KR20200068750A - 키메라 수용체 및 그의 사용 방법 - Google Patents

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제드 윌치우스
루벤 알바레즈 로드리게즈
앨리스 배커
타라 아베드슨
로렌 우
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카이트 파마 인코포레이티드
암젠 인크
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Abstract

항원 결합 분자, 키메라 수용체, 및 조작된 면역 세포가 본 발명에 따라 개시된다. 본 발명은 추가로 벡터, 조성물, 및 항원 결합 분자 및 조작된 면역 세포를 사용한 치료 및/또는 검출 방법에 관한 것이다.

Description

키메라 수용체 및 그의 사용 방법{CHIMERIC RECEPTORS AND METHODS OF USE THEREOF}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2016년 4월 1일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 62/317,068의 이익을 주장하며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 포맷으로 전자 제출된 서열 목록을 포함하고, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 2017년 3월 31일에 작성된 상기 ASCII 카피의 명칭은 K-1029_02_SL.txt이고, 크기는 265,830 바이트이다.
C-유형 렉틴-유사-1 (CLL-1, 또한 CLEC-1, CLEC12A, MICL, 수지상 세포-연관 렉틴-1 (DCAL-1), 및 DCAL-2로도 알려짐)은 당단백질 수용체이고, 세포 증식의 조절 및 면역 조절에 수반되는 C-유형 렉틴-유사 수용체의 패밀리의 구성원이다. CLL-1은 조혈 세포에서, 주로 단핵구, 과립구, 수지상 세포, 뿐만 아니라 골수 전구세포를 포함한 선천성 면역 세포 상에서 발현된다. 문헌 [Van Rhenen et al., Blood 2007:110(7)]. CLL-1은 골수 세포 증식 및 분화의 조절에 연루되어 왔고 (Bakker et al., Cancer Res. 64:8443-8450 (2004); Marshall et al., J. Biol. Chem. 279:14792-14802 (2004)), 급성 골수성 (골수) 백혈병 (AML) 세포 뿐만 아니라 백혈병성 줄기 세포 (Zhao et al., Haematologica 2010, 95(1):71-78) 상에 존재한다.
따라서, CLL-1은 급성 골수성 (골수) 백혈병 (AML), 만성 골수성 (골수) 백혈병 (CML), 만성 골수단핵구성 백혈병 (CMML), 소아 골수단핵구성 백혈병, 비정형 만성 골수성 백혈병, 급성 전골수구성 백혈병 (APL), 급성 단핵구성 백혈병, 급성 단핵모구성 백혈병, 급성 적백혈병, 급성 거핵모구성 백혈병, 골수이형성 증후군 (MDS), 골수증식성 장애, 골수성 신생물, 골수성 육종), 모구성 형질세포양 수지상 세포 신생물 (BPDCN), 또는 그의 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다발성 질환에 연루되어 왔다.
CLL-1은 추가적으로 염증성 또는 자가면역 질환 예컨대 류마티스 관절염, 건선, 알레르기, 천식, 크론병, IBD, IBS, 섬유근육통, 비만세포증, 및 복강 질환에서 소정의 역할을 할 수 있다.
인간 CLL-1 단백질은 하기 아미노산 서열의 폴리펩티드를 포함한다:
MSEEVTYADLQFQNSSEMEKIPEIGKFGEKAPPAPSHVWRPAALFLTLLCLLLLIGLGVLASMFHVTLKIEMKKMNKLQNISEELQRNISLQLMSNMNISNKIRNLSTTLQTIATKLCRELYSKEQEHKCKPCPRRWIWHKDSCYFLSDDVQTWQESKMACAAQNASLLKINNKNALEFIKSQSRSYDYWLGLSPEEDSTRGMRVDNIINSSAWVIRNAPDLNNMYCGYINRLYVQYYHCTYKKRMICEKMANPVQLGSTYFREA (서열식별번호(SEQ ID NO): 140).
추가의 서열 정보는 CLL-1 유니프롯 목록: http://www.uniprot.org/uniprot/Q5QGZ9, 뿐만 아니라 NCBI 참조 서열 NP_612210.4 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_612210.4)에 포함되어 있다.
CLL-1을 언급할 때, 그에 대한 언급은 그의 단편, 뿐만 아니라 대립유전자 변이체, 스플라이스 변이체, 유도체 변이체, 치환 변이체, 결실 변이체, 및/또는 N-말단 메티오닌의 부가를 포함한 삽입 변이체, 융합 폴리펩티드, 및 종간 상동체를 포함하나 이에 제한되지는 않는 관련 폴리펩티드를 포괄한다는 것이 인지될 것이다. 특정 실시양태에서, CLL-1 폴리펩티드는 말단 잔기, 예컨대, 비제한적으로, 리더 서열 잔기, 표적화 잔기, 아미노 말단 메티오닌 잔기, 리신 잔기, 태그 잔기 및/또는 융합 단백질 잔기를 포함한다.
CLL-1에 대한 특정 항체가 미국 특허 번호 8,536,310 및 미국 특허 번호 9,163,090에 기재되어 있다.
조작된 면역 세포는 치유적 치료에서, 특히 종양학에서 목적하는 품질을 보유한다는 것이 제시된 바 있다. 2가지 주요 유형의 조작된 면역 세포는 키메라 항원 수용체 ("CAR" 또는 "CAR-T"로 불림) 및 T-세포 수용체 ("TCR")를 함유하는 것이다. 이들 조작된 세포는 표적 세포를 인식하고 사멸시키는 그의 능력을 보유하거나 이를 증진시키는 한편, 그에게 항원 특이성을 부여하기 위해 조작된다. 키메라 항원 수용체는, 예를 들어, (i) 항원-특이적 성분 ("항원 결합 분자"), (ii) 세포외 도메인, (iii) 1개 이상의 공동자극 도메인, 및 (iv) 1개 이상의 활성화 도메인을 포함할 수 있다. 각각의 도메인은 이종일 수 있고, 즉, 상이한 단백질 쇄로부터 유래된 (또는 그에 상응하는) 서열로 구성될 수 있다. 키메라 항원 수용체-발현 면역 세포 (예컨대 T 세포)는 암 요법을 포함한 다양한 요법에서 사용될 수 있다. 표적 항원에 대한 CAR-발현 세포의 활성화를 증진시키는데 공동자극 도메인이 사용될 수 있고, 이는 따라서 입양 면역요법의 효력을 증가시킬 수 있다는 것이 인지될 것이다.
CLL-1에 대한 특정 CAR이 예를 들어 미국 특허 출원 20160051651 (PCT US2015/041337)에 기재되어 있다.
T 세포는 1개 이상의 목적하는 표적에 대한 특이성을 보유하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, T 세포는 항원 결합 분자, 예컨대 항체의 1개 이상의 단일 쇄 가변 단편 ("scFv")을, 1개 이상의 신호전달 분자, 및/또는 1개 이상의 활성화 도메인, 예컨대 CD3 제타와 함께 코딩하는 DNA 또는 다른 유전 물질로 형질도입될 수 있다.
CAR-T 세포가 표적화된 세포를 인식하고 파괴하는 능력에 더하여, 성공적인 T 세포 요법은 CAR-T 세포가 지속되는 능력 및 항원에 반응하여 증식하는 능력을 유지하는 능력으로부터 이익을 얻는다.
T 세포 수용체 (TCR)는 펩티드가 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 분자에 결합함에 따라 항원 단편을 인식하는 것을 담당하는, T 세포의 표면 상에서 발견되는 분자이다. TCR은 2개의 상이한 단백질 쇄로 구성되고 - 인간 TCR의 대략 95%에서, TCR은 알파 (α) 및 베타 (β) 쇄로 이루어진다. 인간 T 세포의 대략 5%에서 TCR은 감마 및 델타 (γ/δ) 쇄로 이루어진다. 각각의 쇄는 2개의 세포외 도메인: 가변 (V) 영역 및 불변 (C) 영역으로 구성되고, 이는 둘 다 이뮤노글로불린 슈퍼패밀리이다. 다른 이뮤노글로불린에서와 같이, TCR α-쇄 및 β-쇄 (또는 감마 및 델타 (γ/δ) 쇄)의 가변 도메인은 각각 3개의 초가변 또는 상보성 결정 영역 (CDR)을 갖는다. TCR이 항원 펩티드 및 MHC (펩티드/MHC)와 맞물리면, T 세포는 활성화되어, 그것이 표적 세포를 공격하고 파괴하게 할 수 있게 된다.
그러나, 현행 요법은 다양한 수준의 유효성을 바람직하지 않은 부작용과 함께 나타내어 왔다. 따라서, CLL-1 관련 질환 및 장애를 치료하기 위한 신규하고 개선된 요법을 확인하는 것에 대한 필요가 존재한다.
본 발명은 CLL-1에 대한 특이성을 갖는 조작된 면역 세포 (예컨대 CAR 또는 TCR), 항원 결합 분자 (항체, scFv, 중쇄 및/또는 경쇄, 및 이들 항원 결합 분자의 CDR을 포함하나 이에 제한되지는 않음)에 관한 것이다.
본 발명은 추가로, 이들 세포에서 공동자극 도메인으로서 유용한 신규한 CD28 세포외 (힌지) 서열에 관한 것이다.
본 발명의 키메라 항원 수용체는 전형적으로 (i) CLL-1 특이적 항원 결합 분자, (ii) 세포외 (힌지를 포함할 수 있음) 도메인, (iii) 1개 이상의 공동자극 도메인, 및 (iv) 1개 이상의 활성화 도메인을 포함한다. 각각 도메인은 이종일 수 있고, 따라서 상이한 단백질 쇄로부터 유래된 (또는 그에 상응하는) 서열로 구성될 수 있다는 것이 인지될 것이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 CLL-1에 특이적으로 결합하는 항원 결합 분자를 포함하는 키메라 항원 수용체에 관한 것이며, 여기서 항원 결합 분자는 a) 서열식별번호: 17, 51, 73, 및 95로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 CDR1, b) 서열식별번호: 18, 52, 74, 및 96으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 CDR2, c) 서열식별번호: 19, 53, 75, 및 97로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 CDR3, d) 서열식별번호: 22, 56, 78, 및 100으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 CDR1, e) 서열식별번호: 23, 57, 79, 및 101로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 CDR2, 및 f) 서열식별번호: 24, 58, 80, 및 102로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 CDR3 중 적어도 1개를 포함한다. 키메라 항원 수용체는 적어도 1개의 공동자극 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 청구범위 1에 따른 키메라 항원 수용체는 적어도 1개의 활성화 도메인을 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 본원에 제시된 키메라 항원 수용체와 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 동일한 키메라 항원 수용체에 관한 것이다.
또한, 그에 대해 8개 이하의 아미노산 치환을 갖는 키메라 항원 수용체가 본 발명에 포괄된다.
특정 실시양태에서 공동자극 도메인은 CD28, OX-40, 4-1BB/CD137, CD2, CD7, CD27, CD30, CD40, 프로그램화된 사멸-1 (PD-1), 유도성 T 세포 공동자극자 (ICOS), 림프구 기능-연관 항원-1 (LFA-1, CD11a/CD18), CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD247, CD276 (B7-H3), LIGHT, (TNFSF14), NKG2C, Ig 알파 (CD79a), DAP-10, Fc 감마 수용체, MHC 부류 1 분자, TNF 수용체 단백질, 이뮤노글로불린 단백질, 시토카인 수용체, 인테그린, 신호전달 림프구성 활성화 분자 (SLAM 단백질), 활성화 NK 세포 수용체, BTLA, 톨 리간드 수용체, ICAM-1, B7-H3, CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8알파, CD8베타, IL-2R 베타, IL-2R 감마, IL-7R 알파, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드, 또는 그의 임의의 조합의 신호전달 도메인 (또는 다른 적합한 부분)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 공동자극 도메인은 서열식별번호: 141에 제시된 4-1BB 핵산 서열, 및 서열식별번호: 142에 제시된 바와 같은 상응하는 아미노산 서열의 모두 또는 일부를 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 공동자극 도메인은 서열식별번호: 143에 제시된 바와 같은 OX40의 아미노산 서열의 모두 또는 일부를 포함할 수 있다. 또한, 문헌 [Hombach et al., Oncoimmunology. 2012 Jul. 1; 1(4): 458-466]을 참조한다. 다른 실시양태에서, 공동자극 도메인은 문헌 [Guedan et al., August 14, 2014; Blood: 124 (7) 및 Shen et al., Journal of Hematology & Oncology (2013) 6:33]에 기재된 바와 같은 ICOS 분자의 모두 또는 일부를 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 공동자극 도메인은 문헌 [Song et al., Oncoimmunology. 2012 Jul. 1;1(4): 547-549]에 기재된 바와 같은 CD27의 모두 또는 일부를 포함할 수 있다.
바람직한 실시양태는 하기 서열: 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 6, 및 서열식별번호: 8 중 1개 이상의 본 발명의 CAR 내로의 혼입을 포함한다. 추가의 바람직한 실시양태는 서열식별번호: 14에 제시된 서열의 본 발명의 CAR 내로의 혼입을 포함한다.
추가 실시양태에서, 활성화 도메인은 CD3, 바람직하게는 CD3 제타, 보다 바람직하게는 서열식별번호: 10에 제시된 서열을 갖는 CD3 제타를 포함한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 추가로 서열식별번호: 2를 포함하고 추가로 서열식별번호: 10을 포함하는 항원 결합 분자를 포함하는 키메라 항원 수용체에 관한 것이다.
본 발명은 추가로, 키메라 항원 수용체를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드, 및 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터에 관한 것이다. 관련 기술분야에 공지된 임의의 벡터가 본 발명에 적합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 벡터는 레트로바이러스 벡터 (예컨대 pMSVG1), DNA 벡터, 뮤린 백혈병 바이러스 벡터, SFG 벡터, 플라스미드, RNA 벡터, 아데노바이러스 벡터, 바큘로바이러스 벡터, 엡스타인 바르 바이러스 벡터, 파포바바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터, 단순 포진 바이러스 벡터, 아데노바이러스 연관 벡터 (AAV), 렌티바이러스 벡터 (예컨대 pGAR), 또는 그의 임의의 조합이다. pGAR 서열은 다음과 같다:
Figure pat00001
Figure pat00002
Figure pat00003
Figure pat00004
Figure pat00005
pGAR 벡터 지도가 하기 제시된다:
Figure pat00006
적합한 추가의 예시적인 벡터는 예를 들어 pBABE-퓨로, pBABE-네오 대형 TcDNA, pBABE-히그로-hTERT, pMKO.1 GFP, MSCV-IRES-GFP, pMSCV PIG (퓨로 IRES GFP 공 플라스미드), pMSCV-loxp-dsRed-loxp-eGFP-퓨로-WPRE, MSCV IRES 루시페라제, pMIG, MDH1-PGK-GFP_2.0, TtRMPVIR, pMSCV-IRES-mCherry FP, pRetroX GFP T2A Cre, pRXTN, pLncEXP, 및 pLXIN-Luc를 포함한다.
예시적인 면역 세포는 T 세포, 종양 침윤 림프구 (TIL), NK 세포, TCR-발현 세포, 수지상 세포, 또는 NK-T 세포를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. T 세포는 자가, 동종 또는 이종일 수 있다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 면역 세포를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은
(a) 서열식별번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열식별번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
(b) 서열식별번호: 50의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열식별번호: 55의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
(c) 서열식별번호: 72의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열식별번호: 77의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역;
(d) 서열식별번호: 94의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열식별번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역
중 적어도 1개를 포함하는 항원 결합 분자 (및 이들 분자를 포함하는 키메라 항원 수용체)에 관한 것이며;
여기서 VH 및 VL 영역 또는 영역들은 적어도 1개의 링커에 의해 연결된다. 또한, 그에 대해 8개 이하의 아미노산 치환을 갖는 키메라 항원 수용체 및/또는 항원 결합 분자가 본 발명에 포괄된다.
링커는 예를 들어 폴리-Gly 링커 예컨대 GGGGSGGGGSGGGGS (서열식별번호: 130) 또는 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (서열식별번호: 145)일 수 있다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 항원 결합 분자 (및 이들 분자를 포함하는 키메라 항원 수용체)에 관한 것이며, 여기서 링커는 서열식별번호: 130 및 서열식별번호: 132 중 적어도 1개를 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 본원에 제시된 항원 결합 분자 및/또는 키메라 항원 수용체와 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 동일한 항원 결합 분자 및/또는 키메라 항원 수용체에 관한 것이다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 27; 서열식별번호: 31; 서열식별번호: 35; 서열식별번호: 39; 서열식별번호: 43; 서열식별번호: 47; 서열식별번호: 61; 서열식별번호: 65; 서열식별번호: 69; 서열식별번호: 83; 서열식별번호: 87; 서열식별번호: 91; 서열식별번호: 105; 서열식별번호: 109; 서열식별번호: 113; 서열식별번호: 117; 서열식별번호: 121; 및 서열식별번호: 125 중 적어도 1개를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 본원에 제시된 폴리뉴클레오티드와 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 동일한 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
본 발명은 추가로, 이들 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 뿐만 아니라 이들 벡터를 사용하여 형질도입된 세포에 관한 것이다.
추가 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 28; 서열식별번호: 32; 서열식별번호: 36; 서열식별번호: 40; 서열식별번호: 44; 서열식별번호: 48; 서열식별번호: 62; 서열식별번호: 66; 서열식별번호: 70; 서열식별번호: 84; 서열식별번호: 88; 서열식별번호: 92; 서열식별번호: 106; 서열식별번호: 110; 서열식별번호: 114; 서열식별번호: 118; 서열식별번호: 122; 및 서열식별번호: 126 중 적어도 1개에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드에 관한 것이다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 이들 폴리펩티드를 코딩하는 벡터, 이들 폴리펩티드를 포함하는 면역 세포에 관한 것이다. 바람직한 면역 세포는 T 세포, 종양 침윤 림프구 (TIL), NK 세포, TCR-발현 세포, 수지상 세포, 또는 NK-T 세포를 포함한다. T 세포는 자가, 동종 또는 이종일 수 있다. 또한, 그에 대해 8개 이하의 아미노산 치환을 갖는 키메라 항원 수용체가 본 발명에 포괄된다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 CLL-1에 특이적으로 결합하는 항원 결합 분자를 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR) 또는 T 세포 수용체 (TCR)를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이며, 여기서 항원 결합 분자는 서열식별번호: 19, 53, 75 및 97로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH) CDR3을 포함한다. 또한, 그에 대해 8개 이하의 아미노산 치환을 갖는 키메라 항원 수용체가 본 발명에 포괄된다. 폴리뉴클레오티드는 활성화 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 활성화 도메인은 CD3, 보다 바람직하게는 CD3 제타, 보다 바람직하게는 서열식별번호: 9에 제시된 아미노산 서열이다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 CD28, CD28T, OX40, 4-1BB/CD137, CD2, CD3 (알파, 베타, 델타, 엡실론, 감마, 제타), CD4, CD5, CD7, CD9, CD16, CD22, CD27, CD30, CD33, CD37, CD40, CD45, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, PD-1, ICOS, 림프구 기능-연관 항원-1 (LFA-1 (CD11a/CD18), CD247, CD276 (B7-H3), LIGHT (종양 괴사 인자 슈퍼패밀리 구성원 14; TNFSF14), NKG2C, Ig 알파 (CD79a), DAP-10, Fc 감마 수용체, MHC 부류 I 분자, TNF, TNFr, 인테그린, 신호전달 림프구성 활성화 분자, BTLA, 톨 리간드 수용체, ICAM-1, B7-H3, CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8알파, CD8베타, IL-2R 베타, IL-2R 감마, IL-7R 알파, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, CD83 리간드, 또는 그의 단편 또는 조합의 신호전달 도메인 (또는 다른 적합한 부분)을 포함하는 공동자극 도메인을 포함한다. 바람직한 공동자극 도메인이 하기 열거된다.
추가 실시양태에서, 본 발명은 키메라 항원 수용체 (CAR) 또는 T 세포 수용체 (TCR)를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이며, 여기서 상기 CAR 또는 TCR은 CLL-1에 특이적으로 결합하는 항원 결합 분자를 포함하고, 여기서 항원 결합 분자는 서열식별번호: 24, 58, 80 및 102로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 (VL) CDR3을 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 활성화 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 공동자극 도메인을 추가로 포함할 수 있다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 CLL-1에 특이적으로 결합하는 항원 결합 분자를 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR) 또는 T 세포 수용체 (TCR)를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이며, 여기서 항원 결합 분자 중쇄는 CDR1 (서열식별번호: 17), CDR2 (서열식별번호: 18), 및 CDR3 (서열식별번호: 19)을 포함하고, 항원 결합 분자 경쇄는 CDR1 (서열식별번호: 22), CDR2 (서열식별번호: 23), 및 CDR3 (서열식별번호: 24)을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 상기 서열과 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 동일한 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 CLL-1에 특이적으로 결합하는 항원 결합 분자를 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR) 또는 T 세포 수용체 (TCR)를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이며, 여기서 항원 결합 분자 중쇄는 CDR1 (서열식별번호: 51), CDR2 (서열식별번호: 52), 및 CDR3 (서열식별번호: 53)을 포함하고, 항원 결합 분자 경쇄는 CDR1 (서열식별번호: 56), CDR2 (서열식별번호: 57), 및 CDR3 (서열식별번호: 58)을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 상기 서열과 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 동일한 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 CLL-1에 특이적으로 결합하는 항원 결합 분자를 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR) 또는 T 세포 수용체 (TCR)를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이며, 여기서 항원 결합 분자 중쇄는 CDR1 (서열식별번호: 73), CDR2 (서열식별번호: 74), 및 CDR3 (서열식별번호: 75)을 포함하고, 항원 결합 분자 경쇄는 CDR1 (서열식별번호: 78), CDR2 (서열식별번호: 79), 및 CDR3 (서열식별번호: 80)을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 상기 서열과 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 동일한 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 CLL-1에 특이적으로 결합하는 항원 결합 분자를 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR) 또는 T 세포 수용체 (TCR)를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이며, 여기서 항원 결합 분자 중쇄는 CDR1 (서열식별번호: 95), CDR2 (서열식별번호: 96), 및 CDR3 (서열식별번호: 97)을 포함하고, 항원 결합 분자 경쇄는 CDR1 (서열식별번호: 100), CDR2 (서열식별번호: 101), 및 CDR3 (서열식별번호: 102)을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 상기 서열과 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 동일한 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
추가 실시양태에서, 본 발명은 CLL-1에 특이적으로 결합하는 항원 결합 분자를 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR) 또는 T 세포 수용체 (TCR)를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이며, 여기서 항원 결합 분자는 하기를 포함한다.
(a) 아미노산 서열 GX2X3X4X5X6X7X8X9 (서열식별번호: 134)를 포함하고, 여기서 X2는 G, F, 또는 Y이고; X3은 S 또는 T이고; X4는 I, F, 또는 L이고; X5는 S 또는 T이고; X6은 존재하지 않거나 또는 S이고; X7은 존재하지 않거나 또는 G이고; X8은 존재하지 않거나 또는 E 또는 G이고; X9는 F, L, 또는 Y인 중쇄 가변 영역 (VH) 상보성 결정 영역 (CDR) 1;
(b) 아미노산 서열 X1X2X3X4X5X6 (서열식별번호: 135)을 포함하고, 여기서 X1은 D, H, S, 또는 Y이고; X2는 H, P, 또는 Y이고; X3은 D, E, 또는 S이고; X4는 D 또는 G이고; X5는 G 또는 S이고; X6은 존재하지 않거나 또는 D 또는 E인 중쇄 가변 영역 (VH) 상보성 결정 영역 (CDR) 2;
(c) 아미노산 서열 X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12DY (서열식별번호: 136)를 포함하고, 여기서 X1은 E 또는 L이고; X2는 R, S, 또는 V이고; X3은 R 또는 Y이고; X4는 C, G, 또는 S이고; X5는 존재하지 않거나 또는 G 또는 I이고; X6은 존재하지 않거나 또는 G이고; X7은 존재하지 않거나 또는 D이고; X8은 존재하지 않거나 또는 C이고; X9는 존재하지 않거나 또는 W 또는 Y이고; X10은 존재하지 않거나 또는 P 또는 S이고; X11은 존재하지 않거나 또는 G 또는 Y이고; X12는 F 또는 R인 중쇄 가변 영역 (VH) 상보성 결정 영역 (CDR) 3;
(d) 아미노산 서열 X1ASQX5X6X7X8X9LX11 (서열식별번호: 137)을 포함하고, 여기서 X1은 Q 또는 R이고; X5는 D 또는 S이고; X6은 I 또는 V이고; X7은 N 또는 S이고; X8은 N 또는 S이고; X9는 F, L, 또는 Y이고; X11은 N 또는 T인 경쇄 가변 영역 (VL) CDR1;
(e) 아미노산 서열 X1ASX4X5X6X7 (서열식별번호: 138)을 포함하고, 여기서 X1은 D 또는 G이고; X4는 N, S, 또는 T이고; X5는 L 또는 R이고; X6은 A, E, 또는 K이고; X7은 S 또는 T인 경쇄 가변 영역 (VL) CDR2; 및/또는
(f) 아미노산 서열 QQX3X4X5X6PX8T (서열식별번호: 139)를 포함하고, 여기서 X3은 S 또는 Y이고; X4는 D, G, 또는 Y이고; X5는 N, S, 또는 T이고; X6은 L, T, 또는 Y이고; X8은 F 또는 I인 경쇄 가변 영역 (VL) CDR3.
본 발명은 추가로, 본원에 제시된 바와 같은 적어도 1개의 가변 중쇄 CDR3 또는 가변 경쇄 CDR3 서열을 포함하는 CLL-1에 대한 항원 결합 분자에 관한 것이다. 본 발명은 추가로, 본원에 기재된 바와 같은 적어도 1개의 가변 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 CLL-1에 대한 항원 결합 분자에 관한 것이다. 본 발명은 추가로, 본원에 기재된 바와 같은 적어도 1개의 가변 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 CLL-1에 대한 항원 결합 분자에 관한 것이다. 본 발명은 추가로, 본원에 기재된 바와 같은 둘 다의 가변 중쇄 CDR1, CDR2, CDR3, 및 가변 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 CLL-1에 대한 항원 결합 분자에 관한 것이다.
본 발명은 추가로, 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에게 본 발명에 따른 항원 결합 분자, CAR, TCR, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포, 또는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법에 관한 것이다. 치료하기 적합한 질환은 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 골수 백혈병 (CML), 만성 골수단핵구성 백혈병 (CMML), 소아 골수단핵구성 백혈병, 비정형 만성 골수성 백혈병, 급성 전골수구성 백혈병 (APL), 급성 단핵모구성 백혈병, 급성 적백혈병, 급성 거핵모구성 백혈병, 골수이형성 증후군 (MDS), 골수증식성 장애, 골수성 신생물, 골수성 육종), 모구성 형질세포양 수지상 세포 신생물 (BPDCN), 또는 그의 조합을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 추가의 질환은 염증성 및/또는 자가면역 질환 예컨대 류마티스 관절염, 건선, 알레르기, 천식, 크론병, IBD, IBS, 섬유근육통, 비만세포증, 및 복강 질환을 포함한다.
도 1은 상이한 암 세포주에서의 CLL-1 발현을 보여준다.
도 2는 mRNA 전기천공 6시간 후 단백질 L에 의해 결정된 CLL-1 CAR 발현을 보여준다.
도 3은 mRNA 전기천공 24시간 후 상이한 CLL-1 CAR-T 세포 구축물로부터의 시토카인 방출 검정으로부터의 결과를 보여준다.
도 4는 mRNA 전기천공 24시간 후 상이한 CLL-1 CAR-T 세포 구축물의 세포용해 활성을 보여준다.
도 5는 mRNA 전기천공 24시간 후 상이한 CLL-1 CAR-T 세포 구축물의 세포용해 활성을 보여준다.
도 6은 형질도입 후 제12일에 단백질 L에 의해 결정된 CLL-1 CAR 발현을 보여준다.
도 7은 상이한 표적 세포주와의 공동-배양 16시간 후 CLL-1 CAR-T 세포로부터의 시토카인 방출 검정을 보여준다.
도 8은 상이한 표적 세포주와의 공동-배양 16시간 및 40시간 후 CLL-1 CAR-T 세포로부터의 세포용해 활성을 보여준다.
도 9a-9d는 본 발명의 CLL-1 항원 결합 분자의 서열 정렬을 제시한다. CDR은 박스로 표시된다.
도 10은 본 발명에 따른 CAR로 처리된 NSG 마우스에 대한 생물발광 결과를 제시한다.
키메라 항원 수용체 (CAR 또는 CAR-T) 및 T 세포 수용체 (TCR)는 유전자 조작된 수용체라는 것이 인지될 것이다. 이들 조작된 수용체는 관련 기술분야에 공지된 기술에 따라 T 세포를 포함한 면역 세포 내로 용이하게 삽입될 수 있고, 그에 의해 발현될 수 있다. CAR에 의해, 단일 수용체는 특정 항원을 인식하고, 뿐만 아니라 그러한 항원에 결합되었을 때 면역 세포를 활성화하여 그러한 항원을 보유하는 세포를 공격 및 파괴시키도록 프로그램화될 수 있다. 이들 항원이 종양 세포 상에 존재할 때, CAR을 발현하는 면역 세포는 종양 세포를 표적화하고 사멸시킬 수 있다.
CAR은, 표적화된 항원과 상호작용하는 항원 결합 분자를 혼입시킴으로써 그러한 항원 (예컨대 세포-표면 항원)에 결합하도록 조작될 수 있다. 바람직하게는, 항원 결합 분자는 그의 항체 단편, 보다 바람직하게는, 1개 이상의 단일 쇄 항체 단편 ("scFv")이다. scFv는 함께 연결된 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 갖는 단일 쇄 항체 단편이다. 미국 특허 번호 7,741,465, 및 6,319,494 뿐만 아니라 문헌 [Eshhar et al., Cancer Immunol Immunotherapy (1997) 45: 131-136]을 참조한다. scFv는 표적 항원과 특이적으로 상호작용하는 모 항체의 능력을 보유한다. scFv는 다른 CAR 성분과 함께 단일 쇄의 일부로서 발현되도록 조작될 수 있기 때문에 키메라 항원 수용체에서 사용하기에 바람직하다. Id. 또한, 문헌 [Krause et al., J. Exp. Med., Volume 188, No. 4, 1998 (619-626); Finney et al., Journal of Immunology, 1998, 161: 2791-2797]을 참조한다. 항원 결합 분자는 전형적으로, 관심 항원을 인식하고 이에 결합할 수 있도록 CAR의 세포외 부분 내에 함유되는 것으로 인지될 것이다. 1종 초과의 관심 표적에 대한 특이성을 갖는 이중특이적 및 다중특이적 CAR이 본 발명의 범주 내에서 고려된다.
공동자극 도메인.
키메라 항원 수용체에는 그의 효력을 증가시키기 위해 공동자극 (신호전달) 도메인이 혼입될 수 있다. 미국 특허 번호 7,741,465, 및 6,319,494, 뿐만 아니라 문헌 [Krause et al. and Finney et al. (상기 문헌), Song et al., Blood 119:696-706 (2012); Kalos et al., Sci Transl. Med. 3:95 (2011); Porter et al., N. Engl. J. Med. 365:725-33 (2011), 및 Gross et al., Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 56:59-83 (2016)]을 참조한다. 예를 들어, CD28은 T-세포 상에서 자연 발견되는 공동자극 단백질이다. 다양한 공동자극 분자가 본원에 제시되지만, 추가의 공동자극 분자가 또한 본 발명의 범주 내에 포함된다는 것이 인지될 것이다.
CD28의 완전 천연 아미노산 서열은 NCBI 참조 서열: NP_006130.1에 기재되어 있다. 완전 천연 CD28 핵산 서열은 NCBI 참조 서열: NM_006139.1에 기재되어 있다.
특정 CD28 도메인이 키메라 항원 수용체에 사용되어 왔다. 본 발명에 따르면, "CD28T"로 불리는 신규 CD28 세포외 (힌지) 구축물이 CAR 구축물에 사용될 때 예상외로 특정 이익을 제공한다는 것이 발견되었다. 이러한 구축물은 세포외 CD28 서열로부터의 다중 아미노산의 말단절단 (제거)에도 불구하고, CD28-함유 CAR의 특성을 (연장된 시점에) 보유하는 능력을 입증하였다. 이들 이익은 동등하거나 뛰어난 시토카인 생산, 동등하거나 뛰어난 세포용해 활성, 및/또는 동등하거나 뛰어난 CAR 발현 수준을 포함한다.
세포외 도메인, 및 CD28 막횡단 및 세포내 도메인을 포함하는 CD28T 분자의 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 1에 제시된다:
CTTGATAATGAAAAGTCAAACGGAACAATCATTCACGTGAAGGGCAAGCACCTCTGTCCGTCACCCTTGTTCCCTGGTCCATCCAAGCCATTCTGGGTGTTGGTCGTAGTGGGTGGAGTCCTCGCTTGTTACTCTCTGCTCGTCACCGTGGCTTTTATAATCTTCTGGGTTAGATCCAAAAGAAGCCGCCTGCTCCATAGCGATTACATGAATATGACTCCACGCCGCCCTGGCCCCACAAGGAAACACTACCAGCCTTACGCACCACCTAGAGATTTCGCTGCCTATCGGAGC
상응하는 아미노산 서열은 서열식별번호: 2에 제시된다:
LDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSK RSRLLHSDYM NMTPRRPGPT RKHYQPYAPP RDFAAYRS
CD28T의 세포외 부분의 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 3에 제시된다:
CTTGATAATGAAAAGTCAAACGGAACAATCATTCACGTGAAGGGCAAGCACCTCTGTCCGTCACCCTTGTTCCCTGGTCCATCCAAGCCA
CD28T 세포외 도메인의 상응하는 아미노산 서열은 서열식별번호: 4에 제시된다: LDNEKSNGTI IHVKGKHLCP SPLFPGPSKP
CD28 막횡단 도메인의 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 5에 제시된다:
TTCTGGGTGTTGGTCGTAGTGGGTGGAGTCCTCGCTTGTTACTCTCTGCTCGTCACCGTGGCTTTTATAATCTTCTGGGTT
CD28 막횡단 도메인의 아미노산 서열은 서열식별번호: 6에 제시된다:
FWVLVVVGGV LACYSLLVTV AFIIFWV
CD28 세포내 신호전달 도메인의 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 7에 제시된다:
AGATCCAAAAGAAGCCGCCTGCTCCATAGCGATTACATGAATATGACTCCACGCCGCCCTGGCCCCACAAGGAAACACTACCAGCCTTACGCACCACCTAGAGATTTCGCTGCCTATCGGAGC
CD28 세포내 신호전달 도메인의 아미노산 서열은 서열식별번호: 8에 제시된다:
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS
본 발명에 사용하기에 적합한 추가의 CD28 서열은 서열식별번호: 11에 제시된 CD28 뉴클레오티드 서열을 포함한다:
ATTGAGGTGATGTATCCACCGCCTTACCTGGATAACGAAAAGAGTAACGGTACCATCATTCACGTGAAAGGTAAACACCTGTGTCCTTCTCCCCTCTTCCCCGGGCCATCAAAGCCC
상응하는 아미노산 서열은 서열식별번호: 12에 제시된다:
IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP
본 발명은 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 3의 적어도 1개의 단리된 핵산 서열을 포함하는 항원 결합 분자, CAR, TCR 등에 관한 것임이 인지될 것이다. 추가로 본 발명은 세포외 부분이 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 3의 적어도 1개의 단리된 핵산 서열로 이루어진 것인 항원 결합 분자, CAR, TCR 등에 관한 것임이 인지될 것이다. 추가적으로, 본 발명은 세포외 부분이 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 3의 적어도 1개의 단리된 핵산 서열로 본질적으로 이루어진 것인 항원 결합 분자, CAR, TCR 등에 관한 것임이 인지될 것이다.
본 발명은 서열식별번호: 2 또는 서열식별번호: 4의 적어도 1개의 아미노산 서열을 포함하는 항원 결합 분자, CAR, TCR 등에 관한 것임이 인지될 것이다. 추가로 본 발명은 세포외 부분이 서열식별번호: 2 또는 서열식별번호: 4의 적어도 1개의 아미노산 서열로 이루어진 것인 항원 결합 분자, CAR, TCR 등에 관한 것임이 인지될 것이다. 또한, 본 발명은 세포외 부분이 서열식별번호: 2 또는 서열식별번호: 4의 적어도 1개의 아미노산 서열로 본질적으로 이루어진 것인 항원 결합 분자, CAR, TCR 등에 관한 것임이 인지될 것이다.
세포외 및/또는 막횡단 도메인의 또 다른 적합한 공급원은 CD8의 일부 또는 모두로부터 유래될 수 있다 (또는 그에 상응할 수 있다). 적합한 CD8 세포외 및 막횡단 도메인의 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 13에 제시된다:
GCTGCAGCATTGAGCAACTCAATAATGTATTTTAGTCACTTTGTACCAGTGTTCTTGCCGGCTAAGCCTACTACCACACCCGCTCCACGGCCACCTACCCCAGCTCCTACCATCGCTTCACAGCCTCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCTTGCCGACCGGCCGCAGGGGGCGCTGTTCATACCAGAGGACTGGATTTCGCCTGCGATATCTATATCTGGGCACCCCTGGCCGGAACCTGCGGCGTACTCCTGCTGTCCCTGGTCATCACGCTCTATTGTAATCACAGGAAC
상응하는 아미노산 서열은 서열식별번호: 14에 제시된다:
AAALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRN
본 발명의 범주 내의 적합한 공동자극 도메인은 예를 들어 CD28, CD28T, OX40, 4-1BB/CD137, CD2, CD3 (알파, 베타, 델타, 엡실론, 감마, 제타), CD4, CD5, CD7, CD9, CD16, CD22, CD27, CD30, CD33, CD37, CD40, CD45, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, PD-1, ICOS, 림프구 기능-연관 항원-1 (LFA-1 (CD11a/CD18), CD247, CD276 (B7-H3), LIGHT (종양 괴사 인자 슈퍼패밀리 구성원 14; TNFSF14), NKG2C, Ig 알파 (CD79a), DAP-10, Fc 감마 수용체, MHC 부류 I 분자, TNF, TNFr, 인테그린, 신호전달 림프구성 활성화 분자, BTLA, 톨 리간드 수용체, ICAM-1, B7-H3, CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8알파, CD8베타, IL-2R 베타, IL-2R 감마, IL-7R 알파, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, CD83 리간드, 또는 그의 단편 또는 조합으로부터 유래될 수 있다 (또는 그에 상응할 수 있다)는 것이 인지될 것이다. 상기 열거되지 않은 추가의 공동자극 분자, 또는 그의 단편이 본 발명의 범주 내에 있다는 것이 인지될 것이다.
활성화 도메인.
CD3은 천연 T 세포 상의 T 세포 수용체의 요소이고, CAR의 중요한 세포내 활성화 요소인 것으로 제시되어 왔다. 바람직한 실시양태에서, CD3은 CD3 제타이고, 그의 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 9에 제시된다:
AGGGTGAAGTTTTCCAGATCTGCAGATGCACCAGCGTATCAGCAGGGCCAGAACCAACTGTATAACGAGCTCAACCTGGGACGCAGGGAAGAGTATGACGTTTTGGACAAGCGCAGAGGACGGGACCCTGAGATGGGTGGCAAACCAAGACGAAAAAACCCCCAGGAGGGTCTCTATAATGAGCTGCAGAAGGATAAGATGGCTGAAGCCTATTCTGAAATAGGCATGAAAGGAGAGCGGAGAAGGGGAAAAGGGCACGACGGTTTGTACCAGGGACTCAGCACTGCTACGAAGGATACTTATGACGCTCTCCACATGCAAGCCCTGCCACCTAGG
세포내 CD3 제타의 상응하는 아미노산은 서열식별번호: 10에 제시된다:
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPR RKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
세포와 관련한 도메인 배향
구조적으로, 본원에 기재된 도메인은 면역 또는 다른 세포와 관련한 위치에 상응한다는 것이 인지될 것이다. 따라서 이들 도메인은 (i) "힌지" 또는 세포외 (EC) 도메인, (ii) 막횡단 (TM) 도메인, 및/또는 (iii) 세포내/세포질 도메인 (IC)의 일부일 수 있다. 세포내 성분은 빈번하게, 부분적으로 활성화 도메인 예컨대 CD3 패밀리의 구성원의 부분, 바람직하게는 CD3 제타를 포함한다. 이러한 도메인은, 항원 결합 분자의 그의 표적에의 결합 시, T 세포를 활성화할 수 있다. 세포내 도메인은 전형적으로 본원에 기재된 바와 같은 1개 이상의 공동자극 분자를 추가로 포함한다는 것이 인지될 것이다.
본원에 사용된 "활성화" 또는 "자극"은 활성화 분자와 그의 동족 리간드의 결합에 의해 유도되는 1차 반응을 지칭하고, 여기서 결합은 신호 전달 사건을 매개한다.
"활성화 분자" 또는 "자극 분자"는 항원 제시 세포 상에 존재하는 동족 자극 리간드와 특이적으로 결합하는 T 세포 상의 분자, 예를 들어, TCR/CD3 복합체를 지칭한다. 적합한 활성화 분자는 본원에 기재되어 있다.
본원에 사용된 "공동자극 분자"는 증식, 활성화, 분화 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 T 세포 반응을 매개하는 신호를 제공하는 분자를 지칭한다. 공동자극 분자는 본원에 기재된 바와 같은 활성화 분자에 의해 제공되는 1차 신호에 더하여 신호를 제공할 수 있다.
적합한 공동자극 분자는 CD28, CD28T, OX40, 4-1BB/CD137, CD2, CD3 (알파, 베타, 델타, 엡실론, 감마, 제타), CD4, CD5, CD7, CD9, CD16, CD22, CD27, CD30, CD33, CD37, CD40, CD45, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, PD-1, ICOS, 림프구 기능-연관 항원-1 (LFA-1 (CD11a/CD18), CD247, CD276 (B7-H3), LIGHT (종양 괴사 인자 슈퍼패밀리 구성원 14; TNFSF14), NKG2C, Ig 알파 (CD79a), DAP-10, Fc 감마 수용체, MHC 부류 I 분자, TNF, TNFr, 인테그린, 신호전달 림프구성 활성화 분자, BTLA, 톨 리간드 수용체, ICAM-1, B7-H3, CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8알파, CD8베타, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R 알파, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, CD83 리간드, 또는 그의 단편 또는 조합의 모두 또는 일부를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 힌지 영역은 이뮤노글로불린 패밀리의 구성원의 일부 또는 모두, 예컨대 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgD, IgE, IgM, 또는 그의 단편을 함유할 수 있다는 것이 인지될 것이다.
일부 실시양태에서, 세포외 도메인은 항원 결합 분자와 막횡단 도메인 사이에 위치한다.
본 발명에 따른 예시적인 CAR 구축물이 표 1에 제시된다.
표 1
Figure pat00007
주목되는 바와 같이, 본 발명의 조작된 T 세포는 항원 결합 분자 (예컨대 scFv), 세포외 도메인 ("힌지" 도메인을 포함할 수 있음), 막횡단 도메인, 및 세포내 도메인을 포함한다. 세포내 도메인은 적어도 부분적으로, 바람직하게는 CD3 패밀리 구성원 예컨대 CD3 제타, CD3 엡실론, CD3 감마 또는 그의 부분으로 구성된, 활성화 도메인을 포함할 수 있다.
추가로 항원 결합 분자 (예를 들어, 1개 이상의 scFv)는 그의 표적 또는 표적들을 인식하고 그에 결합할 수 있도록, 분자/구축물의 세포외 부분에 위치하도록 조작된다는 것이 인지될 것이다.
세포외 도메인. 본 발명에 특히 유용한 세포외 도메인은 CD28, OX-40, 4-1BB/CD137, CD2, CD7, CD27, CD30, CD40, 프로그램화된 사멸-1 (PD-1), 유도성 T 세포 공동자극자 (ICOS), 림프구 기능-연관 항원-1 (LFA-1, CD11a/CD18), CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD247, CD276 (B7-H3), LIGHT, (TNFSF14), NKG2C, Ig 알파 (CD79a), DAP-10, Fc 감마 수용체, MHC 부류 1 분자, TNF 수용체 단백질, 이뮤노글로불린 단백질, 시토카인 수용체, 인테그린, 신호전달 림프구성 활성화 분자 (SLAM 단백질), 활성화 NK 세포 수용체, BTLA, 톨 리간드 수용체, ICAM-1, B7-H3, CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8알파, CD8베타, IL-2R 베타, IL-2R 감마, IL-7R 알파, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드, 또는 그의 임의의 조합의 모두 또는 일부로부터 유래될 수 있다 (또는 그를 포함할 수 있다). 세포외 도메인은 천연 또는 합성 공급원으로부터 유래될 수 있다.
세포외 도메인은 종종, 때때로 "스페이서" 영역으로 지칭되는, 힌지 부분을 포함한다. 본원에 기재된 분자의 부분 또는 유도체를 포함한 다양한 힌지가 본 발명에 따라 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 힌지 영역은 본원에 제시된 세포외 도메인 아미노산 서열과 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 힌지 영역은 본원에 제시된 세포외 뉴클레오티드 아미노산 서열과 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
막횡단 도메인.
CAR은 CAR의 세포외 도메인에 융합된 막횡단 도메인을 갖도록 설계될 수 있다. 이는 CAR의 세포내 도메인에 유사하게 융합될 수 있다. 일부 경우에, 막횡단 도메인은 이러한 도메인이 동일한 또는 상이한 표면 막 단백질의 막횡단 도메인에 결합하는 것을 피하게 하여 수용체 복합체의 다른 구성원과의 상호작용을 최소화하기 위해 선택되거나 또는 아미노산 치환에 의해 변형될 수 있다. 막횡단 도메인은 천연 또는 합성 공급원으로부터 유래될 수 있다. 공급원이 천연인 경우에, 도메인은 임의의 막-결합 또는 막횡단 단백질로부터 유래될 수 있다. 본 발명에 특히 유용한 막횡단 영역은 CD28, CD28T, OX-40, 4-1BB/CD137, CD2, CD7, CD27, CD30, CD40, 프로그램화된 사멸-1 (PD-1), 유도성 T 세포 공동자극자 (ICOS), 림프구 기능-연관 항원-1 (LFA-1, CD11a/CD18), CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD247, CD276 (B7-H3), LIGHT, (TNFSF14), NKG2C, Ig 알파 (CD79a), DAP-10, Fc 감마 수용체, MHC 부류 1 분자, TNF 수용체 단백질, 이뮤노글로불린 단백질, 시토카인 수용체, 인테그린, 신호전달 림프구성 활성화 분자 (SLAM 단백질), 활성화 NK 세포 수용체, BTLA, 톨 리간드 수용체, ICAM-1, B7-H3, CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8알파, CD8베타, IL-2R 베타, IL-2R 감마, IL-7R 알파, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드, 또는 그의 임의의 조합으로부터 유래될 수 있다 (또는 그를 포함하거나, 또는 그에 상응할 수 있다).
임의로, 짧은 링커가 CAR의 임의의 또는 일부 세포외, 막횡단, 및 세포내 도메인 사이에 연결을 형성할 수 있다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 CAR의 막횡단 도메인은 CD8 막횡단 도메인이다. 한 실시양태에서, CD8 막횡단 도메인은 서열식별번호: 13의 핵산 서열의 막횡단 부분을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, CD8 막횡단 도메인은 서열식별번호: 14 내에 함유된 막횡단 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 CAR의 막횡단 도메인은 CD28 막횡단 도메인이다. 한 실시양태에서, CD28 막횡단 도메인은 서열식별번호: 5의 핵산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, CD28 막횡단 도메인은 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, CD28 막횡단 도메인은 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 포함한다.
세포내 (세포질) 도메인. 본 발명의 조작된 T 세포의 세포내 (세포질) 도메인은 면역 세포의 정상 이펙터 기능 중 적어도 1종의 활성화를 제공할 수 있다. T 세포의 이펙터 기능은, 예를 들어, 시토카인의 분비를 포함한 세포용해 활성 또는 헬퍼 활성을 지칭할 수 있다.
적합한 세포내 분자는 CD28, CD28T, OX-40, 4-1BB/CD137, CD2, CD7, CD27, CD30, CD40, 프로그램화된 사멸-1 (PD-1), 유도성 T 세포 공동자극자 (ICOS), 림프구 기능-연관 항원-1 (LFA-1, CD11a/CD18), CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD247, CD276 (B7-H3), LIGHT, (TNFSF14), NKG2C, Ig 알파 (CD79a), DAP-10, Fc 감마 수용체, MHC 부류 1 분자, TNF 수용체 단백질, 이뮤노글로불린 단백질, 시토카인 수용체, 인테그린, 신호전달 림프구성 활성화 분자 (SLAM 단백질), 활성화 NK 세포 수용체, BTLA, 톨 리간드 수용체, ICAM-1, B7-H3, CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8알파, CD8베타, IL-2R 베타, IL-2R 감마, IL-7R 알파, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드, 또는 그의 임의의 조합으로부터 유래된 (또는 그에 상응하는) 신호전달 도메인을 포함하나 (즉 함유하나), 이에 제한되지는 않는다는 것이 인지될 것이다.
바람직한 실시양태에서, CAR의 세포내/세포질 도메인은 CD3 제타 도메인을 그 자체로, 또는 본 발명의 CAR과 관련하여 유용한 임의의 다른 목적하는 세포내 도메인(들)과 조합하여 포함하도록 설계될 수 있다. 예를 들어, CAR의 세포내 도메인은 CD3 제타 쇄 부분 및 공동자극 신호전달 분자의 부분을 포함할 수 있다. 본 발명의 CAR의 세포내 신호전달 부분 내의 세포내 신호전달 서열은 서로 무작위로 또는 명시된 순서로 연결될 수 있다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 세포내 도메인은 CD3 제타의 활성화 도메인 및 CD28의 신호전달 도메인을 포함하도록 설계된다. 또 다른 실시양태에서, 세포내 도메인은 CD3 제타의 활성화 도메인 및 4-1BB의 신호전달 도메인을 포함하도록 설계된다. 또 다른 실시양태에서, CAR의 세포내 도메인은 CD28 및 CD3 제타의 부분을 포함하도록 설계되고, 여기서 세포내 CD28은 서열식별번호: 7에 제시된 핵산 서열 및 서열식별번호: 8에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. CD3 제타 핵산 서열은 서열식별번호: 9에 제시되고, 아미노산 서열은 서열식별번호: 8에 제시된다.
본 발명에 따른 CAR의 하나의 바람직한 배향은 항원 결합 분자 (예컨대 scFv)를 세포외 및/또는 힌지 도메인, 공동자극 도메인, 및 활성화 도메인과 탠덤으로 포함하는 것이라는 것이 인지될 것이다. 다중 도메인이 탠덤으로 사용될 수 있다는 것이 추가로 인지될 것이다.
일부 실시양태에서, 항원 결합 분자, 적어도 1개의 공동자극 분자, 및 활성화 도메인을 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 단리된 핵산이 제공된다. 일부 실시양태에서, 핵산 구축물은 바이러스 벡터 내에 함유되다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터, 뮤린 백혈병 바이러스 벡터, SFG 벡터, 아데노바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터, 포진 바이러스 벡터, 및 백시니아 바이러스 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 핵산은 플라스미드 내에 함유된다.
일부 실시양태에서, 조작된 면역 세포는 T 세포, 종양 침윤 림프구 (TIL), NK 세포, TCR-발현 세포, 수지상 세포, 또는 NK-T 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 말초 혈액으로부터 수득되거나 제조된다. 일부 실시양태에서, 세포는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)로부터 수득되거나 제조된다. 일부 실시양태에서, 세포는 골수로부터 수득되거나 제조된다. 일부 실시양태에서, 세포는 제대 혈액으로부터 수득되거나 제조된다. 일부 실시양태에서, 세포는 인간 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 전기천공, 초음파천공, 바이오리스틱 (예를 들어, 유전자 총), 지질 형질감염, 중합체 형질감염, 나노입자 또는 폴리플렉스로 이루어진 군으로부터 선택된 방법을 사용하여 핵산 벡터에 의해 형질감염 또는 형질도입된다.
일부 실시양태에서, 본 출원의 핵산을 포함하는 조작된 면역 세포에서 키메라 항원 수용체가 발현된다. 본 출원의 이들 키메라 항원 수용체는, 일부 실시양태에서, (i) 항원 결합 분자 (예컨대 scFv), (ii) 막횡단 영역, 및 (iii) T 세포 활성화 분자 또는 영역을 포함할 수 있다.
추가로, 측면이 언어 "포함하는"을 사용하여 본원에 기재된 경우에, "로 이루어진" 및/또는 "로 본질적으로 이루어진"과 관련하여 기재된 다른 유사한 측면이 또한 제공되는 것으로 이해된다.
추가적으로, 용어 "약" 또는 "본질적으로 포함하는"은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 결정된 바와 같은 특정한 값 또는 조성에 대한 허용 오차 범위 내의 값 또는 조성을 지칭하며, 이는 부분적으로 값 또는 조성이 측정 또는 결정되는 방법, 즉 측정 시스템의 한계에 좌우될 것이다. 예를 들어, "약" 또는 "본질적으로 포함하는"은 관련 기술분야에서의 실시에 따라 1 또는 1 초과의 표준 편차 내에 있음을 의미할 수 있다. 대안적으로, "약" 또는 "본질적으로 포함하는"은 최대 10%의 범위 (즉, ±10%)를 의미할 수 있다. 예를 들어, 약 3 mg은 2.7 mg 및 3.3 mg 사이의 임의의 수를 포함할 수 있다 (10%의 경우). 또한, 특히 생물학적 시스템 또는 프로세스와 관련하여, 상기 용어는 값의 최대 한 자릿수 또는 최대 5-배를 의미할 수 있다. 특정한 값 또는 조성이 본 출원 및 청구범위에서 제공되는 경우에, 달리 언급되지 않는 한, "약" 또는 "본질적으로 포함하는"의 의미는 그러한 특정한 값 또는 조성에 대한 허용 오차 범위 내에 있는 것으로 가정되어야 한다.
항원 결합 분자
항원 결합 분자는 본 발명의 범주 내에 포함된다. 본원에 사용된 "항원 결합 분자"는 명시된 표적 항원에 결합하는 임의의 단백질을 의미한다. 본 출원에서, 명시된 표적 항원은 CLL-1 단백질 또는 그의 단편이다. 항원 결합 분자는 항체 및 그의 결합 부분, 예컨대 면역학적으로 기능성인 단편을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 펩티바디 (즉, 펩티드 결합 도메인을 포함하는 Fc 융합체 분자)는 적합한 항원 결합 분자의 또 다른 예이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 항원 결합 분자에 관한 것이다:
(a) 아미노산 서열 GX2X3X4X5X6X7X8X9 (서열식별번호: 134)를 포함하고, 여기서 X2는 G, F, 또는 Y이고; X3은 S 또는 T이고; X4는 I, F, 또는 L이고; X5는 S 또는 T이고; X6은 존재하지 않거나 또는 S이고; X7은 존재하지 않거나 또는 G이고; X8은 존재하지 않거나 또는 E 또는 G이고; X9는 F, L, 또는 Y인 중쇄 가변 영역 (VH) 상보성 결정 영역 (CDR) 1;
(b) 아미노산 서열 X1X2X3X4X5X6 (서열식별번호: 135)을 포함하고, 여기서 X1은 D, H, S, 또는 Y이고; X2는 H, P, 또는 Y이고; X3은 D, E, 또는 S이고; X4는 D 또는 G이고; X5는 G 또는 S이고; X6은 존재하지 않거나 또는 D 또는 E인 중쇄 가변 영역 (VH) 상보성 결정 영역 (CDR) 2;
(c) 아미노산 서열 X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12DY (서열식별번호: 136)를 포함하고, 여기서 X1은 E 또는 L이고; X2는 R, S, 또는 V이고; X3은 R 또는 Y이고; X4는 C, G, 또는 S이고; X5는 존재하지 않거나 또는 G 또는 I이고; X6은 존재하지 않거나 또는 G이고; X7은 존재하지 않거나 또는 D이고; X8은 존재하지 않거나 또는 C이고; X9는 존재하지 않거나 또는 W 또는 Y이고; X10은 존재하지 않거나 또는 P 또는 S이고; X11은 존재하지 않거나 또는 G 또는 Y이고; X12는 F 또는 R인 중쇄 가변 영역 (VH) 상보성 결정 영역 (CDR) 3;
(d) 아미노산 서열 X1ASQX5X6X7X8X9LX11 (서열식별번호: 137)을 포함하고, 여기서 X1은 Q 또는 R이고; X5는 D 또는 S이고; X6은 I 또는 V이고; X7은 N 또는 S이고; X8은 N 또는 S이고; X9는 F, L, 또는 Y이고; X11은 N 또는 T인 경쇄 가변 영역 (VL) CDR1;
(e) 아미노산 서열 X1ASX4X5X6X7 (서열식별번호: 138)을 포함하고, 여기서 X1은 D 또는 G이고; X4는 N, S, 또는 T이고; X5는 L 또는 R이고; X6은 A, E, 또는 K이고; X7은 S 또는 T인 경쇄 가변 영역 (VL) CDR2; 및/또는
(f) 아미노산 서열 QQX3X4X5X6PX8T (서열식별번호: 139)를 포함하고, 여기서 X3은 S 또는 Y이고; X4는 D, G, 또는 Y이고; X5는 N, S, 또는 T이고; X6은 L, T, 또는 Y이고; X8은 F 또는 I인 경쇄 가변 영역 (VL) CDR3.
일부 실시양태에서, 본 발명은 (a) 서열식별번호: 17, 51, 73, 95, 5, 및 97로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 CDR1; (b) 서열식별번호: 18, 52, 74, 96으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 CDR2; (c) 서열식별번호: 19, 53, 75, 및 97로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 CDR3; (d) 서열식별번호: 22, 56, 78, 및 100으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 CDR1; (e) 서열식별번호: 23, 57, 79, 및 101로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 CDR2; (f) 서열식별번호: 24, 58, 80, 및 102로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 CDR3 중 적어도 1개를 포함하는 항원 결합 분자에 관한 것이다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 (a) 서열식별번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열식별번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역; (b) 서열식별번호: 50의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열식별번호: 55의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역; (c) 서열식별번호: 72의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열식별번호: 77의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역; (d) 서열식별번호: 94의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열식별번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역 중 적어도 1개를 포함하는 항원 결합 분자 (및 이들 분자를 포함하는 키메라 항원 수용체)에 관한 것이며; 여기서 VH 및 VL 영역 또는 영역은 적어도 1개의 링커에 의해 연결된다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 항원 결합 분자 (및 이들 분자를 포함하는 키메라 항원 수용체)에 관한 것이며, 여기서 링커는 서열식별번호: 130 및 서열식별번호: 132 중 적어도 1개를 포함한다.
추가 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 24, 58, 80 및 102로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 (VL) CDR3을 포함하는 항원 결합 분자에 관한 것이다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 CLL-1에 특이적으로 결합하는 항원 결합 분자를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이며, 여기서 항원 결합 분자 중쇄는 CDR1 (서열식별번호: 17), CDR2 (서열식별번호: 18), 및 CDR3 (서열식별번호: 19)을 포함하고, 항원 결합 분자 경쇄는 CDR1 (서열식별번호: 22), CDR2 (서열식별번호: 23), 및 CDR3 (서열식별번호: 24)을 포함한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 CLL-1에 특이적으로 결합하는 항원 결합 분자에 관한 것이며, 여기서 항원 결합 분자 중쇄는 CDR1 (서열식별번호: 51), CDR2 (서열식별번호: 52), 및 CDR3 (서열식별번호: 53)을 포함하고, 항원 결합 분자 경쇄는 CDR1 (서열식별번호: 56), CDR2 (서열식별번호: 57), 및 CDR3 (서열식별번호: 58)을 포함한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 CLL-1에 특이적으로 결합하는 항원 결합 분자에 관한 것이며, 여기서 항원 결합 분자 중쇄는 CDR1 (서열식별번호: 73), CDR2 (서열식별번호: 74), 및 CDR3 (서열식별번호: 75)을 포함하고, 항원 결합 분자 경쇄는 CDR1 (서열식별번호: 78), CDR2 (서열식별번호: 79), 및 CDR3 (서열식별번호: 80)을 포함한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 CLL-1에 특이적으로 결합하는 항원 결합 분자를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이며, 여기서 항원 결합 분자 중쇄는 CDR1 (서열식별번호: 95), CDR2 (서열식별번호: 96), 및 CDR3 (서열식별번호: 97)을 포함하고, 항원 결합 분자 경쇄는 CDR1 (서열식별번호: 100), CDR2 (서열식별번호: 101), 및 CDR3 (서열식별번호: 102)을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 1개 이상의 항체와 교차 경쟁하는 항-CLL-1 항원 결합 분자를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 그의 항원 결합 분자에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 항원 결합 분자 중 1개 이상과 동일한 에피토프에 결합하는 그의 항-CLL-1 항원 결합 분자를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 항원 결합 분자는 종양 세포의 항원에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 분자는 과다증식성 질환에 수반되는 세포 상의 항원 또는 바이러스 또는 박테리아 항원에 결합한다. 추가 실시양태에서, 항원 결합 분자는 그의 상보성 결정 영역 (CDR) 중 1개 이상을 포함하는, 그의 항체의 단편이다. 추가 실시양태에서, 항원 결합 분자는 단일 쇄 가변 단편 (scFv)이다.
용어 항원 결합 분자의 "면역학적으로 기능성인 단편" (또는 "단편")은 전장 쇄에 존재하는 아미노산 중 적어도 일부가 결여되었지만 여전히 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항체의 부분 (그러한 부분이 수득되거나 합성되는 방법과 관계없이)을 포함하는 항원 결합 분자의 종이다. 이러한 단편은 그것이 표적 항원에 결합하고, 주어진 에피토프에의 결합에 대해 무손상 항체를 포함한 다른 항원 결합 분자와 경쟁할 수 있다는 점에서 생물학적으로 활성이다. 일부 실시양태에서, 단편은 중화 단편이다. 일부 실시양태에서, 단편은 CLL-1의 활성을 차단하거나 감소시킬 수 있다. 한 측면에서, 이러한 단편은 전장 경쇄 또는 중쇄에 존재하는 적어도 1개의 CDR을 보유할 것이고, 일부 실시양태에서 단일 중쇄 및/또는 경쇄 또는 그의 부분을 포함할 것이다. 이들 단편은 재조합 DNA 기술에 의해 생산될 수 있거나, 또는 무손상 항체를 포함한 항원 결합 분자의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 생산될 수 있다.
면역학적으로 기능성인 이뮤노글로불린 단편은 scFv 단편, Fab 단편 (Fab', F(ab')2 등), 1개 이상의 CDR, 디아바디 (동일한 쇄 상의 2개의 도메인 사이에 쌍형성을 허용하기에는 매우 짧은, 짧은 펩티드 링커를 통해 연결된, 경쇄 가변 도메인과 동일한 폴리펩티드 상의 중쇄 가변 도메인), 도메인 항체, 및 단일-쇄 항체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 이들 단편은 인간, 마우스, 래트, 낙타류 또는 토끼를 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 포유동물 공급원으로부터 유래될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자가 인지할 바와 같이, 항원 결합 분자는 비-단백질 성분을 포함할 수 있다.
또한 항원 결합 분자의 변이체, 예를 들어, 각각 본원에 기재된 서열의 아미노산 서열과 적어도 70-80%, 80-85%, 85-90%, 90-95%, 95-97%, 97-99%, 또는 99% 초과의 동일성을 갖는 가변 경쇄 및/또는 가변 중쇄가 본 발명의 범주 내에 포함된다. 일부 경우에, 이러한 분자는 적어도 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄를 포함하는 반면에, 다른 경우에 변이체 형태는 2개의 동일한 경쇄 및 2개의 동일한 중쇄 (또는 그의 하위부분)를 함유한다. 통상의 기술자는 널리 공지된 기술을 사용하여 본원에 제시된 바와 같은 항원 결합 분자의 적합한 변이체를 결정할 수 있을 것이다. 특정 실시양태에서, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 활성에 중요한 것으로 여겨지지 않는 영역을 표적화함으로써 활성을 파괴하지 않으면서 변화될 수 있는 분자의 적합한 구역을 확인할 수 있다.
특정 실시양태에서, 항원 결합 분자의 폴리펩티드 구조는 각각 모노클로날 항체, 이중특이적 항체, 미니바디, 도메인 항체, 합성 항체 (때때로 본원에서 "항체 모방체"로 지칭됨), 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 항체 융합체 (때때로 본원에서 "항체 접합체"로 지칭됨), 및 그의 단편을 포함하나 이에 제한되지는 않는 항체에 기초한다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 분자는 아비머를 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
일부 실시양태에서, CLL-1에 대한 항원 결합 분자는 CAR, TCR 또는 다른 면역 세포의 일부로서 투여된다. 이러한 면역 세포에서, CLL-1에 대한 항원 결합 분자는 동일한 프로모터 영역, 또는 별개의 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다. 특정 실시양태에서, CLL-1에 대한 단백질 작용제 및/또는 항원 결합 분자를 코딩하는 유전자는 별개의 벡터에 존재할 수 있다.
본 발명은 추가로 제약상 허용되는 희석제, 담체, 가용화제, 유화제, 보존제 및/또는 아주반트와 함께 CLL-1에 대한 항원 결합 분자를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 특정 실시양태에서, 제약 조성물은 CLL-1에 대한 1종 초과의 상이한 항원 결합 분자를 포함할 것이다. 특정 실시양태에서, 제약 조성물은 CLL-1에 대한 1종 초과의 항원 결합 분자를 포함할 것이고, 여기서 CLL-1에 대한 항원 결합 분자는 1종 초과의 에피토프에 결합할 것이다. 일부 실시양태에서, 다양한 항원 결합 분자는 CLL-1에의 결합에 대해 서로 경쟁하지 않을 것이다.
다른 실시양태에서, 제약 조성물은 비경구 전달을 위해, 흡입을 위해, 또는 소화관를 통한, 예컨대 경구로의 전달을 위해 선택될 수 있다. 이러한 제약상 허용되는 조성물의 제조는 관련 기술분야의 통상의 기술자의 능력 내에 있다. 특정 실시양태에서, 조성물을 생리학적 pH 또는 약간 더 낮은 pH, 전형적으로 약 5 내지 약 8의 pH 범위 내로 유지시키기 위해 완충제가 사용된다. 특정 실시양태에서, 비경구 투여가 고려되는 경우에, 치료 조성물은 제약상 허용되는 비히클 중, 추가의 치료제의 존재 또는 부재 하에, CLL-1에 대한 목적하는 항원 결합 분자를 포함하는 발열원 무함유, 비경구로 허용되는 수용액의 형태로 존재할 수 있다. 특정 실시양태에서, 비경구 주사를 위한 비히클은 멸균 증류수이고, 여기서 CLL-1에 대한 항원 결합 분자는, 적어도 1종의 추가의 치료제의 존재 또는 부재 하에, 적절하게 보존된 멸균, 등장성 용액으로서 제제화된다. 특정 실시양태에서, 제제는 생성물의 제어 또는 지속 방출을 제공할 수 있는 중합체 화합물 (예컨대 폴리락트산 또는 폴리글리콜산), 비드 또는 리포솜을 사용하여 목적하는 분자를 제제화하는 것을 수반할 수 있고, 이어서 이는 데포 주사를 통해 전달될 수 있다. 특정 실시양태에서, 이식형 약물 전달 장치는 목적하는 분자를 도입하는데 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 항원 결합 분자는 진단 또는 확인 툴로서 사용된다. 항원 결합 분자는 샘플 및/또는 대상체에 존재하는 CLL-1의 양을 검정하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 진단 항원 결합 분자는 중화되지 않는다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 항원 결합 분자는 CLL-1의 수준에서의 변화와 연관된 질환 또는 장애를 스크리닝/진단하기 위해, 포유동물 조직 또는 세포에서 CLL-1을 검출하기 위한 검정 키트 및/또는 CLL-1을 검출하기 위한 방법에 사용되거나 또는 그에 제공된다. 키트는 CLL-1에 결합하는 항원 결합 분자를, 존재하는 경우에 CLL-1과 항원 결합 분자의 결합, 및 임의로 CLL-1 단백질 수준을 나타내는 수단과 함께 포함할 수 있다.
항원 결합 분자는 하기 정의 및 설명에 비추어 추가로 이해될 것이다.
"Fc" 영역은 항체의 CH1 및 CH2 도메인을 포함하는 2개의 중쇄 단편을 포함한다. 2개의 중쇄 단편은 2개 이상의 디술피드 결합 및 CH3 도메인의 소수성 상호작용에 의해 함께 유지된다.
"Fab 단편"은 1개의 경쇄, 및 1개의 중쇄의 CH1 및 가변 영역을 포함한다. Fab 분자의 중쇄는 또 다른 중쇄 분자와 디술피드 결합을 형성할 수 없다. "Fab' 단편"은 1개의 경쇄, 및 VH 도메인 및 CH1 도메인을 함유하고 또한 CH1 및 CH2 도메인 사이의 영역을 함유하는 1개의 중쇄의 부분을 포함하고, 이에 따라 2개의 Fab' 단편의 2개의 중쇄 사이에 쇄간 디술피드 결합이 형성되어 F(ab')2 분자가 형성될 수 있다. "F(ab')2 단편"은 2개의 경쇄, 및 CH1 및 CH2 도메인 사이에 불변 영역의 부분을 함유하는 2개의 중쇄를 함유하고, 이에 따라 2개의 중쇄 사이에 쇄간 디술피드 결합이 형성된다. 따라서, F(ab')2 단편은 2개의 중쇄 사이의 디술피드 결합에 의해 함께 유지되는 2개의 Fab' 단편으로 구성된다.
"Fv 영역"은 중쇄 및 경쇄 둘 다로부터의 가변 영역을 포함하지만, 불변 영역이 결여되어 있다.
"단일 쇄 가변 단편" ("scFv", 또한 "단일-쇄 항체"로도 불림)은 중쇄 및 경쇄 가변 영역이 가요성 링커에 의해 연결되어 단일 폴리펩티드 쇄를 형성한 Fv 분자를 지칭하고, 이는 항원 결합 영역을 형성한다. PCT 출원 WO88/01649 및 미국 특허 번호 4,946,778 및 5,260,203을 참조하고, 그의 개시내용은 그 전문이 참조로 포함된다.
"2가 항원 결합 분자"는 2개의 항원 결합 부위를 포함한다. 일부 경우에, 2개의 결합 부위는 동일한 항원 특이성을 갖는다. 2가 항원 결합 분자는 이중특이적일 수 있다. "다중특이적 항원 결합 분자"는 1개 초과의 항원 또는 에피토프를 표적화하는 것이다. "이중특이적", "이중-특이적" 또는 "이중기능적" 항원 결합 분자는 각각, 2개의 상이한 항원 결합 부위를 갖는 하이브리드 항원 결합 분자 또는 항체이다. 이중특이적 항원 결합 분자의 2개의 결합 부위는 동일하거나 상이한 단백질 표적에 존재할 수 있는 2개의 상이한 에피토프에 결합할 것이다.
항원 결합 분자는 해리 상수 (Kd)가 ~1x10-7 M일 때 그의 표적 항원에 "특이적으로 결합"한다고 언급된다. 항원 결합 분자는 Kd가 1-5x10-9 M일 때 "높은 친화도"로, Kd가 1-5x10-10 M일 때 "매우 높은 친화도"로 항원에 특이적으로 결합한다. 한 실시양태에서, 항원 결합 분자는 10-9 M의 Kd를 갖는다. 한 실시양태에서, 오프-레이트는 <1x10-5이다. 다른 실시양태에서, 항원 결합 분자는 인간 CLL-1에 약 10-7 M 내지 10-13 M의 Kd로 결합할 것이고, 또 다른 실시양태에서 항원 결합 분자는 Kd 1.0-5x10-10으로 결합할 것이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 분자는 CLL-1 (예를 들어, hCLL-1)에 특이적으로 결합한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 항-CLL-1 항체 또는 항원 결합 분자는 인간 CLL-1에 1 x 10-6 M 미만, 1 x 10-7 M 미만, 1 x 10-8 M 미만, 또는 1 x 10-9 M 미만의 KD로 결합한다. 하나의 특정한 실시양태에서, 항-CLL-1 항체 또는 항원 결합 분자는 인간 CLL-1에 1 x 10-7 M 미만의 KD로 결합한다. 또 다른 실시양태에서, 항-CLL-1 항체 또는 항원 결합 분자는 인간 CLL-1에 1 x 10-8 M 미만의 KD로 결합한다. 일부 실시양태에서, 항-CLL-1 항체 또는 항원 결합 분자는 인간 CLL-1에 약 1 x 10-7 M, 약 2 x 10-7 M, 약 3 x 10-7 M, 약 4 x 10-7 M, 약 5 x 10-7 M, 약 6 x 10-7 M, 약 7 x 10-7 M, 약 8 x 10-7 M, 약 9 x 10-7 M, 약 1 x 10-8 M, 약 2 x 10-8 M, 약 3 x 10-8 M, 약 4 x 10-8 M, 약 5 x 10-8 M, 약 6 x 10-8 M, 약 7 x 10-8 M, 약 8 x 10-8 M, 약 9 x 10-8 M, 약 1 x 10-9 M, 약 2 x 10-9 M, 약 3 x 10-9 M, 약 4 x 10-9 M, 약 5 x 10-9 M, 약 6 x 10-9 M, 약 7 x 10-9 M, 약 8 x 10-9 M, 약 9 x 10-9 M, 약 1 x 10-10 M, 또는 약 5 x 10-10 M의 KD로 결합한다. 특정 실시양태에서, KD는 koff/kon의 비율로서 계산되고, kon 및 koff는 1가 항체, 예컨대 Fab 단편을 사용하여, 예를 들어 비아코어(BIAcore)® 표면 플라즈몬 공명 기술에 의해 측정되는 바와 같이 결정된다. 다른 실시양태에서, KD는 koff/kon의 비율로서 계산되고, kon 및 koff는 2가 항체, 예컨대 Fab 단편을 사용하여, 예를 들어 비아코어® 표면 플라즈몬 공명 기술에 의해 측정되는 바와 같이 결정된다.
다른 실시양태에서, 항-CLL-1 항체 또는 항원 결합 분자는 인간 CLL-1-Fc에 1 x 10-9 M 미만, 3 x 10-9 M 미만, 5 x 10-9 M 미만, 1 x 10-10 M 미만, 3 x 10-10 M 미만, 또는 5 x 10-10 M 미만의 KD로 결합한다. 다른 실시양태에서, 항-CLL-1 항체 또는 항원 결합 분자는 시노 CLL-1-Fc에 1 x 10-5 M 미만, 1 x 10-6 M 미만, 1 x 10-7 M 미만, 1 x 10-8 M 미만, 1 x 10-9 M 미만, 또는 1 x 10-10 M 미만의 KD로 결합한다.
일부 실시양태에서, 항-CLL-1 항체 또는 항원 결합 분자는 인간 CLL-1에 1 x 10-4 M-1 s-1 미만, 2 x 10-4 M-1 s-1 미만, 3 x 10-4 M-1 s-1 미만, 4 x 10-4 M-1 s-1 미만, 5 x 10-4 M-1 s-1 미만, 6 x 10-4 M-1 s-1 미만, 7 x 10-4 M-1 s-1 미만, 8 x 10-4 M-1 s-1 미만, 9 x 10-4 M-1 s-1 미만, 1 x 10-5 M-1 s-1 미만, 2 x 10-5 M-1 s-1 미만, 3 x 10-5 M-1 s-1 미만, 4 x 10-5 M-1 s-1 미만, 5 x 10-5 M-1 s-1 미만, 6 x 10-5 M-1 s-1 미만, 7 x 10-5 M-1 s-1 미만, 8 x 10-5 M-1 s-1 미만, 9 x 10-5 M-1 s-1 미만, 1 x 10-6 M-1 s-1 미만, 2 x 10-6 M-1 s-1 미만, 3 x 10-6 M-1 s-1 미만, 4 x 10-6 M-1 s-1 미만, 5 x 10-6 M-1 s-1 미만, 6 x 10-6 M-1 s-1 미만, 7 x 10-6 M-1 s-1 미만, 8 x 10-6 M-1 s-1 미만, 9 x 10-6 M-1 s-1 미만, 또는 1 x 10-7 M-1 s-1 미만의 회합률 (kon)로 결합한다. 특정 실시양태에서, kon은 1가 항체, 예컨대 Fab 단편을 사용하여, 예를 들어 비아코어® 표면 플라즈몬 공명 기술에 의해 측정되는 바와 같이 결정된다. 다른 실시양태에서, kon은 2가 항체를 사용하여, 예를 들어 비아코어® 표면 플라즈몬 공명 기술에 의해 측정되는 바와 같이 결정된다.
일부 실시양태에서, 항-CLL-1 항체 또는 항원 결합 분자는 인간 CLL-1에 1 x 10-2 s-1 미만, 2 x 10-2 s-1 미만, 3 x 10-2 s-1 미만, 4 x 10-2 s-1 미만, 5 x 10-2 s-1 미만, 6 x 10-2 s-1 미만, 7 x 10-2 s-1 미만, 8 x 10-2 s-1 미만, 9 x 10-2 s-1 미만, 1 x 10-3 s-1 미만, 2 x 10-3 s-1 미만, 3 x 10-3 s-1 미만, 4 x 10-3 s-1 미만, 5 x 10-3 s-1 미만, 6 x 10-3 s-1 미만, 7 x 10-3 s-1 미만, 8 x 10-3 s-1 미만, 9 x 10-3 s-1 미만, 1 x 10-4 s-1 미만, 2 x 10-4 s-1 미만, 3 x 10-4 s-1 미만, 4 x 10-4 s-1 미만, 5 x 10-4 s-1 미만, 6 x 10-4 s-1 미만, 7 x 10-4 s-1 미만, 8 x 10-4 s-1 미만, 9 x 10-4 s-1 미만, 1 x 10-4 s-1 미만, 또는 5 x 10-4 s-1 미만의 해리율 (koff)로 결합한다. 특정 실시양태에서, koff는 1가 항체, 예컨대 Fab 단편을 사용하여, 예를 들어 비아코어® 표면 플라즈몬 공명 기술에 의해 측정되는 바와 같이 결정된다. 다른 실시양태에서, koff는 2가 항체를 사용하여, 예를 들어 비아코어® 표면 플라즈몬 공명 기술에 의해 측정되는 바와 같이 결정된다.
항원 결합 분자는 제2 표적에 결합하는 것보다 하나의 표적에 더 강하게 결합할 때 "선택적"인 것으로 언급된다.
용어 "항체"는 표적 항원에의 특이적 결합에 대해 무손상 항체와 경쟁할 수 있는 임의의 이소형의 무손상 이뮤노글로불린, 또는 그의 단편을 지칭하고, 예를 들어, 키메라, 인간화, 완전 인간, 및 이중특이적 항체를 포함한다. "항체"는 본원에 정의된 바와 같은 항원 결합 분자의 종이다. 무손상 항체는 일반적으로 적어도 2개의 전장 중쇄 및 2개의 전장 경쇄를 포함할 것이지만, 일부 경우에 단지 중쇄만을 포함할 수 있는 낙타류 내에서 자연 발생하는 항체와 같은 보다 적은 쇄를 포함할 수 있다. 항체는 전적으로 단일 공급원으로부터 유래될 수 있거나, 또는 키메라일 수 있고, 즉, 항체의 상이한 부분은 하기에서 추가로 기재되는 바와 같은 2개의 상이한 항체로부터 유래될 수 있다. 항원 결합 분자, 항체, 또는 결합 단편은 하이브리도마 내에서, 재조합 DNA 기술에 의해, 또는 무손상 항체의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 생산될 수 있다. 달리 나타내지 않는 한, 용어 "항체"는 2개의 전장 중쇄 및 2개의 전장 경쇄를 포함하는 항체에 더하여, 그의 유도체, 변이체, 단편, 및 뮤테인을 포함하고, 그의 예가 하기 기재된다. 또한, 명백하게 제외되지 않으면, 항체는 각각 모노클로날 항체, 이중특이적 항체, 미니바디, 도메인 항체, 합성 항체 (때때로 본원에서 "항체 모방체"로서 지칭됨), 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 항체 융합체 (때때로 본원에서 "항체 접합체"로서 지칭됨), 및 그의 단편을 포함한다.
가변 영역은 전형적으로 3개의 초가변 영역 (즉, "CDR")에 의해 연결된 상대적으로 보존된 프레임워크 영역 (FR)의 동일한 일반적 구조를 나타낸다. 각각의 쌍의 2개의 쇄로부터의 CDR은 전형적으로 프레임워크 영역에 의해 정렬되고, 이는 특이적 에피토프에 결합할 수 있게 할 수 있다. N-말단에서 C-말단으로, 경쇄 및 중쇄 가변 영역 둘 다는 전형적으로 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다. 통상적으로, 중쇄의 CDR 영역은 전형적으로 HC CDR1, CDR2, 및 CDR3으로 지칭된다. 경쇄의 CDR 영역은 전형적으로 LC CDR1, CDR2, 및 CDR3으로 지칭된다. 각각의 도메인에 대한 아미노산의 배정은 전형적으로 카바트(Kabat), 코티아(Chothia)의 정의, 또는 AbM 정의에 따른다.
용어 "카바트 넘버링" 등의 용어는 관련 기술분야에서 인식되고, 항체 또는 그의 항원-결합 부분의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 내의 아미노산 잔기를 넘버링하는 시스템을 지칭한다. 특정 측면에서, 항체의 CDR은 카바트 넘버링 시스템에 따라 결정될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Kabat EA & Wu TT (1971) Ann NY Acad Sci 190: 382-391 및 Kabat EA et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242] 참조). 카바트 넘버링 시스템을 사용하면, 항체 중쇄 분자 내의 CDR은 전형적으로 아미노산 위치 31 내지 35 (이는 임의로 35 다음에 1 또는 2개의 추가의 아미노산 (카바트 넘버링 스킴에서 35A 및 35B로 지칭됨)을 포함할 수 있음) (CDR1), 아미노산 위치 50 내지 65 (CDR2), 및 아미노산 위치 95 내지 102 (CDR3)에 존재한다. 카바트 넘버링 시스템을 사용하면, 항체 경쇄 분자 내의 CDR은 전형적으로 아미노산 위치 24 내지 34 (CDR1), 아미노산 위치 50 내지 56 (CDR2), 및 아미노산 위치 89 내지 97 (CDR3)에 존재한다. 구체적 실시양태에서, 본원에 기재된 항체의 CDR은 카바트 넘버링 스킴에 따라 결정되었다.
특정 측면에서, 항체의 CDR은 코티아 넘버링 스킴에 따라 결정될 수 있고, 이는 이뮤노글로불린 구조적 루프의 위치를 언급한다 (예를 들어, 문헌 [Chothia C & Lesk AM, (1987), J Mol Biol 196: 901-917; Al-Lazikani B et al., (1997) J Mol Biol 273: 927-948; Chothia C et al., (1992) J Mol Biol 227: 799-817; Tramontano A et al., (1990) J Mol Biol 215(1): 175-82]; 및 미국 특허 번호 7,709,226 참조). 전형적으로, 카바트 넘버링 규정을 사용할 때, 코티아 CDR-H1 루프는 중쇄 아미노산 26 내지 32, 33, 또는 34에 존재하고, 코티아 CDR-H2 루프는 중쇄 아미노산 52 내지 56에 존재하고, 및 코티아 CDR-H3 루프는 중쇄 아미노산 95 내지 102에 존재하는 한편, 코티아 CDR-L1 루프는 경쇄 아미노산 24 내지 34에 존재하고, 코티아 CDR-L2 루프는 경쇄 아미노산 50 내지 56에 존재하고, 코티아 CDR-L3 루프는 경쇄 아미노산 89 내지 97에 존재한다. 코티아 CDR-HI 루프의 말단은 카바트 넘버링 규정을 사용하여 넘버링할 경우 루프의 길이에 따라 H32 및 H34 사이에서 달라진다 (이는 카바트 넘버링 스킴이 H35A 및 H35B에 삽입을 두기 때문이고; 35A도 존재하지 않고 35B도 존재하지 않으면, 루프는 32에서 종결되고; 35A만이 존재하면, 루프는 33에서 종결되고; 35A와 35B 둘 다가 존재하면, 루프는 34에서 종결된다).
구체적 실시양태에서, 본원에 기재된 항체의 CDR은 코티아 넘버링 스킴에 따라 결정되었다.
CDR의 수많은 정의가 통상적으로 사용되고 있다: 카바트 넘버링, 코티아 넘버링, AbM 넘버링, 또는 접촉 넘버링. AbM 정의는 옥스포드 몰레큘라(Oxford Molecular)의 AbM 항체 모델링 소프트웨어에 의해 사용되는 2개 사이의 절충안이다. 접촉 정의는 이용가능한 복합체 결정 구조의 분석을 기초로 한다.
표 2: CDR 넘버링
Figure pat00008
본원에 사용된 용어 "중쇄"가 항체와 관련하여 사용될 때, 이는 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여 임의의 별개의 유형, 예를 들어, 알파 (α), 델타 (δ), 엡실론 (ε), 감마 (γ) 및 뮤 (μ)로 지칭될 수 있고, 이는 IgG의 하위부류, 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하여, 각각 항체의 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM 부류를 생성한다.
본원에 사용된 용어 "경쇄"가 항체와 관련하여 사용될 때, 이는 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여 임의의 별개의 유형, 예를 들어, 카파 (κ) 또는 람다 (λ)로 지칭될 수 있다. 경쇄 아미노산 서열은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 구체적 실시양태에서, 경쇄는 인간 경쇄이다.
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 전형적으로 중쇄에서 대략 아미노-말단 120 내지 130개의 아미노산 및 경쇄에서 약 100 내지 110개의 아미노 말단 아미노산을 포함하는, 항체의 경쇄 및/또는 중쇄의 부분을 지칭한다. 항체의 가변 영역은 전형적으로 그의 표적에 대한 특정한 항체의 특이성을 결정한다.
가변성은 항체 또는 항원 결합 분자의 가변 도메인 전반에 걸쳐 고르게 분포되지 않고; 중쇄 및 경쇄 가변 영역 각각의 서브-도메인에 집중되어 있다. 이들 서브도메인은 본원에 추가로 기재된 바와 같이 "초가변 영역" 또는 "상보성 결정 영역" (CDR)으로 불린다. 가변 도메인의 보다 보존된 (즉, 비-초가변) 부분은 "프레임워크" 영역 (FRM 또는 FR)으로 불리고, 이는 6개의 CDR에 대한 스캐폴드를 3차원 공간으로 제공하여 항원-결합 표면을 형성한다. 자연 발생 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 3개의 초가변 영역에 의해 연결된, 주로 β-시트 형상을 취하는 4개의 FRM 영역 (FR1, FR2, FR3, 및 FR4)을 포함하고, 상기 초가변 영역은 β-시트 구조를 연결하고 일부 경우에는 그의 일부를 형성하는 루프를 형성한다. 각각의 쇄에서 초가변 영역은 FRM에 의해 근접하여 함께 유지되고, 다른 쇄로부터의 초가변 영역은 항원-결합 부위의 형성에 기여한다 (본원에 추가로 기재되는 문헌 [Kabat et al.] 참조).
전형적으로, CDR은 정규 구조로 분류될 수 있는 루프 구조를 형성한다. 용어 "정규 구조"는 항원 결합 (CDR) 루프에 의해 채택된 주쇄 입체형태를 지칭한다. 비교 구조 연구로부터, 6개의 항원 결합 루프 중 5개만이 이용가능한 입체형태의 제한된 레퍼토리를 갖는다는 것이 발견되었다. 각각의 정규 구조는 폴리펩티드 백본의 비틀림각을 특징으로 할 수 있다. 따라서 항체 사이에 상응하는 루프는, 루프의 대부분의 부분에서의 높은 아미노산 서열 가변성에도 불구하고, 매우 유사한 3차원 구조를 가질 수 있다 (Chothia and Lesk, J. MoI. Biol., 1987, 196: 901; Chothia et al., Nature, 1989, 342: 877; Martin and Thornton, J. MoI. Biol, 1996, 263: 800). 또한, 채택된 루프 구조와 그 주위의 아미노산 서열 사이에 관계성이 존재한다. 특정한 정규 부류의 입체형태는 루프의 길이, 및 루프 내, 뿐만 아니라 보존된 프레임워크 내 (즉, 루프의 외부) 핵심 위치에 존재하는 아미노산 잔기에 의해 결정된다. 따라서 특정한 정규 부류에의 배정은 이들 핵심 아미노산 잔기의 존재에 기초하여 이루어질 수 있다.
용어 "정규 구조"는 또한, 예를 들어 카바트 (Kabat et al., 본원)에 의해 카탈로그화된 바와 같이, 항체의 선형 서열에 대한 고려사항을 포함할 수 있다. 카바트 넘버링 스킴 (시스템)은 항체 가변 도메인의 아미노산 잔기를 일관된 방식으로 넘버링하는 널리 채택된 표준으로, 본원의 다른 부분에서 또한 언급된 바와 같이 본 발명에 적용된 바람직한 스킴이다. 추가의 구조 고려사항이 또한 항체의 정규 구조를 결정하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 카바트 넘버링에 의해 충분히 반영되지 않은 그러한 차이가 코티아 등의 넘버링 시스템에 의해 기재될 수 있고/거나 다른 기술, 예를 들어, 결정학 및 2- 또는 3-차원 컴퓨터 모델링에 의해 밝혀질 수 있다. 따라서, 주어진 항체 서열은, 다른 것들 중에서, (예를 들어, 다양한 정규 구조를 라이브러리에 포함시키고자 하는 목적에 기초하여) 적절한 섀시 서열을 확인 가능하게 하는 정규 부류로 배치될 수 있다. 항체 아미노산 서열의 카바트 넘버링 및 문헌 [Chothia et al.] (본원)에 기재된 바와 같은 구조 고려사항 및 항체 구조의 정규 측면을 해석하기 위한 그의 관여는 문헌에 기재되어 있다. 이뮤노글로불린의 상이한 부류의 서브유닛 구조 및 3-차원 형상은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 항체 구조의 검토를 위해, 문헌 [Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, eds. Harlow et al., 1988]을 참조한다.
경쇄의 CDR3 및, 특히 중쇄의 CDR3은 경쇄 및 중쇄 가변 영역 내에 항원 결합에서의 가장 중요한 결정자를 구성할 수 있다. 일부 항체 구축물에서, 중쇄 CDR3은 항원과 항체 사이의 주요 접촉 구역을 구성하는 것으로 보인다. CDR3만이 달라지는 시험관내 선택 스킴을 사용하여 항체의 결합 특성을 다르게 하거나 또는 어떠한 잔기가 항원의 결합에 기여하는지 결정할 수 있다. 따라서, CDR3은 전형적으로 항체-결합 부위 내의 분자 다양성의 가장 큰 공급원이다. H3은, 예를 들어, 2개의 아미노산 잔기만큼 짧을 수 있거나 또는 26개 초과의 아미노산일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "불변 영역" 및 "불변 도메인"은 상호교환가능하고, 관련 기술분야에서의 통상적인 의미를 갖는다. 불변 영역은 항체 부분, 예를 들어, 항체의 항원에 대한 결합에 직접 수반되지는 않지만 다양한 이펙터 기능, 예컨대 Fc 수용체와의 상호작용을 나타낼 수 있는 경쇄 및/또는 중쇄의 카르복실 말단 부분이다. 이뮤노글로불린 분자의 불변 영역은 일반적으로 이뮤노글로불린 가변 도메인에 비해 보다 보존된 아미노산 서열을 갖는다.
"결합 친화도"는 일반적으로, 분자 (예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 그의 결합 파트너 (예를 들어, 항원) 사이의 비-공유 상호작용의 총 합계의 강도를 지칭한다. 달리 나타내지 않는 한, 본원에 사용된 "결합 친화도"는 결합 쌍의 구성원들 (예를 들어, 항체 및 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 고유의 결합 친화도를 지칭한다. 분자 X의 그의 파트너 Y에 대한 친화도는 일반적으로 해리 상수 (KD)로 나타내어질 수 있다. 친화도는 평형 해리 상수 (KD) 및 평형 회합 상수 (KA)를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 관련 기술분야에 공지된 수많은 방식으로 측정되고/거나 표현될 수 있다. KD는 koff/kon의 비율로부터 계산되고, 반면에 KA는 kon/koff의 비율로부터 계산된다. kon은 예를 들어, 항체의 항원에 대한 회합률 상수를 지칭하고, koff는 예를 들어, 항체의 항원에 대한 해리율 상수를 지칭한다. kon 및 koff는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 기술, 예컨대 비아코어® 또는 키넥사(KinExA)에 의해 결정될 수 있다.
용어 "중화"는 리간드에 결합하여 그러한 리간드의 생물학적 효과를 막거나 감소시키는 항원 결합 분자, scFv, 또는 항체를 각각 지칭한다. 이는 예를 들어 리간드 상의 결합 부위를 직접 차단하거나, 또는 리간드에 결합하여 간접적 수단 (예컨대 리간드의 구조적 또는 에너지적 변경)을 통해 리간드의 결합 능력을 변경시킴으로써 이루어질 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 용어는 또한 그것이 결합하는 단백질이 생물학적 기능을 수행하는 것을 막는 항원 결합 분자를 나타낼 수 있다.
용어 "표적"은 항원 결합 분자가 결합할 수 있는 분자 또는 분자의 부분을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 표적은 1개 이상의 에피토프를 가질 수 있다.
용어 "경쟁하다"가 동일한 에피토프에 대해 경쟁하는 항원 결합 분자와 관련하여 사용될 때, 이는 시험된 항원 결합 분자 (예를 들어, 항체 또는 면역학적으로 기능성인 그의 단편)가, 참조 항원 결합 분자가 항원에 특이적으로 결합하는 것을 막거나 억제하는 (예를 들어, 감소시키는) 것으로 검정에 의해 결정된 바와 같은, 항원 결합 분자 사이의 경쟁을 의미한다. 하나의 항원 결합 분자가 또 다른 것과 경쟁하는지 여부를 결정하기 위해, 예를 들어: 고체 상 직접 또는 간접 방사선면역검정 (RIA), 고체 상 직접 또는 간접 효소 면역검정 (EIA), 샌드위치 경쟁 검정 (Stahli et al., 1983, Methods in Enzymology 9:242-253); 고체 상 직접 비오틴-아비딘 EIA (Kirkland et al., 1986, J. Immunol. 137:3614-3619), 고체 상 직접 표지된 검정, 고체 상 직접 표지된 샌드위치 검정 (Harlow and Lane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press); 1-125 표지를 사용하는 고체 상 직접 표지 RIA (Morel et al., 1988, Molec. Immunol. 25:7-15); 고체 상 직접 비오틴-아비딘 EIA (Cheung, et al., 1990, Virology 176:546-552); 및 직접 표지된 RIA (Moldenhauer et al., 1990, Scand. J. Immunol. 32:77-82)의 수많은 유형의 경쟁 결합 검정이 사용될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "에피토프"는 항체가 특이적으로 결합할 수 있는 항원의 국부 영역을 지칭한다. 에피토프는 예를 들어 폴리펩티드의 인접 아미노산일 수 있거나 (선형 또는 인접 에피토프), 또는 에피토프는 예를 들어 폴리펩티드 또는 폴리펩티드들의 2개 이상의 비-인접 영역으로부터 함께 모일 수 있다 (입체형태적, 비-선형, 불연속적, 또는 비-인접 에피토프). 특정 실시양태에서, 항체가 결합하는 에피토프는 예를 들어 NMR 분광분석법, X선 회절 결정학 연구, ELISA 검정, 질량 분광측정법과 커플링된 수소/중수소 교환 (예를 들어, 액체 크로마토그래피 전기분무 질량 분광측정법), 어레이-기반 올리고-펩티드 스캐닝 검정, 및/또는 돌연변이유발 맵핑 (예를 들어, 부위-지정 돌연변이유발 맵핑)에 의해 결정될 수 있다. X선 결정학의 경우에, 결정화는 관련 기술분야에 공지된 방법 중 임의의 것을 사용하여 달성될 수 있다 (예를 들어, Giege R. et al., (1994) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50(Pt 4): 339-350; McPherson A (1990) Eur J Biochem 189: 1-23; Chayen NE (1997) Structure 5: 1269-1274; McPherson A (1976) J Biol Chem 251: 6300-6303). 항체:항원 결정은 널리 공지된 X선 회절 기술을 사용하여 연구될 수 있고, 컴퓨터 소프트웨어 예컨대 X-PLOR (예일 대학교, 1992, 몰레큘라 시뮬레이션스, 인크.(Molecular Simulations, Inc.)에 의해 배포됨; 예를 들어 문헌 [Meth Enzymol (1985) volumes 114 & 115, eds Wyckoff HW et al.,]; 미국 2004/0014194 참조), 및 BUSTER (Bricogne G (1993) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 49(Pt 1): 37-60; Bricogne G (1997) Meth Enzymol 276A: 361-423, ed Carter CW; Roversi P et al., (2000) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 56(Pt 10): 1316-1323)을 사용하여 정밀화될 수있다. 돌연변이유발 맵핑 연구는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 방법을 사용하여 달성될 수 있다. 예를 들어, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 기술을 포함한 돌연변이유발 기술의 설명에 대해 문헌 [Champe M et al., (1995) J Biol Chem 270: 1388-1394 및 Cunningham BC & Wells JA (1989) Science 244: 1081-1085]을 참조한다.
본원에 사용된 용어 "표지" 또는 "표지된"은, 예를 들어 방사성표지된 아미노산의 혼입 또는 마킹된 아비딘 (예를 들어, 광학 또는 비색 방법에 의해 검출될 수 있는 형광 마커 또는 효소적 활성을 함유하는 스트렙타비딘)에 의해 검출될 수 있는 비오틴 모이어티의 폴리펩티드에의 부착에 의한, 검출가능한 마커의 혼입을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 표지 또는 마커는 또한 치료적일 수 있다. 폴리펩티드 및 당단백질을 표지하는 다양한 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있고 사용될 수 있다.
치료 방법
입양 면역요법을 사용할 경우, 천연 T 세포를 (i) 환자로부터 빼내어, (ii) 적어도 1종의 종양 항원에 결합하는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하도록 유전자 조작하고, (iii) 조작된 T 세포의 보다 큰 집단으로 생체외 확장하고, (iv) 환자 내로 재도입할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 7,741,465, 및 6,319,494, 문헌 [Eshhar et al. (Cancer Immunol, 상기 문헌); Krause et al. (상기 문헌); Finney et al. (상기 문헌)]을 참조한다. 조작된 T 세포를 환자 내로 재도입한 후, 이는 종양 항원을 발현하는 세포에 대해 면역 반응을 매개한다. 예를 들어, 문헌 [Krause et al., J. Exp. Med., Volume 188, No. 4, 1998 (619-626)]을 참조한다. 이러한 면역 반응은 T 세포에 의한 IL-2 및 다른 시토카인의 분비, 종양 항원을 인식하는 T 세포의 클론 확장, 및 표적-양성 세포의 T 세포-매개된 특이적 사멸을 포함한다. 문헌 [Hombach et al., Journal of Immun. 167: 6123-6131 (2001)]을 참조한다.
본원에 사용된 용어 "림프구"는 자연 킬러 (NK) 세포, T 세포, 또는 B 세포를 포함한다. NK 세포는 선천성 면역계의 주요 성분을 대표하는 세포독성 (세포 독성) 림프구 유형이다. NK 세포는 종양 및 바이러스에 감염된 세포를 거부한다. 이는 아폽토시스 또는 프로그램화된 세포 사멸의 과정을 통해 작용한다. 이들은 세포를 사멸시키기 위해 활성화를 필요로 하지 않기 때문에 "자연 킬러"로 명명된다. T-세포는 세포-매개-면역 (어떠한 항체도 수반되지 않음)에서 주요 역할을 한다. 그의 T-세포 수용체 (TCR)가 이들을 다른 림프구 유형으로부터 구별한다. 면역계의 특수 기관인 흉선은 T 세포의 성숙을 주로 담당한다. 6가지 유형의 T-세포, 즉 헬퍼 T-세포 (예를 들어, CD4+ 세포), 세포독성 T-세포 (또한 TC, 세포독성 T 림프구, CTL, T-킬러 세포, 세포용해 T 세포, CD8+ T-세포 또는 킬러 T 세포로도 알려짐), 기억 T-세포 ((i) 줄기 기억 TSCM 세포, 예컨대 나이브 세포는 CD45RO-, CCR7+, CD45RA+, CD62L+ (L-셀렉틴), CD27+, CD28+ 및 IL-7Rα+이지만, 또한 다량의 CD95, IL-2Rβ, CXCR3, 및 LFA-1을 발현하고, 기억 세포 특유의 수많은 기능 속성을 나타냄; (ii) 중심 기억 TCM 세포는 L-셀렉틴 및 CCR7을 발현하고, IL-2를 분비하지만 IFNγ 또는 IL-4는 분비하지 않음, (iii) 그러나, 이펙터 기억 TEM 세포는 L-셀렉틴 또는 CCR7을 발현하지 않지만, 이펙터 시토카인 예컨대 IFNγ 및 IL-4를 생산함), 조절 T-세포 (Treg, 억제자 T 세포, 또는 CD4+CD25+ 조절 T 세포), 자연 킬러 T-세포 (NKT) 및 감마 델타 T-세포가 존재한다. 다른 한편으로는, B-세포는 체액성 면역 (항체가 수반됨)에서 주요한 역할을 한다. 이는 항체 및 항원을 생성하고, 항원-제시 세포 (APC)의 역할을 수행하고, 항원 상호작용에 의한 활성화 후에 기억 B-세포로 변한다. 포유동물에서, 미성숙 B-세포는 그의 명칭이 유래되는 골수에서 형성된다.
용어 "유전자 조작된" 또는 "조작된"은 코딩 또는 비-코딩 영역 또는 그의 부분을 결실시키거나 또는 코딩 영역 또는 그의 부분을 삽입하는 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 세포의 게놈을 변형시키는 방법을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 변형되는 세포는 림프구, 예를 들어, T 세포이며, 이는 환자 또는 공여자로부터 수득될 수 있다. 외인성 구축물, 예컨대, 예를 들어, 키메라 항원 수용체 (CAR) 또는 T 세포 수용체 (TCR)를 발현하도록 세포가 변형될 수 있고, 이는 세포의 게놈 내로 혼입된다.
"면역 반응"은 침입 병원체, 병원체로 감염된 세포 또는 조직, 암성 또는 다른 비정상 세포, 또는 자가면역 또는 병리학적 염증의 경우에 정상 인간 세포 또는 조직을 선택적으로 표적화하고/거나, 이에 결합하고/거나, 이에 대해 손상을 입히고/거나, 이를 파괴시키고/거나, 이를 척추동물의 신체로부터 제거하는, 면역계의 세포 (예를 들어, T 림프구, B 림프구, 자연 킬러 (NK) 세포, 대식세포, 호산구, 비만 세포, 수지상 세포 및 호중구), 및 이들 세포 중 임의의 것 또는 간에 의해 생산된 가용성 거대분자 (Ab, 시토카인, 및 보체 포함)의 작용을 지칭한다.
용어 "면역요법"은 면역 반응을 유도하거나, 증진시키거나, 억제하거나 또는 달리 변형시키는 것을 포함하는 방법에 의한, 질환을 앓고 있거나 또는 질환에 걸릴 위험이 있거나 또는 질환의 재발로 인해 고통받을 위험이 있는 대상체의 치료를 지칭한다. 면역요법의 예는 T 세포 요법을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. T 세포 요법은 입양 T 세포 요법, 종양-침윤 림프구 (TIL) 면역요법, 자가 세포 요법, 조작된 자가 세포 요법 (eACT), 및 동종 T 세포 이식을 포함할 수 있다. 그러나, 관련 분야의 통상의 기술자는 본원에 개시된 조건화 방법이 임의의 이식된 T 세포 요법의 유효성을 증진시킬 것임을 인식할 것이다. T 세포 요법의 예는 미국 특허 공개 번호 2014/0154228 및 2002/0006409, 미국 특허 번호 5,728,388, 및 국제 공개 번호 WO 2008/081035에 기재되어 있다.
면역요법의 T 세포는 관련 기술분야에 공지된 임의의 공급원으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, T 세포는 조혈 줄기 세포 집단으로부터 시험관내 분화될 수 있거나, 또는 T 세포는 대상체로부터 수득될 수 있다. T 세포는 예를 들어, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 감염 부위로부터의 조직, 복수, 흉막 삼출, 비장 조직, 및 종양으로부터 수득될 수 있다. 또한, T 세포는 관련 기술분야에서 입수가능한 1종 이상의 T 세포주로부터 유래될 수 있다. T 세포는 또한 통상의 기술자에게 공지된 다수의 기술, 예컨대 피콜(FICOLL)™ 분리 및/또는 분리반출술을 사용하여 대상체로부터 수집된 단위 혈액으로부터 수득될 수 있다. T 세포 요법을 위한 T 세포를 단리하는 추가의 방법은 미국 특허 공개 번호 2013/0287748에 개시되어 있고, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
"eACT™"로 약칭될 수 있고 또한 입양 세포 전달로도 공지되어 있는 용어 "조작된 자가 세포 요법"은 환자 자신의 T 세포를 수집하고, 후속하여 1종 이상의 특정 종양 세포 또는 악성종양의 세포 표면에서 발현된 1종 이상의 항원을 인식하고 표적화하도록 이를 유전자 변경하는 방법이다. T 세포는 예를 들어, 키메라 항원 수용체 (CAR) 또는 T 세포 수용체 (TCR)를 발현하도록 조작될 수 있다. CAR 양성 (+) T 세포는 적어도 1개의 공동자극 도메인 및 적어도 1개의 활성화 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 부분에 연결된, 특정한 종양 항원에 대한 특이성을 갖는 세포외 단일 쇄 가변 단편 (scFv)을 발현하도록 조작된다. 공동자극 도메인은, 예를 들어, CD28로부터 유래될 수 있고 (또는 그에 상응할 수 있고), 활성화 도메인은, 예를 들어, CD3-제타로부터 유래될 수 있다 (또는 그에 상응할 수 있다). 특정 실시양태에서, CAR은 2, 3, 4개, 또는 그 초과의 공동자극 도메인을 갖도록 설계된다.
용어 "자가"는 이후에 재-도입될 동일한 개체로부터 유래된 임의의 물질을 지칭한다. 예를 들어, 본원에 기재된 조작된 자가 세포 요법 (eACT™) 방법은 환자로부터 림프구를 수집한 후, 이를 예를 들어 CAR 구축물을 발현하도록 조작하고, 이어서 이를 다시 동일한 환자에게 투여하는 것을 수반한다.
용어 "동종"은 한 개체로부터 유래되고 이어서 동일한 종의 또 다른 개체에 도입되는 임의의 물질, 예를 들어, 동종 T 세포 이식을 지칭한다.
일부 측면에서, 본 발명은 따라서 본원에 개시된 적어도 1종의 단리된 항원 결합 분자, CAR, 또는 TCR의 유효량을 바람직하지 않고/거나 상승된 CLL-1 수준과 연관된 상태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자에서 상기 상태를 치료 또는 예방하는 방법을 포함한다.
암을 포함한 질환 또는 장애를 치료하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 본 출원의 조작된 면역 세포의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 T 세포-매개된 면역 반응을 생성하는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, T 세포-매개된 면역 반응은 표적 세포 또는 세포들에 대해 지시된다. 일부 실시양태에서, 조작된 면역 세포는 키메라 항원 수용체 (CAR), 또는 T 세포 수용체 (TCR)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적 세포는 종양 세포이다. 일부 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 적어도 1종의 단리된 항원 결합 분자의 유효량을 악성종양의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 악성종양을 치료 또는 예방하는 방법을 포함한다. 일부 측면에서, 본 발명은 적어도 1종의 면역 세포의 유효량을 악성종양의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 악성종양을 치료 또는 예방하는 방법을 포함하며, 여기서 면역 세포는 본원에 기재된 바와 같은 적어도 1종의 키메라 항원 수용체, T 세포 수용체, 및/또는 단리된 항원 결합 분자를 포함한다.
일부 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 적어도 1종의 항원 결합 분자 및 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 추가로 추가의 활성제를 포함한다.
본 발명의 항원 결합 분자, CAR, TCR, 면역 세포 등은 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 골수 백혈병 (CML), 만성 골수단핵구성 백혈병 (CMML), 소아 골수단핵구성 백혈병, 비정형 만성 골수성 백혈병, 급성 전골수구성 백혈병 (APL), 급성 단핵모구성 백혈병, 급성 적백혈병, 급성 거핵모구성 백혈병, 골수이형성 증후군 (MDS), 골수증식성 장애, 골수성 신생물, 골수성 육종), 모구성 형질세포양 수지상 세포 신생물 (BPDCN), 또는 그의 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는 골수성 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. 추가의 질환은 염증성 및/또는 자가면역 질환 예컨대 류마티스 관절염, 건선, 알레르기, 천식, 크론병, IBD, IBS, 섬유근육통, 비만세포증, 및 복강 질환을 포함한다.
CAR+/ CAR-T+/ TCR+ 세포에 대한 표적 용량은 바람직하게는 1x106 - 2x1010개 세포/kg, 보다 바람직하게는 2x106개 세포/kg 범위일 수 있다는 것이 인지될 것이다. 이러한 범위를 초과하거나 미만인 용량이 특정 대상체에게 적절할 수 있고, 적절한 용량 수준은 건강관리 제공자에 의해 필요에 따라 결정될 수 있다는 것이 인지될 것이다. 추가적으로, 세포의 다중 용량이 본 발명에 따라 제공될 수 있다.
또한, 본 발명의 조작된 세포를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 종양의 크기를 감소시키는 방법이 제공되며, 여기서 세포는 종양 상의 항원에 결합하는 항원 결합 분자를 포함하는 키메라 항원 수용체, T 세포 수용체, 또는 T 세포 수용체 기반 키메라 항원 수용체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 고형 종양 또는 혈액 악성종양 예컨대 림프종 또는 백혈병을 갖는다. 일부 실시양태에서, 조작된 세포는 종양 층에 전달된다. 일부 실시양태에서, 암은 대상체의 골수에 존재한다. 일부 실시양태에서, 조작된 세포는 자가 T 세포이다. 일부 실시양태에서, 조작된 세포는 동종 T 세포이다. 일부 실시양태에서, 조작된 세포는 이종 T 세포이다. 일부 실시양태에서, 본 출원의 조작된 세포는 생체내 형질감염 또는 형질도입된다. 다른 실시양태에서, 조작된 세포는 생체외 형질감염 또는 형질도입된다. 본원에 사용된 용어 "시험관내 세포"는 생체외 배양되는 임의의 세포를 지칭한다. 특히, 시험관내 세포는 T 세포를 포함할 수 있다.
방법은 1종 이상의 화학요법제를 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 화학요법제는 림프구고갈 (사전조건화) 화학요법제이다. 유익한 사전조건화 치료 요법은, 상관되는 유익한 바이오마커와 함께, 미국 특허 가출원 번호 62/262,143 및 62/167,750에 기재되어 있고, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 이들은, 예를 들어, T 세포 요법을 필요로 하는 환자에게 명시된 유익한 용량의 시클로포스파미드 (200 mg/m2/일 내지 2000 mg/m2/일) 및 명시된 유익한 용량의 플루다라빈 (20 mg/m2/일 내지 900 mg/m2/일)을 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자를 조건화하는 방법을 기재한다. 바람직한 용량 요법은 환자에게 치료 유효량의 조작된 T 세포를 투여하기 전 3일 동안 환자에게 약 500 mg/m2/일의 시클로포스파미드 및 약 60 mg/m2/일의 플루다라빈을 매일 투여하는 것을 포함하는, 환자를 치료하는 것을 수반한다.
다른 실시양태에서, 항원 결합 분자, 형질도입된 (또는 달리 조작된) 세포 (예컨대 CAR 또는 TCR), 및 화학요법제는 각각 대상체에서 질환 또는 상태를 치료하는데 효과적인 양으로 투여된다.
특정 실시양태에서, 본원에 개시된 CAR-발현 면역 이펙터 세포를 포함하는 조성물은 임의의 수의 화학요법제와 함께 투여될 수 있다. 화학요법제의 예는 알킬화제 예컨대 티오테파 및 시클로포스파미드 (시톡산(CYTOXAN)™); 알킬 술포네이트 예컨대 부술판, 임프로술판 및 피포술판; 아지리딘 예컨대 벤조도파, 카르보쿠온, 메투레도파, 및 우레도파; 에틸렌이민 및 메틸라멜라민 예컨대 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드 및 트리메틸올로멜라민 레주메; 질소 머스타드 예컨대 클로람부실, 클로르나파진, 콜로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥시드 히드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비킨, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로스우레아 예컨대 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 라니무스틴; 항생제 예컨대 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 칼리케아미신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신, 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 퓨로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항대사물 예컨대 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 폴산 유사체 예컨대 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체 예컨대 플루다라빈, 6-메르캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘, 5-FU; 안드로겐 예컨대 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항부신제 예컨대 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 폴산 보충제 예컨대 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르미틴; 엘립티늄 아세테이트; 에토글루시드; 질산갈륨; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다민; 미토구아존; 미톡산트론; 모피다몰; 니트라크린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 포도필린산; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK®; 라족산; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 시클로포스파미드; 티오테파; 탁소이드, 예를 들어 파클리탁셀 (탁솔(TAXOL)™, 브리스톨-마이어스 스큅(Bristol-Myers Squibb)) 및 도세탁셀 (탁소테레(TAXOTERE)®, 롱-프랑 로러(Rhone-Poulenc Rorer)); 클로람부실; 겜시타빈; 6-티오구아닌; 메르캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 유사체 예컨대 시스플라틴 및 카르보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미토마이신 C; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 나벨빈; 노반트론; 테니포시드; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다; 이반드로네이트; CPT-11; 토포이소머라제 억제제 RFS2000; 디플루오로메틸로미틴 (DMFO); 레티노산 유도체 예컨대 탈그레틴(Targretin)™ (벡사로텐), 판레틴(Panretin)™, (알리트레티노인); 온탁(ONTAK)™ (데니류킨 디프티톡스); 에스페라미신; 카페시타빈; 및 상기 중 임의의 것의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체를 포함한다. 또한 종양에 대한 호르몬 작용을 조절하거나 억제하는 작용을 하는 항호르몬제, 예컨대 항에스트로겐 예컨대 예를 들어 타목시펜, 랄록시펜, 아로마타제 억제 4(5)-이미다졸, 4-히드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤, 및 토레미펜 (파레스톤); 및 항안드로겐 예컨대 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 류프롤리드, 및 고세렐린; 및 상기 중 임의의 것의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체가 본 정의에 포함된다. 또한, CHOP, 즉, 시클로포스파미드 (시톡산(Cytoxan)®), 독소루비신 (히드록시독소루비신), 빈크리스틴 (온코빈(Oncovin)®), 및 프레드니손을 포함하나 이에 제한되지는 않는 화학요법제의 조합이 적절한 경우에 투여된다.
일부 실시양태에서, 화학요법제는 조작된 세포, 폴리펩티드, 또는 핵산의 투여와 동시에 또는 투여 후 1주 내에 투여된다. 다른 실시양태에서, 화학요법제는 조작된 세포, 폴리펩티드, 또는 핵산을 투여하고 1 내지 4주 또는 1주 내지 1개월, 1주 내지 2개월, 1주 내지 3개월, 1주 내지 6개월, 1주 내지 9개월, 또는 1주 내지 12개월 후에 투여된다. 다른 실시양태에서, 화학요법제는 세포, 폴리펩티드, 또는 핵산을 투여하기 적어도 1개월 전에 투여된다. 일부 실시양태에서, 방법은 2종 이상의 화학요법제를 투여하는 것을 추가로 포함한다.
다양한 추가의 치료제가 본원에 기재된 조성물과 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 잠재적으로 유용한 추가의 치료제는 PD-1 억제제 예컨대 니볼루맙 (옵디보(Opdivo)®), 펨브롤리주맙 (키트루다(Keytruda)®), 펨브롤리주맙, 피딜리주맙, 및 아테졸리주맙을 포함한다.
본 발명과 조합하여 사용하기에 적합한 추가의 치료제는 이브루티닙 (임브루비카(Imbruvica)®), 오파투무맙 (아르제라(Arzerra)®), 리툭시맙 (리툭산(Rituxan)®), 베바시주맙 (아바스틴(Avastin)®), 트라스투주맙 (헤르셉틴(Herceptin)®), 트라스투주맙 엠탄신 (카드실라(KADCYLA)®), 이마티닙 (글리벡(Gleevec)®), 세툭시맙 (에르비툭스(Erbitux)®), 파니투무맙 (벡티빅스(Vectibix)®), 카투막소맙, 이브리투모맙, 오파투무맙, 토시투모맙, 브렌툭시맙, 알렘투주맙, 겜투주맙, 에를로티닙, 게피티닙, 반데타닙, 아파티닙, 라파티닙, 네라티닙, 악시티닙, 마시티닙, 파조파닙, 수니티닙, 소라페닙, 토세라닙, 레스타우르티닙, 악시티닙, 세디라닙, 렌바티닙, 닌테다닙, 파조파닙, 레고라페닙, 세막사닙, 소라페닙, 수니티닙, 티보자닙, 토세라닙, 반데타닙, 엔트렉티닙, 카보잔티닙, 이마티닙, 다사티닙, 닐로티닙, 포나티닙, 라도티닙, 보수티닙, 레스타우르티닙, 룩솔리티닙, 파크리티닙, 코비메티닙, 셀루메티닙, 트라메티닙, 비니메티닙, 알렉티닙, 세리티닙, 크리조티닙, 아플리베르셉트, 아디포티드, 데니류킨 디프티톡스, mTOR 억제제 예컨대 에베롤리무스 및 템시롤리무스, 헷지호그 억제제 예컨대 소니데깁 및 비스모데깁, CDK 억제제 예컨대 CDK 억제제 (팔보시클립)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
추가의 실시양태에서, CAR-함유 면역을 포함하는 조성물은 항염증제와 함께 투여될 수 있다. 항염증제 또는 약물은 스테로이드 및 글루코코르티코이드 (베타메타손, 부데소니드, 덱사메타손, 히드로코르티손 아세테이트, 히드로코르티손, 히드로코르티손, 메틸프레드니솔론, 프레드니솔론, 프레드니손, 트리암시놀론 포함), 비스테로이드성 항염증 약물 (NSAID) 예컨대 아스피린, 이부프로펜, 나프록센, 메토트렉세이트, 술파살라진, 레플루노미드, 항-TNF 의약, 시클로포스파미드 및 미코페놀레이트를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 예시적인 NSAID는 이부프로펜, 나프록센, 나프록센 소듐, Cox-2 억제제 및 시알릴에이트를 포함한다. 예시적인 진통제는 아세트아미노펜, 옥시코돈, 프로폭시펜 히드로클로라이드의 트라마돌을 포함한다. 예시적인 글루코코르티코이드는 코르티손, 덱사메타손, 히드로코르티손, 메틸프레드니솔론, 프레드니솔론 또는 프레드니손을 포함한다. 예시적인 생물학적 반응 조절제는 세포 표면 마커 (예를 들어, CD4, CD5 등)에 대해 지시된 분자, 시토카인 억제제, 예컨대 TNF 길항제 (예를 들어, 에타네르셉트 (엔브렐(ENBREL)®), 아달리무맙 (휴미라(HUMIRA)®) 및 인플릭시맙 (레미케이드(REMICADE)®), 케모카인 억제제 및 부착 분자 억제제를 포함한다. 생물학적 반응 조절제는 모노클로날 항체 뿐만 아니라 분자의 재조합 형태를 포함한다. 예시적인 DMARD는 아자티오프린, 시클로포스파미드, 시클로스포린, 메토트렉세이트, 페니실라민, 레플루노미드, 술파살라진, 히드록시클로로퀸, 금 (경구 (아우라노핀) 및 근육내), 및 미노시클린을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물은 시토카인과 함께 투여된다. 본원에 사용된 "시토카인"은 세포간 매개체로서 또 다른 세포에 대해 작용하는, 하나의 세포 집단에 의해 방출되는 단백질을 지칭하는 것으로 의도된다. 시토카인의 예는 림포카인, 모노카인, 및 전통적인 폴리펩티드 호르몬이다. 시토카인에는 성장 호르몬 예컨대 인간 성장 호르몬, N-메티오닐 인간 성장 호르몬, 및 소 성장 호르몬; 부갑상선 호르몬; 티록신; 인슐린; 프로인슐린; 렐락신; 프로렐락신; 당단백질 호르몬 예컨대 여포 자극 호르몬 (FSH), 갑상선 자극 호르몬 (TSH), 및 황체형성 호르몬 (LH); 간 성장 인자 (HGF); 섬유모세포 성장 인자 (FGF); 프로락틴; 태반 락토겐; 뮬러-억제 물질; 마우스 고나도트로핀-연관 펩티드; 인히빈; 액티빈; 혈관 내피 성장 인자; 인테그린; 트롬보포이에틴 (TPO); 신경 성장 인자 (NGF) 예컨대 NGF-베타; 혈소판-성장 인자; 형질전환 성장 인자 (TGF) 예컨대 TGF-알파 및 TGF-베타; 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II; 에리트로포이에틴 (EPO); 골유도 인자; 인터페론 예컨대 인터페론-알파, 베타, 및 -감마; 콜로니 자극 인자 (CSF) 예컨대 대식세포-CSF (M-CSF); 과립구-대식세포-CSF (GM-CSF); 및 과립구-CSF (G-CSF); 인터류킨 (IL) 예컨대 IL-1, IL-1알파, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; IL-15, 종양 괴사 인자 예컨대 TNF-알파 또는 TNF-베타; 및 LIF 및 kit 리간드 (KL)를 포함한 다른 폴리펩티드 인자가 포함된다. 본원에 사용된 용어 시토카인은 천연 공급원으로부터의 또는 재조합 세포 배양으로부터의 단백질, 및 천연 서열 시토카인의 생물학적 활성 등가물을 포함한다.
일부 측면에서, 본 발명은 100 pM보다 작은 Kd로 CLL-1에 결합하는 항원 결합 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 분자는 10 pM보다 작은 Kd로 결합한다. 다른 실시양태에서, 항원 결합 분자는 5 pM보다 작은 Kd로 결합한다.
제조 방법
다양한 공지된 기술이 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 벡터, 항원 결합 분자, 면역 세포, 조성물 등을 제조하는데 사용될 수 있다.
본원에 기재된 면역 세포의 시험관내 조작 또는 유전자 변형 전에, 세포는 대상체로부터 수득될 수 있다. 일부 실시양태에서, 면역 세포는 T 세포를 포함한다. T 세포는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 감염 부위로부터의 조직, 복수, 흉막 삼출, 비장 조직, 및 종양을 포함한 수많은 공급원으로부터 수득될 수 있다. 특정 실시양태에서, T 세포는 통상의 기술자에게 공지된 다수의 기술, 예컨대 피콜(FICOLL)™ 분리를 사용하여 대상체로부터 수집된 단위 혈액으로부터 수득될 수 있다. 세포는 바람직하게는 개체의 순환 혈액으로부터 분리반출술에 의해 수득될 수 있다. 분리반출술 생성물은 전형적으로 T 세포, 단핵구, 과립구를 포함한 림프구, B 세포, 다른 유핵 백혈구, 적혈구 및 혈소판을 함유한다. 특정 실시양태에서, 분리반출술에 의해 수집된 세포를 세척하여 혈장 분획을 제거하고, 후속 프로세싱을 위해 적절한 완충제 또는 배지 중에 둘 수 있다. 세포는 PBS로 세척될 수 있다. 인지될 바와 같이, 예컨대 반자동화된 관통 원심분리 -- 예를 들어, 코브(Cobe)™ 2991 세포 프로세서, 백스터 시토메이트(Baxter CytoMate)™ 등을 사용함으로써 세척 단계가 사용될 수 있다. 세척 후, 세포는 다양한 생체적합성 완충제, 또는 완충제의 존재 또는 부재 하의 다른 염수 용액 중에 재현탁될 수 있다. 특정 실시양태에서, 분리반출술 샘플의 바람직하지 않은 성분은 제거될 수 있다.
특정 실시양태에서, T 세포는 적혈구를 용해시키고 단핵구를 고갈시킴으로써, 예를 들어, 퍼콜(PERCOLL)™ 구배를 통한 원심분리를 사용함으로써 PBMC로부터 단리된다. T 세포의 특정 하위집단, 예컨대 CD28+, CD4+, CD8+, CD45RA+, 및 CD45RO+ T 세포는 관련 기술분야에 공지된 양성 또는 음성 선택 기술에 의해 추가로 단리될 수 있다. 예를 들어, 음성 선택에 의한 T 세포 집단의 풍부화는 음성 선택된 세포에 고유한 표면 마커로 지시된 항체의 조합에 의해 달성될 수 있다. 본원에서 사용하기 위한 하나의 방법은 음성 선택된 세포 상에 존재하는 세포 표면 마커로 지시된 모노클로날 항체의 칵테일을 사용하는 음성 자기 면역부착 또는 유동 세포측정법을 통한 세포 분류 및/또는 선택이다. 예를 들어, 음성 선택에 의해 CD4+ 세포를 풍부화하기 위해, 모노클로날 항체 칵테일은 전형적으로 CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR, 및 CD8에 대한 항체를 포함한다. 또한 유동 세포측정법 및 세포 분류가 본 발명에 사용하기 위한 관심 세포 집단을 단리하는데 사용될 수 있다.
PBMC는 본원에 기재된 바와 같은 방법을 사용한 면역 세포 (예컨대 CAR 또는 TCR)에 의한 유전자 변형을 위해 직접 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, PBMC의 단리 후, T 림프구가 추가로 단리될 수 있고, 둘 다의 세포독성 및 헬퍼 T 림프구가 유전자 변형 및/또는 확장 전 또는 그 후에 나이브, 기억, 및 이펙터 T 세포 하위집단으로 분류될 수 있다.
일부 실시양태에서, CD8+ 세포는 이들 CD8+ 세포 유형 각각과 연관된 세포 표면 항원을 확인함으로써 나이브, 중심 기억, 및 이펙터 세포로 추가로 분류된다. 일부 실시양태에서, 중심 기억 T 세포의 표현형 마커의 발현은 CD45RO, CD62L, CCR7, CD28, CD3, 및 CD127을 포함하고, 이는 그랜자임 B에 대해 음성이다. 일부 실시양태에서, 중심 기억 T 세포는 CD45RO+, CD62L+, CD8+ T 세포이다. 일부 실시양태에서, 이펙터 T 세포는 CD62L, CCR7, CD28, 및 CD127에 대해 음성이고, 그랜자임 B 및 퍼포린에 대해 양성이다. 특정 실시양태에서, CD4+ T 세포는 하위집단으로 추가로 분류된다. 예를 들어, CD4+ T 헬퍼 세포는 세포 표면 항원을 갖는 세포 집단을 확인함으로써 나이브, 중심 기억, 및 이펙터 세포로 분류될 수 있다.
면역 세포, 예컨대 T 세포는 공지된 방법을 사용하여 단리 후 유전자 변형될 수 있거나, 또는 면역 세포는 유전자 변형 전에 시험관내 활성화 및 확장될 수 있다 (또는 전구세포의 경우에 분화됨). 또 다른 실시양태에서, 면역 세포, 예컨대 T 세포는 본원에 기재된 키메라 항원 수용체에 의해 유전자 변형되고 (예를 들어, CAR을 코딩하는 1개 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 바이러스 벡터에 의해 형질도입되고), 시험관내 활성화 및/또는 확장된다. T 세포를 활성화 및 확장하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들어, 미국 특허 번호 6,905,874; 미국 특허 번호 6,867,041; 미국 특허 번호 6,797,514; 및 PCT WO2012/079000에 기재되어 있고, 그의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 일반적으로, 이러한 방법은 적절한 시토카인, 예컨대 IL-2를 함유하는 배양 배지 중에서 PBMC 또는 단리된 T 세포를, 일반적으로 비드 또는 다른 표면에 부착된 자극 분자 및 공동자극 분자, 예컨대 항-CD3 및 항-CD28 항체와 접촉시키는 것을 포함한다. 동일한 비드에 부착된 항-CD3 및 항-CD28 항체는 "대용물" 항원 제시 세포 (APC)로서의 역할을 한다. 하나의 예는 인간 T 세포의 생리학적 활성화를 위한 CD3/CD28 활성화제/자극제 시스템인 더 디나비즈(The Dynabeads)® 시스템이다. 다른 실시양태에서, T 세포는 미국 특허 번호 6,040,177; 미국 특허 번호 5,827,642; 및 WO2012129514에 기재된 것과 같은 방법을 사용하여, 피더 세포 및 적절한 항체 및 시토카인에 의해 활성화되고 증식하도록 자극될 수 있으며, 상기 문헌의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
본 발명의 구축물 및 조작된 면역 세포를 제조하기 위한 특정 방법이 PCT 출원 PCT/US15/14520에 기재되어 있고, 그의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 구축물 및 세포를 제조하는 추가의 방법은 미국 특허 가출원 번호 62/244036에서 찾아볼 수 있고, 그의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
PBMC는 다른 세포독성 림프구 예컨대 NK 세포, 또는 NKT 세포를 추가로 포함할 수 있다는 것이 인지될 것이다. 본원에 개시된 바와 같은 키메라 수용체의 코딩 서열을 운반하는 발현 벡터는 인간 공여자 T 세포, NK 세포, 또는 NKT 세포의 집단 내로 도입될 수 있다. 발현 벡터를 운반하는 성공적으로 형질도입된 T 세포는 CD3 양성 T 세포를 단리하기 위해 유동 세포측정법을 사용하여 분류될 수 있고, 이어서 추가로, 항-CD3 항체 및 IL-2 또는 본원의 다른 부분에 기재된 바와 같은 관련 기술분야에 공지된 다른 방법을 사용한 세포 활성화에 더하여, 이들 CAR 발현 T 세포의 수를 증가시키기 위해 추가로 증식될 수 있다. 인간 대상체에서의 사용을 위한 저장 및/또는 제조를 위한 CAR을 발현하는 T 세포의 동결보존을 위해 표준 절차가 사용된다. 한 실시양태에서, T 세포의 시험관내 형질도입, 배양 및/또는 확장은 비-인간 동물 유래 생성물 예컨대 소 태아 혈청 및 태아 소 혈청의 부재 하에 수행된다.
폴리뉴클레오티드의 클로닝을 위해, 벡터는 벡터 그 자체의 복제를 가능하게 하는 숙주 세포 (단리된 숙주 세포) 내로 도입될 수 있고, 그에 의해 그 안에 함유된 폴리뉴클레오티드의 카피가 증폭될 수 있다. 클로닝 벡터는 일반적으로, 비제한적으로, 복제 기점, 프로모터 서열, 전사 개시 서열, 인핸서 서열, 및 선택 마커를 포함하는 서열 성분을 함유할 수 있다. 이들 요소는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 복제 기점은 숙주 세포에서의 벡터의 자율 복제를 촉진하기 위해 선택될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 본원에 제공된 벡터를 함유하는 단리된 숙주 세포를 제공한다. 벡터를 함유하는 숙주 세포는 벡터에 함유된 폴리뉴클레오티드의 발현 또는 클로닝에 유용할 수 있다. 적합한 숙주 세포는, 비제한적으로, 원핵 세포, 진균 세포, 효모 세포, 또는 보다 고등 진핵 세포 예컨대 포유동물 세포를 포함할 수 있다. 이러한 목적에 적합한 원핵 세포는, 비제한적으로, 유박테리움, 예컨대 그람-음성 또는 그람-양성 유기체, 예를 들어, 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae) 예컨대 에스케리키아(Escherichia), 예를 들어, 이. 콜라이(E. coli); 엔테로박터(Enterobacter); 에르위니아(Erwinia); 클레브시엘라(Klebsiella); 프로테우스(Proteus); 살모넬라(Salmonella), 예를 들어, 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium); 세라티아(Serratia), 예를 들어, 세라티아 마르세스칸스(Serratia marcescans) 및 시겔라(Shigella); 뿐만 아니라 바실루스(Bacilli) 예컨대 비. 서브틸리스(B. subtilis) 및 비. 리케니포르미스(B. licheniformis); 슈도모나스(Pseudomonas) 예컨대 피. 아에루기노사(P. aeruginosa); 및 스트렙토미세스(Streptomyces)를 포함한다.
벡터는, 비제한적으로, DEAE-덱스트란 매개 전달, 인산칼슘 침전 방법, 양이온성 지질 매개 전달, 리포솜 매개 형질감염, 전기천공, 미세발사체 충격, 수용체-매개 유전자 전달, 폴리리신, 히스톤, 키토산, 및 펩티드에 의해 매개되는 전달을 포함한 관련 기술분야에 공지된 임의의 적합한 방법을 사용하여 숙주 세포에 도입될 수 있다. 관심 벡터의 발현을 위한 세포의 형질감염 및 형질전환을 위한 표준 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 추가 실시양태에서, 상이한 발현 벡터의 혼합물이 면역 이펙터 세포의 공여자 집단을 유전자 변형시키는데 사용될 수 있고, 여기서 각각의 벡터는 본원에 개시된 바와 같은 상이한 CAR을 코딩한다. 생성된 형질도입된 면역 이펙터 세포는 1종 초과의 상이한 CAR을 발현하는 조작된 세포의 비율이 존재하는, 조작된 세포의 혼합된 집단을 형성한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 CLL-1 단백질을 표적화하는 CAR 또는 TCR을 발현하는 유전자 조작된 세포를 분류하는 방법을 제공한다. 이는 세포가 해동 시 생존상태로 유지되도록 면역 세포를 동결보존하는 것을 수반한다. CAR을 발현하는 면역 세포의 한 분획은 악성종양을 앓고 있는 환자의 향후 치료를 위해 이러한 세포의 영구적 공급원을 제공하기 위해 관련 기술분야에 공지된 방법에 의해 동결보존될 수 있다. 필요한 경우에, 동결보존된 형질전환된 면역 세포는 해동되고, 성장되고, 보다 많은 이러한 세포를 위해 확장될 수 있다.
본원에 사용된 "동결보존"은 세포를 영하의 온도, 예컨대 (전형적으로) 77 켈빈 또는 -196℃ (액체 질소의 비점)로 냉각시킴으로써 보존하는 것을 지칭한다. 낮은 온도에서의 동결 또는 실온으로의 가온으로 인해 보존된 세포가 손상되는 것을 방지하기 위해, 종종 영하의 온도에서 동결보호제가 사용된다. 동결보존제 및 최적 냉각 속도는 세포를 손상으로부터 보호할 수 있다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 동결보호제는 디메틸 술폭시드 (DMSO) (Lovelock & Bishop, Nature (1959); 183: 1394-1395; Ashwood-Smith, Nature (1961); 190: 1204-1205), 글리세롤, 폴리비닐피롤리딘 (Rinfret, Ann. N.Y. Acad. Sci. (1960); 85: 576), 및 폴리에틸렌 글리콜 (Sloviter & Ravdin, Nature (1962); 196: 48)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 바람직한 냉각 속도는 1℃ - 3℃/분이다.
용어, "실질적으로 순수한"은 주어진 성분이 높은 수준으로 존재하는 것을 나타내는데 사용된다. 성분은 바람직하게는 조성물 중에 존재하는 우세한 성분이다. 바람직하게는 이는 30% 초과, 50% 초과, 75% 초과, 90% 초과, 또는 심지어 95% 초과의 수준으로 존재하고, 상기 수준은 고려 하의 총 조성물과 관련하여 건조 중량/건조 중량 기준으로 결정된다. 매우 높은 수준에서 (예를 들어 90% 초과, 95% 초과 또는 99% 초과의 수준에서) 성분은 "순수 형태"인 것으로 간주될 수 있다. 본 발명의 생물학적 활성 물질 (CAR, TCR, 단리된 폴리펩티드, 단리된 핵산 분자, 항원 결합 분자, 모이어티)은 물질이 달리 회합될 수 있는 1개 이상의 오염물이 실질적으로 부재하는 형태로 제공될 수 있다. 조성물에 주어진 오염물이 실질적으로 부재하는 경우, 오염물은 낮은 수준으로 (예를 들어, 상기 설정된 건조 중량/건조 중량 기준으로 10% 미만, 5% 미만, 또는 1% 미만의 수준으로) 존재할 것이다.
일부 실시양태에서, 세포는 먼저 그의 배양 배지로부터 세포를 수거한 다음, 세척하고, 투여에 적합한 매질 및 용기 시스템 ("제약상 허용되는" 담체) 중에 세포를 치료-유효량으로 농축시킴으로써 제제화된다. 적합한 주입 매질은 임의의 등장성 매질 제제, 전형적으로 생리 염수, 노르모졸(Normosol)™ R (애보트(Abbott)) 또는 플라즈마-라이트(Plasma-Lyte)™ A (백스터(Baxter))일 수 있지만, 또한 물 중 5% 덱스트로스 또는 링거 락테이트가 사용될 수 있다. 주입 매질에 인간 혈청 알부민이 보충될 수 있다.
조성물 중 세포의 목적하는 치료량은 일반적으로 적어도 2종의 세포 (예를 들어, 적어도 1종의 CD8+ 중심 기억 T 세포 및 적어도 1종의 CD4+ 헬퍼 T 세포 하위세트)이거나, 보다 전형적으로 102개 세포 초과, 및 최대 106개, 최대 108 또는 109개 세포 이하이고, 1010개 세포 초과일 수 있다. 세포의 수는 조성물이 의도하는 목적하는 용도, 및 그 안에 포함되는 세포의 유형에 좌우될 것이다. 목적하는 세포의 밀도는 전형적으로 106개 세포/ml 초과이고, 일반적으로 107개 세포/ml 초과, 일반적으로 108개 세포/ml 또는 그 초과이다. 누적해서 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 또는 1012개 세포와 동등하거나 또는 이를 초과하는 임상적으로 적절한 수의 면역 세포는 다중 주입으로 배분될 수 있다. 본 발명의 일부 측면에서, 특히 모든 주입된 세포는 특정한 표적 항원 (CLL-1)으로 재지시될 것이기 때문에, 106개/킬로그램 (환자당 106 - 1011개) 범위의 보다 낮은 수의 세포가 투여될 수 있다. CAR 치료는 다중 시점에 이들 범위 내의 투여량으로 투여될 수 있다. 세포는 요법을 받는 환자에 대해 자가, 동종, 또는 이종일 수 있다.
본 발명의 CAR 발현 세포 집단은 단독으로, 또는 제약 조성물로서 희석제 및/또는 다른 성분, 예컨대 IL-2 또는 다른 시토카인 또는 세포 집단과 조합되어 투여될 수 있다. 본 발명의 제약 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 CAR 또는 TCR 발현 세포 집단, 예컨대 T 세포를 1종 이상의 제약상 또는 생리학상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 조합하여 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 완충제 예컨대 중성 완충 염수, 포스페이트 완충 염수 등; 탄수화물 예컨대 글루코스, 만노스, 수크로스 또는 덱스트란, 만니톨; 단백질; 폴리펩티드 또는 아미노산 예컨대 글리신; 항산화제; 킬레이트화제 예컨대 EDTA 또는 글루타티온; 아주반트 (예를 들어, 수산화알루미늄); 및 보존제를 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 바람직하게는 정맥내 투여를 위해 제제화된다.
제약 조성물 (용액, 현탁액 등)은 하기 중 1종 이상을 포함할 수 있다: 용매 또는 현탁 매질로서의 역할을 할 수 있는 멸균 희석제 예컨대 주사용수, 염수 용액, 바람직하게는 생리 염수, 링거액, 등장성 염화나트륨, 고정 오일 예컨대 합성 모노- 또는 디글리세리드, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 용매; 항박테리아제 예컨대 벤질 알콜 또는 메틸 파라벤; 항산화제 예컨대 아스코르브산 또는 중아황산나트륨; 킬레이트화제 예컨대 에틸렌디아민테트라아세트산; 완충제 예컨대 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트 및 장성 조정제 예컨대 염화나트륨 또는 덱스트로스. 비경구 제제는 유리 또는 플라스틱으로 만들어진 앰플, 일회용 시린지 또는 다중 용량 바이알 내에 담길 수 있다. 주사가능한 제약 조성물은 바람직하게는 멸균이다.
면역 세포 (1개 이상의 CAR 또는 TCR을 함유함)를 자살 유전자로 형질도입하는 것에 의해 유해 사건이 최소화될 수 있다는 것이 인지될 것이다. 또한 유도성 "온" 또는 "가속" 스위치를 면역 세포 내로 혼입시키는 것이 바람직할 수 있다. 적합한 기술은 세포에 본 발명의 CAR 구축물을 형질도입하기 전, 후 또는 그와 동시에 유도성 카스파제-9 (미국 출원 2011/0286980) 또는 티미딘 키나제를 사용하는 것을 포함한다. 자살 유전자 및/또는 "온" 스위치를 도입하기 위한 추가의 방법은 TALENS, 아연 핑거, RNAi, siRNA, shRNA, 안티센스 기술, 및 관련 기술분야에 공지된 다른 기술을 포함한다.
본 발명에 따르면, 추가의 온-오프 또는 다른 유형의 제어 스위치 기술이 본원에 포함될 수 있다. 이들 기술은 이량체화 도메인 및 이러한 도메인 이량체화의 임의적 활성화제의 사용을 활용할 수 있다. 이들 기술은, 예를 들어, 특정 세포에서 FKBP/라파로그 이량체화 시스템을 사용하는, 문헌 [Wu et al., Science 2014 350 (6258)]에 기재된 것을 포함하며, 그의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 추가의 이량체화 기술이, 예를 들어, 문헌 [Fegan et al. Chem. Rev. 2010, 110, 3315-3336] 뿐만 아니라 미국 특허 번호 5,830,462; 5,834,266; 5,869,337; 및 6,165,787에 기재되어 있고, 그의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 추가의 이량체화 쌍은 시클로스포린-A/시클로필린, 수용체, 에스트로겐/에스트로겐 수용체 (임의로 타목시펜을 사용함), 글루코코르티코이드/글루코코르티코이드 수용체, 테트라시클린/테트라시클린 수용체, 비타민 D/비타민 D 수용체를 포함할 수 있다. 이량체화 기술의 추가의 예는 예를 들어, WO 2014/127261, WO 2015/090229, US 2014/0286987, US2015/0266973, US2016/0046700, 미국 특허 번호 8,486,693, US 2014/0171649, 및 US 2012/0130076에서 찾아볼 수 있고, 그의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 추가로 포함된다.
본원의 설명은 단지 예시적이고 설명적이며, 청구되는 바와 같은 본 발명을 제한하는 것이 아님을 이해할 것이다. 본 출원에서, 단수형의 사용은 구체적으로 언급되지 않는 한 복수형을 포함한다.
본원에 사용된 섹션 표제는 단지 조직화 목적을 위한 것이며, 기재된 대상을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 특허, 특허 출원, 기사, 책, 및 논문을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 본 출원에 인용된 모든 문헌 또는 문헌의 일부는 임의의 목적상 그 전문이 명백하게 본원에 참조로 포함된다. 본 개시내용에 따라 사용되는 바와 같은 하기 용어는, 달리 나타내지 않는 한, 하기 의미를 갖는 것으로 이해될 것이다:
본 출원에서, "또는"의 사용은 달리 언급되지 않는 한 "및/또는"을 의미한다. 또한, 용어 "포함하는", 뿐만 아니라 다른 형태, 예컨대 "포함하다" 및 "포함되다"의 사용은 제한하는 것이 아니다. 또한, 용어 예컨대 "요소" 또는 "성분"은 달리 구체적으로 언급되지 않는 한 하나의 유닛을 포함하는 요소 및 성분 및 하나 초과의 서브유닛을 포함하는 요소 및 성분 둘 다를 포괄한다.
용어 "CLL-1 활성"은 CLL-1의 임의의 생물학적 효과를 포함한다. 특정 실시양태에서, CLL-1 활성은 CLL-1이 기질 또는 수용체와 상호작용하거나 또는 그에 결합하는 능력을 포함한다.
용어 "폴리뉴클레오티드," "뉴클레오티드," 또는 "핵산"은 단일-가닥 및 이중-가닥 뉴클레오티드 중합체 둘 다를 포함한다. 이는 바람직하게는 본원에 정의된 바와 같은 단리된 폴리뉴클레오티드, 뉴클레오티드 또는 핵산을 포함한다. 폴리뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 각각의 유형의 뉴클레오티드의 변형된 형태일 수 있다. 상기 변형은 염기 변형 예컨대 브로모우리딘 및 이노신 유도체, 리보스 변형 예컨대 2',3'-디데옥시리보스, 및 뉴클레오티드간 연결 변형 예컨대 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로-디셀레노에이트, 포스포로-아닐로티오에이트, 포스포르아닐라데이트 및 포스포로아미데이트를 포함한다.
용어 "올리고뉴클레오티드"는 200개 이하의 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 올리고뉴클레오티드는, 예를 들어 돌연변이체 유전자의 구축에 사용하기 위해, 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 검출 검정을 위해 방사성표지, 형광 표지, 합텐 또는 항원 표지를 포함한 표지를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 예를 들어, PCR 프라이머, 클로닝 프라이머 또는 혼성화 프로브로서 사용될 수 있다.
용어 "제어 서열"은 라이게이션되는 코딩 서열의 발현 및 프로세싱에 영향을 미칠 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 이러한 제어 서열의 속성은 숙주 유기체에 따라 좌우될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 원핵생물에 대한 제어 서열은 프로모터, 리보솜 결합 부위, 및 전사 종결 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 진핵생물에 대한 제어 서열은 전사 인자, 전사 인핸서 서열, 및 전사 종결 서열에 대한 하나 또는 복수의 인식 부위를 포함하는 프로모터를 포함할 수 있다. "제어 서열"은 리더 서열 (신호 펩티드) 및/또는 융합 파트너 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, CAR 또는 TCR을 코딩하는 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 추가로 리더 서열 또는 펩티드 (또한 본원에서 "신호 펩티드"로도 지칭됨)를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 리더 펩티드는 아미노산 서열 MALPVTALLLPLALLLHAARP (서열식별번호: 144)와 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 리더 펩티드는 서열식별번호: 144의 아미노산 서열을 포함한다.
본원에 사용된 "작동가능하게 연결된"은 상기 용어가 적용되는 성분들이 적합한 조건 하에 그의 고유 기능을 수행가능하게 하는 관계로 존재하는 것을 의미한다.
용어 "벡터"는 단백질 코딩 정보를 숙주 세포 내로 전달하는데 사용되는 임의의 분자 또는 실체 (예를 들어, 핵산, 플라스미드, 박테리오파지 또는 바이러스)를 의미한다. 용어 "발현 벡터" 또는 "발현 구축물"은 숙주 세포의 형질전환에 적합하고, 작동가능하게 연결된 1개 이상의 이종 코딩 영역의 발현을 (숙주 세포와 관련하여) 지시 및/또는 제어하는 핵산 서열을 함유하는 벡터를 지칭한다. 발현 구축물은 작동가능하게 연결된 코딩 영역의 전사, 번역에 영향을 미치거나 또는 이를 제어하고, 인트론이 존재하는 경우에 그의 RNA 스플라이싱에 영향을 미치는 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
용어 "숙주 세포"는 핵산 서열로 형질전환되었거나, 또는 형질전환될 수 있고, 이에 의해 관심 유전자를 발현하는 세포를 지칭한다. 상기 용어는 관심 유전자가 존재하는 한, 자손이 원래의 모 세포와 형태학상 또는 유전자 구성에서 동일한지 여부와 관계 없이, 모 세포의 자손을 포함한다.
용어 "형질전환"은 세포의 유전자 특징에서의 변화를 지칭하고, 세포는 새로운 DNA 또는 RNA를 함유하도록 변형된 경우에 형질전환되었다. 예를 들어, 세포는 형질감염, 형질도입, 또는 다른 기술을 통해 새로운 유전 물질을 도입함으로써 그의 천연 상태로부터 유전자 변형된 경우에 형질전환되었다. 형질감염 또는 형질도입 후에, 형질전환하는 DNA는 세포의 염색체 내로 물리적으로 통합됨으로써 세포의 DNA와 재조합될 수 있거나, 또는 복제되지 않으면서 에피솜 요소로서 일시적으로 유지될 수 있거나, 또는 플라스미드로서 독립적으로 복제될 수 있다. 세포는 형질전환 DNA가 세포 분열과 함께 복제될 때, "안정적으로 형질전환된" 것으로 간주된다.
용어 "형질감염"은 세포에 의한 외래 또는 외인성 DNA의 흡수를 지칭한다. 수많은 형질감염 기술이 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 본원에 개시되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Graham et al., 1973, Virology 52:456; Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 상기 문헌; Davis et al., 1986, Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier; Chu et al., 1981, Gene 13:197]을 참조한다.
용어 "형질도입"은 외래 DNA가 바이러스 벡터를 통해 세포 내로 도입되는 과정을 지칭한다. 문헌 [Jones et al., (1998).　Genetics: principles and analysis. Boston: Jones & Bartlett Publ]을 참조한다.
용어 "폴리펩티드" 또는 "단백질"은 천연 서열의 1개 이상의 아미노산의 결실, 부가, 및/또는 치환, 및 바람직하게는 그 안에 8개 이하의 아미노산 치환을 포함하는, 단백질의 아미노산 서열을 갖는 거대분자를 지칭한다. 바람직하게는, 폴리펩티드 또는 단백질은 본원에 정의된 바와 같이 단리된다. 용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 구체적으로 항원-결합 단백질의 1개 이상의 아미노산의 결실, 부가, 및/또는 치환, 및 바람직하게는 그 안에 8개 이하의 아미노산 치환을 갖는, CLL-1 항원 결합 분자, 항체 또는 서열을 포괄한다. 용어 "폴리펩티드 단편"은 전장 천연 단백질과 비교하여 아미노-말단 결실, 카르복실-말단 결실, 및/또는 내부 결실을 갖는 단리된 폴리펩티드를 지칭한다. 이러한 단편은 또한 천연 단백질과 비교하여 변형된 아미노산을 함유할 수 있다. 유용한 폴리펩티드 단편은 항원 결합 분자의 면역학적으로 기능성인 단편을 포함한다. 유용한 단편은 1개 이상의 CDR 영역, 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 도메인, 항체 쇄의 다른 부분의 부분 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
용어 "단리된"은 (i) 정상적으로 발견될 적어도 일부의 다른 단백질이 부재하는 것, (ii) 동일한 공급원, 예를 들어, 동일한 종으로부터 다른 단백질이 본질적으로 부재하는 것, (iii) 자연에서 회합되어 있는 폴리뉴클레오티드, 지질, 탄수화물 또는 다른 물질과 적어도 약 50 퍼센트 분리된 것, (iv) 자연에서 회합되지 않는 폴리펩티드와 (공유 또는 비공유 상호작용에 의해) 작동가능하게 회합된 것, 또는 (v) 자연 발생하지 않는 것을 의미한다.
폴리펩티드 (예를 들어, 항원 결합 분자 또는 항체)의 "변이체"는 또 다른 폴리펩티드 서열에 비해 1개 이상의 아미노산 잔기가 아미노산 서열 내로 삽입, 그로부터 결실 및/또는 그와 치환된 아미노산 서열을 포함한다. 변이체는 융합 단백질을 포함한다.
용어 "동일성"은 서열을 정렬하고 비교함으로써 결정되는, 2개 이상의 폴리펩티드 분자 또는 2개 이상의 핵산 분자의 서열 사이의 관계를 지칭한다. "퍼센트 동일성"은 비교되는 분자에서 아미노산 또는 뉴클레오티드 사이에 동일한 잔기의 퍼센트를 의미하고, 비교되는 분자 중 최소 크기에 기초하여 계산된다. 이들 계산을 위해, 정렬 내의 갭 (존재할 경우)이 바람직하게는 특정한 수학적 모델 또는 컴퓨터 프로그램 (즉, "알고리즘")에 의해 다루어진다.
퍼센트 동일성을 계산하기 위해, 비교되는 서열은 전형적으로 서열 사이의 최대 매치를 제공하는 방식으로 정렬된다. 퍼센트 동일성을 결정하기 위해 사용될 수 있는 컴퓨터 프로그램의 한 예는 GCG 프로그램 패키지이고, 이는 GAP (Devereux et al., 1984, Nucl. Acid Res. 12:387; 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group), 위스콘신주 매디슨 소재의 위스콘신 대학교)를 포함한다. 컴퓨터 알고리즘 GAP는 퍼센트 서열 동일성을 결정할 2개의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 정렬시키는데 사용된다. 서열은 그의 각각의 아미노산 또는 뉴클레오티드의 최적 매칭 (알고리즘에 의한 결정 시 "매칭된 폭")을 위해 정렬된다. 특정 실시양태에서, 표준 비교 행렬 (PAM 250 비교 행렬에 대해 문헌 [Dayhoff et al., 1978, Atlas of Protein Sequence and Structure 5:345-352]; BLOSUM 62 비교 행렬에 대해 문헌 [Henikoff et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:10915-10919] 참조)이 또한 알고리즘에 의해 사용한다.
본원에 사용된, 20개의 통상적인 (예를 들어, 자연 발생) 아미노산 및 그의 약어는 통상적인 용법을 따른다. 문헌 [Immunology - A Synthesis (2nd Edition, Golub and Gren, Eds., Sinauer Assoc., Sunderland, Mass. (1991))]을 참조하고, 이는 임의의 목적상 본원에 참조로 포함된다. 20개의 통상적인 아미노산의 입체이성질체 (예를 들어, D-아미노산), 비천연 아미노산 예컨대 알파-, 알파-이치환된 아미노산, N-알킬 아미노산, 락트산, 및 다른 비통상적인 아미노산이 또한 본 발명의 폴리펩티드를 위한 적합한 성분일 수 있다. 비통상적인 아미노산의 예는 4-히드록시프롤린, .감마.-카르복시글루타메이트, 엡실론-N,N,N-트리메틸리신, e-N-아세틸리신, O-포스포세린, N-아세틸세린, N-포르밀메티오닌, 3-메틸히스티딘, 5-히드록시리신, .시그마.-N-메틸아르기닌, 및 다른 유사한 아미노산 및 이미노산 (예를 들어, 4-히드록시프롤린)을 포함한다. 본원에 사용된 폴리펩티드 표기법에서, 표준 용법 및 규정에 따라 왼쪽 방향은 아미노 말단 방향이고, 오른쪽 방향은 카르복시-말단 방향이다.
보존적 아미노산 치환은 비-자연 발생 아미노산 잔기를 포괄할 수 있고, 이는 전형적으로 생물계 내에서의 합성보다는 화학적 펩티드 합성에 의해 혼입된다. 이들은 펩티드모방체 및 다른 역전 또는 역위 형태의 아미노산 모이어티를 포함한다. 자연 발생 잔기는 공통 측쇄 특성을 기초로 하여 하기 부류로 나뉠 수 있다:
a) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
b) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
c) 산성: Asp, Glu;
d) 염기성: His, Lys, Arg;
e) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro; 및
f) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
예를 들어, 비-보존적 치환은 이들 부류 중 하나의 구성원의 또 다른 부류의 구성원으로의 교환을 수반할 수 있다. 이러한 치환된 잔기는 예를 들어, 비-인간 항체와 상동성인 인간 항체의 영역 내로, 또는 분자의 비-상동성 영역 내로 도입될 수 있다. 예시적인 아미노산 치환이 표 3에 제시된.
표 3
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용어 "유도체"는 아미노산 (또는 핵산)의 삽입, 결실, 또는 치환 이외의 화학적 변형을 포함하는 분자를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 유도체는 중합체, 지질, 또는 다른 유기 또는 무기 모이어티와의 화학 결합을 포함하나 이에 제한되지는 않는 공유 변형을 포함한다. 특정 실시양태에서, 화학적으로 변형된 항원 결합 분자는 화학적으로 변형되지 않은 항원 결합 분자보다 더 큰 순환 반감기를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 유도체 항원 결합 분자는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌 글리콜, 또는 폴리프로필렌 글리콜을 포함하나 이에 제한되지는 않는 1개 이상의 수용성 중합체 부착을 포함하도록 공유 변형된다.
펩티드 유사체는 주형 펩티드의 특성과 유사한 특성을 갖는 비-펩티드 약물로서 제약 산업에서 통상적으로 사용된다. 이들 유형의 비-펩티드 화합물은 "펩티드 모방체" 또는 "펩티드모방체"로 불린다. 문헌 [Fauchere, J., Adv. Drug Res., 15:29 (1986); Veber & Freidinger, TINS, p.392 (1985); 및 Evans et al., J. Med. Chem., 30:1229 (1987)]은 임의의 목적상 본원에 참조로 포함된다.
치료제, 예를 들어, 조작된 CAR T 세포의 "치료 유효량", "유효 용량", "유효량", 또는 "치료 유효 투여량"은 단독으로 또는 또 다른 치료제와 조합되어 사용될 때 대상체를 질환 발병으로부터 보호하거나, 또는 질환 증상의 중증도에서의 감소, 질환 무증상 기간의 빈도 또는 지속기간의 증가, 또는 질환 고통으로 인한 손상 또는 장애의 방지에 의해 입증되는 질환 퇴행을 촉진하는 임의의 양이다. 질환 퇴행을 촉진하는 치료제의 능력은 숙련된 진료의에게 공지되어 있는 다양한 방법을 사용하여, 예컨대 임상 시험 동안 인간 대상체에서, 인간에서의 효능을 예측하는 동물 모델 시스템에서, 또는 시험관내 검정에서 작용제의 활성을 검정함으로써 평가될 수 있다.
용어 "환자" 및 "대상체"는 상호교환가능하게 사용되고, 인간 및 비-인간 동물 대상체 뿐만 아니라 이전에 장애가 진단된 것, 이전에 장애가 인식되지 않은 것, 의학적 진찰을 받은 것, 징애가 발생할 위험이 있는 것 등을 포함한다.
용어 "치료하다" 및 "치료"는 대상체에서 장애가 발생할 위험 또는 다른 위험 인자를 감소시키는 치유적 치료, 예방적 치료, 및 적용을 포함한다. 치료는 장애의 완전한 치유를 필요로 하지 않고, 증상 또는 근원적인 위험 인자를 감소시키는 실시양태를 포괄한다. 용어 "예방하다"는 사건의 가능성의 100% 제거를 필요로 하지 않는다. 오히려, 이는 사건의 발생 가능성이 화합물 또는 방법의 존재 하에 감소되는 것을 나타낸다.
재조합 DNA, 올리고뉴클레오티드 합성, 및 조직 배양 및 형질전환 (예를 들어, 전기천공, 리포펙션)을 위해 표준 기술이 사용될 수 있다. 효소적 반응 및 정제 기술은 제조업체의 명세사항에 따라, 또는 관련 기술분야에서 통상적으로 달성되는 바와 같이, 또는 본원에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다. 상기 기술 및 절차는 일반적으로 관련 기술분야에 널리 공지된 통상적인 방법에 따라, 또한 본 명세서 전반에서 인용되고 논의되는 다양한 일반적이고 보다 구체적인 참고문헌에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989))]을 참조하고, 이는 임의의 목적상 본원에 참조로 포함된다.
참조로 포함
본 명세서에 언급된 모든 공개, 특허 및 특허 출원은, 각각의 개별 공개, 특허 또는 특허 출원이 참조로 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 명시된 바와 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다. 그러나, 본원의 참고문헌의 인용은 이러한 참고문헌이 본 발명에 대한 선행 기술이라는 것을 인정하는 것으로서 해석되어서는 안된다. 참조로 포함된 참고문헌에 제공된 임의의 정의 또는 용어가 본원에서 제공되는 용어 및 논의와 상이한 경우에는, 본원의 용어 및 정의가 적용된다.
상기 기재된 명세서는 관련 기술분야의 통상의 기술자가 본 발명을 실시할 수 있기에 충분한 것으로 간주된다. 상기 설명 및 예는 본 발명의 특정 바람직한 실시양태를 상술하며, 본 발명자들에 의해 고려되는 최적 방식을 기재한다. 그러나, 상기의 것이 문서에서 상세하게 나타내어질 수 있더라도, 본 발명이 많은 방식으로 실시될 수 있고 본 발명이 첨부된 청구범위 및 그의 임의의 등가물에 따라 해석되어야 하는 것으로 인지될 것이다.
수행된 실험 및 달성된 결과를 포함한 하기 실시예는 단지 예시적인 목적으로 제공되고, 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시예 1
인간 PBMC에서의 mRNA 전기천공에 의한 CLL-1 CAR 활성의 결정. T7 프로모터, CAR 구축물 및 베타 글로빈 안정화 서열을 코딩하는 플라스미드를, 10ug DNA를 EcoRI 및 BamHI (NEB)로 밤새 소화시켜 선형화하였다. 이어서 DNA를 프로테이나제 K (써모 피셔(Thermo Fisher)™, 600U/ml)로 50℃에서 2시간 동안 소화시키고, 페놀/클로로포름으로 정제하고, 아세트산나트륨 및 2 부피의 에탄올을 첨가하여 침전시켰다. 이어서 펠릿을 건조시키고, RNAse/DNAse 무함유 물 중에 재현탁시키고, 정량화하였다. 이어서 선형 DNA 1ug을 사용하여 제조업체의 지침에 따라 m메세지 m머신 T7 울트라(mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra) (써모 피셔™)를 사용하여 시험관내 전사를 생성하였다. RNA를 제조업체의 지침에 따라 메가클리어(MEGAClear) 키트 (써모 피셔™)를 사용하여 추가로 정제하고, 나노드롭(NanoDrop)™을 사용하여 정량화하였다. 아가로스 겔에 전개시켜 mRNA 완전성을 평가하였다.
상이한 암 세포주를 CLL-1 발현에 대해 평가하였다. 나말바 (ATCC), U937 (ATCC), HL-60 (ATCC), EoL-1 (시그마(Sigma)), KG1a (ATCC) 및 MV4;11 (ATCC) 세포를 염색 완충제 (비디 파밍겐(BD Pharmingen)™) 중 PE (비디 파밍겐™)에 접합된 항-CLL-1 항체로 4℃에서 30분 동안 염색하였다. 이어서 세포를 세척하고, 데이터 획득 전 아이오딘화프로피듐 (비디 파밍겐™)을 함유하는 염색 완충제 중에 재현탁시켰다. 이어서 유동 세포측정법에 의해 샘플을 획득하고, 플로우조(FlowJo)™를 사용하여 데이터를 분석하고, 히스토그램에 플롯팅하였다. CLL-1 발현에 대한 결과는 도 1에서 확인할 수 있다.
건강한 공여자 류코팩 (헤마케어(Hemacare)™)으로부터 피콜-파크 밀도 원심분리를 제조업체의 지침에 따라 사용하여 PBMC를 단리하였다. R10 배지 + IL-2 (300IU/ml, 프로류킨(Proleukin)®, 프로메테우스(Prometheus)® 테라퓨틱스 앤드 다이아그노스틱스(Therapeutics and Diagnostics)) 중의 OKT3 (50ng/ml, 밀테니 바이오텍(Miltenyi Biotec)™)을 사용하여 PBMC를 자극하였다. 자극 7일 후, T 세포를 Opti-MEM™ (써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific)™) 중에서 2회 세척하고, Opti-MEM 중 2.5x107개 세포/ml의 최종 농도로 재현탁시켰다. 전기천공당 mRNA 10μg을 사용하였다. 세포의 전기천공을 제미니(Gemini) X2 시스템 (하버드 어패러투스 비티엑스(Harvard Apparatus BTX)™) 세트를 사용하여 수행하여 2mm 큐벳 (하버드 어패러투스 비티엑스™)에 0.5ms 동안 단일 400V 펄스를 전달하였다. 세포를 즉시 R10 + IL-2 배지로 옮기고, 회복되게 하였다. 활성 검정에 사용하기 전, 세포를 0.5-2.0 x 106개 세포/ml로 유지시켰다.
mRNA 전기천공 6시간 후, T 세포를 염색 완충제 (비디 파밍겐™) 중 비오티닐화된 단백질 L (써모 사이언티픽™)로 4℃에서 30분 동안 염색하였다. 이어서 세포를 세척하고, 염색 완충제 중 PE 스트렙타비딘 (비디 파밍겐™)으로 4℃에서 30분 동안 염색하였다. 이어서 세포를 세척하고, 데이터 획득 전 아이오딘화프로피듐 (비디 파밍겐™)을 함유하는 염색 완충제 중에 재현탁시켰다. CAR 검출에 대한 결과를 도 2에 제시한다.
mRNA 전기천공 6시간 후 이펙터 세포를 R10 배지에서 표적 세포와 1:1 E:T 비로 배양하였다. 시험된 세포주는 나말바, U937, HL-60, EoL-1, KG1a 및 MV4;11을 포함하였다. 공동배양 16시간 후, 상청액을 루미넥스 (이엠디 밀리포어(EMD Millipore))에 의해 제조업체의 지침에 따라 분석하고, 표적 세포 생존율을 아이오딘화프로피듐 (PI) 흡수의 유동 세포측정 분석에 의해 평가하였다. 시토카인 방출 검정에 상응하는 결과는 도 3에서 확인할 수 있다. 세포용해 활성 검정의 결과는 도 4 및 도 5에서 확인할 수 있다.
실시예 2
인간 PBMC의 렌티바이러스 형질도입에 의한 CLL-1 CAR 활성의 결정. 상이한 CLL-1 CAR 구축물을 함유하는 제3 세대 렌티바이러스 전달 벡터를 비라파워(ViraPower)™ 렌티바이러스 패키징 믹스 (라이프 테크놀로지스(Life Technologies)™)와 함께 사용하여 렌티바이러스 상청액을 생성하였다. 간략하게, DNA 15ug 및 폴리에틸렌이민 (폴리사이언시스(Polysciences)™, 1mg/ml) 22.5ul를 OptiMEM™ 배지 600ul 중에서 혼합하여 형질감염 믹스를 생성하였다. 믹스를 실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 동시에, 293T 세포 (ATCC)를 트립신처리하고, 카운팅하고, 총 10x106개의 총 세포를 형질감염 믹스와 함께 T75 플라스크에 플레이팅하였다. 형질감염 3일 후, 상청액을 수집하고, 0.45um 필터를 통해 여과하고, 사용시까지 -80℃에서 저장하였다.
건강한 공여자 류코팩 (헤마케어™)으로부터 피콜-파크 밀도 원심분리를 제조업체의 지침에 따라 사용하여 PBMC를 단리하였다. R10 배지 + IL-2 (300IU/ml, 프로류킨®, 프로메테우스® 테라퓨틱스 앤드 다이아그노스틱스) 중의 OKT3 (50ng/ml, 밀테니 바이오텍™)을 사용하여 PBMC를 자극하였다. 자극 48시간 후, 렌티바이러스를 MOI=10으로 사용하여 세포를 형질도입시켰다. 세포를 활성 검정에서 사용하기 전에 0.5-2.0 x 106개 세포/ml로 유지시켰다.
자극 후 제12일에, T 세포를 염색 완충제 (비디 파밍겐™) 중 비오티닐화된 단백질 L (써모 사이언티픽™)로 4℃에서 30분 동안 염색하였다. 이어서 세포를 세척하고, 염색 완충제 중 PE 스트렙타비딘 (비디 파밍겐™)으로 4℃에서 30분 동안 염색하였다. 이어서 세포를 세척하고, 데이터 획득 전 아이오딘화프로피듐 (비디 파밍겐™)을 함유하는 염색 완충제 중에 재현탁시켰다. CAR 검출에 대한 결과를 도 6에 제시한다.
T 세포 자극 12일 후 이펙터 세포를 R10 배지에서 표적 세포와 1:1 E:T 비로 배양하였다. 시험된 세포주는 나말바, U937, HL-60, EoL-1, KG1a 및 MV4;11을 포함하였다. 공동배양 16시간 후, 상청액을 루미넥스 (이엠디 밀리포어™)에 의해 제조업체의 지침에 따라 분석하고, 표적 세포 생존율을 아이오딘화프로피듐 (PI) 흡수의 유동 세포측정 분석에 의해 평가하였다. 시토카인 방출 검정에 상응하는 결과는 도 7에서 확인할 수 있다. 세포용해 활성 검정의 결과는 도 8에서 확인할 수 있다.
실시예 3
5-6 주령의 암컷 잭슨 NSG 마우스 (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ)를 본 연구에 사용하였다. 마우스에게 방사선조사된 하를란 2918.15 설치류 식이 및 물을 자유롭게 제공하였다. 마우스는 버블 환경 내에 시간당 100의 완전 환기로 H.E.P.A 여과된 공기를 제공하는 바이오버블(Biobubble)® 클린 룸 내부에 옥수수 속대가 깔린 이노비브(Innovive)™ 일회용 환기 케이징에 수용하였다. 모든 처리, 체중 결정, 및 종양 측정은 버블 환경에서 수행하였다. 상기 환경을 70℉±2℉의 온도 범위 및 30-70%의 습도 범위로 제어하였다. 모든 절차는 미국 국립 보건원 (NIH)의 모든 법규, 규정 및 가이드라인을 준수하여 몰레큘라 이미징, 인크.(Molecular Imaging, Inc.)의 동물 실험 윤리 위원회의 승인 하에 수행하였다.
종양 세포 제조
U937-luc 세포를 리포르(Lifor)® 보존 용액 중에 수득하였다. 세포를 200rcf에서 4℃에서 8분 동안 원심분리하고, 상청액을 흡인해내고, 펠릿을 차가운 둘베코 포스페이트 완충 염수 (DPBS) 중에 피펫팅에 의해 재현탁시켰다. 균질 세포 현탁액의 분취물을 트리판 블루 용액 중에 희석하고, 루나(Luna)™ 자동화 세포 계수기를 사용하여 카운팅하였다. 세포 현탁액을 200rcf에서 4℃에서 8분 동안 원심분리하였다. 상청액을 흡인해내고, 세포 펠릿을 차가운 혈청-무함유 배지 중에 재현탁시켜 트리팝-배제 세포/ml의 최종 농축물을 생성하였다. 세포 현탁액을 이식 동안 웨트 아이스 상에서 유지시켰다. 시험 동물에게 27-게이지 바늘 및 시린지를 사용하여 제0일에 0.2ml의 1.00E+06개 세포를 외측 꼬리 정맥을 통해 정맥내로 이식하였다.
CAR T-세포 제조
본 발명에 따른 T 세포를 수득하고, 드라이 아이스 상에서 동결시키고, 액체 질소 중에 저장하였다. 처리일에, 제공된 크리오바이알을 크리오스토리지에서 꺼내어 37℃ 수조에서 해동시켰다. 각각의 군의 경우에, 제공된 T 세포를 단일 50ml 원추형 튜브 내에서 10% FBS가 보충된 가온된 RPMI 1640과 합하였다. 크리오바이알 튜브를 10% FBS를 함유하는 가온된 RPMI 1640으로 세정하여 세포 손실을 최소화하고 각각의 원추형 튜브에서 총 부피 50ml에 도달하게 하였다. 각각 50ml 원추형 튜브를 200rcf에서 4℃에서 8분 동안 원심분리하였다. 상청액을 흡인해내고, 세포 펠릿을 실온 DPBS 10ml 중에 재현탁시켰다. 균질 세포 현탁액의 분취물을 트리판 블루 용액 중에 희석하고, 혈구계수기를 사용하여 수동으로 카운팅하였다. 세포 현탁액을 다시 200rcf에서 4℃에서 8분 동안 원심분리하였다. 상청액을 흡인해내고, 세포 펠릿을 실온 DPBS 중에 재현탁시켜 요구되는 최종 농축물을 생성하였다. 세포 현탁액을 처리 투여 동안 웨트 아이스 상에서 유지시켰다.
생물발광 영상화
IVIS 스펙트럼 (퍼킨 엘머(Perkin Elmer), 매사추세츠주 홉킨턴)을 사용하여 생체내 생물발광 영상화 (BLI)를 수행하였다. 동물을 ~1-2% 이소플루란 기체 마취 하에 한 번에 최대 5회 영상화하였다. 각각의 동물에게 150mg/kg (15mg/ml) D-루시페린을 IP로 주사하고, 주사 10분 후에 복와위에 이어 양와위 자세로 영상화하였다. 영상당 적어도 수백개의 카운트를 수득하고 추가로 CCD 칩의 포화를 피하기 위해, 큰 비닝 내지 작은 비닝의 CCD 칩을 사용하고 노출 시간을 조정하였다 (2초 내지 2분). BLI 영상을 제3일, 제11일, 제18일, 및 제25일에 수집하였다. 영상을 리빙 이미지(Living Image) 버전 4.5 (퍼킨 엘머, 매사추세츠주 홉킨턴) 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 각각의 개별 동물에 대한 복와위 및 양와위 영상 위에 전신 고정-부피 ROI를 놓고, 동물 확인에 기초하여 라벨링하였다. 광자/초 (p/s)로 표현되는 총 방사휘도를 계산하고, 모든 ROI에 대해 전송하여 군 사이의 분석을 용이하게 하였다. 복와위 및 양와위 ROI를 함께 합하여 전신 종양 부담을 추정하였다.
처리
모든 마우스를 전신 종양 부담의 BLI-유도된 추정치에 기초하여 연구 군으로 분류하였다. 모든 군에 대한 평균 종양 부담이 연구 집단에 대한 전체 평균 종양 부담의 10% 이내이도록 마우스를 분배하였다. CAR T 세포에 의한 처리를 제3일에 시작하였다. 모든 마우스에게 0.2mL의 고정 부피를 투여하였다. 결과를 도 10에 제시한다.
부작용의 평가
모든 동물을 적어도 1일 1회 임상 징후에 대해 관찰하였다. 각각의 처리일에 동물을 칭량하였다. 개개의 체중을 매주 3회 기록하였다.
하기 서열은 본 발명을 추가로 예시할 것이다.
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SEQUENCE LISTING <110> KITE PHARMA, INC. <120> CHIMERIC RECEPTORS AND METHODS OF USE THEREOF <130> K-1029.02US <140> 15/476,699 <141> 2017-03-31 <150> 62/317,068 <151> 2016-04-01 <160> 147 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 294 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 cttgataatg aaaagtcaaa cggaacaatc attcacgtga agggcaagca cctctgtccg 60 tcacccttgt tccctggtcc atccaagcca ttctgggtgt tggtcgtagt gggtggagtc 120 ctcgcttgtt actctctgct cgtcaccgtg gcttttataa tcttctgggt tagatccaaa 180 agaagccgcc tgctccatag cgattacatg aatatgactc cacgccgccc tggccccaca 240 aggaaacact accagcctta cgcaccacct agagatttcg ctgcctatcg gagc 294 <210> 2 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys 1 5 10 15 His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp 20 25 30 Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val 35 40 45 Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu 50 55 60 Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr 65 70 75 80 Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr 85 90 95 Arg Ser <210> 3 <211> 90 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 cttgataatg aaaagtcaaa cggaacaatc attcacgtga agggcaagca cctctgtccg 60 tcacccttgt tccctggtcc atccaagcca 90 <210> 4 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys 1 5 10 15 His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro 20 25 30 <210> 5 <211> 81 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 ttctgggtgt tggtcgtagt gggtggagtc ctcgcttgtt actctctgct cgtcaccgtg 60 gcttttataa tcttctgggt t 81 <210> 6 <211> 27 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu 1 5 10 15 Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val 20 25 <210> 7 <211> 123 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 agatccaaaa gaagccgcct gctccatagc gattacatga atatgactcc acgccgccct 60 ggccccacaa ggaaacacta ccagccttac gcaccaccta gagatttcgc tgcctatcgg 120 agc 123 <210> 8 <211> 41 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr 1 5 10 15 Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro 20 25 30 Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser 35 40 <210> 9 <211> 336 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 agggtgaagt tttccagatc tgcagatgca ccagcgtatc agcagggcca gaaccaactg 60 tataacgagc tcaacctggg acgcagggaa gagtatgacg ttttggacaa gcgcagagga 120 cgggaccctg agatgggtgg caaaccaaga cgaaaaaacc cccaggaggg tctctataat 180 gagctgcaga aggataagat ggctgaagcc tattctgaaa taggcatgaa aggagagcgg 240 agaaggggaa aagggcacga cggtttgtac cagggactca gcactgctac gaaggatact 300 tatgacgctc tccacatgca agccctgcca cctagg 336 <210> 10 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly 1 5 10 15 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 20 25 30 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 35 40 45 Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 50 55 60 Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 65 70 75 80 Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 85 90 95 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 100 105 110 <210> 11 <211> 117 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 attgaggtga tgtatccacc gccttacctg gataacgaaa agagtaacgg taccatcatt 60 cacgtgaaag gtaaacacct gtgtccttct cccctcttcc ccgggccatc aaagccc 117 <210> 12 <211> 39 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn 1 5 10 15 Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu 20 25 30 Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro 35 <210> 13 <211> 288 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 gctgcagcat tgagcaactc aataatgtat tttagtcact ttgtaccagt gttcttgccg 60 gctaagccta ctaccacacc cgctccacgg ccacctaccc cagctcctac catcgcttca 120 cagcctctgt ccctgcgccc agaggcttgc cgaccggccg cagggggcgc tgttcatacc 180 agaggactgg atttcgcctg cgatatctat atctgggcac ccctggccgg aacctgcggc 240 gtactcctgc tgtccctggt catcacgctc tattgtaatc acaggaac 288 <210> 14 <211> 96 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Ala Ala Ala Leu Ser Asn Ser Ile Met Tyr Phe Ser His Phe Val Pro 1 5 10 15 Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro 20 25 30 Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu 35 40 45 Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp 50 55 60 Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly 65 70 75 80 Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn 85 90 95 <210> 15 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 15 caggtgcagc tgcaggaatc cggaccgggg ctggtgaagc ccagcgagac tctgagtctc 60 acgtgtacag tttctggagg tagcattagc tcctactatt ggtcatggat aaggcagccc 120 cccgggaagg gattggaatg gatcggctat atttactaca gtgggagcac caattacaac 180 ccctcactga agtctagagt tacaatcagc gttgacacct caaagaatca 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Gly Ser Ile Ser Ser Tyr 1 5 <210> 18 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 18 Tyr Tyr Ser Gly Ser 1 5 <210> 19 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 19 Leu Val Tyr Cys Gly Gly Asp Cys Tyr Ser Gly Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 20 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 20 gacatccagt tgacacagag cccgagttcc ttgtccgcct ccgtcgggga tagagtgtca 60 tttacctgtc aggcctctca ggatattaat aactttctga attggtatca gcaaaagccc 120 ggaaaggcac ccaagctgtt gatttacgac gccagtaacc tggagacagg cgtgccctcc 180 cggtttagtg gtagcggaag cggtacggat tttaccttta ctatcagctc tctccaaccc 240 gaagacattg caacctacta ttgtcaacaa tatggaaacc tgccttttac atttggcggc 300 ggcaccaagg tggagattaa gcgg 324 <210> 21 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 21 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Phe Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Phe 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Asn Leu Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 22 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 22 Gln Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Phe Leu Asn 1 5 10 <210> 23 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 23 Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr 1 5 <210> 24 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 24 Gln 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gccggaggac 720 atcgccacat attactgtca acagtacgga aacttgccct ttacttttgg aggcggcacc 780 aaagttgaaa tcaaaagggc cgctgccctg gataacgaaa agagcaatgg gactataata 840 catgttaaag gaaaacacct gtgtccatct cccctgttcc ctggaccgtc aaagccattt 900 tgggtgctcg tggttgtcgg tggcgttctc gcctgttata gcttgctggt gacagtagcc 960 ttcattatct tttgggtgag atccaaaaga agccgcctgc tccatagcga ttacatgaat 1020 atgactccac gccgccctgg ccccacaagg aaacactacc agccttacgc accacctaga 1080 gatttcgctg cctatcggag cagggtgaag ttttccagat ctgcagatgc accagcgtat 1140 cagcagggcc agaaccaact gtataacgag ctcaacctgg gacgcaggga agagtatgac 1200 gttttggaca agcgcagagg acgggaccct gagatgggtg gcaaaccaag acgaaaaaac 1260 ccccaggagg gtctctataa tgagctgcag aaggataaga tggctgaagc ctattctgaa 1320 ataggcatga aaggagagcg gagaagggga aaagggcacg acggtttgta ccagggactc 1380 agcactgcta cgaaggatac ttatgacgct ctccacatgc aagccctgcc acctaggtaa 1440 <210> 26 <211> 479 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 26 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu 20 25 30 Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly 35 40 45 Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys 50 55 60 Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr 65 70 75 80 Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys 85 90 95 Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala 100 105 110 Val Tyr Tyr Cys Val Ser Leu Val Tyr Cys Gly Gly Asp Cys Tyr Ser 115 120 125 Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile 145 150 155 160 Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg 165 170 175 Val Ser Phe Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Phe Leu Asn 180 185 190 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp 195 200 205 Ala Ser Asn Leu Glu Thr 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ctctgggggc ggaggctcag gtggtggagg cagcgacatc 480 cagttgacac agagcccgag ttccttgtcc gcctccgtcg gggatagagt gtcatttacc 540 tgtcaggcct ctcaggatat taataacttt ctgaattggt atcagcaaaa gcccggaaag 600 gcacccaagc tgttgattta cgacgccagt aacctggaga caggcgtgcc ctcccggttt 660 agtggtagcg gaagcggtac ggattttacc tttactatca gctctctcca acccgaagac 720 attgcaacct actattgtca acaatatgga aacctgcctt ttacatttgg cggcggcacc 780 aaggtggaga ttaagcgggc ggcagctatt gaggtgatgt atccaccgcc ttacctggat 840 aacgaaaaga gtaacggtac catcattcac gtgaaaggta aacacctgtg tccttctccc 900 ctcttccccg ggccatcaaa gcccttctgg gttcttgtgg tcgtgggagg cgtgcttgct 960 tgttattctc tgctcgttac cgtggcgttt atcatttttt gggttagatc caaaagaagc 1020 cgcctgctcc atagcgatta catgaatatg actccacgcc gccctggccc cacaaggaaa 1080 cactaccagc cttacgcacc acctagagat ttcgctgcct atcggagcag ggtgaagttt 1140 tccagatctg cagatgcacc agcgtatcag cagggccaga accaactgta taacgagctc 1200 aacctgggac gcagggaaga gtatgacgtt ttggacaagc gcagaggacg ggaccctgag 1260 atgggtggca aaccaagacg aaaaaacccc 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aaggaaacac 1020 taccagcctt acgcaccacc tagagatttc gctgcctatc ggagcagggt gaagttttcc 1080 agatctgcag atgcaccagc gtatcagcag ggccagaacc aactgtataa cgagctcaac 1140 ctgggacgca gggaagagta tgacgttttg gacaagcgca gaggacggga ccctgagatg 1200 ggtggcaaac caagacgaaa aaacccccag gagggtctct ataatgagct gcagaaggat 1260 aagatggctg aagcctattc tgaaataggc atgaaaggag agcggagaag gggaaaaggg 1320 cacgacggtt tgtaccaggg actcagcact gctacgaagg atacttatga cgctctccac 1380 atgcaagccc tgccacctag g 1401 <210> 32 <211> 467 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 32 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr 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acctacccca 900 gctcctacca tcgcttcaca gcctctgtcc ctgcgcccag aggcttgccg accggccgca 960 gggggcgctg ttcataccag aggactggat ttcgcctgcg atatctatat ctgggcaccc 1020 ctggccggaa cctgcggcgt actcctgctg tccctggtca tcacgctcta ttgtaatcac 1080 aggaacagat ccaaaagaag ccgcctgctc catagcgatt acatgaatat gactccacgc 1140 cgccctggcc ccacaaggaa acactaccag ccttacgcac cacctagaga tttcgctgcc 1200 tatcggagca gggtgaagtt ttccagatct gcagatgcac cagcgtatca gcagggccag 1260 aaccaactgt ataacgagct caacctggga cgcagggaag agtatgacgt tttggacaag 1320 cgcagaggac gggaccctga gatgggtggc aaaccaagac gaaaaaaccc ccaggagggt 1380 ctctataatg agctgcagaa ggataagatg gctgaagcct attctgaaat aggcatgaaa 1440 ggagagcgga gaaggggaaa agggcacgac ggtttgtacc agggactcag cactgctacg 1500 aaggatactt atgacgctct ccacatgcaa gccctgccac ctaggtaa 1548 <210> 34 <211> 515 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 34 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala 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cactgtcgca 960 ttcatcatct tctgggtcag atccaaaaga agccgcctgc tccatagcga ttacatgaat 1020 atgactccac gccgccctgg ccccacaagg aaacactacc agccttacgc accacctaga 1080 gatttcgctg cctatcggag cagggtgaag ttttccagat ctgcagatgc accagcgtat 1140 cagcagggcc agaaccaact gtataacgag ctcaacctgg gacgcaggga agagtatgac 1200 gttttggaca agcgcagagg acgggaccct gagatgggtg gcaaaccaag acgaaaaaac 1260 ccccaggagg gtctctataa tgagctgcag aaggataaga tggctgaagc ctattctgaa 1320 ataggcatga aaggagagcg gagaagggga aaagggcacg acggtttgta ccagggactc 1380 agcactgcta cgaaggatac ttatgacgct ctccacatgc aagccctgcc acctaggtaa 1440 <210> 38 <211> 458 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 38 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Phe Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Phe 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 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Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 41 atggcactcc ccgtaactgc tctgctgctg ccgttggcat tgctcctgca cgccgcacgc 60 ccggatatcc agctgaccca gtctccatcc tctttgagtg cctccgtggg tgaccgcgtc 120 tctttcactt gccaagccag ccaagacatc aacaactttc tgaattggta ccagcagaaa 180 ccaggcaaag caccaaagct cctcatctac gacgcctcca acctggaaac cggggtgccc 240 agcaggttta gcgggagcgg ttctggcacg gattttacgt tcaccatctc ctctctgcag 300 cccgaggata tagctactta ttactgtcag cagtacggga atctgccatt tacttttggg 360 ggtggaacta aggtggaaat caaaaggggc ggcgggggaa gcgggggcgg gggctcaggt 420 ggcggaggga gccaggtgca actccaggaa agtggcccag gattggtgaa gcccagcgag 480 accctttccc ttacttgtac tgttagcgga ggcagcataa gcagctacta ttggtcctgg 540 atcagacagc caccagggaa agggcttgaa tggattggct acatttacta ttccgggtcc 600 accaactaca acccatccct caagtcccgc gtgacaattt ccgtcgacac aagcaagaac 660 cagttctccc tgaaacttag tagcgtcact gctgcagata cagcagtgta ctattgtgtc 720 agccttgtct actgtggcgg cgactgctac agtggctttg attactgggg 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actcagcact gctacgaagg atacttatga cgctctccac 1380 atgcaagccc tgccacctag g 1401 <210> 44 <211> 467 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 44 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Phe Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Phe 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Asn Leu Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Gly Gly Gly Gly 100 105 110 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln 115 120 125 Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr 130 135 140 Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile 145 150 155 160 Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu 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Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 50 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly 20 25 30 Gly Phe Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly Tyr Ile His His Ser Gly Ser Thr His Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys Asn Leu Phe 65 70 75 80 Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Ser Leu Val Tyr Cys Gly Gly Asp Cys Tyr Ser Gly Phe Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 51 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 51 Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly Gly Phe 1 5 <210> 52 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 52 His His Ser Gly Ser 1 5 <210> 53 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 53 Leu Val Tyr Cys Gly Gly Asp Cys Tyr Ser Gly Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 54 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 54 gatatccagc tcactcaaag cccctctagt ctctctgcct cagtggggga tcgggtcagt 60 tttacttgtc aagcttcaca ggatatcaac aacttcctta attggtatca gcagaagcca 120 ggaaaagcac ccaagctgct catctatgat gcctcaaatt tggagacggg tgttcccagt 180 cgattctctg ggtcagggtc cgggaccgac tttacgttta cgatctcctc tctgcagccc 240 gaagacatcg ccacatacta ttgtcaacag tacggcaact tgcctttcac atttgggggc 300 gggactaagg ttgaaatcaa gagg 324 <210> 55 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 55 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Phe Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Phe 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala 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900 cctttttggg ttcttgttgt ggtcgggggg gtgctggcct gctattctct gctggtcacg 960 gtggccttca taattttctg ggttagatcc aaaagaagcc gcctgctcca tagcgattac 1020 atgaatatga ctccacgccg ccctggcccc acaaggaaac actaccagcc ttacgcacca 1080 cctagagatt tcgctgccta tcggagcagg gtgaagtttt ccagatctgc agatgcacca 1140 gcgtatcagc agggccagaa ccaactgtat aacgagctca acctgggacg cagggaagag 1200 tatgacgttt tggacaagcg cagaggacgg gaccctgaga tgggtggcaa accaagacga 1260 aaaaaccccc aggagggtct ctataatgag ctgcagaagg ataagatggc tgaagcctat 1320 tctgaaatag gcatgaaagg agagcggaga aggggaaaag ggcacgacgg tttgtaccag 1380 ggactcagca ctgctacgaa ggatacttat gacgctctcc acatgcaagc cctgccacct 1440 aggtaa 1446 <210> 60 <211> 481 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 60 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu 20 25 30 Val Lys Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly 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catactattg tcaacagtac ggcaacttgc ctttcacatt tgggggcggg 720 actaaggttg aaatcaagag ggccgctgca ctggacaatg agaagtccaa cggcaccatc 780 atccacgtga agggcaagca cctgtgccct agtcctctgt tcccaggccc atccaaacct 840 ttttgggttc ttgttgtggt cgggggggtg ctggcctgct attctctgct ggtcacggtg 900 gccttcataa ttttctgggt tagatccaaa agaagccgcc tgctccatag cgattacatg 960 aatatgactc cacgccgccc tggccccaca aggaaacact accagcctta cgcaccacct 1020 agagatttcg ctgcctatcg gagcagggtg aagttttcca gatctgcaga tgcaccagcg 1080 tatcagcagg gccagaacca actgtataac gagctcaacc tgggacgcag ggaagagtat 1140 gacgttttgg acaagcgcag aggacgggac cctgagatgg gtggcaaacc aagacgaaaa 1200 aacccccagg agggtctcta taatgagctg cagaaggata agatggctga agcctattct 1260 gaaataggca tgaaaggaga gcggagaagg ggaaaagggc acgacggttt gtaccaggga 1320 ctcagcactg ctacgaagga tacttatgac gctctccaca tgcaagccct gccacctagg 1380 <210> 62 <211> 460 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 62 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser 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gtggcgattg ttatagtggc tttgactact gggggcaggg gacattggtt 360 accgtttcaa gtggaggcgg tgggtctggc gggggcggta gcggaggtgg ggggagcgac 420 atacagctta cgcagagccc ctccagcctt tcagcctccg tgggggatag ggtgtccttt 480 acctgccagg cttcccagga cataaacaac ttcctcaatt ggtatcagca aaagcccggg 540 aaagcaccaa agctgctcat ctacgatgcc agcaacctgg aaaccggagt gccgtctcgc 600 ttctctggaa gtggcagtgg gaccgatttc acttttacaa tctcaagttt gcagccagaa 660 gacattgcaa catactactg tcaacagtac ggcaatctcc cctttacatt tgggggggga 720 actaaagtgg agattaagcg cgctgcagcc attgaagtta tgtatccgcc cccgtatctg 780 gataacgaga aatctaatgg taccataata catgtgaagg ggaagcacct ctgtccatca 840 ccgctgttcc ccggcccttc aaaacctttc tgggtactcg ttgtcgtggg tggagttctg 900 gcctgctata gtctgctggt gaccgtggcg tttatcatct tctgggtaag atccaaaaga 960 agccgcctgc tccatagcga ttacatgaat atgactccac gccgccctgg ccccacaagg 1020 aaacactacc agccttacgc accacctaga gatttcgctg cctatcggag cagggtgaag 1080 ttttccagat ctgcagatgc accagcgtat cagcagggcc agaaccaact gtataacgag 1140 ctcaacctgg gacgcaggga agagtatgac gttttggaca agcgcagagg acgggaccct 1200 gagatgggtg gcaaaccaag acgaaaaaac ccccaggagg gtctctataa tgagctgcag 1260 aaggataaga tggctgaagc ctattctgaa ataggcatga aaggagagcg gagaagggga 1320 aaagggcacg acggtttgta ccagggactc agcactgcta cgaaggatac ttatgacgct 1380 ctccacatgc aagccctgcc acctagg 1407 <210> 66 <211> 469 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 66 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly 20 25 30 Gly Phe Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly Tyr Ile His His Ser Gly Ser Thr His Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys Asn Leu Phe 65 70 75 80 Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Ser Leu Val Tyr Cys Gly Gly Asp Cys Tyr Ser Gly Phe Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly 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gtcctggata 180 cgccagcatc ccgggaaagg acttgaatgg attggatata tccaccattc cggaagcacc 240 cactacaatc caagccttaa atcccgggtg acaatctcca tcgacacctc aaagaatctt 300 ttttccctgc ggttgtcttc agtaactgcc gccgataccg ctgtgtacta ctgtgccagc 360 ctcgtctatt gcggcggaga ttgttattct gggttcgatt attggggtca aggcacactg 420 gtaactgtca gcagcggagg cggcggttcc gggggcgggg gcagtggagg gggcggatct 480 gacattcagc ttacgcagtc cccatcttca cttagcgcca gcgttggcga tcgggtcagc 540 ttcacgtgtc aagcaagtca ggatatcaac aactttctta actggtacca gcagaagcca 600 ggcaaggcac ccaagttgct gatttacgat gcttctaacc tcgagacggg agtgcctagc 660 cgcttctccg ggagcggcag cggcacagac tttaccttta cgatttccag tctgcagcca 720 gaggatatag caacttatta ctgtcagcag tatggcaacc tcccttttac cttcggtggt 780 ggcacaaagg tcgagattaa aagagccgca gcgttgtcca actccataat gtatttttct 840 cattttgtgc ccgtctttct gcctgccaaa cctaccacca cccccgcccc acgaccacct 900 actccagccc ccaccatcgc ctcccagccc ctcagcctga ggccagaggc ttgtcgccct 960 gctgcggggg gcgctgtcca taccagagga ctcgacttcg cctgcgatat ttatatatgg 1020 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Synthetic polypeptide <400> 77 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Ser Gly Ala Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Pro Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Ile 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 78 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 78 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 79 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 79 Gly Ala Ser Ser Leu Lys Ser 1 5 <210> 80 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 80 Gln 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ttatttgaat tggtatcagc agaagcccgg gaaagcacct 540 aagctgttga tcagcggggc ttctagcctg aagagtgggg taccttcacg gttcagcgga 600 agcggaagcg gaaccgattt caccctgact atcagcagcc tgccacctga ggactttgca 660 acttactact gccaacagtc atacagcact ccgatcactt tcggccaggg cacccggctc 720 gaaatcaagc gcgctgctgc tttggacaat gagaagtcaa acggcaccat catacatgtt 780 aaaggtaaac atctgtgtcc ctccccgctg ttccccggcc cttccaaacc gttctgggtt 840 ctggtggtgg tcggaggcgt actcgcttgc tatagtctgc tggtaactgt cgccttcatc 900 atcttttggg tgagatccaa aagaagccgc ctgctccata gcgattacat gaatatgact 960 ccacgccgcc ctggccccac aaggaaacac taccagcctt acgcaccacc tagagatttc 1020 gctgcctatc ggagcagggt gaagttttcc agatctgcag atgcaccagc gtatcagcag 1080 ggccagaacc aactgtataa cgagctcaac ctgggacgca gggaagagta tgacgttttg 1140 gacaagcgca gaggacggga ccctgagatg ggtggcaaac caagacgaaa aaacccccag 1200 gagggtctct ataatgagct gcagaaggat aagatggctg aagcctattc tgaaataggc 1260 atgaaaggag agcggagaag gggaaaaggg cacgacggtt tgtaccaggg actcagcact 1320 gctacgaagg atacttatga cgctctccac 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caccacctag agatttcgct gcctatcgga gcagggtgaa gttttccaga 1080 tctgcagatg caccagcgta tcagcagggc cagaaccaac tgtataacga gctcaacctg 1140 ggacgcaggg aagagtatga cgttttggac aagcgcagag gacgggaccc tgagatgggt 1200 ggcaaaccaa gacgaaaaaa cccccaggag ggtctctata atgagctgca gaaggataag 1260 atggctgaag cctattctga aataggcatg aaaggagagc ggagaagggg aaaagggcac 1320 gacggtttgt accagggact cagcactgct acgaaggata cttatgacgc tctccacatg 1380 caagccctgc cacctagg 1398 <210> 88 <211> 466 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 88 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Glu Leu 20 25 30 Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Val Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr 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gtgggagatc gcgtgactat tacttgccgc 480 gccagccaga gtattagctc ctatctgaat tggtaccagc aaaagcccgg gaaggcccct 540 aagcttctga tttctggcgc ctcctctttg aagtcaggtg tgccaagcag atttagcggg 600 tctggaagtg gcactgactt tacacttact atctccagcc tgcccccaga ggattttgcc 660 acatattact gtcagcaaag ctactctact ccaatcactt tcggccaggg cacaagattg 720 gagattaaga gggctgccgc actttcaaat tccatcatgt atttcagcca ttttgtgcct 780 gtttttcttc cggccaaacc tacaaccact cccgccccac gcccacctac tcccgcccct 840 accattgcct cccagcctct gtctcttaga cctgaggctt gtagacctgc tgccggcgga 900 gccgtgcaca ctcgcggtct ggacttcgcc tgcgacatct atatctgggc ccctctggcc 960 ggcacctgcg gcgttctcct tctctcactc gtaatcacac tctattgcaa tcacaggaac 1020 agatccaaaa gaagccgcct gctccatagc gattacatga atatgactcc acgccgccct 1080 ggccccacaa ggaaacacta ccagccttac gcaccaccta gagatttcgc tgcctatcgg 1140 agcagggtga agttttccag atctgcagat gcaccagcgt atcagcaggg ccagaaccaa 1200 ctgtataacg agctcaacct gggacgcagg gaagagtatg acgttttgga caagcgcaga 1260 ggacgggacc ctgagatggg tggcaaacca agacgaaaaa acccccagga gggtctctat 1320 aatgagctgc agaaggataa gatggctgaa gcctattctg aaataggcat gaaaggagag 1380 cggagaaggg gaaaagggca cgacggtttg taccagggac tcagcactgc tacgaaggat 1440 acttatgacg ctctccacat gcaagccctg ccacctagg 1479 <210> 92 <211> 493 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 92 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Glu Leu 20 25 30 Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Val Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr Glu Ser Arg Gly Ile Gly Trp Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln 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ggtggccgtc atttcttatg acggatcaga taagtactac 180 gtggacagcg tcaagggcag attcaccatc tctagggaca acagtaaaaa tagactctac 240 ctccagatga atagcctcag agctgaagac acggccgtct actattgtgc tcgggagcgg 300 tatagtggca gagactactg ggggcagggc acactcgtta cagtgagtag c 351 <210> 94 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 94 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asp Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Arg Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Arg Tyr Ser Gly Arg Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 95 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 95 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 1 5 <210> 96 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 96 Ser Tyr Asp Gly Ser Asp 1 5 <210> 97 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 97 Glu Arg Tyr Ser Gly Arg Asp Tyr 1 5 <210> 98 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 98 gagattgtta tgacccagag tcctgcgacc ctctcagtca gccccgggga gcgcgcaact 60 ttgtcttgca gagctagtca gtccgtgtcc tctcttctga catggtacca gcaaaagccc 120 gggcaggctc cgcgcctttt gatctttggg gcttcaacaa gagccactgg gattcccgca 180 cgattctctg gctccgggag cggtactggt ttcaccctga cgattagcag tctccagagc 240 gaggacttcg ccgtatacta ctgccagcag tacgatacgt ggccattcac ttttggacca 300 gggactaaag tggattttaa gcgc 324 <210> 99 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 99 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Leu 20 25 30 Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Phe Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gly Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Thr Trp Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Phe Lys Arg 100 105 <210> 100 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 100 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Leu Leu Thr 1 5 10 <210> 101 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 101 Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr 1 5 <210> 102 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 102 Gln Gln Tyr Asp Thr Trp Pro Phe Thr 1 5 <210> 103 <211> 1425 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 103 atggcactcc ccgtaactgc tctgctgctg ccgttggcat tgctcctgca cgccgcacgc 60 ccgcaggtcc agttggtcga aagtggcggt ggtgtagtgc agccgggccg cagtttgagg 120 ctttcctgtg cggcttcagg ctttactttt tccagctatg gaatgcactg ggtgcggcag 180 gcccccggca aaggacttga gtgggtggcc gtcatttctt atgacggatc agataagtac 240 tacgtggaca gcgtcaaggg cagattcacc atctctaggg acaacagtaa aaatagactc 300 tacctccaga tgaatagcct cagagctgaa gacacggccg tctactattg tgctcgggag 360 cggtatagtg gcagagacta ctgggggcag ggcacactcg ttacagtgag tagcggcgga 420 ggagggagtg ggggcggtgg ctccggtgga ggaggttctg agattgttat gacccagagt 480 cctgcgaccc tctcagtcag ccccggggag cgcgcaactt tgtcttgcag agctagtcag 540 tccgtgtcct ctcttctgac atggtaccag caaaagcccg ggcaggctcc gcgccttttg 600 atctttgggg cttcaacaag agccactggg attcccgcac gattctctgg ctccgggagc 660 ggtactggtt 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Synthetic polypeptide <400> 104 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val 20 25 30 Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe 35 40 45 Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys 50 55 60 Gly Leu Glu Trp Val Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asp Lys Tyr 65 70 75 80 Tyr Val Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser 85 90 95 Lys Asn Arg Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 100 105 110 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Arg Tyr Ser Gly Arg Asp Tyr Trp 115 120 125 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Met Thr Gln Ser 145 150 155 160 Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys 165 170 175 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Leu Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys 180 185 190 Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Phe Gly Ala Ser Thr Arg Ala 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gacccagtct 480 ccggctacac tttcagtctc ccctggggag agagctacac tgtcatgcag agcgtcccag 540 tccgtctctt ctctccttac ctggtatcag cagaagcccg gccaggctcc tcgactgctg 600 atcttcggtg cctccacaag ggcgaccggg attccagccc gcttctcagg ttctgggagc 660 ggaactggtt tcactttgac aatcagttca ctgcagtcag aggatttcgc cgtgtactac 720 tgccagcaat acgacacatg gccattcact ttcggacccg gtaccaaagt cgatttcaag 780 agagccgcgg ccatcgaggt tatgtaccca ccaccatatc tggacaatga aaaaagcaat 840 ggaaccatta tccatgtgaa gggtaaacac ctctgcccta gcccactttt ccctggccca 900 tcaaagccct tctgggtctt ggtggtcgtg gggggtgtgc tggcctgtta cagccttctg 960 gtgacggttg ctttcattat cttctgggtt agatccaaaa gaagccgcct gctccatagc 1020 gattacatga atatgactcc acgccgccct ggccccacaa ggaaacacta ccagccttac 1080 gcaccaccta gagatttcgc tgcctatcgg agcagggtga agttttccag atctgcagat 1140 gcaccagcgt atcagcaggg ccagaaccaa ctgtataacg agctcaacct gggacgcagg 1200 gaagagtatg acgttttgga caagcgcaga ggacgggacc ctgagatggg tggcaaacca 1260 agacgaaaaa acccccagga gggtctctat aatgagctgc agaaggataa gatggctgaa 1320 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tacatctggg cccctttggc cggaacctgc 1020 ggtgtgctgc tgctgtcact cgtgattaca ctttactgca accaccgaaa cagatccaaa 1080 agaagccgcc tgctccatag cgattacatg aatatgactc cacgccgccc tggccccaca 1140 aggaaacact accagcctta cgcaccacct agagatttcg ctgcctatcg gagcagggtg 1200 aagttttcca gatctgcaga tgcaccagcg tatcagcagg gccagaacca actgtataac 1260 gagctcaacc tgggacgcag ggaagagtat gacgttttgg acaagcgcag aggacgggac 1320 cctgagatgg gtggcaaacc aagacgaaaa aacccccagg agggtctcta taatgagctg 1380 cagaaggata agatggctga agcctattct gaaataggca tgaaaggaga gcggagaagg 1440 ggaaaagggc acgacggttt gtaccaggga ctcagcactg ctacgaagga tacttatgac 1500 gctctccaca tgcaagccct gccacctagg taa 1533 <210> 112 <211> 509 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 112 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val 20 25 30 Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe 35 40 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gggccagaac 1140 caactgtata acgagctcaa cctgggacgc agggaagagt atgacgtttt ggacaagcgc 1200 agaggacggg accctgagat gggtggcaaa ccaagacgaa aaaaccccca ggagggtctc 1260 tataatgagc tgcagaagga taagatggct gaagcctatt ctgaaatagg catgaaagga 1320 gagcggagaa ggggaaaagg gcacgacggt ttgtaccagg gactcagcac tgctacgaag 1380 gatacttatg acgctctcca catgcaagcc ctgccaccta ggtaa 1425 <210> 116 <211> 474 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 116 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu 20 25 30 Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln 35 40 45 Ser Val Ser Ser Leu Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala 50 55 60 Pro Arg Leu Leu Ile Phe Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro 65 70 75 80 Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gly Phe Thr Leu Thr Ile 85 90 95 Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr 100 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cttggtatca gcaaaaacca 120 gggcaggcac cgcggctttt gatttttggt gcaagcacac gcgccactgg cattccagct 180 aggttttctg gaagtggatc tgggacaggc ttcactctga caatcagtag cctgcagagt 240 gaggactttg ctgtttacta ctgtcaacag tacgacacct ggccattcac attcgggccc 300 ggcaccaagg tcgacttcaa gaggggcggt ggaggttcag gtggtggcgg gtcaggcggc 360 ggtgggtctc aggttcaact ggtggaatca ggtggcggcg ttgtccaacc ggggcgatca 420 cttcgacttt cctgtgctgc ctcaggcttt actttttcat cctatgggat gcactgggtt 480 cggcaggctc ccggaaaagg actcgagtgg gttgcagtga tctcttacga tggctcagac 540 aagtattatg tggactcagt caaggggaga ttcacaataa gccgagacaa ctccaaaaac 600 cggctttatc tccagatgaa cagccttaga gcggaagata ccgcggtata ctactgtgcc 660 cgcgagaggt attccggcag agactactgg ggacagggca cactggtcac cgtgagttct 720 gccgcagcgc tcgataacga aaagagcaac ggaaccatta tccacgttaa gggcaagcac 780 ctgtgcccca gtcccctctt cccaggacca tctaaaccct tctgggttct ggtagtagtt 840 ggaggggtcc ttgcatgtta ctcccttttg gtcaccgtcg ccttcattat tttctgggtg 900 agatccaaaa gaagccgcct gctccatagc gattacatga atatgactcc 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catcttcggg gcatcaacta gggccaccgg cattcctgca 180 agattttccg ggtctggcag cggcaccggc ttcaccctta ccattagctc tctgcagtct 240 gaggacttcg ccgtttacta ttgtcagcag tatgatactt ggccctttac cttcggtccc 300 ggaactaagg tggacttcaa gcgcgggggg ggtggatctg gaggtggtgg ctccgggggc 360 ggtggaagcc aggtccagtt ggttgagagc ggcggcggag tggtgcagcc cgggaggtcc 420 ttgcggctga gctgtgcagc ctccggtttt actttttcta gctatggaat gcattgggta 480 agacaggctc ccggaaaagg cctcgagtgg gtggcggtca ttagctatga tggatctgat 540 aaatactatg tggactcagt taaggggcgc ttcacaatct caagagacaa tagcaaaaat 600 agactgtacc tgcagatgaa tagtctgcgc gccgaggaca ctgccgtgta ctactgcgcc 660 cgcgagagat acagcggacg ggattactgg ggccagggta ccctcgtaac ggtgtcctcc 720 gctgccgccc ttagcaacag cattatgtac ttttctcatt tcgtgccagt ctttctccca 780 gcaaagccca ccactacccc ggcccccagg ccgcctactc ctgcccccac tatcgcgtct 840 cagcctctct ccttgcggcc cgaggcctgc cggccagccg cagggggcgc cgtacatact 900 cggggtttgg atttcgcttg cgacatatat atttgggccc ccctcgccgg cacatgtgga 960 gtgctgctcc tgagtctcgt tataaccctc tattgcaacc atagaaacag atccaaaaga 1020 agccgcctgc tccatagcga ttacatgaat atgactccac gccgccctgg ccccacaagg 1080 aaacactacc agccttacgc accacctaga gatttcgctg cctatcggag cagggtgaag 1140 ttttccagat ctgcagatgc accagcgtat cagcagggcc agaaccaact gtataacgag 1200 ctcaacctgg gacgcaggga agagtatgac gttttggaca agcgcagagg acgggaccct 1260 gagatgggtg gcaaaccaag acgaaaaaac ccccaggagg gtctctataa tgagctgcag 1320 aaggataaga tggctgaagc ctattctgaa ataggcatga aaggagagcg gagaagggga 1380 aaagggcacg acggtttgta ccagggactc agcactgcta cgaaggatac ttatgacgct 1440 ctccacatgc aagccctgcc acctagg 1467 <210> 126 <211> 489 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 126 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Leu 20 25 30 Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Phe Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 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Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 132 Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr 1 5 10 15 Lys Gly <210> 133 <211> 152 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 133 Met Leu Arg Leu Leu Leu Ala Leu Asn Leu Phe Pro Ser Ile Gln Val 1 5 10 15 Thr Gly Asn Lys Ile Leu Val Lys Gln Ser Pro Met Leu Val Ala Tyr 20 25 30 Asp Asn Ala Val Asn Leu Ser Cys Lys Tyr Ser Tyr Asn Leu Phe Ser 35 40 45 Arg Glu Phe Arg Ala Ser Leu His Lys Gly Leu Asp Ser Ala Val Glu 50 55 60 Val Cys Val Val Tyr Gly Asn Tyr Ser Gln Gln Leu Gln Val Tyr Ser 65 70 75 80 Lys Thr Gly Phe Asn Cys Asp Gly Lys Leu Gly Asn Glu Ser Val Thr 85 90 95 Phe Tyr Leu Gln Asn Leu Tyr Val Asn Gln Thr Asp Ile Tyr Phe Cys 100 105 110 Lys Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser 115 120 125 Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro 130 135 140 Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro 145 150 <210> 134 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Gly, Phe or Tyr <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Ser or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Ile, Phe or Leu <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Ser or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(7) <223> May or may not be present <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Glu, Gly or absent <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> Phe, Leu or Tyr <400> 134 Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Gly Xaa Xaa 1 5 <210> 135 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Asp, His, Ser or Tyr <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> His, Pro or Tyr <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Asp, Glu or Ser <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Asp or Gly <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Gly or Ser <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Asp, Glu or absent <400> 135 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 136 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Glu or Leu <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Arg, Ser or Val <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Arg or Tyr <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Cys, Gly or Ser <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Gly, Ile or absent <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(8) <223> May or may not be present <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> Trp, Tyr or absent <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Pro, Ser or absent <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> Gly, Tyr or absent <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> Phe or Arg <400> 136 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Asp Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Tyr 1 5 10 <210> 137 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Gln or Arg <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Asp or Ser <220> <221> 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gggatggcgc 660 gccagtaatc aattacgggg tcattagttc atagcccata tatggagttc cgcgttacat 720 aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa 780 taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg 840 agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc 900 cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct 960 tatgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt accatgctga 1020 tgcggttttg gcagtacatc aatgggcgtg gatagcggtt tgactcacgg ggatttccaa 1080 gtctccaccc cattgacgtc aatgggagtt tgttttggca ccaaaatcaa cgggactttc 1140 caaaatgtcg taacaactcc gccccattga cgcaaatggg cggtaggcgt gtacggtggg 1200 aggtctatat aagcagagct ggtttagtga accggggtct ctctggttag accagatctg 1260 agcctgggag ctctctggct aactagggaa cccactgctt aagcctcaat aaagcttgcc 1320 ttgagtgctt caagtagtgt gtgcccgtct gttgtgtgac tctggtaact agagatccct 1380 cagacccttt tagtcagtgt ggaaaatctc tagcagtggc gcccgaacag ggacttgaaa 1440 gcgaaaggga aaccagagga gctctctcga cgcaggactc ggcttgctga agcgcgcacg 1500 gcaagaggcg aggggcggcg actggtgagt acgccaaaaa ttttgactag cggaggctag 1560 aaggagagag atgggtgcga gagcgtcagt attaagcggg ggagaattag atcgcgatgg 1620 gaaaaaattc ggttaaggcc agggggaaag aaaaaatata aattaaaaca tatagtatgg 1680 gcaagcaggg agctagaacg attcgcagtt aatcctggcc tgttagaaac atcagaaggc 1740 tgtagacaaa tactgggaca gctacaacca tcccttcaga caggatcaga agaacttaga 1800 tcattatata atacagtagc aaccctctat tgtgtgcatc aaaggataga gataaaagac 1860 accaaggaag ctttagacaa gatagaggaa gagcaaaaca aaagtaagac caccgcacag 1920 caagccgccg ctgatcttca gacctggagg aggagatatg agggacaatt ggagaagtga 1980 attatataaa tataaagtag taaaaattga accattagga gtagcaccca ccaaggcaaa 2040 gagaagagtg gtgcagagag aaaaaagagc agtgggaata ggagctttgt tccttgggtt 2100 cttgggagca gcaggaagca ctatgggcgc agcgtcaatg acgctgacgg tacaggccag 2160 acaattattg tctggtatag tgcagcagca gaacaatttg ctgagggcta ttgaggcgca 2220 acagcatctg ttgcaactca cagtctgggg catcaagcag ctccaggcaa gaatcctggc 2280 tgtggaaaga tacctaaagg atcaacagct cctggggatt tggggttgct ctggaaaact 2340 catttgcacc actgctgtgc cttggaatgc tagttggagt aataaatctc tggaacagat 2400 ttggaatcac acgacctgga tggagtggga cagagaaatt aacaattaca caagcttaat 2460 acactcctta attgaagaat cgcaaaacca gcaagaaaag aatgaacaag aattattgga 2520 attagataaa tgggcaagtt tgtggaattg gtttaacata acaaattggc tgtggtatat 2580 aaaattattc ataatgatag taggaggctt ggtaggttta agaatagttt ttgctgtact 2640 ttctatagtg aatagagtta ggcagggata ttcaccatta tcgtttcaga cccacctccc 2700 aaccccgagg ggacccgaca ggcccgaagg aatagaagaa gaaggtggag agagagacag 2760 agacagatcc attcgattag tgaacggatc tcgacggtat cggttaactt ttaaaagaaa 2820 aggggggatt ggggggtaca gtgcagggga aagaatagta gacataatag caacagacat 2880 acaaactaaa gaattacaaa aacaaattac aaaattcaaa attttatcgc gatcgcggaa 2940 tgaaagaccc cacctgtagg tttggcaagc tagcttaagt aacgccattt tgcaaggcat 3000 ggaaaataca taactgagaa tagagaagtt cagatcaagg ttaggaacag agagacagca 3060 gaatatgggc caaacaggat atctgtggta agcagttcct gccccggctc agggccaaga 3120 acagatggtc cccagatgcg gtcccgccct cagcagtttc tagagaacca tcagatgttt 3180 ccagggtgcc ccaaggacct gaaaatgacc ctgtgcctta tttgaactaa ccaatcagtt 3240 cgcttctcgc ttctgttcgc gcgcttctgc tccccgagct caataaaaga gcccacaacc 3300 cctcactcgg cgcgccagtc cttcgaagta gatctttgtc gatcctacca tccactcgac 3360 acacccgcca gcggccgctg ccaagcttcc gagctctcga attaattcac ggtacccacc 3420 atggcctagg gagactagtc gaatcgatat caacctctgg attacaaaat ttgtgaaaga 3480 ttgactggta ttcttaacta tgttgctcct tttacgctat gtggatacgc tgctttaatg 3540 cctttgtatc atgctattgc ttcccgtatg gctttcattt tctcctcctt gtataaatcc 3600 tggttgctgt ctctttatga ggagttgtgg cccgttgtca ggcaacgtgg cgtggtgtgc 3660 actgtgtttg ctgacgcaac ccccactggt tggggcattg ccaccacctg tcagctcctt 3720 tccgggactt tcgctttccc cctccctatt gccacggcgg aactcatcgc cgcctgcctt 3780 gcccgctgct ggacaggggc tcggctgttg ggcactgaca attccgtggt gttgtcgggg 3840 aagctgacgt ccttttcatg gctgctcgcc tgtgttgcca cctggattct gcgcgggacg 3900 tccttctgct acgtcccttc ggccctcaat ccagcggacc ttccttcccg cggcctgctg 3960 ccggctctgc ggcctcttcc gcgtcttcgc cttcgccctc agacgagtcg gatctccctt 4020 tgggccgcct ccccgcctgg ttaattaaag tacctttaag accaatgact tacaaggcag 4080 ctgtagatct tagccacttt ttaaaagaaa aggggggact ggaagggcga attcactccc 4140 aacgaagaca agatctgctt tttgcttgta ctgggtctct ctggttagac cagatctgag 4200 cctgggagct ctctggctaa ctagggaacc cactgcttaa gcctcaataa agcttgcctt 4260 gagtgcttca agtagtgtgt gcccgtctgt tgtgtgactc tggtaactag agatccctca 4320 gaccctttta gtcagtgtgg aaaatctcta gcaggcatgc cagacatgat aagatacatt 4380 gatgagtttg gacaaaccac aactagaatg cagtgaaaaa aatgctttat ttgtgaaatt 4440 tgtgatgcta ttgctttatt tgtaaccatt ataagctgca ataaacaagt taacaacaac 4500 aattgcattc attttatgtt tcaggttcag ggggaggtgt gggaggtttt ttggcgcgcc 4560 atcgtcgagg ttccctttag tgagggttaa ttgcgagctt ggcgtaatca tggtcatagc 4620 tgtttcctgt gtgaaattgt tatccgctca caattccaca caacatacga gccggaagca 4680 taaagtgtaa agcctggggt gcctaatgag tgagctaact cacattaatt gcgttgcgct 4740 cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagct gcattaatga atcggccaac 4800 gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc 4860 tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt 4920 tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg 4980 ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg 5040 agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat 5100 accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta 5160 ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct 5220 gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc 5280 ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa 5340 gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg 5400 taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaagaacag 5460 tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt 5520 gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta 5580 cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc 5640 agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca 5700 cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa 5760 cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat 5820 ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct 5880 taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt 5940 tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat 6000 ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta 6060 atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg 6120 gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt 6180 tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg 6240 cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg 6300 taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc 6360 ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca catagcagaa 6420 ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca aggatcttac 6480 cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt 6540 ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg 6600 gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa tattattgaa 6660 gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata 6720 aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc ac 6762

Claims (44)

  1. C-유형 렉틴-유사-1 ("CLL-1")에 결합하는 단일 쇄 Fv ("scFv"), 막횡단 도메인, 및 CD3 제타의 신호전달 도메인인 세포내 활성화 도메인을 포함하는 폴리펩티드이고, 여기서 scFv는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 경쇄 가변 영역 (VL) 쌍을 포함하는 것인, CLL-1에 결합하는 키메라 항원 수용체:
    (a) 각각 서열식별번호: 73, 서열식별번호: 74 및 서열식별번호: 75의 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역 ("CDR") 1, 2 및 3을 포함하는 VH 영역, 및 각각 서열식별번호: 78, 서열식별번호: 79 및 서열식별번호: 80의 아미노산 서열을 갖는 CDR 1, 2 및 3을 포함하는 VL 영역; 및
    (b) 각각 서열식별번호: 95, 서열식별번호: 96 및 서열식별번호: 97의 아미노산 서열을 갖는 CDR 1, 2 및 3을 포함하는 VH 영역, 및 각각 서열식별번호: 100, 서열식별번호: 101 및 서열식별번호: 102의 아미노산 서열을 갖는 CDR 1, 2 및 3을 포함하는 VL 영역.
  2. 제1항에 있어서, CD3 제타의 신호전달 도메인이 서열식별번호: 10에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 키메라 항원 수용체.
  3. 제1항에 있어서, 적어도 1개의 공동자극 도메인 신호전달 영역을 추가로 포함하는 키메라 항원 수용체.
  4. 제3항에 있어서, 공동자극 도메인 신호전달 영역이 CD28, OX-40, 4-1BB/CD137, CD27 또는 ICOS의 신호전달 영역인 키메라 항원 수용체.
  5. 제4항에 있어서, 공동자극 도메인 신호전달 영역이 서열식별번호: 8을 포함하는 것인 키메라 항원 수용체.
  6. 제5항에 있어서, 서열식별번호: 2를 포함하는 키메라 항원 수용체.
  7. 제1항에 있어서, 막횡단 도메인이 CD28 또는 CD8 막횡단 도메인인 키메라 항원 수용체.
  8. 제7항에 있어서, 막횡단 도메인이 서열식별번호: 6을 포함하는 CD28 막횡단 도메인인 키메라 항원 수용체.
  9. 제1항에 있어서, (a) 서열식별번호: 2에 제시된 바와 같은 CD28의 세포외 및 막횡단 도메인, 또는 (b) 서열식별번호: 14에 제시된 바와 같은 CD8의 세포외 및 막횡단 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체.
  10. 제1항에 있어서, scFv의 링커가 서열식별번호: 130 또는 서열식별번호: 132 중 적어도 1개를 포함하는 것인 키메라 항원 수용체.
  11. 제1항에 있어서, scFv가
    (a) 서열식별번호: 72의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열식별번호: 77의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역; 또는
    (b) 서열식별번호: 94의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열식별번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역
    을 포함하는 것인 키메라 항원 수용체.
  12. C-유형 렉틴-유사-1 ("CLL-1")에 결합하는 단일 쇄 Fv ("scFv"), 막횡단 도메인, 및 CD3 제타의 신호전달 도메인인 세포내 활성화 도메인을 포함하는 폴리펩티드이고, 여기서 scFv는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 경쇄 가변 영역 (VL) 쌍을 포함하는 것인, CLL-1에 결합하는 키메라 항원 수용체:
    (a) 서열식별번호: 72의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열식별번호: 77의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역; 및
    (b) 서열식별번호: 94의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열식별번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역.
  13. 제1항 또는 제12항의 키메라 항원 수용체를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  14. 제13항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  15. 제14항에 있어서, 레트로바이러스 벡터, DNA 벡터, 플라스미드, RNA 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노바이러스 연관 벡터, 또는 렌티바이러스 벡터인 벡터.
  16. 제14항의 벡터를 포함하는 면역 세포.
  17. 제16항에 있어서, T 세포, 종양 침윤 림프구 (TIL), NK 세포, 또는 NK-T 세포인 면역 세포.
  18. 제17항에 있어서, 세포가 자가 T 세포인 면역 세포.
  19. 제17항에 있어서, 세포가 동종 T 세포인 면역 세포.
  20. 제18항의 T 세포 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는, 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 골수 백혈병 (CML), 만성 골수단핵구성 백혈병 (CMML), 소아 골수단핵구성 백혈병, 비정형 만성 골수성 백혈병, 급성 전골수구성 백혈병 (APL), 급성 단핵모구성 백혈병, 급성 적백혈병, 급성 거핵모구성 백혈병, 골수이형성 증후군 (MDS), 골수증식성 장애, 골수성 신생물, 골수성 육종, 모구성 형질세포양 수지상 세포 신생물 (BPDCN), 류마티스 관절염, 건선, 알레르기, 천식, 크론병, IBD, IBS, 섬유근육통, 비만세포증, 및 복강 질환 중 하나 이상의 치료를 위한 제약 조성물.
  21. 서열식별번호: 84; 서열식별번호: 88; 서열식별번호: 92; 서열식별번호: 106; 서열식별번호: 110; 서열식별번호: 114; 서열식별번호: 118; 서열식별번호: 122; 또는 서열식별번호: 126에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 키메라 항원 수용체 폴리펩티드.
  22. 서열식별번호: 83; 서열식별번호: 87; 서열식별번호: 91; 서열식별번호: 105; 서열식별번호: 109; 서열식별번호: 113; 서열식별번호: 117; 서열식별번호: 121; 또는 서열식별번호: 125에 제시된 바와 같은 핵산 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  23. 제22항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  24. 제23항에 있어서, 레트로바이러스 벡터, DNA 벡터, 플라스미드, RNA 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노바이러스 연관 벡터, 또는 렌티바이러스 벡터인 벡터.
  25. 제23항의 벡터를 포함하는 면역 세포.
  26. 제25항에 있어서, T 세포, 종양 침윤 림프구 (TIL), NK 세포, 또는 NK-T 세포인 면역 세포.
  27. 제26항에 있어서, 세포가 자가 T 세포인 면역 세포.
  28. 제26항에 있어서, 세포가 동종 T 세포인 면역 세포.
  29. 제27항 또는 제28항에 따른 T 세포 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는, 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 골수 백혈병 (CML), 만성 골수단핵구성 백혈병 (CMML), 소아 골수단핵구성 백혈병, 비정형 만성 골수성 백혈병, 급성 전골수구성 백혈병 (APL), 급성 단핵모구성 백혈병, 급성 적백혈병, 급성 거핵모구성 백혈병, 골수이형성 증후군 (MDS), 골수증식성 장애, 골수성 신생물, 골수성 육종, 모구성 형질세포양 수지상 세포 신생물 (BPDCN), 류마티스 관절염, 건선, 알레르기, 천식, 크론병, IBD, IBS, 섬유근육통, 비만세포증, 및 복강 질환 중 하나 이상의 치료를 위한 제약 조성물.
  30. 제27항 또는 제28항에 따른 T 세포 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는, CLL-1을 발현하는 종양 또는 악성종양을 치료하기 위한 제약 조성물.
  31. C-유형 렉틴-유사-1 ("CLL-1")에 결합하는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 경쇄 가변 영역 (VL) 쌍을 포함하고, 여기서 VH 및 VL 쌍은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 항원-결합 분자:
    (a) 각각 서열식별번호: 73, 서열식별번호: 74 및 서열식별번호: 75의 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역 ("CDR") 1, 2 및 3을 포함하는 VH 영역, 및 각각 서열식별번호: 78, 서열식별번호: 79 및 서열식별번호: 80의 아미노산 서열을 갖는 CDR 1, 2 및 3을 포함하는 VL 영역; 및
    (b) 각각 서열식별번호: 95, 서열식별번호: 96 및 서열식별번호: 97의 아미노산 서열을 갖는 CDR 1, 2 및 3을 포함하는 VH 영역, 및 각각 서열식별번호: 100, 서열식별번호: 101 및 서열식별번호: 102의 아미노산 서열을 갖는 CDR 1, 2 및 3을 포함하는 VL 영역.
  32. 제31항에 있어서, VH 및 VL 쌍이
    (a) 서열식별번호: 72의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열식별번호: 77의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역; 및
    (b) 서열식별번호: 94의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열식별번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역
    으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 항원-결합 분자.
  33. 제31항에 있어서, VH 및 VL 쌍이 각각 서열식별번호: 73, 서열식별번호: 74 및 서열식별번호: 75의 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역 ("CDR") 1, 2 및 3을 포함하는 VH 영역, 및 각각 서열식별번호: 78, 서열식별번호: 79 및 서열식별번호: 80의 아미노산 서열을 갖는 CDR 1, 2 및 3을 포함하는 VL 영역을 포함하는 것인 항원-결합 분자.
  34. 제31항에 있어서, VH 및 VL 쌍이 각각 서열식별번호: 95, 서열식별번호: 96 및 서열식별번호: 97의 아미노산 서열을 갖는 CDR 1, 2 및 3을 포함하는 VH 영역, 및 각각 서열식별번호: 100, 서열식별번호: 101 및 서열식별번호: 102의 아미노산 서열을 갖는 CDR 1, 2 및 3을 포함하는 VL 영역을 포함하는 것인 항원-결합 분자.
  35. 제31항에 있어서, 항체 또는 그의 면역학적으로 기능성인 단편인 항원-결합 분자.
  36. 제35항에 있어서, scFv 단편, 펩티바디, Fab 단편, 모노클로날 항체, 이중특이적 항체, 미니바디, 도메인 항체, 합성 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 또는 항체 융합체 단백질인 항원-결합 분자.
  37. 제31항에 따른 항원-결합 분자 또는 그의 면역학적으로 기능성인 단편을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  38. 제37항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  39. 제38항에 있어서, 레트로바이러스 벡터, DNA 벡터, 플라스미드, RNA 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노바이러스 연관 벡터, 또는 렌티바이러스 벡터인 벡터.
  40. 제38항의 벡터를 포함하는 세포.
  41. 제40항에 있어서, T 세포, 종양 침윤 림프구 (TIL), NK 세포, 또는 NK-T 세포인 세포.
  42. 제31항의 항원-결합 분자 또는 그의 면역학적으로 기능성인 단편, 또는 제40항의 세포, 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는, 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 골수 백혈병 (CML), 만성 골수단핵구성 백혈병 (CMML), 소아 골수단핵구성 백혈병, 비정형 만성 골수성 백혈병, 급성 전골수구성 백혈병 (APL), 급성 단핵모구성 백혈병, 급성 적백혈병, 급성 거핵모구성 백혈병, 골수이형성 증후군 (MDS), 골수증식성 장애, 골수성 신생물, 골수성 육종, 모구성 형질세포양 수지상 세포 신생물 (BPDCN), 류마티스 관절염, 건선, 알레르기, 천식, 크론병, IBD, IBS, 섬유근육통, 비만세포증, 및 복강 질환 중 하나 이상의 치료를 위한 제약 조성물.
  43. 제31항의 항원 결합 분자 또는 그의 면역학적으로 기능성인 단편 또는 제40항의 세포 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는, CLL-1을 발현하는 종양 또는 악성종양을 치료하기 위한 제약 조성물.
  44. 제19항의 T 세포 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는, 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 골수 백혈병 (CML), 만성 골수단핵구성 백혈병 (CMML), 소아 골수단핵구성 백혈병, 비정형 만성 골수성 백혈병, 급성 전골수구성 백혈병 (APL), 급성 단핵모구성 백혈병, 급성 적백혈병, 급성 거핵모구성 백혈병, 골수이형성 증후군 (MDS), 골수증식성 장애, 골수성 신생물, 골수성 육종, 모구성 형질세포양 수지상 세포 신생물 (BPDCN), 류마티스 관절염, 건선, 알레르기, 천식, 크론병, IBD, IBS, 섬유근육통, 비만세포증, 및 복강 질환 중 하나 이상의 치료를 위한 제약 조성물.
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