合蛋白。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。本发明所涉及的生物分子(核酸、多肽等)包括以分离的形式存在的生物分子。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明多肽(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明多肽序列中。
本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的核酸构建物，例如表达载体和重组载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。载体通常含有用于质粒维系和用于克隆与表达外源性核苷酸序列的序列。所述序列(在某些实施方案中总称为“侧翼序列”)通常包括一个或多个以下核苷酸序列：启动子、一个或多个增强子序列、复制起点、转录终止序列、含有供体和受体剪接位点的完全内含子序列、编码用于多肽分泌的前导序列、核糖体结合位点、聚腺苷酸化序列、用于插入编码将要表达的抗体的核酸的多连接子区和可选标记元件。
本发明涉及的宿主细胞可以是原核细胞，例如细菌细胞；或是低等真核细胞，例如酵母细胞；或是高等真核细胞，例如哺乳动物细胞。代表性例子有大肠杆菌、链霉菌属、鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；酵母的真菌细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS7、293细胞的动物细胞等。
在一些实施方式中，宿主细胞可以是本领域熟知的各种功能细胞，例如各种杀伤性细胞，包括但不限于细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)、树突状细胞刺激的细胞因子诱导的杀伤细胞(DC-CIK)、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、γδT细胞、自然杀伤细胞(NK)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、淋巴因子激活杀伤细胞(LAK)、CD3AK细胞(抗CD3单抗的杀伤细胞)和CAR-T/TCR-T细胞。在某些实施方案中，所述杀伤性细胞为T细胞或NK细胞。示例性的NK细胞包括但不限于原代NK细胞、NK细胞株(如NK92)和NKT细胞。在某些实施方案中，所述NK细胞为原代NK细胞。示例性的T细胞包括但不限于外周血T淋巴细胞、脐带血T淋巴细胞、细胞毒杀伤T细胞(CTL)、辅助T细胞、抑制/调节性T细胞、γδT细胞以及细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)等混合细胞群体的T细胞。在某些实施方案中，所述T细胞为外周血T淋巴细胞、脐带血T淋巴细胞。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所熟知。另一种方法是使用MgCl2。此外，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔，脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基，例如含血清培养基或无血清培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上述方法中的多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术以及这些方法的结合。
本发明还公开了用于克隆和表达本发明的任何一种CAR的载体。在一些实施方案中，载体适合于在真核细胞，例如哺乳动物细胞中复制和整合。在一些实施方案中，载体是病毒载体。病毒载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、牛痘载体、单纯疱疹病毒载体及其衍生物。病毒载体技术在本领域中是众所周知的，并且在Sambrook等人(Molecular Cloning:A Laboratory Manual.Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor.(2001))以及其他病毒学和分子生物学手册中进行过描述。
现有技术中已经开发了许多基于病毒的系统用于将基因转移到哺乳动物细胞中。例如，逆转录病毒为基因传递系统提供了一个方便的平台。可以使用本领域已知的技术将异源核酸插入载体并包装在逆转录病毒颗粒中。然后可以在体外或离体分离重组病毒并将其递送至工程化哺乳动物细胞。许多逆转录病毒系统是本领域已知的。在一些实施方案中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体是本领域已知的。在一些实施方案中，使用慢病毒载体。在一些实施方案中，使用自灭活慢病毒载体。例如，携带免疫调节剂(例如免疫检查点抑制剂)编码序列的自灭活慢病毒载体和/或携带嵌合抗原受体的自灭活慢病毒载体可以用本领域已知的方案包装。使用本领域已知的方法，所得慢病毒载体可用于转导哺乳动物细胞(例如原代人T细胞)。源自逆转录病毒(如慢病毒)的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因的长期、稳定整合及其在后代细胞中的繁殖。慢病毒载体还具有低免疫原性，并且可以转导非增殖细胞的优点。
在一些实施方案中，载体包含任何一种编码本发明所述CAR的核酸。可以使用本领域中任何已知的分子克隆方法将核酸克隆到载体中，包括例如使用限制性核酸内切酶位点和一种或多种选择标记。在一些实施方案中，核酸与启动子可操作地连接。已经探索了多种启动子用于哺乳动物细胞中的基因表达，并且本领域已知的任何启动子都可以用于本发明。启动子可进一步分为组成型启动子或调节型启动子，例如诱导型启动子。
在一些实施方案中，编码CAR的核酸可操作地连接到组成型启动子。组成型启动子允许异源基因(也称为转基因)在宿主细胞中组成型表达。本发明考虑的示例性组成型启动子包括但不限于巨细胞病毒(CMV)启动子、人延伸因子-1α(hEF1α)启动子、泛素C(UbiC)启动子、磷酸甘油激酶(PGK)启动子、猿病毒40(SV40)早期启动子，以及鸡β-肌动蛋白与CMV早期增强子偶联(CAGG)启动子。这种组成型启动子在驱动转基因表达方面的效率已在大量研究中进行了广泛比较。例如Michael C.Milone等人(Molecular Therapy,17(8):1453-1464(2009))比较了CMV、hEF1α、UbiC和PGK在人类原代T细胞中驱动嵌合抗原受体表达的效率，并得出结论，hEF1α启动子不仅诱导最高水平的转基因表达，而且维持在CD4和CD8人T细胞中是最佳的。在一些实施方案中，编码CAR的核酸可操作地连接到hEF1α启动子。
在一些实施方案中，编码CAR的核酸可操作地连接至诱导型启动子。诱导型启动子属于调节型启动子。诱导型启动子可以由一种或多种条件诱导，例如物理条件、工程化免疫效应细胞的微环境或工程化免疫效应细胞的生理状态、诱导剂等。
在一些实施方案中，诱导条件不诱导工程化哺乳动物细胞和/或接受药物组合物的受试者中的内源基因的表达。在一些实施方案中，诱导条件选自：诱导剂、辐射(例如电离辐射、光)、温度(例如热)、氧化还原状态、肿瘤环境和工程化哺乳动物细胞的活化状态。
在一些实施方案中，载体还包含选择标记基因或报告基因以从通过慢病毒载体转染的宿主细胞群中选择表达CAR的细胞。选择标记和报告基因的两侧都可以有适当的调节序列以在宿主细胞中表达。例如，载体可以含有转录和翻译终止子、起始序列和用于调节核酸序列表达的启动子。
本发明所用术语“免疫效应细胞”是可以执行免疫效应功能的免疫细胞。在一些实施方案中，免疫效应细胞至少表达FcγRIII并执行ADCC效应功能。介导ADCC的免疫效应细胞的例子包括T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞、树突状细胞、诱导性多能干细胞(iPSC)等。
在一些实施方案中，免疫效应细胞是T细胞。在一些实施方案中，T细胞是CD4+/CD8-、CD4-/CD8+、CD4+/CD8+、CD4-/CD8-T细胞或其组合。在一些实施方案中，T细胞在表达CAR并结合靶细胞如CD22+肿瘤细胞后产生IL-2、TFN和/或TNF。在一些实施方案中，CD8+T细胞在表达CAR并与靶细胞结合后裂解抗原特异性靶细胞。
在一些实施方案中，免疫效应细胞是NK细胞。在其他实施方案中，免疫效应细胞可以是已建立的细胞系，例如NK-92细胞。
在一些实施方案中，免疫效应细胞可以从干细胞分化而来，例如造血干细胞、多能干细胞、iPSC或胚胎干细胞。
本发明的工程化的免疫效应细胞是通过将CAR引入免疫效应细胞(例如T细胞)中来制备的。在一些实施方案中，通过转染任何一种分离的核酸或任何一种上述载体将CAR引入免疫效应细胞。
将载体或分离的核酸引入哺乳动物细胞的方法是本领域已知的。所描述的载体可以通过物理、化学或生物学方法转移到免疫效应细胞中。
将载体引入免疫效应细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。用于产生包含载体和/或外源核酸的细胞的方法是本领域众所周知的(参见Sambrook,J.,Fritsch,E.F.and Maniatis,T.(2001)Molecular Cloning:A LaboratoryManual.Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor.)。在一些实施方案中，通过电穿孔将载体引入细胞中。
将载体引入免疫效应细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体已成为将基因插入哺乳动物(例如人类细胞)中最广泛使用的方法。
将载体引入免疫效应细胞的化学方法包括胶体分散系统，例如包括大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠和基于脂质的系统，例如包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外递送载体的示例性胶体系统是脂质体。
在一些实施方案中，编码本文所述的任何CAR的RNA分子可以通过常规方法(例如体外转录)制备，然后通过已知方法例如mRNA电穿孔引入免疫效应细胞(参见Peter MRabinovich.Human Gene Therapy,17:1027-1035(2006))。
在一些实施方案中，转导或转染的免疫效应细胞在引入载体或分离的核酸后离体增殖。在一些实施方案中，培养转导或转染的免疫效应细胞以增殖至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12或14天。在一些实施方案中，可以进一步评估或筛选转导或转染的免疫效应细胞以选择工程化的免疫效应细胞。
报告基因可用于识别可能转染的细胞和评估调节序列的功能。一般而言，报告基因是不存在于受体生物体或组织中或不由受体生物体或组织表达的基因，并且其编码多肽，该多肽表达一些容易检测的特性，例如酶活性。在将DNA引入受体细胞后的合适时间测定报告基因的表达。合适的报道基因可以包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶或绿色荧光蛋白的基因(参见Kumiko Ui-Tei.FEBS Letters,479:79-82(2000))。合适的表达系统是本领域已知的并且可以使用已知技术制备或商业获得。确认工程化免疫效应细胞中存在编码CAR的核酸的其他方法包括：本领域技术人员熟知的分子生物学测试方法，例如Southern和Northern印迹、RT-PCR和PCR；生化测定方法，例如检测特定肽的存在或不存在；免疫学方法，例如ELISA。
本发明公开的药物组合物含有本发明所述靶向CD22的单域抗体、工程化的免疫效应细胞以及药学上可接受的赋形剂或载体。药学上可接受的赋形剂或载体包括但不限于稀释剂、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/或佐剂。辅料优选地在所采用的剂量和浓度下对接受者无毒或基本上无毒。这类辅料包括但并不限于：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。在某些实施方案中，药物组合物可含有用于改善、维持或保留例如组合物的pH、渗透性、粘度、澄清度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、吸收或渗透的物质。可视预期的施用途径、递送方式和所需的剂量来确定最佳的药物组合物。
用于体内施用的药物组合物通常以无菌制剂的形式提供。通过经无菌过滤膜过滤来实现灭菌。在组合物冻干时，可在冻干、复溶、稀释之前或之后使用此方法进行灭菌。可选择本发明的药物组合物用于肠胃外递送。用于肠胃外施用的组合物可以冻干形式或在溶液中储存。例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。肠胃外组合物通常放在具有无菌进入孔的容器中，例如具有皮下注射针可刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶。或者，可选择组合物用于吸入或通过消化道(诸如经口)递送。所述药学上可接受的组合物的制备在本领域的技术范围内。其它药物组合物将为本领域技术人员显而易见，包括在持续或控制释放递送配制物中包含抗体的配制物。用于配制多种其它持续或可控传递方式的技术(诸如脂质体载剂、生物易蚀微粒或多孔珠粒和积存注射)也为本领域技术人员所知。
药物组合物一经配制，就以溶液、悬浮液、凝胶、乳液、固体、晶体或以冻干粉末的形式储存在无菌小瓶中。所述配制物可储存成即用形式或在施用前复溶的形式(例如，冻干)。本发明还提供用于产生单剂量施用单位的试剂盒。本发明的试剂盒可各自含有具有干燥蛋白的第一容器和具有含水配制物的第二容器。在本发明的某些实施方案中，提供含有单腔和多腔预填充注射器(例如，液体注射器和冻干注射器)的试剂盒。
本发明还提供通过施用本发明任一实施方式所述的靶向CD22的单域抗体、工程化的免疫效应细胞或其药物组合物来治疗患者(尤其是患有CD22相关疾病的患者)的方法。本发明中术语“患者”、“受试者”、“个体”、“对象”在本文中可互换使用，包括任何生物体，优选动物，更优选哺乳动物(例如大鼠、小鼠、狗、猫、兔等)，且最优选的是人。“治疗”指向受试者采用本文所述治疗方法以达到至少一种阳性治疗效果(比如，癌细胞数目减少、肿瘤体积减小、癌细胞浸润至周边器官的速率降低或肿瘤转移或肿瘤生长的速率降低)。有效治疗患者的治疗方法可根据多种因素(比如患者的疾病状态、年龄、体重以及疗法激发受试者的抗癌反应能力)而变。
将采用的含有本发明靶向CD22的单域抗体或工程化的免疫效应细胞的药物组合物的治疗有效量将取决于例如治疗程度和目标。本领域技术人员将了解，用于治疗的适当剂量水平将部分取决于所递送的分子、适应症、施用途径和患者情况(体重、体表或器官大小)和/或状况(年龄和一般健康状况)而变化。在某些实施方式中，临床医生可滴定剂量并改变施用途径来获得最佳的治疗效果。
给药频率将取决于所用配制物中靶向CD22的单域抗体或工程化的免疫效应细胞的药物动力学参数。临床医生典型地施用药物组合物直到达到实现所需效果的剂量。药物组合物因此可作为单次剂量施用，或随时间以作为两次或多次剂量(可含有或不含有相同量的所需分子)施用，或通过植入装置或导管以连续输液的方式施用。
药物组合物的施用途径是本领域常规的，例如经口、经鼻、通过静脉内、腹膜内、脑内(脑实质内)、脑室内、肌肉内、眼内、动脉内、门静脉或病灶内途径注射，还可以通过持续释放系统或通过植入装置进行施用。
附图说明
图1A显示了在各组CD4+T细胞上CD22 CAR多肽分子的表达率。
图1B显示了在各组CD8+T细胞上CD22 CAR多肽分子的表达率。
图2显示了分别在Raji细胞、Namalwa细胞、K562细胞表面CD22抗原的表达情况。
图3A显示了效靶比(E:T)＝1:1时，第一天(D1)各组效应细胞对Raji细胞的杀伤率。
图3B显示了效靶比(E:T)＝1:1时，第三天(D3)各组效应细胞对Raji细胞的杀伤率。
图4A显示了效靶比(E:T)＝1:3时，第一天(D1)各组效应细胞对Raji细胞的杀伤率。
图4B显示了效靶比(E:T)＝1:3时，第三天(D3)各组效应细胞对Raji细胞的杀伤率。
图5A显示了效靶比(E:T)＝1:3时，第一天(D1)各组效应细胞对Namalwa细胞的杀伤率。
图5B显示了效靶比(E:T)＝1:3时，第三天(D3)各组效应细胞对Namalwa细胞的杀伤率。
图6A显示了各组效应细胞在体外杀伤实验中Granzyme B的释放情况。
图6B显示了各组效应细胞在体外杀伤实验中TNF-α的释放情况。
图6C显示了各组效应细胞在体外杀伤实验中IFN-γ的释放情况。
图6D显示了各组效应细胞在体外杀伤实验中IL-2的释放情况。
在上述图中：UnT为阴性对照组、m971为阳性对照组、S1为S1-CAR-T组、S4为S4-CAR-T组、S9为S9-CAR-T组、S27为S27-CAR-T组、S28为S28-CAR-T组、S35为S35-CAR-T组、S36为S36-CAR-T组、S41为S41-CAR-T组、S43为S43-CAR-T组。
本发明目的的实现、功能特点以及有益效果取得将结合以下实施例，并参照附图做进一步说明。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围内。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1.靶向CD22 VHH单域抗体的制备
(1)动物免疫和免疫反应试验
动物免疫使用的CD22抗原为Hμman Siglec-2/CD22 Protein,Fc Tag(AcroBiosystem,Cat.No.CD2-H5253)。
1)选择健康羊驼为免疫对象。
2)第1次免疫接种，将完全弗氏佐剂与CD22抗原(0.8mg)1:1混合，乳化后皮下多点注射，后续加强免疫选用不完全弗氏佐剂与CD22抗原1:1混合，免疫间隔周期为2周，共免疫5次；免疫前及每次免疫后均采外周血5mL，分离血清，用ELISA方法监测免疫反应，确认血清滴度。
3)第5次免疫后，血浆效价达到100000水平，采血20mL，分离其中淋巴细胞并保存在Trizol中，用于后续抗体噬菌体文库构建。
(2)抗体噬菌体文库的构建
1)动物免疫结束后，使用分离后的淋巴细胞提取RNA并使用Takara反转录试剂盒对得到的总RNA进行反转录；将上述总RNA样品分为两份，一份使用试剂盒内的Oligo dTPrimer作为引物，另一份用试剂盒内的Random 6-mers作为引物，按照反转录试剂盒说明书将上一步得到的总RNA反转录成cDNA，分别保存到2个离心管中。
2)PCR扩增
a.从反转录的cDNA中扩增特定的抗体片段，使用Taq DNAPolymerase Hot Start酶进行PCR扩增；将所有PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，并切胶回收目的片段大小在600-700bp左右的条带，即为第一轮PCR扩增产物，放入-20℃保存；
b.将第一轮PCR扩增产物作为模板进行第二轮PCR反应，反应结束后，进行1％琼脂糖凝胶电泳，最终切胶回收目的条带单一且片段大小为400bp左右条带，并使用通用型DNA纯化回收试剂盒对PCR反应液进行DNA纯化。
3)酶切与连接
将第二轮PCR扩增的目的基因片段和pComb3XSS噬菌体质粒载体用限制性内切酶Spe I、Sac I分别酶切，酶切完成用连接酶将VHH目的基因片段连接到pComb3XSS噬菌体质粒载体，构建重组质粒。
4)细菌文库构建
a.取一支50μL的TG1感受态细胞在冰上放置5-10min融化；
b.加入100ng连接产物，转移到已经预冷好的间距1mm的电转杯中，在电转仪中设定参数：1800V、1mm后，点击按钮转化；
c.等待电转完成后立即加入37℃预热好的SOC培养液1mL，混匀后37℃、200rpm摇菌复苏1h；
d.取20多个100ng连接体系按上述方法使用感受态进行电转反应；
e.从复苏的菌液中取100μL进行10梯度稀释后涂板，37℃过夜培养；
f.收集剩下所有菌液并均匀涂布到20多个15cm培养板(2×YT含有100μg/mLAmp，2％琼脂糖)中，37℃倒置培养过夜；
g.根据稀释倍数和单菌落数计算所有反应能获得的转化菌落数目，即为细菌文库的库容量；同时从梯度稀释板中随机挑选若干个单克隆进行菌落PCR，PCR产物有在400bp左右的单一条带认为是阳性克隆，以此估算细菌文库的克隆阳性率；
h.将过夜培养的平板菌落使用2×YT液体培养基刮下，置于50mL离心管，测量其OD600值，添加终浓度20％甘油-80℃保存。
5)噬菌体文库构建
a.接种细菌文库到100mL 2×YT液体培养基(含有100μg/mLAmp)中，使初始OD600值为0.1，37℃、250rpm培养直至OD600为0.5-0.55；
b.按照1：20(细菌个数：噬箘体数)的比例加入辅助噬菌体，37℃、250rpm孵育30min；
c.加入终浓度为50μg/mLKana，30℃、250rpm过夜培养，离心，收集上清液；
d.加入1/4体积的预冷PEG/NaCl，混合均匀，冰上静置孵育至少30min，4℃，4000rpm离心20分钟去除上清后加入1mLPBS缓冲液溶解沉淀；再次加入1/4体积的预冷PEG/NaCl后冰上孵育10分钟，4℃、12000g离心10分钟后去除上清并将沉淀溶解在1mLPBS，放入-80℃保存，得到纯化后的噬菌体文库。
(3)噬菌体筛选
1)第一轮筛选
a.将筛选抗原包被免疫管(50μg/管，包被液为PBS，2mL/管)，4℃缓慢旋转过夜，同时平行包被BSA(50μg于PBS，2mL/管)作对照；将过夜包被的免疫管中的上清弃掉，用PBS缓冲液室温清洗免疫管3次，旋转5min/次，加入2mL封闭液(3％脱脂奶粉)溶液，室温旋转封闭2h后弃上清，并加入2mLPBST缓冲液室温清洗免疫管3次，旋转5min/次；
b.弃掉免疫管中的清洗液，加入制备的噬菌体文库约1012pfu作为第一轮筛选输入噬菌体文库，加入PBS缓冲液至2mL，室温旋转孵育1h；弃上清，加入2mLPBST(1×PBS加0.1％Tween20，下同)缓冲液室温清洗免疫管20次，每次旋转5min；将免疫管内液体弃掉，加入1mL0.25mg/mL Trypsin溶液，室温旋转洗脱30min；加入10μL 10％AEBSF终止洗脱，将免疫管中的溶液转移至新的1.5mL离心管中，即为第一轮筛选噬菌体洗脱液。
2)第一轮噬菌体洗脱液效价检测
取第一轮噬菌体洗脱液10μL，在1.5mL离心管中进行10倍梯度稀释，共稀释12个梯度，至10-12；在每个稀释离心管中加入90μL的TG1菌液，振荡混匀后37℃孵育30min；从每个稀释离心管中取5μL滴加到2×YT固体培养基(Amp)中，静止数分钟后，放入37℃倒置过夜培养；统计板上可以明显区分单菌落的稀释度的单菌落数量，并按照以下公式计算每毫升噬菌体溶液中噬菌粒的数量，即噬菌体文库效价：
T(pfu/mL)＝N×D×400
其中，T为噬菌体效价(pfu/mL)，D为稀释倍数，N为相应稀释倍数的单菌落个数。
3)第三轮筛选噬菌体洗脱液
重复以上实验3次，并以第一轮的噬菌体作为第二轮筛选输入噬菌体文库，得到第二轮筛选噬菌体洗脱液，再以第二轮的噬菌体作为第三轮筛选输入噬菌体文库，得到第三轮筛选噬菌体洗脱液。
(4)单克隆ELISA检测
1)取第三轮筛选后合适稀释度的菌液，均匀涂布到含有100μg/mLAmp的固体培养基平板，放入37℃过夜培养。
2)从过夜培养后的培养基平板中随机挑取192单克隆菌落于无菌96孔细胞培养板中，每孔加入200μL 2×YT培养基(含有100μg/mLAmp)，放入37℃过夜静置培养。
3)取过夜培养的菌液5μL转接至每孔200μL 2×YT液体培养基(含有100μg/mLAmp)的新96孔细胞培养板中，放入37℃静置培养5h。
4)每孔加入辅助噬菌体M13K07，其中细菌个数：噬菌体数为1：20。
5)37℃孵育30min后，加入终浓度为50μg/mL的Kana，放入30℃静置过夜培养，然后将96孔细胞培养板离心，放入4℃保存备用。
6)将筛选抗原包被酶标板(1ng/μL，PBS，100μL/孔)同时平行包被相同浓度的BSA作对照，放入4℃包被过夜；弃上清，用PBS缓冲液室温下洗涤酶标板3次，每次10min；每孔加入200μL封闭液(3％BSA于PBST)封闭酶标板，室温封闭1h；弃封闭液，每孔加入200μLPBST(1×PBS加0.1％Tween20，下同)缓冲液，室温清洗酶标板3次，每次10min。
7)每孔加入100μL封闭液后再加入100μL步骤5)中离心后的上清液，室温孵育2h。
8)弃掉酶标板内液体，每孔加入200μL PBST缓冲液洗涤3次，每次10min。
9)每孔加入M13 BacteriophageAntibody(HRP)，Mouse Mab，1:30000稀释于封闭液中，100μL/孔，室温孵育1h。
10)弃掉ELISA板内液体，每孔加入200μLPBST缓冲液洗涤6次，每次5min。
11)每孔加入100μLTMB单组份显色液，避光显色1-3min，然后每孔加入100μL 1MHCl终止反应，用酶标仪读取OD450值，记录并保存。
实施例2.靶向CD22的嵌合抗原受体的构建及免疫细胞表达
(1)CD22 CAR的构建
首先设计并人工合成了各组靶向CD22的CAR核苷酸序列(SEQ ID No.161-178)，各组序列中包含HLA-A信号肽(SEQ ID No.138)或CD8α信号肽、CD22 VHH(SEQ ID No.120-136)或CD22 scFv(m971阳性对照，SEQ ID No.137)的细胞外抗原结合结构域、CD8α铰链区(SEQ ID No.139)、CD8α跨膜结构域(SEQ ID No.140)、CD137(4-1BB)共刺激信号结构域(SEQ ID No.141)和CD3ζ细胞内信号转导结构域(SEQ ID No.142)的编码核苷酸序列，用于表达完整的CD22 CAR多肽分子(SEQ ID No.143-160)。通过同源重组将CD22 CAR核苷酸序列插入至慢病毒表达载体pK1的多克隆位点从而获得pK1-CD22 CAR，通过电泳及测序结果验证慢病毒表达载体序列构建成功。
(2)慢病毒载体的包装
复苏293T细胞，在含有10％FBS的DMEM培养基中培养；经过2-3代细胞扩增培养后，按照4×104个/cm2的密度接种到2层细胞工厂中；在细胞接种3天后，进行质粒转染；质粒转染用无菌50ml离心管中加入40ml Optim-MEM后，再根据pK1-CD22 CAR：pLP1：pLP2：pLP-VSVG＝5：4：3：1的比例加入病毒包装载体和病毒包膜载体，然后加入800μLPEI转染试剂，立即混匀，于室温下孵育15min，然后将质粒/载体/转染试剂复合物逐滴加入到293T细胞的培养瓶中；24h后收集病毒上清液至50ml离心管中，250g离心5min，离心后上清液用0.45μm的滤器过滤，将过滤后的上清液超速离心(25000g，4℃，3h)获得浓缩的CD22 CAR慢病毒；离心后弃去上清液，用4℃预冷的PBS重悬慢病毒，对重悬后的CD22 CAR慢病毒液进行分装，放入-80℃条件下贮存备用。
(3)T细胞的复苏与活化
设置水浴锅温度为38℃，并提前将培养基预热；从液氮罐中取出冻存袋，立即浸没在水浴锅中，待冻存的脐血呈现透明状完全融化时，取出冻存袋；用干棉球擦拭冻存袋外的水渍，并用75％酒精喷洒消毒，待酒精挥发完全后转移至生物安全柜；取出脐血放入50mL离心管中，并加入适量RPMI 1640培养基，混匀后取样计数；在300g、5min条件下离心，离心后收集下层细胞，并用完全培养基重悬至T细胞密度为1×106个/mL，根据重悬体积加入活化抗体Anti-hμman CD3 antibody和Anti-hμman CD28 antibody，其中CD3使用浓度为0.15μg/mL，CD28使用浓度为0.625μg/mL，并放入37℃、5％二氧化碳培养箱中培养；培养4hr后补加完全培养基调整至T细胞密度为4×105个/mL，继续培养。
(4)T细胞的分选与纯化
细胞活化36hr后，混匀取样20μL加入稀释后的抗体10μL染色10min，加入PBS稀释10倍后使用流式细胞仪检测计数，记录CD3+、CD4+、CD8+T细胞密度，观察CD69和CD25分子表达情况；记录细胞体积，确认细胞量；将细胞悬液转移至离心管300g、5min离心，弃上清收集下层细胞；加入MACS Buffer洗涤，再次离心后收集下层细胞，离心条件同上，并用适量MACSBuffer重悬细胞；根据细胞量计算磁珠加入量，每1×106个CD4+T细胞加入4μL CD4+磁珠，每1×106个CD8+T细胞加入8μL CD8+磁珠；磁珠加入后，混匀，室温条件下避光孵育20min，孵育完成后，加入MACS Buffer洗涤，300g、5min离心后弃上清，用适量MACS Buffer重悬；将LS分选柱放在MACS磁力分选架上，用1mLBuffer润洗柱子，润洗完成后，将细胞悬液过柱，持续加入Buffer 9mL过柱；将LS柱从MACS磁力架上取出，并加入5mLBuffer，将截留在LS柱子上的细胞冲出；最后将细胞悬液混匀后取样染色计数，记录CD3+、CD4+、CD8+T细胞密度，并计算分选回收率及纯度。
(5)CD22 CAR-T细胞的制备
慢病毒转导T细胞：将细胞密度调整为约400个/μL铺板，每孔体积500μL，并根据实际T细胞数量，按照MOI＝25加入各组CD22 CAR慢病毒液，阴性对照组(UnT)为未加慢病毒转导T细胞，于37℃、5％二氧化碳培养箱中培养3天后检测T细胞上CD22 CAR多肽分子的表达率(组别为m971、S1、S4、S9、S27、S28、S35、S36、S41、S43)，结果见图1A和1B。
每3天观察CD22 CAR-T细胞扩增情况并补加新鲜培养液，持续培养11天后收获，用于后续体外杀伤实验。
实施例3.CD22 CAR-T细胞的肿瘤细胞杀伤效果验证
(1)CD22抗原在靶细胞表面的表达情况测定
分别使用Raji细胞(购自ATCC，CCL-86)、Namalwa细胞(购自ATCC，CRL-1432)和K562细胞(购自ATCC，CRL-3344)作为靶细胞，通过流式细胞仪检测这些细胞表面CD22抗原的表达情况，结果见图2。结果显示Raji细胞为CD22高表达，Namalwa细胞为CD22中等表达，K562细胞为CD22阴性细胞，最后选取Raji细胞与Namalwa细胞作为体外杀伤实验的靶细胞。
(2)CD22 CAR-T细胞的体外杀伤效果测定
在24孔板中，加入各组CAR-T细胞(组别为m971、S1、S4、S9、S27、S28、S35、S36、S41、S43，2×105个/孔，其中各组CD4+与CD8+T细胞比例相同)，按效靶比(E:T)＝1:1或1:3添加对应细胞量的Raji细胞，阴性对照组(UnT)也按相应效靶比加入相同量的T细胞和靶细胞，并补加培养基至500μL/孔，置于37℃、5％CO2培养箱中培养；共培养18hr和72hr后，分别通过流式细胞仪检测每孔中Raji细胞量，按杀伤率＝靶细胞减少量/靶细胞铺板细胞量×100％，计算D1(18hr)杀伤率和D3(72hr)杀伤率，结果见图3A、3B、4A和4B。
在24孔板中，加入各组CAR-T细胞(组别为m971、S1、S4、S9、S27、S28、S35、S36、S41、S43，2×105个/孔，其中各组CD4+与CD8+T细胞比例相同)，按效靶比(E:T)＝1:3添加对应细胞量的Namalwa细胞，阴性对照组(UnT)也按相应效靶比加入相同量的T细胞和靶细胞，并补加培养基至500μL/孔，置于37℃、5％CO2培养箱中培养；铺板后18hr和72hr分别通过流式细胞仪检测每孔中Namalwa细胞量，按杀伤率＝靶细胞减少量/靶细胞铺板细胞量×100％，计算D1(18hr)杀伤率和D3(72hr)杀伤率，结果见图5A和5B。
(3)CD22 CAR-T细胞的细胞因子释放测定
在体外杀伤实验铺板后18hr，收集各组CAR-T细胞(组别为UnT、m971、S1、S4、S9、S27)与Namalwa细胞共培养液的上清，通过CBA检测手段(CBA检测试剂盒：LEGENDplexTMHuman CD8/NK Panel(13-plex)with V-bottom Plate,Biolegend,Cat.No.741065；LEGENDplexTMHuman Macrophage/Microglia Panel(13-plex)with V-bottom Plate,Biolegend,Cat.No.740503)，检测各组细胞因子Granzyme B、TNF-α、IFN-γ、IL-2的释放情况，结果见图6A、6B、6C和6D。
具体操作步骤如下：
培养液上清收集：收集杀伤实验铺板后18hr的细胞培养液上清50μL，用于后续检测上清中细胞因子分泌量。
Beads准备：将所需Beads恢复至室温后，涡旋2min使Beads充分混匀，根据样本量计算Beads所需量，其中每个样本加入体积为15μL。
Wash Buffer准备：将20x Wash Buffer恢复至室温，使其中盐分充分溶解，用up水将其配成1xWash Buffer备用。
标准品准备：用250μLAssay Buffer溶解标准品，颠倒多次使其充分混匀，室温静止10min,然后移入EP管中；取出25μL标准品于EP管，标记为C7；取7个EP管，分别标记为C6/C5/C4/C3/C2/C1/C0，每个管中加22.5μLAssay Buffer,从C7中取出标准品7.5μL按4倍倍比依次进行梯度稀释，直到稀释到C1为止，C0为Assay Buffer(0pg/ml)。
标准品孔和样品孔准备：配制细胞上清标准曲线孔，在EP管中加入AssaBuffer、标准品、Beads各15μL，混匀；配制样品孔:在EP管中加入Assay Buffer、样品和Beads各15μL，混匀。
捕获Beads与目的分析物的结合：将标准品孔和样品孔在500rpm震荡，避光条件下孵育2hr。
洗涤：将样品于2000g离心5min，弃上清，底部可见Beads；加入200μL 1xWashbuffer到各EP管，短暂涡旋后，2000g离心5min，弃上清。
捕获Beads、目的分析物与生物素化的检测抗体、SA-PE的结合：加入15μL检测抗体到各EP管，吹打混匀，在500rpm震荡，避光条件下孵育1hr；加入15μL链霉亲和素-藻红蛋白(SA-PE)到各管，500rpm震荡，避光条件下孵育0.5hr。
二次洗涤：加入200μL 1xWash buffer到各EP管，短暂涡旋后，2000g离心5min，弃上清。
检测：每管加入200μL 1xWash buffer，涡旋后，进行流式细胞仪检测，流式细胞仪勾选FSC、SSC、APC、PE通道。
检测结果：将流式细胞仪检测的文件导出为FSC格式进行分析，使用LEGENDplexTM数据分析软件根据已知的标准曲线确定目标细胞因子的浓度。

Claims (22)

1.一种靶向CD22的单域抗体，其特征在于，所述抗体包含CDR1、CDR2和CDR3；
其中所述CDR1包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，其中所述CDR2包含如SEQ IDNO:20所示的氨基酸序列，其中所述CDR3包含如SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列；
其中所述CDR1包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，其中所述CDR2包含如SEQ IDNO:20所示的氨基酸序列，其中所述CDR3包含如SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列；
其中所述CDR1包含如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，其中所述CDR2包含如SEQ IDNO:20所示的氨基酸序列，其中所述CDR3包含如SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列；
其中所述CDR1包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，其中所述CDR2包含如SEQ IDNO:20所示的氨基酸序列，其中所述CDR3包含如SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列；
其中所述CDR1包含如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，其中所述CDR2包含如SEQ IDNO:22所示的氨基酸序列，其中所述CDR3包含如SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列；
其中所述CDR1包含如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，其中所述CDR2包含如SEQ IDNO:23所示的氨基酸序列，其中所述CDR3包含如SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列；
其中所述CDR1包含如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，其中所述CDR2包含如SEQIDNO:26所示的氨基酸序列，其中所述CDR3包含如SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列；
其中所述CDR1包含如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列，其中所述CDR2包含如SEQIDNO:27所示的氨基酸序列，其中所述CDR3包含如SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列；
其中所述CDR1包含如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列，其中所述CDR2包含如SEQIDNO:28所示的氨基酸序列，其中所述CDR3包含如SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列；
其中所述CDR1包含如SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列，其中所述CDR2包含如SEQIDNO:29所示的氨基酸序列，其中所述CDR3包含如SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列；
其中所述CDR1包含如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列，其中所述CDR2包含如SEQIDNO:30所示的氨基酸序列，其中所述CDR3包含如SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列；
其中所述CDR1包含如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列，其中所述CDR2包含如SEQIDNO:30所示的氨基酸序列，其中所述CDR3包含如SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列；
其中所述CDR1包含如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列，其中所述CDR2包含如SEQIDNO:31所示的氨基酸序列，其中所述CDR3包含如SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列；
其中所述CDR1包含如SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列，其中所述CDR2包含如SEQIDNO:31所示的氨基酸序列，其中所述CDR3包含如SEQ ID NO:59所示的氨基酸序列；
其中所述CDR1包含如SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列，其中所述CDR2包含如SEQIDNO:32所示的氨基酸序列，其中所述CDR3包含如SEQ ID NO:60所示的氨基酸序列；
其中所述CDR1包含如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列，其中所述CDR2包含如SEQIDNO:33所示的氨基酸序列，其中所述CDR3包含如SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列；或
其中所述CDR1包含如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列，其中所述CDR2包含如SEQIDNO:34所示的氨基酸序列，其中所述CDR3包含如SEQ ID NO:62所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的单域抗体，其特征在于，其中所述CDR1、CDR2和CDR3的确定是根据IMGT编号方案、Kabat编号方案、AbM编号方案、Chothia编号方案或Contact编号方案。
3.根据权利要求1或2所述的单域抗体，其特征在于，所述抗体进一步包含FR1、FR2、FR3和FR4；
其中所述FR1包含如SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列，其中所述FR2包含如SEQ IDNO:73所示的氨基酸序列，其中所述FR3包含如SEQ ID NO:93所示的氨基酸序列，其中所述FR4包含如SEQ ID NO:119所示的氨基酸序列；
其中所述FR1包含如SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列，其中所述FR2包含如SEQ IDNO:73所示的氨基酸序列，其中所述FR3包含如SEQ ID NO:97所示的氨基酸序列，其中所述FR4包含如SEQ ID NO:119所示的氨基酸序列；
其中所述FR1包含如SEQ ID NO:65所示的氨基酸序列，其中所述FR2包含如SEQ IDNO:77所示的氨基酸序列，其中所述FR3包含如SEQ ID NO:104所示的氨基酸序列，其中所述FR4包含如SEQ ID NO:119所示的氨基酸序列；
其中所述FR1包含如SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列，其中所述FR2包含如SEQ IDNO:78所示的氨基酸序列，其中所述FR3包含如SEQ ID NO:105所示的氨基酸序列，其中所述FR4包含如SEQ ID NO:119所示的氨基酸序列；
其中所述FR1包含如SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列，其中所述FR2包含如SEQ IDNO:80所示的氨基酸序列，其中所述FR3包含如SEQ ID NO:108所示的氨基酸序列，其中所述FR4包含如SEQ ID NO:119所示的氨基酸序列；
其中所述FR1包含如SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列，其中所述FR2包含如SEQ IDNO:81所示的氨基酸序列，其中所述FR3包含如SEQ ID NO:109所示的氨基酸序列，其中所述FR4包含如SEQ ID NO:119所示的氨基酸序列；
其中所述FR1包含如SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列，其中所述FR2包含如SEQ IDNO:82所示的氨基酸序列，其中所述FR3包含如SEQ ID NO:110所示的氨基酸序列，其中所述FR4包含如SEQ ID NO:119所示的氨基酸序列；
其中所述FR1包含如SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列，其中所述FR2包含如SEQ IDNO:84所示的氨基酸序列，其中所述FR3包含如SEQ ID NO:111所示的氨基酸序列，其中所述FR4包含如SEQ ID NO:119所示的氨基酸序列；
其中所述FR1包含如SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列，其中所述FR2包含如SEQ IDNO:85所示的氨基酸序列，其中所述FR3包含如SEQ ID NO:112所示的氨基酸序列，其中所述FR4包含如SEQ ID NO:119所示的氨基酸序列；
其中所述FR1包含如SEQ ID NO:69所示的氨基酸序列，其中所述FR2包含如SEQ IDNO:85所示的氨基酸序列，其中所述FR3包含如SEQ ID NO:111所示的氨基酸序列，其中所述FR4包含如SEQ ID NO:119所示的氨基酸序列；
其中所述FR1包含如SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列，其中所述FR2包含如SEQ IDNO:87所示的氨基酸序列，其中所述FR3包含如SEQ ID NO:113所示的氨基酸序列，其中所述FR4包含如SEQ ID NO:119所示的氨基酸序列；
其中所述FR1包含如SEQ ID NO:71所示的氨基酸序列，其中所述FR2包含如SEQ IDNO:89所示的氨基酸序列，其中所述FR3包含如SEQ ID NO:115所示的氨基酸序列，其中所述FR4包含如SEQ ID NO:119所示的氨基酸序列；
其中所述FR1包含如SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列，其中所述FR2包含如SEQ IDNO:90所示的氨基酸序列，其中所述FR3包含如SEQ ID NO:116所示的氨基酸序列，其中所述FR4包含如SEQ ID NO:119所示的氨基酸序列；
其中所述FR1包含如SEQ ID NO:72所示的氨基酸序列，其中所述FR2包含如SEQ IDNO:91所示的氨基酸序列，其中所述FR3包含如SEQ ID NO:117所示的氨基酸序列，其中所述FR4包含如SEQ ID NO:119所示的氨基酸序列；或
其中所述FR1包含如SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列，其中所述FR2包含如SEQ IDNO:92所示的氨基酸序列，其中所述FR3包含如SEQ ID NO:118所示的氨基酸序列，其中所述FR4包含如SEQ ID NO:119所示的氨基酸序列。
4.根据权利要求1-3任一项所述的单域抗体，其特征在于，所述抗体包含与SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:125、SEQID NO:126、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:130、SEQ IDNO:131、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:135或SEQ ID NO:136所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相似度的氨基酸序列。
5.一种嵌合抗原受体，其特征在于，包含：
(a)细胞外抗原结合结构域，
(b)跨膜结构域，和
(c)细胞内信号转导结构域；
其中，所述细胞外抗原结合结构域包含如权利要求1-4所述靶向CD22的单域抗体。
6.根据权利要求5所述的嵌合抗原受体，其特征在于，其中所述跨膜结构域源自于CD8α、CD4、CD28、CD137、CD80、CD86、CD152或PD-1。
7.根据权利要求6所述的嵌合抗原受体，其特征在于，其中所述跨膜结构域包含如SEQIDNO:140所示的氨基酸序列。
8.根据权利要求5-7任一项所述的嵌合抗原受体，其特征在于，其中所述细胞内信号转导结构域源自于CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD22、CD79a、CD79b、CD66d、FcRγ、FcRβ。
9.根据权利要求8所述的嵌合抗原受体，其特征在于，其中所述细胞内信号转导结构域包含如SEQ ID NO:142所示的氨基酸序列。
10.根据权利要求8或9所述的嵌合抗原受体，其特征在于，其中所述细胞内信号转导结构域进一步包含共刺激信号结构域，其中所述共刺激信号结构域源自于CD137、CD27、CD28、ICOS、OX40、CD30、CD40、CD3、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83配体以及它们的组合。
11.根据权利要求10所述的嵌合抗原受体，其特征在于，其中所述共刺激信号结构域包含如SEQ ID NO:141所示的氨基酸序列。
12.根据权利要求5-11任一项所述的嵌合抗原受体，其特征在于，进一步包含位于细胞外抗原结合结构域C端和跨膜结构域N端之间的铰链区，其中所述铰链区源自于CD8α、CD28、IgG1或IgG4。
13.根据权利要求12所述的嵌合抗原受体，其特征在于，其中所述铰链区包含如SEQIDNO:139所示的氨基酸序列。
14.根据权利要求5-13任一项所述的嵌合抗原受体，其特征在于，进一步包含位于嵌合抗原受体多肽N端的信号肽，其中所述信号肽源自于HLA-A、CD8α、CD33、Igκ、IL-2、GM-CSFRα。
15.根据权利要求14所述的嵌合抗原受体，其特征在于，其中所述信号肽包含如SEQIDNO:138所示的氨基酸序列。
16.一种嵌合抗原受体，其特征在于，包含与SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:144、SEQ IDNO:145、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:151、SEQ ID NO:152、SEQ ID NO:153、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:155、SEQIDNO:156、SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:158或SEQ ID NO:159所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相似度的氨基酸序列。
17.一种核酸，其特征在于，包含编码如权利要求5-16任一项所述的嵌合抗原受体的核酸序列。
18.一种载体，其特征在于，包含如权利要求17所述的核酸。
19.一种工程化的免疫效应细胞，其特征在于，包含如权利要求5-16任一项所述的嵌合抗原受体、权利要求17所述的核酸、或权利要求18所述的载体。
20.根据权利要求19所述的工程化的免疫效应细胞，其特征在于，所述免疫效应细胞选自T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞、树突状细胞、诱导性多能干细胞。
21.一种药物组合物，其特征在于，包含如权利要求1-4任一项所述靶向CD22的单域抗体、权利要求19或20所述工程化的免疫效应细胞以及药学上可接受的载体或赋形剂。
22.一种如权利要求1-4任一项所述靶向CD22的单域抗体、权利要求19或20所述工程化的免疫效应细胞、或权利要求21所述的药物组合物在制备治疗B细胞相关恶性肿瘤、B细胞相关自身免疫性疾病和/或炎性疾病药物中的用途。
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