CN117561281A - 治疗肿瘤的方法和组合物 - Google Patents

Abstract

一种给予患有或怀疑患CLD18阳性胆道肿瘤个体的免疫效应细胞的治疗方法，包括给予个体特异性识别CLD18.2的免疫效应细胞。先进行预处理后再给予本申请的免疫效应细胞时，能够显著提高免疫效应细胞的肿瘤治疗疗效。

Description

治疗肿瘤的方法和组合物

优先权信息

本申请要求：于2021年6月23日提交的中国专利申请CN202110701218.X、于2022年4月8日提交的中国专利申请CN202210378612.9，它们的全部内容通过整体引用并入本文。

同时提交的序列表文件

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技术领域

本申请属于免疫治疗领域；具体地，涉及靶向识别肿瘤抗原、引发免疫效应细胞活化且发挥抗肿瘤效应的免疫细胞治疗。

背景技术

目前已发表临床研究结果显示，既往接受过一线标准治疗的胆道肿瘤的无进展生存期均低于约6个月。因此，急需开发新的治疗胆道肿瘤或延长患者生存期的治疗手段。

发明内容

本申请提供了一种治疗患有或怀疑患CLD18阳性胆道肿瘤受试者的方法，包括向所述受试者给予靶向CLD18的外源受体的细胞。

本申请还提供了一种靶向CLD18的外源受体的细胞用于制备治疗患有或怀疑患CLD18阳性胆道肿瘤受试者的药物的用途。

本申请还提供一种表达靶向CLD18的外源受体的细胞和化学药物或其他生物药物或放疗用于制备治疗患有或怀疑患CLD18阳性胆道肿瘤受试者的药物的用途。

本申请还提供了一种靶向CLD18的外源受体的细胞用于治疗患有或怀疑患CLD18阳性胆道肿瘤受试者的用途。

本申请还提供了一种表达靶向CLD18的外源受体的细胞和化学药物或其他生物药物或放疗用于治疗患有或怀疑患CLD18阳性胆道肿瘤受试者的用途。

在一优选例中，所述CLD18为CLD18.2。

在一优选例中，所述胆道肿瘤包括胆囊癌和胆管癌。

在一优选例中，所述细胞包含免疫效应细胞。

在一优选例中，所述免疫效应细胞选自T细胞、NK细胞、NKT细胞、肥大细胞、巨噬细胞、树突细胞、CIK细胞、干细胞衍生的免疫效应细胞或其组合。

在一优选例中，所述免疫效应细胞来源于天然的T细胞和/或经多能干细胞诱导产生的T细胞。

在一优选例中，所述免疫效应细胞为自体或同种异体T细胞、或原代T细胞。

在一优选例中，所述T细胞包含记忆性干细胞样T细胞(Tscm细胞)、中心记忆T细胞(Tcm)、效应性T细胞(Tef)、调节性T细胞(Tregs)，效应记忆T细胞(Tem)、γδT细胞、αβT细胞或其组合。

在一优选例中，所述外源受体选自嵌合抗原受体(CAR)、T细胞受体(TCR)、T细胞融合蛋白(TFP)、T细胞抗原耦合器(TAC)、抗体-TCR嵌合物或其组合；所述外源受体的抗原结合域特异性结合CLD18.2。

在一优选例中，所述嵌合抗原受体包括：

(i)特异性结合CLD18.2的抗体、CD8或CD28的跨膜区和CD3ζ胞内域；

(ii)特异性结合CLD18.2的抗体、CD8或CD28的跨膜区、CD137胞内域和CD3ζ胞内域；

(iii)特异性结合CLD18.2的抗体、CD28或CD8的跨膜区、CD28胞内域和CD3ζ胞内域；或

(iv)特异性结合CLD18.2的抗体、CD8或CD28的跨膜区、CD28胞内域、CD137胞内域和CD3ζ胞内域。

在一优选例中，给予所述受试者至少一个周期的所述细胞进行治疗；优选的，给予受试者1-3个周期的所述细胞进行治疗。

在一优选例中，每个周期给予的细胞治疗产品中细胞的剂量不超过约2ⅹ10 ⁹个细胞/kg受试者体重、2ⅹ10 ⁸个细胞/kg受试者体重、或2ⅹ10 ⁷个细胞/kg受试者体重；或细胞治疗产品中细胞剂量不超过约1ⅹ10 ¹¹个细胞/受试者、1ⅹ10 ¹⁰个细胞/受试者、5ⅹ10 ⁹个细胞/受试者、2ⅹ10 ⁹个细胞/受试者或1ⅹ10 ⁹个细胞/受试者。

在一优选例中，每个周期给予的细胞治疗产品中细胞的剂量为约1ⅹ10 ⁵个细胞/kg受试者体重至2ⅹ10 ⁷个细胞/kg受试者体重，或约1ⅹ10 ⁶个细胞/kg受试者体重至2ⅹ10 ⁷个细胞/kg受试者体重；或者

每个周期给予的细胞治疗产品中细胞剂量为约1ⅹ10 ⁷个细胞至5ⅹ10 ⁹个细胞/受试者、约1ⅹ10 ⁷个细胞至2ⅹ10 ⁹个细胞/受试者、或约1ⅹ10 ⁷个细胞至1ⅹ10 ⁹个细胞/受试者；或者

每个周期给予的细胞治疗产品中细胞剂量为约1ⅹ10 ⁸个细胞至5ⅹ10 ⁹个细胞/受试者、约1ⅹ10 ⁸个细胞至2ⅹ10 ⁹个细胞/受试者、或约1ⅹ10 ⁸个细胞至1ⅹ10 ⁹个细胞/；或者

每个周期给予的细胞治疗产品中细胞剂量为约2.5ⅹ10 ⁸个细胞至5ⅹ10 ⁸个细胞/受试者。

在一优选例中，每个周期给予所述细胞治疗产品之前进行预处理，所述预处理包括给 予所述受试者化学药物、生物药物(其他生物药物，在本文中其他生物药物不同于所述靶向CLD18的外源受体的细胞)、放疗或其组合。

在一优选例中，所述预处理在给予细胞治疗产品前1-8天实施；优选的，在给予细胞治疗产品前2-6天实施；优选地，每种化学药物、生物药物(其他生物药物)、放疗或其组合连续使用不超过4天。

在一优选例中，所述化学药物选自以下任意一种或至少两种：环磷酰胺、氟达拉滨、微管蛋白抑制剂、嘧啶类抗肿瘤药物；或所述化学药物包括环磷酰胺和氟达拉滨；或者所述化学药物包括环磷酰胺、氟达拉滨以及微管蛋白抑制剂。

在一优选例中，所述微管蛋白抑制剂包括紫杉烷类化合物；或所述微管蛋白抑制剂包括紫杉醇、白蛋白结合型紫杉醇、多西他赛；或所述微管蛋白抑制剂为白蛋白结合型紫杉醇。

在一优选例中，氟达拉滨的给予量约为10-50mg/m ²/天、或约15-40mg/m ²/天、或约15-30mg/m ²/天、或约20-30mg/m ²/天；或约25mg/m ²/天、或约为30-60mg/天、或约30-50mg/天、或约35-45mg/天；

环磷酰胺的给予量约为200-400mg/m ²/天、或约200-300mg/m ²/天、或约250mg/m ²/天、或约为300-1000mg/天、或约300-550mg/天、或约300-500mg/天；

紫杉烷类化合物给予量为不高于约300mg/天、或不高于约200mg/天，或约为90-120mg/天。

在一优选例中，所述环磷酰胺给予2-3次；或所述氟达拉滨给予1-2次；或所述紫杉烷类化合物给予一次。

在一优选例中，所述抗原结合域或所述抗体具有：SEQ ID NO：2、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33所示的scFv序列；或

所述抗原结合域或所述抗体具有SEQ ID NO：14所示的HCDR1、SEQ ID NO：15所示的HCDR2、SEQ ID NO：16所示的HCDR3、SEQ ID NO：17所示的LCDR1、SEQ ID NO：18所示的LCDR2、SEQ ID NO：19所示的LCDR3；或

所述抗原结合域或所述抗体具有SEQ ID NO：10所示的重链可变区，SEQ ID NO：12所示的轻链可变区。

在一优选例中，所述的嵌合抗原受体具有SEQ ID NO：2、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33所示的scFv序列分别与SEQ ID NO：34、35或36顺序连接的序列；或所述的嵌合抗原受体具有SEQ ID NO：37、38或39所示的核苷酸序列。

在一优选例中，在每个周期给予细胞治疗产品之前，对所述受试者的指示CRS的细胞因子、指示神经毒性的细胞因子、指示肿瘤负荷的指标、和/或指示宿主抗-CAR免疫应答的因子的血清水平进行评价。

在一优选例中，在给予细胞治疗产品治疗后，所述受试者没有显示严重CRS，或没有显示超过3级的神经毒性。

在一优选例中，待在先周期的所述细胞治疗后在体内检测不到后，再给予后续周期的治疗。

在一优选例中，所述的后续周期给予的所述细胞剂量为足以稳定或降低所述受试者的肿瘤负荷的细胞数量。

在一优选例中，每个周期的所述细胞分为1-5次给予，优选的，分为1-3次给予。

在一优选例中，给予在后周期的治疗时，所述受试者具有以下任一特征：

(i)细胞因子释放综合征(CRS)相关的细胞因子在受试者中血清中的峰值水平比在先周期中细胞治疗产品给予后的峰值水平小；

(ii)没有显示出3级或更高的神经毒性；

(iii)CRS水平与给予在先周期的细胞治疗产品后的CRS水平相比，呈现降低；

(iv)所述受试者没有显示出针对细胞治疗产品的可检测的体液或细胞介导的免疫应答。

在一优选例中，所述(i)中，细胞因子的水平与给予在先周期的细胞治疗产品后的细胞因子的的峰值水平相比，降低至少50％，优选的，降低至少20％，更优的，降低至少5％。

在一优选例中，所述CRS水平与给予在先周期的细胞治疗产品之前的CRS水平相当。

在一优选例中，每个周期给予所述细胞之前进行预处理，所述预处理包括给予所述受试者化学药物和/或放疗。

在一优选例中，所述放疗包括全身辐射治疗或局部辐射治疗。

在一优选例中，所述预处理在给予所述细胞前1-8天实施；优选的，在给予所述细胞前2-6天实施。

在一优选例中，所述化学药物选自以下任意一种或至少两种：环磷酰胺、氟达拉滨、微管蛋白抑制剂、嘧啶类抗肿瘤药物。

在一优选例中，所述化学药物为环磷酰胺和氟达拉滨；或者环磷酰胺、氟达拉滨以及微管蛋白抑制剂。

在一优选例中，所述微管蛋白抑制剂是紫杉烷类化合物；

优选的，所述紫杉烷类化合物选自紫杉醇、白蛋白结合型紫杉醇、多西他赛；

更优选的，所述紫杉烷类化合物为白蛋白结合型紫杉醇。

在一优选例中，所述嘧啶类抗肿瘤药物选自5-氟尿嘧啶、双呋氟尿嘧啶、卡莫氟、去氧氟尿苷、卡培他滨。

在一优选例中，每种化学药物连续使用不超过4天。

在一优选例中，所述环磷酰胺给予2-3次；或所述氟达拉滨给予1-2次。

在一优选例中，所述紫杉烷类化合物给予一次。

应理解，在本申请范围内中，本申请的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体 描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1.CAR-T细胞的细胞毒性测定；

图2.CAR-T细胞体内杀伤实验：图2A、2B为肿瘤体积、肿瘤重量测定。

具体实施方式

发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现经表达CLDN18.2-CAR的免疫效应细胞(例如，T细胞)及其组合物用于治疗胆道肿瘤(包括胆管癌、胆囊癌)的受试者的方法和用途。在此基础上完成了本申请。在一些方面，与现有技术相比，该方法、免疫效应细胞和组合物提供或实现改善的或更持久的应答或功效和/或降低的毒性风险或其他副作用。在一实例中，所述方法通过给予指定或相对数量的细胞，治疗特定受试者群体，显著提高抗胆道肿瘤疗效。

目前已发表临床研究结果显示，既往接受过一线标准治疗的胆道肿瘤的无进展生存期均低于约6个月(1.8-5.6个月)。本申请针对胆囊癌受试者，施用CAR-T细胞治疗，显示了更长的无进展生存期和总生存期，使受试者获得显著临床受益：1例胆囊癌受试者在CAR-T细胞治疗后达到PR(partial response，部分缓解)，PFS(progression-free survival，无进展生存期)为4.2个月，OS(Overall Survival，总生存期)约10个月；1例胆囊癌受试者在CAR-T细胞治疗后达到SD(stable disease，病情稳定，处于平稳状态)，PFS已达9.3个月，并且仍在持续稳定期；1例胆管癌受试者在CAR-T细胞治疗后达到SD，PFS已达7.5个月，并且仍在持续稳定期。

除非另外定义，本文使用的所有专业术语、符号和其它技术和科学术语或专有词汇旨在具有本申请所属领域技术人员通常所理解的相同含义。在一些情况中，本文出于阐明和/或便于引用的目的对具有所常规理解的含义的术语加以进一步限定，本文中包括的此类进一步限定不应理解为表示与本领域常规理解的有实质上的差异。

本申请中提及的所有出版物，包括专利文件、学术论文和数据库，均可独立地通过引用其全文纳入本文。如果本文所示的定义与通过引用纳入本文的专利、公开申请和其它出版物中所示的定义不同或有其它情况下不一致，以本文所示的定义为主。

1.定义

如本文所用，“约”可表示取决于具体情况并且由本领域技术人员已知或可知的，或表示在给定值的至多约±1％、±2％、±3％、±4％、±5％、±6％、±7％、±8％、±9％、±10％、±11％、±12％、±13％、±14％、±15％、±16％、±17％、±18％、±19％、±20％、±25％、±30％范围内变化。即“约”表示的范围涵盖给定值±1％、给定值±2％、给定值±3％、给定值±4％、给定值±5％、给定值±6％、给定值±7％、给定值±8％、给定值±9％、给定值±10％、给定值 ±11％、给定值±12％、给定值±13％、给定值±14％、给定值±15％、给定值±16％、给定值±17％、给定值±18％、给定值±19％、给定值±20％、给定值±25％、给定值±30％。可替代的，特别是关于生物系统或方法，该术语可指在数值的一个数量级内，例如在一个值的约5倍之内或在约2倍之内。

范围：范围形式的描述仅仅为方便和简洁起见，而不应当被看作是对本申请的范围不可改变的限制。因此，范围的描述应当被认为特别地公开了所有可能的子范围以及该范围内的单独数值。

在描述氨基酸或者核酸序列时，本申请中“具有”特定序列应当被理解为涵盖了特定序列的变体。本申请中所述氨基酸或者核酸序列具有某特定序列是指所述氨基酸或者核酸序列与所述特定序列具有超过70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或者99％的序列同一性。序列同一性可以通过序列分析软件(例如，BLAST、BESTFIT、GAP、PILEUP/PRETTYBOX等程序)进行测量。这样的软件通过将同源性程度分配给各种取代、缺失和/或其他修饰来匹配相同或相似的序列。保守取代通常包括以下组内的取代：甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸赖氨酸、精氨酸；和苯丙氨酸、酪氨酸。在确定同一性程度的示例性方法中，可以使用BLAST程序，其中e-3和e-100之间的概率得分指示密切相关的序列。

术语“外源”，是指核酸分子或多肽不是内源性存在细胞中的，或表达水平不足以实现过表达时具有的功能；涵盖在细胞中表达的任何重组核酸分子或多肽，例如外源、异源和过表达的核酸分子或多肽。在一实例中，外源受体包括嵌合受体，指用基因重组技术将不同来源的DNA片段或蛋白质相应的cDNA或多肽片段连接而成的融合分子，包括胞外域、跨膜域和胞内域。外源受体包括但不限于：嵌合抗原受体(CAR)、嵌合T细胞受体(TCR)、T细胞抗原耦合器(TAC)、T细胞融合蛋白(TFP)。

术语“CAR”包括胞外抗原结合域、跨膜域和胞内信号传导域。在一实例中，CAR的胞外抗原结合域包含scFv。胞内信号传导域包括刺激性分子和/或共刺激性分子的功能信号传导域；或包括刺激性分子和/或共刺激性分子的全部细胞内部分、或全部天然胞内信号传导域、或其功能片段或衍生物。

术语“T细胞受体(TCR)”介导T细胞对特异性主要组织相容性复合物(MHC)-限制性肽抗原进行识别，包括天然TCR受体和修饰的TCR受体。天然TCR受体，由α、β两条肽链组成，每条肽链又可分为可变区(V区)，恒定区(C区)，跨膜区和胞质区等，其抗原特异性存在于V区。天然TCR改造后获得能特异性结合CLD18.2多肽的修饰TCR受体。本文中修饰TCR受体包括但不限于嵌合T细胞受体(TCR)、T细胞抗原耦合器(TAC)、T细胞融合蛋白(TFP)、抗体-TCR嵌合物。

“特异性结合”是指多肽或其片段识别并结合目的生物分子(例如多肽)但基本上不识别并结合样品中其他分子。结合亲和力可以采用标准结合测定法测定。

术语“抗原结构域”是指特异性结合抗原决定簇的分子，包括免疫球蛋白分子和免疫分子的免疫活性部分，即含有与抗原特异性结合(“免疫反应”)的抗原结合位点的分子。术语“抗体”不仅包括完整的抗体分子，也包括保留抗原结合能力的抗体分子的片段。本申请中术语“抗体”与术语“免疫球蛋白”“抗原结构域”可互换使用。抗体，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、天然抗体、双特异性抗体、嵌合抗体、Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、线性抗体、单链抗体分子(例如scFv)、单域抗体。在一实例中，抗体包括通过二硫键连接的至少两个重(H)链和两个轻(L)链。每条重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。CH有三个结构域CH1、CH2、CH3组成。每条轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)。CL由一个结构域组成。VH和VL可进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，其间散布有更保守的区域，称为框架区(FR)。每个VH和VL均由三个CDR和四个FR组成，从氨基端到羧基端按以下顺序排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。重链和轻链的可变区包括与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(例如，免疫效应细胞)与经典补体系统的第一组分(C1q)。如果抗原结构域以与其它参考抗原(包括多肽或其他物质)结合相比更大亲和力(或称亲合力)结合抗原，则所述抗原结构域与抗原“特异性结合”或与抗原是“免疫反应性的”。

术语“组合物”指两种或更多种物质的混合物。其可以是溶液、悬液、液体、粉末、糊剂、水性、非水性或其任何组合。

术语“激活”和“活化”可互换使用，可以指细胞从静止状态转变为活性状态的过程。该过程可以包括对抗原、迁移和/或功能活性状态的表型或遗传变化的响应。

术语“核酸”或“多核苷酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其聚合物，包括编码目的多肽或其片段的任何核酸分子。所述核酸分子只需要与内源性核酸序列保持基本同一性即可，不需要与内源性核酸序列100％同源性或同一性。与内源性序列具有“基本同一性”的多核苷酸通常能与双链核酸分子的至少一条链杂交。术语“基本同一性”或“基本同源性”，是指与参考氨基酸序列或核酸序列表现出至少约50％同源性或同一性的多肽或核酸分子。

术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用，是指由通过肽键共价连接的氨基酸残基组成的化合物。

2.外源受体

本申请外源受体是指用基因重组技术将不同来源的DNA片段或蛋白质相应的cDNA连接而成的融合分子，包括特异性结合CLD18的胞外域、跨膜域和胞内域；包括但不限于：嵌合抗原受体(CAR)、嵌合T细胞受体(TCR)、T细胞抗原耦合器(TAC)、T细胞融合蛋白(TFP)、抗体-TCR嵌合物。在一实例中，本申请提供特异性结合CLD18.2多肽的外源受体。在一实例中，外源受体结合至CLD18.2多肽的胞外结构域。在一实例中，本申请提供特异性结合CLD18.2多肽的CAR。

CLD18多肽(Claudin 18、密蛋白18、CLDN18)指CLD18基因或编码的蛋白的任何变体、衍生物或同种型，包括剪接变体1(Claudin 18.1、CLD18.1、CLDN18.1)：NP_057453、NM016369，以及剪接变体2(Claudin 18.2、CLD18.2、CLDN18.2)：NP_001002026、NM_001002026。在一实例中，所述CLD18.2多肽为人CLD18.2多肽，包括与SEQ ID NO:9所示序列具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性或同一性的氨基酸序列或其片段，和/或可任选地包括至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代。CLD18.2多肽在若干癌症类型中强烈表达，包括胆囊癌和胆管癌。

2.1 CAR

在一实例中，本申请包括的外源受体是特异性结合CLD18多肽的CAR。在一实例中，CAR特异性结合CLD18.2多肽。在一实例中，CAR特异性结合CLD18.2多肽胞外结构域。在一实例中，CAR多肽的各个结构域处于相同的多肽链中，例如，作为单个多肽链表达。在一些实例中，CAR多肽的各个结构域彼此不邻接，例如，处于不同的多肽链中。

2.1.1抗原结构域

在一实例中，抗原结构域包括抗体。在一实例中，抗原结构域包括scFV。在一实例中，抗原结构域包括抗体重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)；或者包括交联的Fab；或者包括F(ab) ₂。在一实例中，抗原结构域包括抗体VH和VL，形成可变片段(Fv)。

在一实例中，CAR包括与CLD18.2多肽特异性结合的抗体。在一实例中，CAR的抗原结构域包括特异性结合CLD18.2多肽的Fv。在一实例中，CAR的抗原结合域包含：SEQ ID NO：14所示的HCDR1、SEQ ID NO：15所示的HCDR2、SEQ ID NO：16所示的HCDR3、SEQ ID NO：17所示的LCDR1、SEQ ID NO：18所示的LCDR2、SEQ ID NO：19所示的LCDR3。在一实例中，CAR的抗原结合域包含：SEQ ID NO：10所示的VH，SEQ ID NO：12所示的VL。在一实例中，CAR的抗原结合域包含：SEQ ID NO：2、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33所示的scFv序列。

在一个方面，本申请考虑到产生功能上等同的分子的起始抗体(例如，VH或VL)氨基酸序列的修饰。例如，可修饰CAR包括特异性结合CLD18.2多肽的抗原结构域的VH或VL的至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性序列。

在一实例中，可进一步修饰本申请的抗体，使得它们在氨基酸序列上(例如，相对于野生型)有所变化，但在所需活性上没有变化。例如，可对蛋白质进行另外的核苷酸置换，导致“非必需”氨基酸残基处的氨基酸置换。例如，分子中的非必需氨基酸残基可被来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基取代。在另一个实施方案中，氨基酸片段可被结构相似但在顺序和/或组成上与侧链家族成员不同的氨基酸片段取代，例如，可进行保守置换，其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基所取代。

在一个实例中，抗原结构域与跨膜结构域直接连接或通过铰链连接。在一实例中，所述铰链包括CD8铰链，例如，具有SEQ ID NO:3所示序列95-100％同一性的序列。

在一实例中，编码CAR的核酸分子上游包括编码信号肽的多核苷酸。在一个实施方案中，信号肽的序列具有SEQ ID NO:1所示序列。

2.1.2跨膜结构域

跨膜结构域可以将CAR锚定在细胞膜上。本申请CAR分子的跨膜结构域包括选自以下的跨膜结构域:T细胞受体的α、β、或ζ的跨膜区、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD154、KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CD11a、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D和/或NKG2C的跨膜结构域。

在一实例中，CAR包括CD8跨膜区，具有SEQ ID NO:4所示序列95-100％同一性的序列。在一实例中，CAR包括CD28跨膜区，具有SEQ ID NO:5所示序列90-100％同一性的序列。

2.1.3胞内信号结构域

在一实例中，本申请提供的CAR包括胞内信号结构域。在一实例中，胞内信号结构域包括一级信号结构域。在一实例中，胞内信号结构域包括共刺激信号结构域。在一实例中，胞内信号结构域包括一级信号结构域和共刺激信号结构域。

在一实例中，一级信号结构域包括选自CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、FcRγ(FCER1G)、FcRβ(FcεR1b)、CD79a、CD79b、FcγRIIa、DAP10、和DAP12的蛋白质的功能信号结构域。在一实例中，一级信号结构域包括CD3ζ的胞内域，具有SEQ ID NO:8所示序列90-100％同一性的序列。

在一实例中，共刺激信号结构域包括选自如下一种或多种的蛋白质的功能信号结构域:CD27、CD28、CD137、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、特异性结合CD83的配体、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、 TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244,2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、或NKG2D。

在一实例中，共刺激信号结构域包括CD137胞内域，具有SEQ ID NO:6所示序列90-100％同一性的序列。

在一实例中，CAR的胞内信号结构域包括人CD3ζ胞内域。在一实例中，CAR的胞内信号结构域包括人CD3ζ胞内域和CD28胞内域。在一实例中，CAR的胞内信号结构域包括人CD3ζ胞内域和CD137胞内域。在一实例中，CAR的胞内信号结构域包括CD3ζ胞内域、CD28胞内域和CD137胞内域。

本申请考虑到整个CAR分子的修饰，例如，CAR分子的各个结构域的一个或多个氨基酸序列的修饰，以便产生功能上等同的分子。可修饰CAR分子保留起始CAR分子的至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

示例性的外源受体，如包括CAR的序列具有SEQ ID NO：2、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33所示的scFv序列分别与SEQ ID NO：34、35或36顺序连接的序列。示例性，如SEQ ID NO：2所示序列与SEQ ID NO：34所示序列顺序连接，或SEQ ID NO：2所示序列与SEQ ID NO：35所示序列顺序连接，SEQ ID NO：2所示序列与SEQ ID NO：36所示序列顺序连接；如SEQ ID NO：23所示序列与SEQ ID NO：34所示序列顺序连接，或SEQ ID NO：23所示序列与SEQ ID NO：35所示序列顺序连接，SEQ ID NO：23所示序列与SEQ ID NO：36所示序列顺序连接；如SEQ ID NO：24所示序列与SEQ ID NO：34所示序列顺序连接，或SEQ ID NO：24所示序列与SEQ ID NO：35所示序列顺序连接，SEQ ID NO：24所示序列与SEQ ID NO：36所示序列顺序连接；如SEQ ID NO：25所示序列与SEQ ID NO：34所示序列顺序连接，或SEQ ID NO：25所示序列与SEQ ID NO：35所示序列顺序连接，SEQ ID NO：25所示序列与SEQ ID NO：36所示序列顺序连接；如SEQ ID NO：26所示序列与SEQ ID NO：34所示序列顺序连接，或SEQ ID NO：26所示序列与SEQ ID NO：35所示序列顺序连接，SEQ ID NO：26所示序列与SEQ ID NO：36所示序列顺序连接；如SEQ ID NO：27所示序列与SEQ ID NO：34所示序列顺序连接，或SEQ ID NO：27所示序列与SEQ ID NO：35所示序列顺序连接，SEQ ID NO：27所示序列与SEQ ID NO：36所示序列顺序连接；如SEQ ID NO：28所示序列与SEQ ID NO：34所示序列顺序连接，或SEQ ID NO：28所示序列与SEQ ID NO：35所示序列顺序连接，SEQ ID NO：28所示序列与SEQ ID NO：36所示序列顺序连接；如SEQ ID NO：29所示序列与SEQ ID NO：34所示序列顺序连接，或SEQ ID NO：29 所示序列与SEQ ID NO：35所示序列顺序连接，SEQ ID NO：29所示序列与SEQ ID NO：36所示序列顺序连接；如SEQ ID NO：30所示序列与SEQ ID NO：34所示序列顺序连接，或SEQ ID NO：30所示序列与SEQ ID NO：35所示序列顺序连接，SEQ ID NO：30所示序列与SEQ ID NO：36所示序列顺序连接；如SEQ ID NO：31所示序列与SEQ ID NO：34所示序列顺序连接，或SEQ ID NO：31所示序列与SEQ ID NO：35所示序列顺序连接，SEQ ID NO：31所示序列与SEQ ID NO：36所示序列顺序连接；如SEQ ID NO：32所示序列与SEQ ID NO：34所示序列顺序连接，或SEQ ID NO：32所示序列与SEQ ID NO：35所示序列顺序连接，SEQ ID NO：32所示序列与SEQ ID NO：36所示序列顺序连接；如SEQ ID NO：33所示序列与SEQ ID NO：34所示序列顺序连接，或SEQ ID NO：33所示序列与SEQ ID NO：35所示序列顺序连接，SEQ ID NO：33所示序列与SEQ ID NO：36所示序列顺序连接。或所述的嵌合抗原受体具有SEQ ID NO：37、38或39所示的核苷酸序列。

2.2修饰TCR受体

本申请提供修饰TCR受体特异性结合CLD18.2多肽，包括但不限于：嵌合T细胞受体、T细胞融合蛋白(TFP)、T细胞抗原耦合器(TAC)、抗体-TCR嵌合物。在一实例中，修饰TCR受体的抗原结合域，具有SEQ ID NO：2、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33所示序列的至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。

3.宿主细胞

本申请提供的宿主细胞是包括表达特异性结合CLD18.2多肽的外源受体的细胞。外源受体与CLD18.2多肽结合后能激活所述细胞。在一实例中，宿主细胞包括干细胞。干细胞包括人多能干细胞(包括人诱导多能干细胞(iPSC)和人胚胎干细胞)。在一实例中，宿主细胞包括免疫效应细胞(也称为免疫细胞)。在一实例中，宿主细胞为原代细胞。本申请提供包含所述宿主细胞的细胞治疗产品。宿主细胞可以指人或非人的、来源于动物的细胞。

本申请的免疫效应细胞包括淋巴谱系的细胞。包括B、T和自然杀伤(NK)细胞的淋巴谱系提供抗体的产生、细胞免疫系统的调节、血液中外源试剂的检测、宿主外源细胞的检测等。淋巴谱系的免疫效应细胞的非限制性实例包括T细胞、自然杀伤T(NKT)细胞及其前体，包括胚胎干细胞和多能干细胞(例如，分化成淋巴样细胞的干细胞或多能干细胞)。T细胞包括在胸腺中成熟的淋巴细胞，主要负责细胞介导的免疫。T细胞参与适应性免疫系统。T细胞包括任何类型的T细胞，包括但不限于辅助T细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞(包括中央记忆T细胞、干细胞样记忆T细胞(或干样记忆T细胞)和两种效应记忆T细胞：例如TEM细胞和TEMRA细胞)、调节性T细胞(也称为抑制性T细胞)、自然杀伤T细胞、粘膜相关性不变T细胞、γδT细胞或αβT细胞。细胞毒性T细胞(CTL或杀伤性T细胞)是能够诱导被感染的体细胞或肿瘤细胞死亡的T淋巴细胞。在一实例中，本 申请的细胞选自：T细胞、NK细胞、细胞毒性T细胞、NKT细胞、巨噬细胞、CIK细胞、以及干细胞衍生的免疫效应细胞或其组合。在一实例中，免疫效应细胞是T细胞。在一实例中，T细胞包括CD4+T细胞和/或CD8+T细胞。在一实例中，免疫效应细胞包括CD3+T细胞。在一实例中，本申请组合物中的细胞包括由PBMC细胞经CD3磁珠刺激后收集的细胞群。在一实例中，免疫效应细胞选自T细胞、NK细胞、NKT细胞、肥大细胞、巨噬细胞、树突细胞、CIK细胞、干细胞衍生的免疫效应细胞或其组合。在一实例中，免疫效应细胞来源于天然的T细胞和/或经多能干细胞诱导产生的T细胞。在一实例中，免疫效应细胞为自体或同种异体T细胞、或原代T细胞。在一实例中，所述T细胞包含记忆性干细胞样T细胞(Tscm细胞)、中心记忆T细胞(Tcm)、效应性T细胞(Tef)、调节性T细胞(Tregs)，效应记忆T细胞(Tem)、γδT细胞、αβT细胞或其组合。

本申请的细胞(例如，T细胞)可以是自体的、非自体的(例如，同种异体的)、或者是体外从工程化的祖细胞或干细胞衍生而来。可从许多来源获得，包括外周血单个核细胞(PBMC)、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。

在本申请的某些方面，可使用本领域技术人员已知的任意数量的技术如Ficoll ^TM分离技术从收集自受试者的血液样品中获得T细胞。在一个优选的方面，通过单采血液成分术获得来自个体的循环血液的细胞。单采血液成分术产物通常含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核白细胞、红细胞和血小板。在一个方面，可洗涤通过单采血液成分术收集的细胞以去除血浆部分并将细胞置于适当的缓冲液或培养基中以供后续处理步骤。在本申请的背景下还可使用多轮选择。在某些方面，可能需要进行选择程序并在激活和扩充过程中使用“未选择的”细胞。“未选择的”细胞也可以经受其他轮选择。

本申请的细胞能够调节肿瘤微环境。

未纯化的CTL来源可以是本领域已知的任何来源，例如骨髓、胎儿、新生儿或成年或其它造血细胞来源，例如胎儿肝、外周血或脐带血。可以采用各种技术来分离细胞。例如，阴性选择法可以最初去除非CTL。mAb对于鉴定与特定细胞谱系和/或阳性和阴性选择的分化阶段相关的标志物特别有用。

最初可以通过相对粗略的分离除去大部分末端分化的细胞。例如，最初可以使用磁珠分离来去除大量不相关的细胞。在某些实施方式中，在分离细胞之前将去除总造血细胞的至少约80％，通常至少约70％。

分离的程序包括但不限于密度梯度离心；重沉(resetting)；偶联至改变细胞密度的颗粒；用抗体包被的磁珠进行磁分离；亲和色谱；与mAb结合或结合使用的细胞毒性剂，包括但不限于补体和细胞毒素；并用附着在固体基质(例如板、芯片、淘析)上的抗体淘选或任何其它方便的技术。

分离和分析的技术包括但不限于流式细胞术，其可以具有不同的复杂程度，例如多个 颜色通道、低角度和钝角光散射检测通道、阻抗通道。

通过使用与死细胞相关的染料，例如碘化丙啶(PI)，可以针对死细胞选择细胞。在某些实施方式中，将细胞收集在包括2％胎牛血清(FCS)或0.2％牛血清白蛋白(BSA)的培养基或任何其它合适的例如无菌等渗培养基中。

4.载体

本文中载体包含分离的核酸并可用于将分离的核酸递送至细胞内部的组合物，包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两亲化合物相关的多核苷酸、质粒和病毒。载体包括自主复制的质粒或病毒。载体还包括促进核酸转移到细胞中的非质粒和非病毒化合物，例如聚赖氨酸化合物、脂质体等。

对本申请所述宿主细胞的遗传修饰可以通过用重组核酸分子转导基本上均质的细胞群来完成。在一实例中，病毒载体(AAV、逆转录病毒或慢病毒)用于将核酸分子引入细胞。例如，可以将编码外源受体(例如CAR)的多核苷酸克隆到逆转录病毒载体。也可以使用非病毒载体。转导可以使用任何合适的病毒载体或非病毒递送系统。可以在单个多顺反子表达盒、单个载体的多个表达盒或多个载体中用辅助分子(例如细胞因子)构建CAR。产生多顺反子表达盒的元件的实例包括但不限于各种病毒和非病毒内部核糖体进入位点(IRES，例如，FGF-1IRES、FGF-2IRES、VEGF IRES、IGF-II IRES、NF-κB IRES、RUNX1IRES、p53IRES、甲型肝炎IRES、丙型肝炎IRES、瘟病毒IRES、无杆状病毒IRES、小核糖核酸病毒IRES、脊髓灰质炎病毒IRES和脑心肌炎病毒IRES)和可切割的接头(例如2A肽，例如P2A、T2A、E2A和F2A肽)。

可以使用的其它病毒载体包括，例如，腺病毒、慢病毒和与腺相关的病毒载体、牛痘病毒、牛乳头瘤病毒或疱疹病毒，例如爱泼斯坦-巴尔病毒。

非病毒方法也可以用于免疫效应细胞的遗传修饰。例如，可以通过在脂质转染，脱唾液酸血清类粘蛋白-聚赖氨酸偶联，或手术条件下的微注射将核酸分子引入免疫效应细胞中。其它非病毒的基因转移方法包括使用脂质体、磷酸钙、DEAE葡聚糖、电穿孔和原生质体融合的体外转染。也可以先将核酸分子转移到可离体培养的细胞类型(例如，自体或同种异体原代细胞或其后代)中，再将经所述核酸分子修饰后的细胞(或其后代)注射到受试者目标组织中或全身注射。

5.给药

本申请组合物包括所述宿主细胞或所述细胞治疗产品。在一实例中，组合物系统地或直接提供给受试者，以诱导和/或增强对CLD18.2多肽的免疫应答和/或治疗和/或预防胆道肿瘤。在一实例中，将组合物直接注射到目的器官(例如，受肿瘤影响的器官)中。或者，例如通过向循环系统(例如，静脉、肿瘤脉管系统)给药，将组合物间接地提供给目的器官。可以在施用之前、同时或之后提供扩增和分化剂，以增加体外或体内T细胞、NKT细胞或CTL细胞的扩增。

本申请的组合物中的免疫效应细胞可以包括纯化的细胞群。本领域技术人员可以使用 各种众所周知的方法，例如荧光激活细胞分选(FACS)，容易地确定群体中本申请的免疫效应细胞的百分比。在包括本申请的免疫效应细胞的群体中，纯度的合适范围是约50％至约55％、约5％至约60％、以及约65％至约70％。在一实例中，纯度为约70％至约75％、约75％至约80％或约80％至约85％。在一实例中，纯度为约85％至约90％，约90％至约95％以及约95％至约100％。可以通过注射、导管等引入细胞。

本申请的组合物可以是包括本申请的免疫效应细胞或其祖细胞和药学上可接受的载体的药物组合物。给药可以是自体的或异体的。例如，可以从一个受试者获得免疫效应细胞或祖细胞，并将其施用于相同受试者或不同的相容受试者。外周血来源的免疫效应细胞或其后代(例如，体内、离体或体外来源)可通过局部注射施用，包括导管给药、全身注射、局部注射、静脉内注射或肠胃外给药。当施用本申请的组合物时，可以将其配制成单位剂量可注射形式(溶液剂、悬浮剂、乳剂等)。

6.剂型

包括本申请的组合物以无菌液体制剂的形式提供，例如等渗水溶液剂、悬浮液、乳剂、分散剂或粘性组合物，其可以缓冲至选定的pH。液体制剂通常比凝胶、其它粘性组合物和固体组合物更容易制备。另外，液体组合物在某种程度上更方便施用，尤其是通过注射。另一方面，可以在适当的粘度范围内配制粘性组合物以提供与特定组织的更长的接触时间。液体或粘性组合物可以包括载体，所述载体可以是溶剂或分散介质，其包括例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。

可以通过将本申请组合物中的免疫效应细胞掺入所需量的适当溶剂中，并根据需要掺入不同量的其它成分来制备无菌注射溶液。这样的组合物可以与合适的载体、稀释剂或赋形剂例如无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋糖等混合。组合物也可以冻干。所述组合物可包括辅助物质，例如润湿剂、分散剂或乳化剂(例如，甲基纤维素)、pH缓冲剂、胶凝剂或增粘剂、防腐剂、矫味剂、颜料等，这取决于给药途径和所需制剂。

可以添加增强组合物的稳定性和无菌性的各种添加剂，包括抗微生物防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和缓冲剂。可以通过各种抗细菌和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸等来确保防止微生物的作用。可通过使用延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶来延长可注射药物形式的吸收。然而，所使用的任何媒介物、稀释剂或添加剂将必须与遗传修饰的免疫效应细胞或其祖细胞相容。

该组合物可以是等渗的，即它们可以具有与血液和/或泪液相同的渗透压。组合物的所需等渗性可以使用氯化钠或其它药学上可接受的试剂例如葡萄糖、硼酸、酒石酸钠、丙二醇或其它无机或有机溶质来实现。氯化钠可以特别适用于含有钠离子的缓冲剂。

如果需要，可使用药学上可接受的增稠剂将组合物的粘度保持在选定水平。例如，甲基纤维素容易且经济地获得并且易于使用。其它合适的增稠剂包括，例如，黄原胶、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、卡波姆等。增稠剂的浓度可以取决于选择的试剂。重要的是要使用能够达到所选粘度的用量。显然，合适载体和其它添加剂的选择将取决于确切的给药 途径和特定剂型的性质，例如液体剂型(例如，是否将组合物配制成溶液剂、悬浮液、凝胶剂或其它液体形式，例如定时释放形式或液体填充形式)。

对于所治疗的受试者，要施用的组合物中的细胞数量将有所不同。可以更少的数量施用更有效的细胞。可以根据每个受试者的个体因素，包括其大小、年龄、性别、体重和受试者的状况，来确定有效剂量的精确确定。本领域技术人员从本申请和本领域知识中可以容易地确定剂量。

本领域技术人员可以容易地确定组合物中和在方法中施用的细胞和任选的添加剂、媒介物和/或载体的量。通常，任何添加剂(除一种或多种活性细胞和/或一种或多种试剂外)在磷酸盐缓冲盐水中的存在量为0.001％至50％(重量)溶液，并且活性成分按微克至毫克的顺序存在，例如约0.0001wt％至约5wt％、约0.0001wt％至约1wt％、约0.0001wt％至约0.05wt％或约0.001wt％至约20wt％、约0.01wt％至约10wt％或约0.05wt％至约5wt％。对于要施用于动物或人的任何组合物，可以确定以下结果：毒性，例如通过在合适的动物模型例如啮齿类动物如小鼠中确定致死剂量(LD)和LD50；组合物的剂量，其中的组分浓度和施用组合物的时间，引起合适的反应。

7.治疗方法

本申请提供一种治疗患有或怀疑患CLD18阳性胆道肿瘤受试者的方法。胆道肿瘤包括胆囊癌和胆管癌。在一实例中，本方法治疗胆道肿瘤细胞的CLD18.2多肽呈“阳性”的受试者，如通过免疫学检测(例如流式细胞术、免疫组化等)胆道肿瘤细胞的CLD18.2多肽的表达水平显著高于采用同种型匹配的对照，和/或基本相似于已知CLD18.2多肽呈阳性的细胞的水平，和/或显著高于已知CLD18.2多肽呈阴性的细胞的水平；所述受试者在给予本方法治疗后能获得临床受益。在一实例中，本方法治疗胆道肿瘤细胞的CLD18.2多肽呈“阴性”的受试者，例如，当通过用特异性地结合CLD18.2多肽的抗体染色，所述染色可被免疫学检测以一定水平检测到，所述水平显著低于采用同种型匹配的对照在其它条件相同的情况下进行相同步骤时检测到的染色的水平，和/或显著低于已知对CLD18.2多肽呈阳性的细胞的水平，和/或基本相似于已知对CLD18.2多肽呈阴性的细胞的水平；所述受试者在给予本方法治疗后能获得临床受益，则该受试者为怀疑患有CLD18.2阳性的胆道肿瘤患者。

临床受益是指受试者对本方法有应答或有治疗效果。本文中“有应答”是指根据实体肿瘤的疗效评价标准1.1版(RECIST1.1)评估为完全缓解CR(Complete Response，所有靶病灶消失，全部病理淋巴结短直径必须减少至<10mm)；或者部分缓解PR：靶病灶直径之和比基线水平减少至少30％；或者疾病稳定(SD):靶病灶减小的程度没达到PR，增加的程度也没达到PD水平，介于两者之间，研究时可以直径之和的最小值作为参考。根据实体肿瘤的疗效评价标准1.1版(RECIST1.1)评估为疾病进展(PD，progressive disease)：以整个实验研究过程中所有测量的靶病灶直径之和的最小值为参照，直径和相对增加至少20％(如果基线测量值最小就以基线值为参照)；除此之外，必须满足直径和的绝对值增加 至少5mm(出现一个或多个新病灶也视为PD)。无进展生存期(PFS)被定义为从本申请治疗方法的第一剂量到疾病进展的第一次出现或由于任何原因的死亡的时间。总生存期(OS)被测量为从本申请治疗方法的第一剂量到由于任何原因引起的死亡的时间，并且将被以与针对PFS描述的方式类似的方式分析。

在一实例中，有应答包括本申请治疗方法处理后出现CR或PR。在一实例中，有应答包括本申请治疗方法处理后出现CR、PR或SD；在一实例中，有应答是指接受本申请治疗方法的受试者能获得明显的临床获益，包括PFS和/或OS明显延长，比如延长2周、3周、4周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月或更长。

在一实例中，给予本申请治疗方法治疗后，疾病负荷约减少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或100％。

在一实例中，通过本申请提供的方法进行的治疗，与其它方法相比，复发的概率降低。例如，在一实例中，治疗后复发或进展的概率小于约80％，小于约70％，小于约60％，小于约50％，小于约40％，小于约30％，小于约20％，小于约10％，小于约9％，小于约8％，小于约7％，小于约6％。

本文中“受试者”与“患者”可以交换使用，是指接受细胞产品治疗的个体，如人或其它动物，通常是人。

本文中“治疗”指在试图改变疾病过程的干预措施，完全或部分减轻或减少疾病或与其相关的症状。所述的治疗效果包括但不限于，预防胆道肿瘤的发生或复发、减轻症状、减少胆道肿瘤的任何直接或间接病理学结果、防止转移、减缓胆道肿瘤进展速率、改善或减轻胆道肿瘤状态，和减轻或改善预后、或延迟胆道肿瘤的发展。所述“延迟胆道肿瘤的发展"表示推迟、阻碍、减缓、减慢、稳定、遏制和/或拖延胆道肿瘤的发展。该延迟可具有不同的时间长度，这取决于疾病史和/或待治疗的个体。本领域技术人员应理解，充分或显著的延迟可涵盖预防(对于未发展胆道肿瘤的个体而言)。

本方法包括给予受试者包含本申请所述宿主细胞、细胞治疗产品或组合物。在一实例中，给予受试者有效量或治疗有效量的包含本申请所述宿主细胞、细胞治疗产品或组合物。

本文中“有效量”或“治疗有效量”是指足以预防或治疗个体胆道肿瘤的剂量。治疗性或预防性使用的有效剂量取决于所治疗胆道肿瘤的阶段和严重程度、受试者的年龄、体重和一般健康状况以及处方医生的判断。剂量的大小还取决于所选择的活性物质、给药方法、给药时间和频率、可能伴随特定活性物给药的不良副作用的存在、性质和程度以及所需的生理效应。根据处方医生或本领域技术人员判断可能需要一个周期轮或多个周期给予本申请所述宿主细胞、细胞治疗产品或组合物。

本文中“肿瘤负荷”，包括肿瘤体积大小或分化程度，或转移类型、阶段，和/或中晚期癌症常见的并发症的出现与消失，例如癌性胸腹水，和/或肿瘤标志物出现或表达水平的变化，和/或受试者发生毒性结果的可能性或发生率，例如CRS，巨噬细胞活化综合征， 肿瘤溶解综合征，神经毒性和/或针对给予的细胞和/或嵌合抗原受体的宿主免疫应答。在一实例中，肿瘤的大小通过PET(正电子发射型计算机断层显像)和CT(计算机X线断层扫描)自带的标尺进行测量。肿瘤标志物，是指特征性存在于恶性肿瘤细胞，或由恶性肿瘤细胞异常产生的物质，或是宿主对肿瘤的刺激反应而产生的物质，并能反映肿瘤发生、发展，监测肿瘤对治疗反应的一类物质。肿瘤标志物存在于肿瘤患者的组织、体液和排泄物中，能够用免疫学、生物学及化学的方法检测到，示例性的，包括甲胎蛋白(AFP)、CA125、CA15-3、鳞状细胞癌抗原(SCC)、细胞角蛋白19的可溶性片段(CYFRA21-1)、癌胚抗原(CEA)、CA199、CA724等。

本文中“周期”指每一次细胞治疗从接受治疗前的基线期(即评估阶段)开始，到给下一次接受治疗前的基线期前这段时间；如从给予预处理药物开始，直至下一周期开始预处理药物治疗前。在一些实施方式中，每个周期给予细胞治疗产品之前都需要进行预处理。

本文中“预处理”是指在给予所述宿主细胞、细胞治疗产品或组合物之前，先给予受试者其他的药物或治疗，使得受试者的身体状态更适合输注所述宿主细胞、细胞治疗产品或组合物。在一实例中，预处理包括给予受试者化学药物、生物药物、放疗或其组合。优选的，给予化学药物进行预处理，更优选，所述的化学药物为化疗药。在一实例中，受试者在接受预处理之后的淋巴细胞相比预处理之前减少约50％、55％、60％、65％或者70％。

本文中“化学药物”是指通过化学合成的方法制备的抗癌药物，包括传统的化疗药，例如烷化剂、抗代谢药、抗癌抗生素等，也包括靶向药，如阿法替尼、爱乐替尼等。在一实例中，化学药物包括但不限于烷化剂、抗代谢药、抗肿瘤抗生素、植物类抗癌药、激素、免疫制剂等；例如，二萜生物碱类化合物(如紫杉烷)、环磷酰胺、氟达拉滨、环孢菌素、雷帕霉素、美法仑、苯达莫司汀、天冬酰胺酶，白消安，卡铂，顺铂，柔红霉素，多柔比星，氟尿嘧啶，羟基脲，甲氨蝶呤，利妥昔单抗，长春碱和/或长春新碱等。在一实例中，抗代谢药包括但不限于卡莫氟、替加氟、喷司他丁、去氧氟尿苷、曲美沙特、氟达拉滨、吉美嘧啶、奥替拉西钾、双呋氟尿嘧啶、卡莫氟、卡培他滨、加洛他滨、阿糖胞苷十八烷基磷酸钠、fosteabine钠水合物、雷替曲塞、paltitrexid、乙嘧替氟、噻唑呋林(tiazofurin)、诺拉曲塞、培美曲塞、奈拉滨(nelzarabine)、2’-脱氧-2’-亚甲基胞苷、2’-氟亚甲基-2’-脱氧胞苷、N-[5-(2,3-二氢-苯并呋喃基)磺酰基]-N’-(3,4-二氯苯基)脲、N6-[4-脱氧-4-[N2-[2(E),4(E)-十四碳二烯酰基]甘氨酰基氨基]-L-甘油-B-L-甘露糖-吡喃庚糖基]腺嘌呤、aplidine、海鞘素、4-[2-氨基-4-氧代-4,6,7,8-四氢-3H-嘧啶并[5,4-b]噻嗪-6-基-(S)-乙基]-2,5-噻吩酰基(thienoyl)-L-谷氨酸、氨基蝶呤、5-氟尿嘧啶、阿拉诺新、11-乙酰基-8-(氨基甲酰氧基甲基)-4-甲酰基-6-甲氧基-14-氧杂-1,11-二氮杂四环(7.4.1.0.0)-十四碳-2,4,6-三烯-9-基醋酸酯、苦马豆碱、洛美曲索、右雷佐生、蛋氨酸酶、2’-氰基-2’-脱氧-N4-棕榈酰基-1-B-D-阿糖呋喃糖基(arabinofuranosyl)胞嘧啶和3-氨基吡啶-2-醛缩氨基硫脲等。在一实例中，烷化剂包括但不限于达卡巴嗪、苯丙氨酸氮芥、环磷酰胺、替莫唑胺、苯丁酸氮芥、 白消安、氮芥和亚硝基脲等。本文中“生物药物(即其他生物药物)”是指通过分子生物学或基因工程的手段制备的药物，如抗体药物、ADC等。本文中“微管蛋白抑制剂”包括微管蛋白聚合促进剂和微管蛋白聚合抑制剂。微管蛋白抑制剂包括但不限于例如紫杉烷类、埃坡霉素类、海绵内酯类以及Laulimalide等。本文中“紫杉烷类(taxanes)药物”指主要成分含有紫杉烷类化合物的药物，所述的紫杉烷类化合物具有与紫杉烷类似的桥亚甲基苯并环癸烯母核结构。在一实例中，紫杉烷类化合物的所述桥亚甲基苯并环癸烯母核结构中含有不饱和键、或不含不饱和键。在一实例中，紫杉烷类的所述桥亚甲基苯并环癸烯母核结构上的碳原子被选自N、O、S、P的杂原子取代。在一实例中，紫杉烷类化合物的给药方式为注射给药。

在一实例中，预处理包括给予受试者环磷酰胺、氟达拉滨、微管蛋白抑制剂、嘧啶类抗肿瘤药物中的任意一种或至少两种或其组合。

在一实例中，每个周期给予所述宿主细胞、细胞治疗产品或组合物之前，先对受试者进行预处理，所述预处理包括给予受试者化疗药物、生物药物和/或放疗。在一实例中，所述放疗是全身辐射治疗，或是局部辐射治疗。

本文中“剂量”，是以重量为基础计算的剂量，或是以体表面积(BSA)为基础计算的剂量，或是以单个人为基础计算的剂量。以重量为基础计算的剂量是以受试者体重为基础所计算出的剂量，例如mg/kg受试者或患者体重，细胞个数/kg受试者或患者体重等。以BSA为基础计算的剂量是以受试者的表面积为基础所计算出的剂量，例如mg/m ²，细胞个数/m ²等。以单个人为基础计算的剂量是指每个受试者每个周期或每次给予的剂量，例如mg/受试者，细胞个数/受试者。

本文中“给药次数”是指每个周期内给予所述宿主细胞、细胞治疗产品或组合物或每个预处理药物的频率。例如，氟达拉滨给药次数：给予1次；或每日给予1次，连续给予4、3或2日。环磷酰胺给药次数：给予1次；或每日给予1次，连续给予4、3或2日。白蛋白结合型紫杉醇给药次数：给予1次；或每日给予1次，连续给予4、3或2日。例如，每个周期内给予的所述宿主细胞、细胞治疗产品或组合物一次性给予；或分2、3、4、5、6、7、8、9、10次给予，可以是连续日给予，或间隔1、2、3、4、5、6天给予。

在一实例中，给予受试者至少一个周期的所述宿主细胞、细胞治疗产品或组合物进行治疗。在一实例中，每个周期的剂量可以是相同的，也可以是不同的。在一实例中，一个周期内的剂量一次或分多次给予受试者，每次给药的分剂量可以是相同或不同。如，一个周期内的所述宿主细胞、细胞治疗产品或组合物1次给予受试者，或分2次、3次、4次、5次，或更多次给予受试者。在一实例中，当一个周期内的剂量分多次给予受试者时，每次给予的所述宿主细胞、细胞治疗产品或组合物或预处理药物的剂量由医生根据受试者的具体情况确定。受试者的具体情况可以是受试者的整体健康情况、疾病的严重程度、对同周期前次给药量的反应、对先前周期的反应、受试者联合用药情况、毒性反应程度或可能性、并发症、癌症转移情况、以及医生所认为的会影响到受试者接受细胞治疗或预处理 药物的剂量的任何其他因素。在一实例中，每次给予的剂量呈递增趋势。在一实例中，每次给予的剂量呈递减趋势。在一实例中，每次给予的剂量呈先递增后递减的趋势。在一实例中，每次给予的剂量呈先递减后递增的趋势。

给予多周期的所述宿主细胞、细胞治疗产品或组合物是指具有多个时间段，在每个时间段内给予一定总量的所述宿主细胞、细胞治疗产品或组合物。在一实例中，每个时间段的间隔时间是一致的。在一实例中，每个时间段的间隔时间是不一致的。在一实例中，给予至少2个周期的所述宿主细胞、细胞治疗产品或组合物，如给予2、3、4、5、6、7、8、9或10个周期。在一实例中，每个周期给予的剂量及给予次数，不同周期之间的间隔时间的设计，是以改善一种或多种结果为目标来评估，例如，结果可以是降低受试者的副作用的程度或发生副作用的可能性，也可以是改善疗效。

在一实例中，每个周期给予特异性结合CLD18.2多肽的外源受体的细胞(例如CLD18.2-CAR-T细胞)的剂量不超过约2ⅹ10 ⁹个细胞/kg受试者体重，或不超过约1ⅹ10 ¹¹个细胞/人。优选的，每个周期给予的剂量不超过约2ⅹ10 ⁸个细胞/kg受试者体重，或不超过约1ⅹ10 ¹⁰个细胞/人。更优选地，每个周期给予的剂量不超过约2ⅹ10 ⁷个细胞/kg受试者体重，或不超过约5ⅹ10 ⁹个细胞/人、或2ⅹ10 ⁹个细胞/人、或1ⅹ10 ⁹个细胞/人、或5ⅹ10 ⁸个细胞/人。在一实例中，每个周期给予的剂量为约1ⅹ10 ⁵个细胞/kg受试者体重至2ⅹ10 ⁷个细胞/kg受试者体重，或约1ⅹ10 ⁶个细胞/kg受试者体重至2ⅹ10 ⁷个细胞/kg受试者体重。在一实例中，每个周期给予的剂量是约1ⅹ10 ⁷个细胞至1ⅹ10 ⁹个细胞、1ⅹ10 ⁷个细胞至2ⅹ10 ⁹个细胞、1ⅹ10 ⁷个细胞至5ⅹ10 ⁹个细胞、或1ⅹ10 ⁷个细胞至1ⅹ10 ¹⁰个细胞，优选的，为1ⅹ10 ⁸个细胞至1ⅹ10 ⁹个细胞、1ⅹ10 ⁸个细胞至2ⅹ10 ⁹个细胞、1ⅹ10 ⁸个细胞至5ⅹ10 ⁹个细胞，更优选的，为1ⅹ10 ⁸个细胞至5ⅹ10 ⁸个细胞、或2.5ⅹ10 ⁸个细胞至5ⅹ10 ⁸个细胞、3.75ⅹ10 ⁸个细胞至5ⅹ10 ⁸个细胞。

在一实例中，预处理包括给予受试者环磷酰胺和氟达拉滨；或者环磷酰胺、氟达拉滨以及微管蛋白抑制剂。在一实例中，微管蛋白抑制剂是紫杉烷类化合物，优选的，所述紫杉烷类化合物选自紫杉醇、白蛋白结合型紫杉醇、多西他赛，更优选的，所述紫杉烷类化合物是白蛋白结合型紫杉醇。

在一实例中，可在同日或不同日给予氟达拉滨、环磷酰胺和白蛋白结合型紫杉醇。如果在同日给予氟达拉滨、环磷酰胺和白蛋白结合型紫杉醇，则可在氟达拉滨前或后给予环磷酰胺和/或白蛋白结合型紫杉醇；或在环磷酰胺前或后给予氟达拉滨和/或白蛋白结合型紫杉醇；或在白蛋白结合型紫杉醇前或后给予环磷酰胺和/或氟达拉滨。在一实例中，可同时给予或依次给予氟达拉滨、环磷酰胺、白蛋白结合型紫杉醇。在一实例中，在给予氟达拉滨前给予环磷酰胺。在一实例中，在给予氟达拉滨后给予环磷酰胺。在一实例中，在给予氟达拉滨前给予白蛋白结合型紫杉醇。在一实例中，在给予氟达拉滨后给予白蛋白结合型紫杉醇。在一实例中，在给予环磷酰胺前给予白蛋白结合型紫杉醇。在一实例中，在给予环磷酰胺后给予白蛋白结合型紫杉醇。

在一实例中，氟达拉滨的给予量约为20-60mg/天、或约30-55mg/天、或约30-50mg/天。在一实例中，氟达拉滨的给予量约为10-50mg/m ²/天、或约15-40mg/m ²/天、或约15-30mg/m ²/天、或约20-30mg/m ²/天；或约25mg/m ²/天。在一实例中，环磷酰胺的给予量约为200-1000mg/天、或约300-600mg/天、或约300-560mg/天、或约300-550mg/天、或约300-500mg/天。在一实例中，环磷酰胺的给予量约为200-400mg/m ²/天、或约200-300mg/m ²/天、或约250mg/m ²/天。在一实例中，紫杉烷类化合物给予量为不高于约300mg/天、或不高于约200mg/天，优选的，所述紫杉烷类化合物给予量约为90-200mg/天，更优选的，所述紫杉烷类化合物给予量约为90-120mg/天。在一实例中，每种预处理药物连续使用不超过4天。在一实例中，环磷酰胺给予2-3次。在一实例中，氟达拉滨给予1-2次。在一实例中，紫杉烷类化合物给予一次。

将对受试者每个周期给予CAR-T细胞疗法之日指定为第0日。在一实例中，在第-6和-5日给予氟达拉滨。在一实例中，在第-5和-4日给予氟达拉滨。在一实例中，在第-4和-3日给予氟达拉滨。在一实例中，在第-6、-5、-4和-3日给予氟达拉滨。在一实例中，在第-7、-6、-5和-4日给予氟达拉滨。在一实例中，在第-6、-5、-4和-3日给予环磷酰胺。在一实例中，在第-6、-5和-4日给予环磷酰胺。在一实例中，在第-5、-4和-2日给予环磷酰胺。在一实例中，在第-5、-4和-3日给予环磷酰胺。在一实例中，在第-4、-3和-2日给予环磷酰胺。在一实例中，在第-4和-3日给予环磷酰胺。在一实例中，在第-6和-5日给予环磷酰胺。在一实例中，在第-5和-4日给予环磷酰胺。在一实例中，在第-2日、第-3日、第-4日、第-5日、或第-6日，给予紫杉烷类化合物(如白蛋白结合型紫杉醇)。

在一实例中，本文所述的用途或方法还包括监控受试者对所述宿主细胞、细胞治疗产品或组合物的毒性反应程度或者风险，并根据所述毒性程度或者风险确定后续分次给药或者在后周期的给药剂量和间隔时间。在一实例中，所述毒性反应程度或者风险包括但不限于例如CRS、神经毒性、巨噬细胞活化综合征和肿瘤溶解综合征等。

在一实例中，通常在给予所述宿主细胞、细胞治疗产品或组合物之后，当毒性反应或其症状或生物化学指标(例如CRS或神经毒性、巨噬细胞活化综合征或肿瘤溶解综合征)的风险等于或低于可接受水平的情况下，给予在后周期的治疗。在一实例中，所述毒性反应或其症状或生物化学指标包括发热、低血压、缺氧、神经障碍、炎性细胞因子、C反应性蛋白(CRP)的血清水平中的一种或多种。在一实例中，所述毒性反应或其症状或生物化学指标的风险的可接受的水平是指在给予在先周期的治疗之后的峰值水平的95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、或者5％。在一实例中，在基于在先周期的治疗之后，在受试者中指示细胞因子-释放综合征(CRS)的因子的血清水平不超过该受试者在给予在先周期之前的血清水平的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30倍的情况下给予在后周期的治疗。在一实例中，经在先周期的治疗，在肿瘤负荷呈现稳定或减少后，适应性宿主免疫应答(即，机体对CAR-T细胞产生 的免疫排斥反应)产生之前，给予一个或多个在后周期的治疗。在这种条件下，在后周期可以安全有效地提供免疫监测、清除或预防残留肿瘤细胞的增殖或转移。因此，在一实例中，在后周期是疾病巩固剂量。

在一实例中，在给予在先周期的细胞治疗产品后至少28、29、30、31、32、33、34、35天之后，给予在后周期的治疗。

给予细胞治疗产品的方法是已知的。在一实例中，所述宿主细胞、细胞治疗产品或组合物通过自体回输的方式给予受试者。在一实例中，特异性结合CLD18.2多肽的外源受体的细胞(例如CLD18.2-CAR-T细胞)源自需要本方法治疗的受试者，并在体外进行基因修饰后回输。在一实例中，特异性结合CLD18.2多肽的外源受体的细胞(例如CLD18.2-CAR-T细胞)通过同种异体回输的方式给予受试者。在一实例中，特异性结合CLD18.2多肽的外源受体的细胞(例如CLD18.2-CAR-T细胞)源自健康供者，供者和回输细胞的受试者不同。

所述宿主细胞、细胞治疗产品或组合物可通过任何合适的方式给予，例如，通过注射，例如，静脉内或皮下注射、腹腔注射、眼内注射、眼底注射、视网膜下注射、玻璃体内注射、反间隔注射、巩膜下注射、脉络膜内注射、前房注射、结膜下注射、结膜下注射、巩膜上腔注射、球后注射、眼周注射或球周递送。在一实例中，通过胃肠外、肺内的和鼻内，以及病灶内给予。腹膜外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下给予。在一实例中，可利用任何途径(包括静脉注射(IV))给予氟达拉滨、环磷酰胺和白蛋白结合型紫杉醇。

可利用任何途径(包括静脉注射(IV))给予所述宿主细胞、细胞治疗产品或组合物(例如CAR-T细胞)。在一些实施方式中，在下列时间内利用IV给予CAR-T细胞：约3分钟、约4分钟、约5分钟、约6分钟、约7分钟、约8分钟、约9分钟、约10分钟、约11分钟、约12分钟、约13分钟、约14分钟、约15分钟、约16分钟、约17分钟、约18分钟、约19分钟、约20分钟、约21分钟、约22分钟、约23分钟、约24分钟、约25分钟、约26分钟、约27分钟、约28分钟、约29分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟、约60分钟。

本申请所述方法中可包括各种其他干预。例如，环磷酰胺与氟达拉滨在给予后可能引起受试者的不良事件。本申请的范围包括对受试者给予组成物以使这些不良事件中的某些事件减少。在一实例中，包含对受试者给予生理盐水。在一实例中，包含给予佐剂与赋形剂。例如，美司钠(2-巯基乙烷磺酸钠)。在一实例中，包含给予外源性细胞激素。

给予受试者所述宿主细胞、细胞治疗产品或组合物后，可用多种已知方法中的任一种来测量给予的细胞群的生物活性。评估的参数包括：细胞与抗原的特异性结合，体内方式(例如，通过成像)或离体方式(例如，通过ELISA或流式细胞术)。在一实例中，通过测定细胞因子，例如CD107a，IFNγ，IL-2和TNF的表达和/或分泌，来测量细胞的生物活性。在一实例中，生物活性通过评估临床结果，例如肿瘤负荷的减少。在一实例中，评估 肿瘤标志物的降低。在一实例中，评估细胞的毒性结果、持久性和/或增殖，和/或存在或不存在宿主免疫应答。

在一实例式中，如果指示副作用的生物化学指标或指示物(如：细胞因子释放综合征(CRS)、巨噬细胞活化综合征、或肿瘤溶解综合征、或神经毒性)显示的临床风险不存在或已过去，在需要的情况下，可以给予在后周期的治疗。在一实例中，是否给予在后周期的治疗，何时给予在后周期的治疗，和/或在后周期中给予的细胞治疗产品的剂量基于受试者中针对在先周期的细胞或其表达的嵌合抗原受体的免疫应答或可检测免疫应答的存在、不存在或程度确定。在一实例中，在受试者中指示CRS的因子的血清水平不超过给予在先周期前时刻的受试者中该指示物的血清水平的约10倍、25倍、50倍或100倍时，给予在后周期的治疗。在一实例中，在受试者中与CRS相关的结果(例如与CRS相关或指示CRS的血清因子)或其临床迹象或症状如发热、缺氧、低血压或神经障碍已经达到峰值水平，并且在给予在先周期后开始下降之后时给予在后周期的治疗。在一实例中，在宿主适应性免疫应答未被检测到、尚未建立、或尚未达到一定水平、程度或阶段时给予在后周期的治疗。在一些方面，在受试者的记忆免疫应答发展之前给予在后周期的治疗。

可检测的免疫应答是指通过用于评估对特定抗原和细胞的特异性免疫应答的许多已知方法中的任何一种可检测到的量。在一实例中，通过在受试者的血清上进行ELISPOT、ELISA或基于细胞的抗体检测方法(例如，通过流式细胞术)以检测特异性结合和/或中和存在于细胞上的抗原，例如结合嵌合抗原受体的表位，例如CAR的抗体的存在来检测特定类型的免疫应答。在一实例中，确定检测到的抗体的同种型并且可以指示应答的类型和/或应答是否是记忆应答。

本申请实施例中，通过基于“去单个核细胞分离术”从患有癌症的人类受试者的外周血单个核细胞(PBMC)制备T细胞，并且用编码嵌合抗原受体(CAR)的病毒载体培养和转导所述T细胞，所述嵌合抗原受体(CAR)特异性结合受试者中由肿瘤细胞表达的抗原，其是肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原。细胞在单独的柔性冷冻袋中的输注介质中冷冻保存。每个包含单个单位剂量的细胞，其为约1×10 ⁶个细胞至5×10 ⁷个细胞。每个受试者输注的在先周期不高于约1×10 ¹²个细胞，优选地，不高于约1×10 ¹¹个细胞，更优选地，不高于约1×10 ¹⁰个细胞或约5ⅹ10 ⁹个细胞或约2ⅹ10 ⁹个细胞。在输注之前，将细胞保持在约低于-130℃或约低于-175℃的温度下。

在开始细胞治疗之前，从受试者获得血液，并且任选地通过ELISA和/或MSD和/或CBA的方法评估血清中指示细胞因子释放综合征(CRS)的一种或多种血清因子的水平，例如肿瘤坏死因子α(TNFα)、干扰素γ(IFNγ)、IL-10或IL-6。在治疗开始之前，可以通过例如通过PET或CT扫描测量实体肿瘤的大小或质量来任选地评估肿瘤负荷。

通过升温至约38℃进行复苏，并且受试者通过多次输注给予在先周期的细胞。每次输注为约3-30分钟时间内连续输注静脉内(IV)给予。

在给予在先周期后，受试者接受身体检查，并监测任何毒性或毒性结果的症状，例 如发热、低血压、缺氧、神经障碍或炎性细胞因子或C反应蛋白(CRP)的血清水平升高。任选地，在给予在先周期后，在一次或多次的情况下，从受试者获得血液，并通过ELISA和/或MSD和/或CBA的方法评估指示CRS的血清因子的水平。将血清因子的水平与刚好给予在先周期之前获得的血清因子的水平进行比较。如有必要，给予抗IL6或其他CRS治疗以减少CRS的症状。

在给予在先周期后，例如在给药开始后1、2、3和/或4周，任选地检测受试者中抗CAR免疫应答的存在或不存在，例如，通过qPCR、ELISA、ELISPOT、基于细胞的抗体测定和/或混合淋巴细胞反应。

通过在先周期实现的肿瘤负荷减少百分比可任选地在通过扫描(例如PET和CT扫描)在实体瘤患者中给予在先周期后一次或多次进行测量，和/或通过量化在血液或肿瘤部位肿瘤阳性细胞。

从首剂开始并持续长达数年，定期监测受试者。在随访期间，测量肿瘤负荷、和/或通过流式细胞术和定量聚合酶链反应(qPCR)检测CAR-表达细胞，以测量所给予的细胞的体内增殖和持久性、和/或评估抗CAR免疫应答的发展。

每个受试者输注的在先周期不高于约1×10 ¹²个细胞，优选地，不高于约1×10 ¹¹个细胞，优选地，不高于约1×10 ¹⁰个细胞、或不高于约5×10 ⁹个细胞、或不高于2×10 ⁹个细胞。在输注之前，将细胞保持在低于-175℃的温度下。在输注时，升温至38℃左右进行复苏。

在后周期的给药剂量是受试者特异性的，并且基于肿瘤负荷，抗CAR免疫应答的存在和CRS相关结果的水平。在后周期的给药剂量不高于约1×10 ¹²个细胞，优选地，不高于约1×10 ¹¹个细胞，更优选地，不高于约1×10 ¹⁰个细胞,更优选地，不高于约5×10 ⁹个细胞或不高于约2×10 ⁹个细胞。

采用描述性统计方法(如例数、平均数、中位数、标准差[SD]、最小值和最大值)分析。分类变量采用频数表(频数和百分比)分析。所有不良事件(AE)将依据ICH国际医学用语辞典MedDRA最新版本的编码进行分类，并按照不良事件常用标准术语标准(CTCAE v5.0版)分级，采用频率分布、图表或其它描述性指标进行分析，将按系统器官分类、首选术语和组别计算发生治疗后出现的不良事件(TEAE)的受试者例数和百分比。将生成包含不同检测时间点CAR-T细胞拷贝数。对于ORR和DCR采用Clopper-Pearson方法计算95％置信区间。

8.试剂盒

本申请提供用于在受试者中治疗和/或预防胆道肿瘤的试剂盒。在一实例中，试剂盒包括有效量的本申请的所述宿主细胞、细胞治疗产品、组合物组或药物组合物。在一实例中，试剂盒包括无菌容器；包括盒子、安瓿、瓶、小瓶、管、袋、小袋、泡罩包装或本领域已知的其它合适的容器形式。容器包括由塑料、玻璃、层压纸、金属箔或其它适合于容纳药物的材料制成。在一实例中，试剂盒包括编码本申请的CAR的核酸分子，其以可表达的形式识别CLD18.2多肽，可以任选地包括在一种或多种载体中。

在一实例中，将本申请的组合物和/或核酸分子，与将所述组合物或核酸分子施用于患有肿瘤或病原体或免疫疾病或有发展成肿瘤或病原体或免疫疾病的受试者的说明书一起提供。说明书通常包括有关组合物用于治疗和/或预防肿瘤或病原体感染的信息。在一实例中，说明书包括以下至少一项：治疗剂的描述；用于治疗或预防肿瘤、病原体感染或免疫疾病或其症状的剂量表和给药；注意事项；警告；适应症；不适应症；用药信息；不良反应；动物药理学；临床研究；和/或参考。这些说明书可以直接打印在容器上，或者作为粘贴在容器上的标签，或者作为单独的纸页、小册子、卡片或文件夹提供在容器内或与容器一起。

本申请的优点：

1.本申请显著提高利用表达嵌合抗原受体的免疫效应细胞进行胆道肿瘤(包括胆囊癌、胆管癌)治疗的疗效：肿瘤数量减少或体积缩小，和/或转移的数量和/或程度降低，和/或肿瘤标志物降低，和/或中晚期癌症常见的并发症的消失或减弱表示。

2.对实体瘤的抗肿瘤效果显著，提供了一种安全有效，能稳定甚至治愈CLA18.2阳性的中晚期胆道肿瘤(包括胆囊癌、胆管癌)的治疗手段。

3.提供一种提高免疫效应细胞抗胆道肿瘤(包括胆囊癌、胆管癌)治疗的预处理组合物，在给予免疫效应细胞之前给予氟达拉滨、环磷酰胺、白蛋白结合型紫杉醇组合物，能显著促进免疫效应细胞的抗肿瘤疗效，大幅降低受试者的肿瘤负荷、提高受试者的生活质量，以及延长生存期。

下面结合具体实施例，进一步阐述本申请。应理解，这些实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

材料与方法：

材料：

本申请采用的各种材料，包括试剂均可自商业渠道购得。

本申请的示例性的抗原受体，包括CAR，以及用于工程改造和将受体导入细胞中的方法，参考例如例如中国专利申请公开号CN107058354A、CN107460201A、CN105194661A、CN105315375A、CN105713881A、CN106146666A、CN106519037A、CN106554414A、CN105331585A、CN106397593A、CN106467573A、CN104140974A、CN 108884459A、CN107893052A、CN108866003A、CN108853144A、CN109385403A、CN109385400A、CN109468279A、CN109503715A、CN 109908176A、CN109880803A、CN 110055275A、CN110123837A、CN 110438082A、CN 110468105A国际专利申请公开号WO2017186121A1、WO2018006882A1、WO2015172339A8、WO2018/018958A1、WO2014180306A1、WO2015197016A1、WO2016008405A1、WO2016086813A1、 WO2016150400A1、WO2017032293A1、WO2017080377A1、WO2017186121A1、WO2018045811A1、WO2018108106A1、WO 2018/219299、WO2018/210279、WO2019/024933、WO2019/114751、WO2019/114762、WO2019/141270、WO2019/149279、WO2019/170147A1、WO 2019/210863、WO2019/219029中公开的全文内容。

实施例1.CAR-T细胞的制备

采用本领域常规分子生物学方法制备表达特异性识别CLD18.2的CAR-T细胞。以PRRLSIN为载体，分别插入表1所示的嵌合抗原受体序列构建了表达CLD18.2抗体的嵌合抗原受体的慢病毒载体，分别感染活化后的T细胞并培养扩增至需要的数量，得到CLD18.2-BBZ CAR-T细胞、CLD18.2-28Z CAR-T细胞、CLD18.2-28BBZ CAR-T细胞。

表1嵌合抗原受体

注：CD8α信号肽(SEQ ID NO:1)；CLDN18.2scFV(SEQ ID NO:2)；CD8铰链区(SEQ ID NO:3)；CD8跨膜区(SEQ ID NO:4)；CD28跨膜区(SEQ ID NO:5)；CD137胞内域(SEQ ID NO:6)；CD28胞内域(SEQ ID NO:7)；CD3ζ胞内域(SEQ ID NO:8)。

实施例2.CAR-T细胞的细胞毒性测定

通过乳酸脱氢酶法检测CAR-T细胞在体外杀伤。采用CytoTox 试剂盒(Promega，G1780)，具体步骤参照试剂盒说明书。

(1)靶细胞：CLD18.2表达阴性的人胆管癌细胞RBE、人胆囊癌细胞GBC-SD；外源性表达人CLD18.2的RBE-CLD18.2细胞、GBC-SD-CLD18.2细胞。

(2)效应细胞：UTD(未感染病毒的T细胞)、CLD18.2-28Z CAR-T细胞。

分别按效靶比3:1、1:1、1:3铺入96孔板中，在37℃、5％CO ₂下共培养18小时检测。如图1所示：CLD18.2-28Z CAR-T杀伤CLD18.2表达阳性的细胞；CLD18.2-28Z CAR-T对CLD18.2表达阴性的细胞RBE、GBC-SD基本无杀伤。

实施例3.CAR-T细胞体内杀伤实验

接种3×10 ⁶个GBC-SD-CLD18.2细胞于5～6周龄，雌性NPG小鼠(购自北京维通达生物技术有限公司)右侧腋部皮下，肿瘤接种日记为D0。接种后D15,肿瘤体积长至约150mm ³，随机分为4组，分别为UTD、CLD18.2-28Z CAR-T组，其中CLD18.2-28Z CAR-T组包括CAR-T1(5*10^5细胞/小鼠)、CAR-T2(1*10^6细胞/小鼠)、CAR-T3(3*10^6细胞/小鼠)。如图2所示，肿瘤细胞接种后D36天时，与UTD相比，各组抑瘤率分别为：CAR-T1：42.43％，CAR-T2：80％；CAR-T3：100％(5只小鼠肿瘤 均消退)。

实施例4.CAR-T细胞治疗胆道肿瘤

对CLD18.2阳性的胆道肿瘤受试者进行靶向CLD18A2的CAR-T细胞治疗，采用既往手术或活检的肿瘤组织切片进行CLD 18.2表达检测。在给予CAR-T细胞之前，受试者接受“去单个核细胞分离术”的单采分离技术，并进行预处理治疗。通过单采，从受试者体内获得PBMC，通过编码抗CLD18A2的CAR(示例性CAR采用CLD18.2-28Z CAR)的病毒载体转导和扩增，得到CAR-T细胞。在给予CAR-T之前，给予受试者预处理：氟达拉滨、环磷酰胺和白蛋白结合型紫杉醇。

CAR-T治疗之前，通过例如PET或CT扫描测量实体肿瘤的大小或性状来任选地评估肿瘤负荷，且还可以通过检测肿瘤标志物和/或观察肿瘤并发症发生及严重程度来评估肿瘤负荷。

当受试者需要进行至少一个周期的CAR-T治疗时，在后周期的CAR-T给药，在前一周期的CAR T给药完成后的4周后给予。每个周期的CAR-T给药，可以一次给予，也可以分两次或两次以上静脉(IV)滴注给予，每次给予的细胞在约3-30分钟完成输注，优选5-25分钟时间完成输注。每个周期在CAR-T给药完毕后，受试者会接受身体检查，并监测任何毒性或毒性结果的症状，例如发热、低血压、缺氧、神经障碍或炎性细胞因子或C反应蛋白(CRP)的血清水平升高。检查可以是从受试者获得血液，通过ELISA、和/或MSD、和/或CBA的方法评估指示CRS的细胞因子水平。如有必要，给予抗IL-6治疗，或给予其他CRS治疗，以减少CRS的症状。每个周期在CAR-T给药完毕后，例如在给药开始后1、2、3、和/或4周，可以通过qPCR、ELISA、ELISPOT、抗体测定等评估受试者体内的CAR-T数量。

每个周期的治疗后肿瘤负荷的减少情况可通过扫描(例如PET和CT扫描)，和/或通过量化在血液或肿瘤部位呈现抗原(如claudin18.2)阳性的细胞得出。

示例性，受试者1：男、65岁、44kg，胆囊低分化腺癌，CLD18.2表达呈+++(强阳性染色)、染色的肿瘤细胞百分比为90％。既往接受过姑息性胆囊切除术，氟尿嘧啶等化疗药治疗，现有远处转移。CAR-T治疗前预处理：氟达拉滨为35mg/d第1-2天，环磷酰胺为350mg/d第1-3天，白蛋白结合型紫杉醇为100mg/d第2天。接受2个周期的CAR-T输注，周期1的输注剂量为3.75×10 ⁸个细胞，周期2的输注剂量为2.5×10 ⁸个细胞，均为一次性回输。

受试者2：女、63岁、59kg，胆囊高中分化腺癌，CLD18.2表达呈+++(强阳性染色)、染色的肿瘤细胞百分比为80％。既往接受过胆囊切除术，白蛋白结合型紫杉醇、S-1等化疗药和帕博利珠单抗免疫治疗，现有远处转移。CAR-T治疗前预处理：氟达拉滨为38.75mg/d第1-2天，环磷酰胺为387.5mg/d第1-3天，白蛋白结合型紫杉醇为100mg/d第2天。该受试者接受了1个周期的CAR-T输注，输注剂量为2.5×10 ⁸个细胞，为一次性回输。

受试者3：男、57岁、65kg，肝外胆管中-低分化癌，CLD18.2表达呈+++(强阳性染色)、染色的肿瘤细胞百分比为80％。既往接受过胰十二指肠切除术，吉西他滨、雷替曲塞、顺铂等化疗药治疗以及PD-L1/TGF-β双抗(Bintrafusp alfa)或安慰剂治疗，现有远处转移。CAR-T治疗前预处理：氟达拉滨为42.25mg/d第1-2天，环磷酰胺为422.5mg/d第1-3天，白蛋白结合型紫杉醇为100mg/d第2天。该受试者接受了1个周期的CAR-T细胞输注，输注剂量为2.5×10 ⁸个细胞，为一次性回输。

实施例5：治疗的评估

通过影像学检测靶病灶和非靶病灶对治疗前和治疗后的肿瘤负荷进行评估，并确定靶病灶的数目及大小，疗效评价标准参见实体肿瘤的疗效评价标准1.1版。所有不良事件(AE)将依据ICH国际医学用语辞典MedDRA最新版本的编码进行分类，并按照不良事件常用标准术语标准(CTCAE v5.0版分级)进行分析。其中，细胞因子释放综合征(CRS)和神经毒性按照ASTCT共识进行分级和处理。

3例胆道肿瘤受试者没有发生严重CRS及神经毒性，靶向CLD18.2的CAR-T治疗是安全的。2例胆囊癌受试者CAR-T回输发生1-2级CRS。临床表现以发热、心动过速、外周水肿为主，亦可见低血压、低血氧，经对症支持治疗后可恢复。1例胆管癌受试者CAR-T回输未发生CRS。CAR-T治疗前后，3例受试者体重均保持稳定。

受试者1经过治疗后处于PR，PFS为4.2个月，OS约10个月。受试者2和3经过治疗后达到SD，无疾病进展生存期分别为约9.3个月、7.5个月，并且均仍在持续稳定期。

检测CAR-T细胞在体内持续存活期，即CAR-T细胞“植入”体内持续存活的期间。从初次输注(为第0天)结束后起每个访视点采用Q-PCR的方法(所用探针(SEQ ID NO:20)，上游引物(SEQ ID NO:21)，下游引物(SEQ ID NO:22))检测外周血中含有CAR-CLD18DNA的拷贝数。结果显示，CAR-T输注后，受试者1体内扩增拷贝数D5达峰值6713拷贝/μg gDNA，持续存在至少62天；受试者2于D7达峰值8237拷贝/μg gDNA，持续存在至少85天；受试者3于D14达峰值，5698拷贝/μg gDNA，持续存在至少28天。

在本申请提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本申请的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本申请作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

以下表格中列出了本申请中使用的序列：

Claims (22)

1. 一种治疗患有或怀疑患CLD18阳性胆道肿瘤受试者的方法，其特征在于，包括向所述受试者给予靶向CLD18的外源受体的细胞。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述CLD18为CLD18.2。
3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述胆道肿瘤包括胆囊癌和胆管癌。
4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞为免疫效应细胞，优选所述免疫效应细胞选自T细胞、NK细胞、NKT细胞、肥大细胞、巨噬细胞、树突细胞、CIK细胞、干细胞衍生的免疫效应细胞或其组合，进一步优选免疫效应细胞为来源于天然的T细胞和/或经多能干细胞诱导产生的T细胞。
5. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述免疫效应细胞为自体或同种异体T细胞、或原代T细胞。
6. 如权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于，所述外源受体选自嵌合抗原受体(CAR)、T细胞受体(TCR)、T细胞融合蛋白(TFP)、T细胞抗原耦合器(TAC)、抗体-TCR嵌合物或其组合；所述外源受体的抗原结合域特异性结合CLD18.2。
7. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述CAR包括：

   (i)特异性结合CLD18.2的抗体、CD8或CD28的跨膜区和CD3ζ胞内域；

   (ii)特异性结合CLD18.2的抗体、CD8或CD28的跨膜区、CD137胞内域和CD3ζ胞内域；

   (iii)特异性结合CLD18.2的抗体、CD28或CD8的跨膜区、CD28胞内域和CD3ζ胞内域；或

   (iv)特异性结合CLD18.2的抗体、CD8或CD28的跨膜区、CD28胞内域、CD137胞内域和CD3ζ胞内域。
8. 如权利要求1-7任一所述的方法，其特征在于，给予所述受试者至少一个周期的所述细胞进行治疗；优选的，给予受试者1-3个周期的所述细胞进行治疗。
9. 如权利要求8所述的所述的方法，其特征在于，

   每个周期给予的细胞治疗产品中细胞的剂量不超过约2ⅹ10 ⁹个细胞/kg受试者体重、2ⅹ10 ⁸个细胞/kg受试者体重、或2ⅹ10 ⁷个细胞/kg受试者体重；或

   细胞治疗产品中细胞剂量不超过约1ⅹ10 ¹¹个细胞/受试者、1ⅹ10 ¹⁰个细胞/受试者、5ⅹ10 ⁹个细胞/受试者、2ⅹ10 ⁹个细胞/受试者或1ⅹ10 ⁹个细胞/受试者。
10. 如权利要求9所述的方法，其特征在于，

    每个周期给予的细胞治疗产品中细胞的剂量为约1ⅹ10 ⁵个细胞/kg受试者体重至2ⅹ10 ⁷个细胞/kg受试者体重，或约1ⅹ10 ⁶个细胞/kg受试者体重至2ⅹ10 ⁷个细胞/kg受试者体重；或者

    每个周期给予的细胞治疗产品中细胞剂量为约1ⅹ10 ⁷个细胞至5ⅹ10 ⁹个细胞/受试者、约 1ⅹ10 ⁷个细胞至2ⅹ10 ⁹个细胞/受试者、或约1ⅹ10 ⁷个细胞至1ⅹ10 ⁹个细胞/受试者；或者

    每个周期给予的细胞治疗产品中细胞剂量为约1ⅹ10 ⁸个细胞至5ⅹ10 ⁹个细胞/受试者、约1ⅹ10 ⁸个细胞至2ⅹ10 ⁹个细胞/受试者、或约1ⅹ10 ⁸个细胞至1ⅹ10 ⁹个细胞/受试者；或者

    每个周期给予的细胞治疗产品中细胞剂量为约2.5ⅹ10 ⁸个细胞至5ⅹ10 ⁸个细胞/受试者。
11. 如权利要求8-10任一项所述的方法，其特征在于，每个周期给予所述细胞治疗产品之前进行预处理，所述预处理包括给予所述受试者化学药物、生物药物、放疗或其组合。
12. 如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述预处理在给予细胞治疗产品前1-8天实施；优选的，在给予细胞治疗产品前2-6天实施；优选地，每种化学药物、生物药物、放疗或其组合连续使用不超过4天。
13. 如权利要求11或12所述的方法，其特征在于，所述化学药物选自以下任意一种或至少两种：环磷酰胺、氟达拉滨、微管蛋白抑制剂、嘧啶类抗肿瘤药物；或所述化学药物包括环磷酰胺和氟达拉滨；或者所述化学药物包括环磷酰胺、氟达拉滨以及微管蛋白抑制剂。
14. 如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述微管蛋白抑制剂包括紫杉烷类化合物；或所述微管蛋白抑制剂包括紫杉醇、白蛋白结合型紫杉醇、多西他赛；或所述微管蛋白抑制剂为白蛋白结合型紫杉醇。
15. 如权利要求13或14所述的方法，其特征在于，

    氟达拉滨的给予量约为10-50mg/m ²/天、或约15-40mg/m ²/天、或约15-30mg/m ²/天、或约20-30mg/m ²/天；或约25mg/m ²/天、或约为30-60mg/天、或约30-50mg/天、或约35-45mg/天；或者

    环磷酰胺的给予量约为200-400mg/m ²/天、或约200-300mg/m ²/天、或约250mg/m ²/天、或约为300-1000mg/天、或约300-550mg/天、或约300-500mg/天；或者

    紫杉烷类化合物给予量为不高于约300mg/天、或不高于约200mg/天，或约为90-120mg/天。
16. 如权利要求13-15任一所述的方法，其特征在于，所述环磷酰胺给予2-3次；或所述氟达拉滨给予1-2次；或所述紫杉烷类化合物给予一次。
17. 如权利要求6-16任一所述的方法，其特征在于，所述抗原结合域或所述抗体具有：SEQ ID NO：2、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33所示的scFv序列；或

    所述抗原结合域或所述抗体具有SEQ ID NO：14所示的HCDR1、SEQ ID NO：15所示的HCDR2、SEQ ID NO：16所示的HCDR3、SEQ ID NO：17所示的LCDR1、SEQ ID NO：18所示的LCDR2、SEQ ID NO：19所示的LCDR3；或

    所述抗原结合域或所述抗体具有SEQ ID NO：10所示的重链可变区，SEQ ID NO：12所示的轻链可变区。
18. 如权利要求6-17任一所述的方法，其特征在于，所述的嵌合抗原受体具有SEQ ID NO： 2、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33所示的scFv序列分别与SEQ ID NO：34、35或36顺序连接的序列或所述的嵌合抗原受体具有SEQ ID NO：37、38或39所示的核苷酸序列。
19. 靶向CLD18的外源受体的细胞用于制备治疗患有或怀疑患CLD18阳性胆道肿瘤受试者的药物的用途。
20. 表达靶向CLD18的外源受体的细胞和化学药物或其他生物药物或放疗用于制备治疗患有或怀疑患CLD18阳性胆道肿瘤受试者的药物的用途。
21. 靶向CLD18的外源受体的细胞用于治疗患有或怀疑患CLD18阳性胆道肿瘤受试者的用途。
22. 表达靶向CLD18的外源受体的细胞和化学药物或其他生物药物或放疗用于治疗患有或怀疑患CLD18阳性胆道肿瘤受试者的用途。