CN108424927A - 一种能同时表达cd19 car和敲低t细胞表面pd-1表达的质粒结构及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种能同时表达CD19CAR和敲低T细胞表面PD‑1表达的质粒结构，包括依次串联的H1启动子、由H1启动子启动的抗PD‑1shRNA序列、EF1α启动子以及由EF1α启动子启动的三代CD19CAR序列；所述三代CD19CAR序列由CD19单链可变区、人CD8α铰链区、人CD28跨膜区和胞内区、人41BB胞内区、以及人CD3ζ胞内区串联构成。本发明所提供的质粒结构，将其用慢病毒转导进T细胞，比采用CRISPR/Cas9敲除PD‑1在生产CART细胞的工艺上简化了很大一步；并且这些CART细胞在体外受到抗原刺激后表现出了杀肿瘤细胞毒性的增强，细胞持久性的修复以及细胞因子分泌能力的上升。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种能同时表达CD19 CAR和敲低T细胞表面PD-1表达的质粒结构及其构建方法。
技术背景
美国食品和药物管理局(FDA)在2017年8月30日批准了第一个基因治疗，他们批准了Kymriah(tisagenlecleucel)治疗一些患有急性淋巴细胞白血病(ALL)的儿童和年轻成人患者。Kymriah是一种基因改良的自体T细胞免疫疗法，即嵌合抗原受体T细胞(CART)免疫疗法。最常见的CARs包括了一段抗原识别序列，比如一段单克隆抗体(mAb)的单链可变区片段(scFv)，以及主要来自于激活T细胞胞内信号域的TCRζ链(Lee DW,Barrett DM,MackallC,Orentas R,Grupp SA.The Future Is Now:Chimeric Antigen Receptors as NewTargeted Therapies for Childhood Cancer.Clin Cancer Res.2012；18(10):2780-2790.doi:10.1158/1078-0432.CCR-11-1920.)。靶向CD19的CART细胞已经在临床前和临床实验中表现出了十分有希望的结果，并且已经证明他们在具有难治性和复发性的b-前体急性淋巴细胞性白血病儿童和青少年中进行的有效抗白血病效应是安全可行的，所有的毒性可逆并且没有发生持续的B细胞发育不全(Lee DW,Kochenderfer JN,Stetler-StevensonM,et al.T cells expressing CD19chimeric antigen receptors for acutelymphoblastic leukaemia in children and young adults:A phase 1 dose-escalation trial.Lancet.2015；385(9967):517-528.doi:10.1016/S0140-6736(14)61403-3)。
然而，在治疗另一些血液肿瘤比如慢性淋巴细胞白血病和实体瘤方面还有很多的问题没有解决。肿瘤微环境在抑制和增强免疫应答方面具有十分重要的作用，为了能够消除肿瘤细胞，需要免疫系统的激活，效应细胞的扩增和激活效应细胞浸润到组织里面，才能消灭肿瘤细胞。而效应T细胞会被肿瘤微环境中的免疫检查点分子抑制，比如程序性死亡受体(PD-1).PD-1在急性髓细胞性白血病(AML)中与CART细胞的耗竭和机能障碍有关4,而PD-1的封闭能够在体外增强T细胞的生存和毒性，PD-1/PD-L1的结合反应可能是诱导活化导致的细胞死亡(AICD)产生的分子机制之一，并限制了CART细胞在体内的持续存在(GargettT,Yu W,Dotti G,et al.GD2-specific CAR T cells undergo potent activation anddeletion following antigen encounter but can be protected from activation-induced cell death by PD-1 blockade.Mol Ther.2016；24(6):1135-1149.doi:10.1038/mt.2016.63.)。
通过抗体合格CART细胞表面的PD-1受体，细胞内源性的PD-1shRNA封闭，或者是表达显性失活的PD-1受体来封闭PD-1免疫检查点都可以修复CART细胞的效应功能(Cherkassky L,Morello A,Villena-vargas J,et al.Human CAR T cells with cell-intrinsic PD-1checkpoint blockade resist tumor-mediated inhibition.2017.doi:10.1172/JCI88959.)。CRISPR/Cas9控制CART细胞PD-1的破坏表现出了高效抗肿瘤效果(Levi JR,Kathrin S,Kole TR,Ga RE,Chun JY.CRISPR/Cas9-mediated PD-1disruptionenhances anti-tumor efficacy of human chimeric antigen receptor T cells.2017；(April 2016):1-10.doi:10.1038/s41598-017-00462-8.)，然而也有研究发现在初始CD8+T细胞中程序性细胞死亡因子1基因(PDCD1)的意外缺失会增加其耗竭并损伤细胞的存活性和功能(Odorizzi PM,Pauken KE,Paley MA,Sharpe A,Wherry EJ.Genetic absence ofPD-1promotes accumulation of terminally differentiated exhausted CD8+Tcells.J Exp Med.2015；212(7):1125-1137.doi:10.1084/jem.20142237.)。基因沉默是一种能降低目的基因表达的分子机制，它不像基因敲除会消除整个目的基因的表达，只会使靶基因的表达降低至少70％(Hood E.RNAi:What’s all the noise about genesilencing？ Environ Heal Perspect 112 A224–9 doi101289/ehp112-a224.)。所以我们假设，如果只是用RNAi,CRISPR或者siRNA的方式使CART细胞中的PD-1表达降低，T细胞就能躲避肿瘤微环境中的抑制信号，并且避免完全消除PDCD1基因带来的损害。为了这个目的，我们将一个抗-PD-1shRNA与一个三代靶向CD19的41BB+CD28CAR结合到同一个表达质粒上，然后检查了PD-1的基因沉默是否会增加CART细胞的抗肿瘤效应(细胞毒性和增殖能力)。
CART细胞免疫治疗在血液肿瘤的临床前和临床试验中表现出巨大的潜力，但由于肿瘤微环境中免疫检查点的抑制作用，CART细胞在实体瘤治疗中的效果一直不尽如人意，其中PD-1/PD-L1通路已经被证实与T细胞耗竭有关，会导致CART细胞功能减退，肿瘤清除能力受损等问题。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种能同时表达CD19 CAR和敲低T细胞表面PD-1表达的质粒结构。
为了达成上述的目的，本发明提供一种能同时表达CD19 CAR和敲低T细胞表面PD-1表达的质粒结构pLVX-H1-shRNA-EF1α-CD19，包括：依次串联的H1启动子、由H1启动子启动的抗PD-1shRNA序列、EF1α启动子以及由EF1α启动子启动的三代CD19 CAR序列；所述三代CD19 CAR序列由CD19单链可变区、CD8α铰链区、CD28跨膜区和胞内区、41BB胞内区、以及CD3ζ胞内区串联构成。
进一步地，其中所述抗PD-1shRNA序列为PD1-1shRNA序列、PD1-4shRNA序列、抗PD1-8shRNA序列或抗PD1-10shRNA序列。
进一步地，其中所述抗PD-1shRNA序列为抗PD1-1shRNA序列，其核苷酸序列如SEQID NO.1所示。
进一步地，其中所述抗PD-1shRNA序列为抗PD1-8shRNA序列，其核苷酸序列如SEQID NO.2所示。
进一步地，其中所述质粒结构以三代CD19 CAR序列的结构为信号传导结构域。
进一步地，其中所述三代CD19 CAR序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
进一步地，其中所述三代CD19 CAR序列的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
进一步地，其中所述H1启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
进一步地，其中所述EF1α启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
本发明还提供一种上述质粒结构pLVX-H1-shRNA-EF1α-CD19的构建方法，包括以下步骤：
1)通过预实验优选出的合适的抗PD-1shRNA序列，基因合成H1启动子；
2)之后将H1启动子和shRNA序列亚克隆合成到pLVX-EF1α-IRES-Puro载体的ClaⅠ和SphⅠ酶切位点之间，得到pLVX-H1-shRNA-IRES-puro中间载体；
3)合成三代CD19-CAR序列，其两端带有BamHⅠ和MluⅠ的酶切位点，由酶切连接的方法亚克隆到pLVX-H1-shRNA-IRES-puro中间载体，得到质粒结构pLVX-H1-shRNA-EF1α-CD19。
进一步地，其中所述pLVX-EF1α-IRES-Puro载体上自带有EF1α启动子。
本发明具有如下有益效果：
携带抗-PD-1shRNA的CD19-CAR T细胞的PD-1表达发生明显降低，由q-PCR验证，降低效率在20％-40％之间。
携带抗-PD-1shRNA的CD19-CAR T细胞对CD19阳性靶细胞RAJI肿瘤细胞的体外杀伤作用相对于普通CD19-CART细胞发生明显增强；对于阴性靶细胞JURKAT肿瘤的体外杀伤作用没有明显影响。
携带抗-PD-1shRNA的CD19-CAR T细胞在体外与丝裂霉素C处理失去增殖能力的PD-L1高表达的肿瘤细胞共培养体系表现出了更好的细胞增殖能力和更少发生凋亡的情况。
携带抗-PD-1shRNA的CD19-CAR T细胞在体外与PD-L1高表达的肿瘤细胞共培养体系表现出了分泌更多的细胞因子IFN-gama的特点。
附图说明
图1为本发明所述的质粒结构示意图；
图2为mCherry阳性/mCherry阴性细胞GFP平均荧光强度比例图；
图3为jurkat细胞PD-1表达降低图；
图4为人T细胞PD-1表达降低图；
图5为q-PCR验证CART细胞PD-1表达降低图；
图6A为CART细胞体外肿瘤细胞杀伤能力的测定图之一；
图6B为CART细胞体外肿瘤细胞杀伤能力的测定图之二；
图7A为CART细胞与灭活肿瘤细胞体外共培养增殖能力和凋亡情况测定图之一；
图7B为CART细胞与灭活肿瘤细胞体外共培养增殖能力和凋亡情况测定图之二；
图8为CART细胞与肿瘤细胞体外共培养细胞因子分泌能力测定图；
图9为肿瘤细胞系表达PD-L1的图；
图10为丝裂霉素处理肿瘤细胞不影响细胞表面PD-L1表达的图；
图11为CART细胞与丝裂霉素灭活Raji细胞共培养增殖能力测定的图。
具体实施方式
下列实施例将进一步说明本发明的其它特征和优点，但该等实施例仅为示例而用，并非对本发明的限制。
以下所涉及的材料或试剂除非特别说明，均为市售。
本发明提供了一种能同时表达CD19 CAR和敲低T细胞表面PD-1表达的质粒结构pLVX-H1-shRNA-EF1α-CD19，包括：依次串联的H1启动子、由H1启动子启动的抗PD-1shRNA序列、EF1α启动子以及由EF1α启动子启动的三代CD19 CAR序列；所述三代CD19 CAR序列由CD19单链可变区、CD8α铰链区、CD28跨膜区和胞内区、41BB胞内区、以及CD3ζ胞内区串联构成。所述抗PD-1shRNA序列为PD1-1shRNA序列、PD1-4shRNA序列、抗PD1-8shRNA序列或抗PD1-10shRNA序列。当所述抗PD-1shRNA序列为抗PD1-1shRNA序列时，其核苷酸序列如SEQID NO.1所示。当所述抗PD-1shRNA序列为抗PD1-8shRNA序列时，其核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。所述质粒结构以三代CD19 CAR序列的结构为信号传导结构域。所述三代CD19CAR序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。所述三代CD19 CAR序列的氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示。所述H1启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。所述EF1α启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
上述能同时表达CD19 CAR和敲低PD-1的质粒结构pLVX-H1-shRNA-EF1α-CD19的构建方法，包括以下步骤：
1)通过预实验优选出的合适的抗PD-1shRNA序列，基因合成H1启动子；
2)之后将H1启动子和shRNA序列亚克隆合成到pLVX-EF1α-IRES-Puro载体(其为标准载体，自带有EF1α启动子)的ClaⅠ和SphⅠ酶切位点之间，得到pLVX-H1-shRNA-IRES-puro中间载体；
3)合成三代CD19-CAR序列，其两端带有BamHⅠ和MluⅠ的酶切位点，由酶切连接的方法亚克隆到pLVX-H1-shRNA-IRES-puro中间载体，得到质粒结构pLVX-H1-shRNA-EF1α-CD19，如图1所示。
下文结合具体实施例进行进一步说明。
实施例1能共表达CAR和shRNA的骨架质粒筛选，K-562人慢性髓原白血病细胞中的GFP表达能被p H1结构有效敲低
为了简化实验我们先用慢病毒转导和puromycin筛选构建了GFP+K562稳定细胞系，然后用mCherry荧光序列代替CAR序列，使用不同的启动子和质粒结构构建了三个骨架质粒p H1，p MSCV和p EF1α。通过慢病毒将三种质粒转导进GFP+K-562人慢性髓原白血病细胞系，流式检测mCherry和GFP荧光表达强度。实验结果如图2所示，p H1+K562相比于其余两个表现出了更明显的GFP表达下调现象，说明此骨架是可以允许shRNA和目的CAR序列同时高效表达的。
实施例2在jurkat细胞系和人CD3+T细胞中筛选和验证最高效的抗-PD-1shRNA序列
预实验证明Jurkat细胞系和人CD3+T细胞也能由人T细胞激活免疫磁珠CD3/CD28磁珠诱导表达PD-1。我们用十个靶向PD-1mRNA可敲低其表达的shRNA序列如表1所示构建了表达质粒，使用GFP荧光作为标记。然后将十个质粒经慢病毒转导进Jurkat细胞系，用CD3/CD28磁珠刺激后流式检测jurkat细胞表面GFP荧光和PD-1表达情况。实验结果说明，在激活的jurkat细胞中，PD1-1,PD1-4,PD1-8和PD1-10都表现出了较好的PD-1敲低作用如图3所示。
为了验证在人T细胞中的作用，我们将这四个shRNA序列的慢病毒进行浓缩和纯化使其达到高滴度，然后转导进PBMC分选得到并用CD3/CD28磁珠激活的人CD3+T细胞中，流式检测细胞表面GFP荧光和PD-1表达情况。结果说明PD1-1和PD1-8都表现出了接近60％的PD-1敲低作用如图4所示。
表1 10个anti-PD-1shRNA的序列
实施例3携带抗-PD-1shRNA的CD19-CAR T细胞表面PD-1表达降低
将筛选得到的两个shRNA序列PD1-1和PD1-8使用p H1的结构与三代抗-CD1941BB+CD28CAR亚克隆到pLVX-IRES-puro标准载体的质粒结构上。使用基本CD19-CAR作为阴性对照组，通过慢病毒包装，用浓缩纯化后的高低度病毒转导健康志愿者用CD3/CD28磁珠刺激后的CD3+T细胞。转导后72h流式检测转效，在转导后24h，72h分别收集三组样品(CD19-control；CD19-PD1-1；CD19-PD1-8)提取总RNA，相对定量q-PCR分析T细胞中PD-1mRNA表达水平(GAPDH作为内参)。实验结果表明，相对于CD19-control组，携带抗-PD-1shRNA的两组CART细胞都表现出了PD-1mRNA降低的能力，降低水平在20％-40％之间(图5)。
实施例4携带抗-PD-1shRNA的CD19-CAR T细胞具有更高的体外肿瘤杀伤能力
用CD19+的淋巴瘤细胞-Raji细胞系作为阳性靶细胞，人急性T淋巴细胞白血病细胞-Jurkat细胞系作为阴性靶细胞，采用钙黄绿素标记法检测T细胞杀伤活性。体外肿瘤杀伤实验前一天复测慢病毒转效，按照转效计算有效细胞数进行T细胞杀伤毒性实验。实验结果表明，携带抗-PD-1shRNA的CART细胞(CD19-PD1-1；CD19-PD1-8)相对于阴性对照组(CD19)表现出了更高的细胞毒性(图6A，图6B)。
实施例5携带抗-PD-1shRNA的CD19-CAR T细胞在体外肿瘤细胞共培养体系中能分泌更多的细胞因子，并明显减轻了肿瘤免疫检查点抑制作用。
为了研究PD-1的基因沉默对CART细胞的功能影响，我们需要先构建一个肿瘤细胞表面表达可检测PD-L1的微环境，即使用肿瘤细胞和T细胞共培养的方式来实现。实验发现8226肿瘤细胞系表面大量表达可检测PD-L1抗原如图9所示，经丝裂霉素C抑制DNA合成从而失去增殖能力处理后不影响表达程度如图10所示，可以用来实现PD-1免疫检查点的抑制作用；同时使用Raji细胞作为CD19+刺激抗原。通过CFSE标记效应细胞和Raji肿瘤细胞共培养的预实验我们发现在T细胞：肿瘤细胞＝2:1(细胞数)时共培养系统中CART细胞表现出了明显的增殖扩增如图11所示，所以我们的正式试验选用T细胞：肿瘤细胞＝1:1(细胞数)来达到更好的刺激增殖效果。
慢病毒转导的第三天，流式细胞术检测转效后，在六孔板中将CART细胞与丝裂霉素C灭活处理过的8226肿瘤细胞和Raji肿瘤细胞以细胞数1:1:1的比例共培养，每种细胞6*10^5cells每孔。为了检测基因沉默PD-1对CART细胞凋亡情况的影响，在共培养后48h，用AnnexinV+7-AAD流式检测分析CD3+T细胞发生凋亡的情况。我们发现CD19-PD1-1/8细胞相对于CD19表现出更低的发生凋亡细胞比例(图7B)。
我们同时使用了CFSE标记CART细胞之后再与8226和Raji细胞共培养，72h后流式检测T细胞中CFSE强度来观察T细胞增殖情况。实验结果显示，CD19-PD1-1/8细胞相对于CD19细胞发生增殖的细胞比例有微小而显著的增加，说明携带抗-PD-1shRNA的CD19-CAR T在体外PD-L1免疫检查点抑制的情况下具有更强的细胞增殖能力(图7A)。
随后，我们确认了各组共培养细胞的细胞因子分泌的差异，通过分别建立缺乏外源添加的IL-2共培养体系并收集6h，24h培养上清，ELISA检测IFN-γ的浓度，结果表明，携带抗-PD-1shRNA的CD19-CAR T细胞具有更强的IFN-γ分泌能力(图8)。
实施例6动物实验
a.构建PD-L1+的raji肿瘤细胞系；b.购买4-6周大小的NSG的小鼠约30只，培养3-6天后检查生长情况；c.使用PD-L1+的Raji细胞尾静脉注射到NGS小鼠体内，培养5-7天后成像观察成瘤情况；d.成瘤的小鼠分成四组：Control T；CD19-control；CD19-PD1-1；CD19-PD-1-8，每组5-6只,分别按照剂量回输CART和对照T细胞；e.每3-5天成像检测各组小鼠肿瘤负荷情况以及取血检测血液中细胞因子分皿情况，共检测7-8次。实验结果表明，实验组CD19-PD1-1和CD19-PD-1-8肿瘤负荷会持续低于对照组甚至完全清除，并且血液中的细胞因子水平更高；T细胞回输后按时取血Q-PCR检测血液中CART细胞持续水平,CD19-PD1-1和CD19-PD-1-8持续时间更长且活性更好。
综上所述，以上所述仅为本发明的较佳实施例，并非因此而限制本发明的专利保护范围，故举凡本发明说明书及附图所作等效变化等，皆应包括于本发明的保护范围内。
序列表
<110> 武汉波睿达生物科技有限公司
<120> 一种能同时表达CD19CAR和敲低T细胞表面PD-1表达的质粒结构及其构建方法
<130> WH1801020-1
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 54
<212> DNA
<213> 人源(human.sp.)
<400> 1
gtgctaaact ggtaccgcat ttcaagagaa tgcggtacca gtttagcatt tttt 54
<210> 2
<211> 55
<212> DNA
<213> 人源(human.sp.)
<400> 2
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<210> 3
<211> 1596
<212> DNA
<213> 鼠源(mice.sp.)
<400> 3
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<212> PRT
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340 345 350
Pro Ala Ala Pro Gly Pro Thr Ala Leu His Thr Gly Pro Thr Ala Pro
355 360 365
Pro Ala Ala Pro Ala Ala Thr Ala Ser Leu Ala Gly Ala Leu Leu Leu
370 375 380
Leu Thr Ile Pro Leu Gly Pro Pro Met Ala Pro Val Gly Thr Thr Gly
385 390 395 400
Gly Gly Ala Gly Cys Ser Cys Ala Pro Pro Gly Gly Gly Gly Gly Gly
405 410 415
Cys Gly Leu Ala Val Leu Pro Ser Ala Ser Ala Ala Ala Pro Ala Thr
420 425 430
Gly Gly Gly Gly Ala Gly Leu Thr Ala Gly Leu Ala Leu Gly Ala Ala
435 440 445
Gly Gly Thr Ala Val Leu Ala Leu Ala Ala Gly Ala Ala Pro Gly Met
450 455 460
Gly Gly Leu Pro Ala Ala Leu Ala Pro Gly Gly Gly Leu Thr Ala Gly
465 470 475 480
Leu Gly Leu Ala Leu Met Ala Gly Ala Thr Ser Gly Ile Gly Met Leu
485 490 495
Gly Gly Ala Ala Ala Gly Leu Gly His Ala Gly Leu Thr Gly Gly Leu
500 505 510
Ser Thr Ala Thr Leu Ala Thr Thr Ala Ala Leu His Met Gly Ala Leu
515 520 525
Pro Pro Ala
530
<210> 5
<211> 222
<212> DNA
<213> 人源(human.sp.)
<400> 5
aacgctgacg tcatcaaccc gctccaagga atcgcgggcc cagtgtcact aggcgggaac 60
acccagcgcg cgtgcgccct ggcaggaaga tggctgtgag ggacagggga gtggcgccct 120
gcaatatttg catgtcgcta tgtgttctgg gaaatcacca taaacgtgaa atgtctttgg 180
atttgggaat cttataagtt ctgtatgaga ccactctttc cc 222
<210> 6
<211> 1182
<212> DNA
<213> 人源(human.sp.)
<400> 6
gctccggtgc ccgtcagtgg gcagagcgca catcgcccac agtccccgag aagttggggg 60
gaggggtcgg caattgaacc ggtgcctaga gaaggtggcg cggggtaaac tgggaaagtg 120
atgtcgtgta ctggctccgc ctttttcccg agggtggggg agaaccgtat ataagtgcag 180
tagtcgccgt gaacgttctt tttcgcaacg ggtttgccgc cagaacacag gtaagtgccg 240
tgtgtggttc ccgcgggcct ggcctcttta cgggttatgg cccttgcgtg ccttgaatta 300
cttccacgcc cctggctgca gtacgtgatt cttgatcccg agcttcgggt tggaagtggg 360
tgggagagtt cgaggccttg cgcttaagga gccccttcgc ctcgtgcttg agttgaggcc 420
tggcttgggc gctggggccg ccgcgtgcga atctggtggc accttcgcgc ctgtctcgct 480
gctttcgata agtctctagc catttaaaat ttttgatgac ctgctgcgac gctttttttc 540
tggcaagata gtcttgtaaa tgcgggccaa gatctgcaca ctggtatttc ggtttttggg 600
gccgcgggcg gcgacggggc ccgtgcgtcc cagcgcacat gttcggcgag gcggggcctg 660
cgagcgcggc caccgagaat cggacggggg tagtctcaag ctggccggcc tgctctggtg 720
cctggcctcg cgccgccgtg tatcgccccg ccctgggcgg caaggctggc ccggtcggca 780
ccagttgcgt gagcggaaag atggccgctt cccggccctg ctgcagggag ctcaaaatgg 840
aggacgcggc gctcgggaga gcgggcgggt gagtcaccca cacaaaggaa aagggccttt 900
ccgtcctcag ccgtcgcttc atgtgactcc acggagtacc gggcgccgtc caggcacctc 960
gattagttct cgagcttttg gagtacgtcg tctttaggtt ggggggaggg gttttatgcg 1020
atggagtttc cccacactga gtgggtggag actgaagtta ggccagcttg gcacttgatg 1080
taattctcct tggaatttgc cctttttgag tttggatctt ggttcattct caagcctcag 1140
acagtggttc aaagtttttt tcttccattt caggtgtcgt ga 1182
Claims (10)
1.一种能同时表达CD19CAR和敲低T细胞表面PD-1表达的质粒结构pLVX-H1-shRNA-EF1α-CD19，其特征在于，包括：依次串联的H1启动子、由H1启动子启动的抗PD-1 shRNA序列、EF1α启动子以及由EF1α启动子启动的三代CD19 CAR序列；所述三代CD19 CAR序列由CD19单链可变区、CD8α铰链区、CD28跨膜区和胞内区、41BB胞内区、以及CD3ζ胞内区串联构成。
2.如权利要求1所述的质粒结构pLVX-H1-shRNA-EF1α-CD19，其特征在于，所述抗PD-1shRNA序列为PD1-1 shRNA序列、PD1-4 shRNA序列、抗PD1-8 shRNA序列或抗PD1-10 shRNA序列。
3.如权利要求2所述的质粒结构pLVX-H1-shRNA-EF1α-CD19，其特征在于，所述抗PD-1shRNA序列为抗PD1-1 shRNA序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
4.如权利要求2所述的质粒结构pLVX-H1-shRNA-EF1α-CD19，其特征在于，所述抗PD-1shRNA序列为抗PD1-8 shRNA序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
5.如权利要求1所述的质粒结构pLVX-H1-shRNA-EF1α-CD19，其特征在于，所述质粒结构以三代CD19 CAR序列的结构为信号传导结构域。
6.如权利要求5所述的质粒结构pLVX-H1-shRNA-EF1α-CD19，其特征在于，所述三代CD19 CAR序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
7.如权利要求5所述的质粒结构pLVX-H1-shRNA-EF1α-CD19，其特征在于，所述三代CD19 CAR序列的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
8.如权利要求1所述的质粒结构pLVX-H1-shRNA-EF1α-CD19，其特征在于，所述H1启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述EF1α启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
9.一种权利要求1-8任一项所述的质粒结构pLVX-H1-shRNA-EF1α-CD19的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)通过预实验优选出的合适的抗PD-1 shRNA序列，基因合成H1启动子；
2)之后将H1启动子和shRNA序列亚克隆合成到pLVX-EF1α-IRES-Puro标准载体的ClaⅠ和SphⅠ酶切位点之间，得到pLVX-H1-shRNA-IRES-puro中间载体；
3)合成三代CD19-CAR序列，其两端带有BamHⅠ和MluⅠ的酶切位点，由酶切连接的方法亚克隆到pLVX-H1-shRNA-IRES-puro中间载体，得到质粒结构pLVX-H1-shRNA-EF1α-CD19。
10.如权利要求9所述的构建方法，其特征在于，所述pLVX-EF1α-IRES-Puro载体上自带有EF1α启动子。
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