MXPA06008336A - Analisis de citotoxicidad. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se relaciona con metodos para detectar la actividad CTL utilizando citometria de flujo para detectar la escision de las enzimas relacionadas con la citotoxicidad.

Description

ANÁLISIS DE CITOTOXICIDAD CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con métodos para detectar la actividad CTL utilizando citometría de flujo para detectar la escisión de las enzimas relacionadas con la citotoxicidad.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN - El tanálisis para la liberación de 51Cr ha sido el estándar de oro para medir la actividad CTL durante una respuesta inmunitaria durante "más de 3 décadas. Sin embargo, el análisis tiene varias limitaciones técnicas y los recientes datos han llevado al tema de la relevancia fisiológica del análisis para la liberación de 51Cr y si es una verdadera medida de la actividad CTL contra los codocitos in vi vo , especialmente en tumores sólidos. La lisis de linfocitos en análisis CTL in vi tro se pueden inducir vía dos mecanismos distintos: 1) Un proceso membranolisis suministrado cuando se inserta simplemente en la membrana del codocito; y, 2) la fragmentación de ADN (apoptosis) inducida por la acción de Granzyme B y Granzyme A que entran a un codocito vía la perforina y/o casos de fusión vesicular a la superficie del codocito. El análisis para la liberación de 51Cr mide la primera de estas dos lecturas. El último mecanismo tiene mayor relevancia fisiológica y se requiere in vi vo para el exterminio de codocitos . Recientes observaciones indican que la medición de citotoxicidad de células efectoras mediante el análisis para la liberación de 51Cr puede no ser exacto o en algunos casos, incluso relevante. Con base en estas observaciones, el investigador debe saber del hecho que las células efectoras determinadas para ser citotóxicas con base en los análisis para la liberación de 51Cr puede no ser de hecho CTL capaz de exterminar células tumorales vía la fragmentación de ADN in vi vo . Esto se puede tomar en cuenta para muchos de los resultados en la literatura de inmunoterapia del cáncer en la cual las respuestas a células efectoras supervisadas in vi tro pueden no correlacionarse con la eficacia de la vacuna en el paciente.- Por ejemplo, las vacunas peptídicas seleccionadas en virtud de los datos de citotoxicidad de células efect-oras positivas generados utilizando los análisis para la liberación de 51Cr pueden no reflejar demanera precisa los epítopes reales activos para inducir la lisis CTL in vivo vía la fragmentación de AD . Además, existen otros diversos problemas que aglig el uso de los análisis con base en 51Cr, incluyendo la necesidad de utilizar radioactividad peligrosa, y los problemas relacionados con el uso de contadores de centelleo. El análisis JAM es un método más novedoso que resuelve algunos de los problemas con la liberación de 51Cr. Aunque mide eficazmente la fragmentación de ADN, tiene serias limitaciones debido a la necesidad de marcar el ADN de los codocitos con agentes tales como por ejemplo, 3H-timidina o 125I-desoxiuridina . Este método invariablemente -provoca daño al ADN y cambia la fisiología del codocito antes del análisis CTL. Además, el método de marcación con 3H-timidina no produce el mismo grado de sensibilidad como 51Cr y 125I es un agente peligroso que requiere considerable protección de plomo tanto para los trabajadores de laboratorio como para el área de laboratorio. En general, un método no radiactivo para medir la inducción de apoptosis y la fragmentación de ADN en codocitos durante ataque CTL podría ser un análisis más ideal, especialmente cuando se contempla su utilización en .supervisión de pruebas clínicas. La detección de la escisión de caspasa utilizando substratos de caspasa fluorogénica también se ha utilizado para demostrar la actividad de ' linfocitos T citotóxicos (Liu, et al. Visualization and quantification of T cell-mediated cytotoxicity using cell-permeable fluorogenic caspase substrates . Nature Medicine, Ene. 2003, 9(l) :4-5.) Además, se han presentado otros métodos bastante sensibles para enumerar los linfocitos T CD8+, antígeno-especí fieos , tales como por ejemplo, tinción de citocina intracelular, el análsisi ELISPOT, y la tinción para linfocitos T utilizando los tetrámeros MHC clase I. Sin embargo, estos análisis no miden la última función citolítica, que es especialmente importante para analizar respuestas inmunitarias. anti-tumor. Hacen falta análisis que ofrezcan uno de los niveles adecuados de sensibilidad, especificidad, seguridad y facilidad de uso. En la presente se proporciona un sistema de análisis novedoso y sensible para detectar la actividad CTL.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona un análisis de. citotoxicidad que detecta los cambios relacionados con la fragmentación de ADN y/o apoptosis en _ codocitos después del contacto con células efectoras. En una modalidad, el análisis se conduce utilizando uno o más reactivos que detectan la escisión de una caspasa o fosforilación de histonas. En una modalidad preferida, la escisión de caspasas se detecta utilizando un anticuerpo monoclonal. En otra modalidad preferida, la fosforilación de histonas se detecta utilizando un anticuerpo monoclonal. En otras modalidades, se detectan la caspasa escindida y/o las histonas fosforiladas utilizando al menos un anticuerpo monoclonal acoplado con análisis citométrico de flujo.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Fig. 1. Estabilidad del tinte marcador para codocitos y estrategia de activación desarrollada para supervisar la actividad CTL utilizando la escisión de caspasa 3 en codocitos. A. Tinte rastreador de la célula DDAO-SE que marca brillante y establemente las líneas de codocitos CTL. Se muestra la tinción de varias de las líneas celulares cultivadas en suspensión y adherentes normalmente utilizadas: P815, EL4, linfoma T2, NIH 3T3, cáncer de. mama 4T1, y melanoma B16F10. Las células se tiñeron con DDAO-SE y se incubaron durante los intervalos de tiempo indicados (0, 1, 3, o 15 h) y se analizaron mediante FACS. La intensidad de fluorescencia media y el coeficiente de variación (CV) se muestran para cada línea celular. Se muestra el resultado de uno de dos experimentos similares. B. La estrategia de activación utilizada para enumerar la escisión de caspasa 3 en blancos marcados con DDAO-SE. Se muestra un ejemplo de células P815 marcadas con DDAO- SE con células C57BL/6 anti-Balb/c MLR. La primera gráfica muestra FSC contra SSC con la activación de la población total (Rl) - Las células Rl activadas luego se analizaron utilizando SSC y fluorescencia FSC contra FL4 (DDAO-SE positivo) . Las células positivas con DDAO-SE se activaron como se muestra (R2 y R3) excluyendo las células con bajo FSC (muertas) . Las células R2*R3 se analizaron entonces utilizando FL2 (caspasa 3 escindida y marcada con PE) contra FL4 (DDAO-SE) para determinar el porcentaje de blancos apoptóticos (R4) . Fig . 2. Medición de la actividad CTL en MLR murino utilizando el análisis de escisión de caspasa y la dependencia de la escisión de caspasa 3 en el blanco sobre la secreción de perforina y granzima mediante CTL. Se incubaron células efectoras MLR de C57BL/6 Anti-Balb/c o Balb/c anti-C57BL/6 con blancos P815 marcados (A) durante diferentes intervalos de tiempo (0.5, 1, 2, y 3 h) seguidos por tinción para la escisión de caspasa 3 como se muestra. Sólo se encontró la escisión de caspasa 3 con las efectoras MLR de anti-Balb/c. B. Los blancos P815 o EL4 marcados con DDAO-SE. se incubaron con las efectoras MLR C57BL/6 anti-Balb/c o Balb/c anti-C57BL/6 durante intervalos de tiempo diferentes como se muestra. Se muestra el porcentaje de codocitos escindidos con caspasa3. Los resultados muestran la especificidad del análisis con las efectoras MLR que sólo exterminan los blancos que no coinciden con H-2. Los resultados son representativos de 3 experimentos con resultados similares. C. Concanamicina A, un inhibidor de la secreción de granulos citolíticos mediante CTL evita la escisión de caspasa 3 en los blancos P815 incubados con las células efectoras MLR de C57BL/6 anti-Balb/c. Al quinto día los cultivos de MLR se aislaron y diluyeron con linfocitos de bazo C57BL/6 singeneicos que no han recibido tratamiento previo a un 1:1, 1:3, 1:9 o sin dilución,, como se muestra. Las efectoras diluidas se incubaron con células P815 marcadas. Los controles fueron células de bazo C57BL/6 que no han recibido tratamiento previo sin células MLR o células P815 marcadas solas. Los análisis se tiñeron para la escisión de caspasa 3 después de 3 h.

Fig. 3. Comparación del análisis de escisión de caspasa 3 y la liberación de 51Cr para supervisar la actividad CTL utilizando las efectoras MLR murinas y CTL aislado después de las respuestas a la vacuna con base en péptidos en ratones. A. Células efectoras provenientes de un MLR murino (b—>d) se incubaron con 100,000 P815 o codocitos EL4 (control) en un análisis de 4 h a las proporciones E:T indicadas. Para el análisis para la liberación de 59Cr, se inició a una dilución. 16:1 y se diluyó a 0.2:1, mientras que el análisis para escisión de caspasa 3 se probó a una proporción entre 1:1 y 0.1:1 E:T. Se muestran los resultados de 1 de 2 experimentos similares. B. El análisis para la escisión de caspasa 3 es igualmente fiable y específico como el análisis para la liberación de 51Cr para supervisar las respuestas de anulación provenientes de ratones inmunizados con péptidos. Los ratones se inmunizaron con el péptido TRP2 de melanoma y se probaron a las proporciones E:T indicadas . Fig. 4. Supervisión de las respuestas de linfocitos T a CD8+ después de la vacunación con base en un vector viral en ratones utilizando resultados comparables con los rendimientos del análisis CTL con la escisión de caspasa 3 como el análisis ELISPOT de IFN-?. Ratones transgénicos HLA-A2.1/Kb se inmunizaron con ALVAC-gplOO y las células de bazo se re-estimularon durante 5 días con' una mezcla de péptidos gplOO. Las células viables se aislaron y se probaron para la actividad CTL utilizando la escisión de caspasa 3 con una proporción E:T 20:1 (panel izquierdo) , o para la producción de IFN-? en los análisis ELISPOT (panel derecho) a 100,000 células por cavidad. Los blancos fueron transfectantes P815-A2/Kb pulsados con péptidos gplOO o un péptido control pp65 CMV de unión con A2. Se muestran los resultados de dos experimentos independientes. Los puntos representan los resultados de ratones vacunados individualmente. Fig. 5. Supervisión de las respuestas de linfocitos T a CD8+ humano antígeno-específico utilizando el análisis de escisión de caspasa 3. Se generaron líneas de linfocitos T humanos péptido-específicos primarios provenientes de PBMC de donadores HLA-A*0201+ utilizando DC autólogos y linfocitos B activados pulsados con péptidos según se describe. Los linfocitos T experimentaron cuatro rondas de estimulación péptido-especí fica antes de ser probados para la actividad CTL. A. Aplicación del análisis de escisión de caspasa 3 - a líneas de linfocitos T externas antígeno-específicas (péptido rev de VIH) . Los linfocitos T se recolectaron y se incubaron con blancos de linfoma T2 marcados con DDAO-SE pulsados con los péptidos pp65 rev de VIH o CMV, o sin péptido. Los linfocitos T se diluyeron con PBMC autólogo que no ha recibido tratamiento previo a una proporción de 1:1 o 1:5 antes de mezclar con 100,000 blancos pulsados a una proporción de 1:1. Las células se incubaron durante 1 ó 3 h, como se indica, y se tiñeron para la caspasa 3 escindida*. Los codocitos solos ("T solo") también se utilizaron como los controles. Se muestran los resultados de uno de 3 experimentos similares. B. Actividad CTL medida en líneas de linfocitos T humanos auto-antígeno-específicos (péptido CAPÍ de CEA) utilizando la escisión de caspasa 3 o el análisis de tinción con Annexin-V más 7-AAD. Las células efecctoras se diluyeron a las proporciones indicadas con PBMC autólogo que no había recibido tratamiento previo antes de mezclar con los linfocítos T2 pulsados con péptidos, pulsados con el CAPÍ péptido específico o el péptido pp65 de CMV no específico. Se utilizaron codocitos solos ( " 1 solo") y PBMC que no había recibido* tratamiento previo provenientes del donador como controles negativos. Se muestran los resultados de 3 h de incubación. Se obtuvieron resultados similares después de 1 ó 4 h de incubación (no mostrados) . Se muestran los resultados de uno de dos experimentos similares. Fig. 6. La escisión de caspasa 3 es un análisis muy sensible para supervisar la actividad CTL murina. Las células de bazo' de b—>d MLR se recolectaron y se incubaron con . codocitos P815 marcados con DDAO-SE. Las células efectoras MLR se diluyeron con células de bazo singeneicas gue no habían recibido tratamiento previo a las proporciones indicadas antes de mezclar con los blancos P815 a una proporción de 1:1. 100,000 células efectoras diluidas y 100,000 codocitos estuvieron en el análisis. El panel superior (A) muestra los diagramas de punto para DDAO-SE contra la escisión de caspasa 3 después del análisis FACS a diluciones diferentes de las células efectoras MLR. Las células de bazo B6 que no habían recibido tratamiento previo mezcladas con codocitos se muestran como un control negativo. B. Los resultados de dos experimentos independientes que muestran la escisión de caspasa 3 a las diluciones de células efectoras b—>d MLR indicadas. Las células efectoras y los codocitos P815 se incubaron durante 2 ó 4 h antes de la tinción para la caspasa 3 escindida. Fig. 7. La escisión de caspasa 3 es un análisis muy sensible para supervisar la actividad de linfocitos T con CD8+ humano con un nivel similar de sensibilidad como la tinción TCR con pentámeros del péptido HLA. Líneas de linfocitos T humanos péptido-específicos gag de VIH restringido con HLA-A*0201 se generaron como anteriormente y se probaron para la actividad CTL. Los linfocitos T se diluyeron con PBMC autólogo que no había recibido tratamiento previo a la proporción indicada antes de agregar a una proporción 1:1 con blancos T2 pulsados con péptidos de VIH o CMV (control de especificidad) . Los blancos solos y PBMC que no había recibido tratamiento previo sin células efectoras se utilizaron como controles negativos. A. Los diagramas de puntos muestran los resultados representativos cuando los linfocitos T péptido-específicos gag de VIH bastante diluidos son linfocitos T2 incubados pulsados con el péptido gag de VIH o el péptido pp65 de CMV no específico. Se detectaron rutinariamente incluso a la dilución de 1:199 diferencias significativas en el porcentaje de escisión de caspasa. B. Gráfica de barras que muestra la desviación promedio y estándar de tres experimentos por separado para probar el análisis para escisión de caspasa 3 para medir la actividad CTL en las líneas de linfocitos T pépt ido-específicos gag de VIH diluidas con PBMC que no había recibido tratamiento previo como se indica. En cada caso, se incubaron 150,000 efectoras diluidas con 150,000 blancos pulsados con péptidos y marcados con DDAO-SE. Como una comparación, los mismos linfocitos T se tiñeron con un pentámero peptídico gag de HLA (Prolmmune, Oxford, UK) en paralelo (C). Se utilizó como el control de especificidad una línea de linfocitos T péptido-específicos pp65 de CMV. Con el fin de comparar el análisis de pentámeros con el análisis de escisión de caspasa 3, 150,000 linfocitos T activados se recolectaron para cada punto de datos (la misma cantidad de células efectoras agregadas al análisis CTL) .

DESCRIPCIÓN DETALLADA La presente invención se relaciona con reactivos y análisis para realizar análisis de citotoxicidad. Los análisis son adecuados para detectar la citotoxicidad producida por células efectoras inmunes incluyendo de manera enunciativa: linfocitos T, células citolíticas naturales (NK) , granulocitos, monocitos, macrófagos, y lo semejante. Los análisis en general se basan en la detección de cambios relacionados con la fragmentación de ADN y/o apoptosis en un codocito. Por ejemplo, en ciertas modalidades, se detecta la escisión de una enzima implicada en el proceso apoptótico. En otra modalidad, se detecta un cambio en las características de una proteína asociada con ADN durante el proceso apoptótico. Estos cambios son adecuados para la detección utilizando dispositivos que miden la fluorescencia celular, tales como por ejemplo, una máquina Clasificadora de Células Activadas por Fluorescencia (FACS) o citómetro de flujo. En una modalidad, la presente invención se relaciona con un análisis para medir la escisión de una o más caspasas durante el proceso apoptótico. Se muestra que las caspasas desempeñan una función en la apoptosis que puede ser adecuada para la detección en un análisis como, se muestra en la presente pueden incluir de manera enunciativa: las caspasas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, y 14. En una modalidad, la caspasa 3 se detecta utilizando el análisis descrito en la presente. Otra enzima conocida que se escindirá durante el proceso apoptótico es la poli-ADP ribosa polimerasa (PARP) . La escisión de caspasas, en particular caspasa 3, y PARP son casos tempranos durante la apoptosis y se activan en blancos CTL. Además de la escisión de caspasas y PARP, varios de los substratos intracelulares se fosforilan durante la inducción de apoptosis. Por ejemplo, la histona H2A.X se fosforila en una amplia variedad de linajes celulares. Los anticuerpos con capacidad de unión específica para la caspasas escindidas, así como también los anticuerpos específicos para la histona H2.AX fosforilada están disponibles comercialmente y son adecuados para utilizarse en la práctica de la presente invención. En ciertas modalidades, se utilizan tintes para teñir codocitos antes de entrar en contacto con las células efectoras. Los tintes adecuados incluyen Vial T, CFSE, y DDAO-SE, cada uno de los mismos se conocen en la técnica. Un tinte preferido es DDAO-SE (soluciones de ensayo molecular) . También se conocen en la técnica otros tintes adecuados y pueden ser útiles en la práctica de la presente invención. En una modalidad, el análisis de la presente invención se lleva a cabo al: 1) preparar células efectoras (E); 2) preparar codocitos (T), incluyendo la marcación de células con un marcador perceptible tal como por ejemplo, un tinte fluorescente; 3) mezclar las células efectoras y los codocitos a un número suficiente de proporciones E:T; 4) incubar la mezcla durante un periodo de tiempo suficiente y bajo condiciones adecuadas para al menos algunas de las células efectoras para que se tornen citotóxicas hacia al menos algunos de los codocitos; 5) fijar y permeabilizar las células mezcladas; 6) teñir las células con un reactivo perceptible que tenga la capacidad de unir una proteína o fragmento de la misma que experimenta un cambio durante el proceso apoptótico o que resulta del mismo; y, 7) detectar el reactivo perceptible. • En ciertas modalidades, el reactivo perceptible se puede detectar en virtud de .una marca fluorescente o entidad contenida dentro del reactivo o al detectar un reactivo secundario que se une al reactivo detectable, el reactivo secundario será detectable en virtud de una marca fluorescente o • entidad contenida dentro del reactivo secundario. En modalidades preferidas, el reactivo detectable y/o el reactivo secundario es un anticuerpo, que se . puede marcar fluorescentemente. El reactivo detectable se puede detectar mediante cualquiera de diversos métodos bien conocidos que incluyen de manera enunciativa FACS. En una modalidad preferida, el reactivo detectable es un anticuerpo antí-caspasa 3 (tal como por ejemplo, el Anticuerpo caspasa 3 anti-activo de Conejo Monoclonal Conjugado con PE, Catálogo BD Pharmingen No. 550914) . Se conocen en la técnica otros reactivos adecuados. En ciertas modalidades, puede ser benéfico o conveniente poner en contacto o "pulsar" un codocito con un péptido al cual las células efectoras pueden responder antes de teñir los codocitos y/o mezclar los codocitos y células efectoras. Por ejemplo, un codocito se puede pulsar con un péptido que corresponda a la secuencia de aminoácidos de un agente infeccioso tal como por ejemplo, VIH o un antígeno tumoral. Por ejemplo, los antígenos tumorales adecuados incluyen por ejemplo, gplOO (Cox et al., Sci en ce , 264: 716-719 (1994)), MART-1/Melan A (Kawakami et al., J . Exp . Med . , 180:347-352 (1994)), gp75 (TRP-1) (Wang et al. J. Exp . Med . , 186:1131-1140 (1996)), tirosinasa (Wolfel et al., Eur . J . Imm un ol . , 24:759-764 (1994)), NY-ESO-1 (WO 98/14464; WO 99/18206), melanoma prot eoglicano (Hellstrom et al., J. Imm un ol . , 130:1467-1472 (1983)), antígenos de la familia MAGE (es decir, MAGE-1, 2,3,4,6 y 12; Van der Bruggen . et * al., Science, 254:16 3-1647 (1991); patente de los Estados Unidos No. 6,235,525), antígenos de la familia BAGE (Boel et al., Immunity, 2:167-175 (1995)), antígenos de la familia GAGE (es decir, GAGE-1,2 ; Van den Eynde et al., J. Exp. Med. , 182:689-698 (1995); patente ' de los Estados Unidos No. 6,013, 765), antígenos de la familia RAGE (es decir, RAGE-1; Gaugler et at . , Immunogenetics , 44:323-330 (1996); patente de los Estados Unidos No. 5,939,526), N-acetilglucosaminiltransferasa-V (Guilloux et at . , J. Exp. Med., 183:1173-1183 (1996)), pl5 (Robbins et al., J. Immunol. 154:5944-5950 (1995)), ß-catenina (Robbins et al., J. Exp. Med. , 183:1185-1192 (1996)), MUM-1 (Coulie et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 92:7976-7980 (1995)), cinasa-4 dependiente de ciclina (CDK4) (Wolfel et al., Science, 269:1281-1284 (1995) ) , p21-ras • (Fossum et at . , Int. J. Cáncer, 56:40-45 (1994)), BCR-abl (Bocchia et al., Blood, 85:2680-2684 (1995)), p53 (Theobald et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 92:11993-11997 (1995)), pl85 HER2/neu (erb-Bl; Fisk et al., J. Exp. Med. , 181:2109-2117 (1995)), receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) (Harris et al., Breast Cáncer Res. Treat, 29:1-2 (1994), antígenos carcinoembriónicos (CEA) (Kwong et al., J. Nati.

Cán cer In s t . , 85:982-990 (1995) patentes de los Estados Unidos Nos. 5,756,103; 5,274,087; 5,571,710; 6,071,716; 5,698,530; 6,045,802; EP 263933; EP 346710; y EP 784483); mucina s mut adas asociadas con carcinoma (es decir, productos génicos MUC-1; Jerome et al., J. Imm un ol . , 151:1654-1662 (1993)); productos génicos EBNA de EBV (es decir, EBNA-1; Rickinson et al., Cán cer Surveys , 13:53-80 (1992)); proteínas E7, E6 de virus de papiloma humano (Ressing et al., J . Imm un ol , 154 ; 5934 -5943 (1995)); antígeno próstata específico (PSA; Xue et al., Th e Pros ta t e , 30:73-78(1997)); antígeno de membrana próstata específico (PSMA; Israelí, et al, Cán cer Res . , - 54:1807-1811 (1994)) ; epítopes o antígenos idiotípicos, por ejemplo, idiotipos de inmunglobulina o idiotipos del receptor de linfocitos T (Chen et al., J. Imm un ol . , 153:4775-4787 (1984)); KSA (patente de los Estados Unidos No. 5,348,887), cinesina 2 (Dietz, et al. Biochen Biphys Res Común 2000 Sep 7; 275 ( 3 ) : 731-8 ) , HIP-55, factor ant i-apoptótico TGFß-1 (Toomey, et al. Br J Biomed Sci 2001 ; 58 ( 3 ) : 177-83 ) , proteína tumoral D52 (Bryne • J.A., et al., Genomics, 35:523-532 (1996)), H1FT, NY-BR-1 (WO 01/47959), NY-BR-62, NY-BR-75, NY-B-85, NY-BR-87 y NY-BR-96 (Scanlan, M. Serologic and Bioinfomatic Approaches to ghe Identificación of Human tumor Antigens, in Cá n cer Va ccin es 2000 , Cáncer Research Institute, New York, NY) , entre otros, incluyendo las versions mutadas, modificadass , tipo Silvestre de los mismos. En ciertas modalidades, se puede modificar el - tiempo durante el cual se incuban los codocitos y células efectoras. Por ejemplo, puede ser conveniente incubar la mezcla durante una, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más horas antes de un análisis adicional . Otros aspectos de la presente invención incluyen los equipos para llevar a cabo los análisis descritos en la presente. Un equipo puede incluir los materiales útiles para preparar las células efectoras, un número adecuado de células efectoras, un tinte fluorescente con el cual teñir los codocitos, un dispositivo tal como por ejemplo, una placa de 96 cavidades en la cual los codocitos y las células efectoras se pueden mezclar e incubar, los materiales requeridos para fijar y permeabilizar las células, un reactivo detectable, y/o un reactivo secundario. Combinaciones diferentes de estos materiales se pueden organizar como un equipo para ayudar al técnico experto para llevar a cabo el análisis de la presente invención.

A partir de los siguientes ejemplos se tendrá una mejor comprensión de la presente invención y de sus muchas ventajas, proporcionados a manera de ilustración .

EJEMPLOS Ejemplo 1 MATERIALES Y MÉTODOS A. Reactivos y medios para cultivo celular La caspasa 3 anti-escindida (reactivo contra proteínas tanto humanas como de ratón) fue ficoeritrina (PE) -marcada y adquirida de BD Biosciences (Mississauga, ON) . La anti-fosfo-histona H2A.X-FITC se adquirió de Upstate Cell Signaling Solutions (Lake Placid, NY) . El tinte rastreador celular, DDAO-SE se obtuvo de Soluciones de Ensayo Molecular (Eugene, OR) . Todo el medio de cultivo celular fue de Invitrogen (Mississauga, ON) . Las citocinas (IL-2, IL-2, IL-12, e IL-6) fueron de R&D Systems (Minneapolis, MN) . Los pares del anticuerpo Anti-IFN-? para el análisis ELISPOT de IFN-? humano y de ratón fue de MabTech (Amsterdam, NL) y BD Biosciences (Mississauga, ON ) , respectivamente. 51Cr (51Cromato de Sodio) fue de Amersham (Toronto, Ontario) . Se utilizaron en los experimentos los siguientes péptidos de unión con HLA-A2.1 y de unión con H-2Kb murino: ILKEPVHGV (VIH rev), SLYNTVATL (con gag de VIH), YLSGANLNL (epítope CAPÍ del antígeno tumoral CEA) , IMDQVPVSV, YLEPGPVTV, KTWGQYWQV (epítopes de melanoma gplOO), NLVPMVATV (epítope pp65 de CMV) , DAPIYTNV (epítope H-2Kb de ß-galactosidasa) , TPHPARIGL ( (H-2Ld de ß-galactosidasa) , y TLDSQVMSL (epítope de melanoma TRP-2) . Los péptidos se sintetizaron en un Sintetizador 396 Múltiple Biomolecular (Advanced Chemtech, Louisville, KY) y se purificaron mediante HPLC. ALVAC-gal y ALVAC-gplOO se propagaron en fibroblastos embrionarios de polluelo (CEF) y se purificaron en un cojincillo de sacarosa mediante centrifugación a partir de células lisadas, como se describió anteriormente (Ferrari et al., 1997) . En CEF se determinaron las valoraciones virales en unidades formadoras de placa (ufp), como se describió anteriormente (Santra et al., 2002) .

B. Ratones Ratones Balb/c y C57BL/6 se adquirieron de Charles River (Montreal, QC) . Se generaron ratones transgénicos HLA-A2.1/Kb según se describe (Borenstein et al., 2000) . Todos los ratones se guardaron bajo condiciones libres de patógenos específicos (SPF)' en jaulas micro-aisladoras en el Departamento de Recursos Animales de Aventis Pasteur (Sunnybrook Campus, Toronto, ON) siguiendo los lineamientos del Consejo Canadiense para el Cuidado Animal (CACC) .

C. Preparaciones de PBMC humano Se obtuvieron PBMC humanos de donadores de leucoférisis utilizando centrifugación de gradiente Ficoll-Hypaque (Sigma, St . Louis, MO) . Todos los productos sanguíneos se recolectaron en el Centro de Ciencias Sunnybrook y para la Salud de Mujeres (Toronto, ON ) de acuerdo con los lineamientos institucionales IRB con el total consentimiento de los donadores. Los donadores se pre-seleccionaron para HLA-A*0201 utilizando secuenciación de ADN y sólo los individuos positivos se sometieron a las recolecciones mediante leucoféresis .

D . MLR murino y preparación de células efecctoras y codocitos Se recolectaron bazos de ratones C57BL/6 o Balb/c en el medio de cultivo celular de ratón (a- MEM, 10% de FCS, mercaptoetanol 50 µM, Glutamax 1 mM, Penicilina-Estreptomicina) y las suspensiones celulares se prepararon utilizando una máquina Stomacher (Stomacher 80 Biomaster, UK) . La suspensión celular se filtró a través de un colador con tamaño de poro de 70 µM (BD Biosciences) . Las células se lavaron y se re-suspendieron en un medio de cultivo. Las células estimuladoras se irradiaron a 2000 Rads ( Gammacell®l 000 , Élite MDS Nordion) y se lavaron una vez en el medio de cultivo y se re- suspendieron en el medio de cultivo a 10 x 106 células/ml. Las células detectoras (20 x 106 células) y las células estimuladoras irradiadas (20 x 106 células) se colocaron en matraces T-25 verticales en un total de 20 ml . Los cultivos se incubaron durante 5 días y las células viables se recolectaron utilizando centrifugación sobre Lympholyte-M (Cedarlane Labs, Canadá) a lOOxg durante 20 min. Las células se lavaron en el medio de cultivo a 1.5 x lOAmI.

E. Estudios para inmunización de ratones y reestimulación de linfocitos T in vi tro La inmunización con péptidos se realizó utilizando un péptido antigénico tumoral TRP-2 de unión con H-2b y melanoma enlazado a un péptido de transcitosis del gen humano Periodo 1. Esta secuencia induce la absorción de la secuencia TRP-2 en APC e induce una fuerte respuesta CTL anti- péptido. Se inmunizaron ratones C57BL/6 con 50 µg del péptido TRP-2 subcutáneamente y se les administró un refuerzo después de 3 semanas. Tres semanas después del refuerzo se recolectaron los bazos y las * células de bazo se re-estimularon con el péptido TRP- 2 durante 5 días y luego se sometieron a análisis CTL utilizando ya sea liberación de 51Cr o utilizando el análisis para escisión de caspasa - 3. La inmunización con un vector viral de viruela canaria (ALVAC-gplOO) se realizó subcutáneamente e-n ratones transgénicos HLA-A2.1/K (Borenstein et al., 2000) . Los ratones se inmunizaron con 2 xlO7 ufp de ALVAC-gplOO seguido por un refuerzo a la misma dosis 2 semanas después. Se recolectaron los esplenocitos 5 semanas y 7 semanas después del refuerzo y se re-estimularon (5 x 106 células /cavidad en placas de 24 cavidades) con una mezcla de péptidos gplOO de unión con HLA-A2.1 dominante (IMDQVPVSV, YLEPGPVTV, y KTWGQYWQV) , a 0.2 µg/ml/péptido, durante 5 días. Las células se recolectaron y se sometieron a análisis utilizando IFN-? ELISPOT o el análisis para escisión de caspasa 3. El análisis ELISPOT se realizó con 100,000 células de bazo re-activadas mezcladas con 10,000 P815 pulsado con el péptido gplOO (2 µg/ml) transfectados establemente con un plásmido de expresión HLA-A2/Kb (línea celular P815-A2/Kb) .

F. Generación de linfositos T péptido-específicos humanos Se estimularon PBMC (fracción negativa adherente plástica de PBMC) enriquecidos con linfocitos T utilizando células dendríticas (CD) maduras autólogas pulsadas con péptidos en medio de cultivo de linfocitos T humanos (HTC-CM) que consiste de Medio Dulbecco Modificado de Iscove, Glutamax 1 mM, piruvato 1 M (Invitrogen, Mississauga, ON), 5% de suero AB humano, 2-mercaptoetanol 50 µM, 20 µg/ml de gentamicina. Las CD maduras se generaron en un protocolo de un solo paso durante 6 días a partir de monocitos adherentes utilizando HTC-CM conteniendo 2% de suero AB humano, 1,000 U/ml GM-CSF, 1,000 U/ml de IL-4, 4 ng/ml de TNF-a, y 100 U de IFN-?. Las CD se recolectaron, se lavaron y se pulsaron con 10 µg/ml del péptido. Se utilizaron los siguientes péptidos con nonámero de unión con HLA-A2.1 para la generación de linfocitos T: el péptido rev de VIH (ILKEPVHGV), péptido gag de VIH (SLYNTVATL) y el epítope CAPÍ del antígeno tumoral CEA (YLSGANLNL) . Se había demostrado anteriormente que estos péptidos se unen a HLA-A2.1 y producen respuestas de linfocitos T a CD8+ restringido con HLA-A2.1 (Stuber et al., 1992; Herr et al., 1996; Zaremba et al., 1997) . Las CD pulsadas se lavaron y se utilizaron para estimular PBMC autólogo enriquecido con linfocitos T (linfocitos T) en placas de 24 cavidades a una proporción de 0.6 x 106 de CD pulsadas con 6 x 106 linfocitos T. Se agregaron al inicio del cultivo IL-2 (10 U/ml), IL-7 (5 ng/ml), IL-6 (1,000 U/ml), e IL-12 (10 ng/ml) y las células se alimentaron con IL-2 (10 U/ml adicionales) después de 4 días. Se realizaron activaciones primarias durante 10 a 12 días seguidas por 2 a 3 ciclos de re-es tumulación utilizando linfocitos B autólogos activados con ligandos CD40 pulsados con péptidos, generados como se describió anteriormente (Schultze et al., 1997) . Los análisis de células efectoras (análisis para escisión de caspasa 3, ELISPOT de IFN-?, CTL utilizando Annexin-V/7-AAD, y tinción con el pentámero de HLA) se realizaron 5 días después de la tercera o cuarta estimulación. En algunos casos, los linfocitos T activados se diluyeron qon PBMC autólogo que no había recibido tratamiento previo antes de los análisis, según se indica.

G. Análisis para escisión de caspasa 3 y metodología de tinción 1 . Marcación de codoci tos y pulsación con péptidos .

Los codocitos recolectados (P815, EL4, células de linfoma T2) se lavaron una vez con D-PBS. Las células se re-suspendieron a 5 x 106/ml en tampón de marcado que contenía DDAO-SE 0.6 µM (Soluciones de Ensayo Molecular, Eugenio, OR) en D-PBS y se incubaron a 37°C durante 15 min. Las células se lavaron en el medio de cultivo y se re-suspendieron en el medio de cultivo a 2 x 10d célula/ml y se pulsaron con los péptidos indicados a 1-3 µg/ml durante 1 h. Los blancos pulsados se lavaron una vez en el medio de cultivo y se re-suspendieron a 1 x 106 células /ml . 2. Preparación del análisis CTL y tinción con anti cuerpos . Los codocitos marcados con DDAO-SE se pulsados con el péptido (0.1 ml) se mezclaron con 0.1 ml de células efectoras (1 x 106 células/ml) en tubos para agrupación Costar cónicos de polipropileno (Costar, Corning, NY) . La mezcla celular se centrifugó a baja velocidad (200 rpm) durante 1 minuto. Las mezclas se incubaron a 37°C, 5% de C02 en una incubadora humidificada durante los lapsos de tiempo indicados (0.5 a 5 h) . Las células se lavaron con D-PBS, 1% de BSA a temperatura ambiente (RT) y ya sea se fijaron y permeabilizaron con solución Fix/Perm (BD Biosciences, Mississauga, ON) 20 min a RT inmediatamente .o se fijaron 1% de paraformaldehído durante 20 a RT y luego se almacenaron a 4°C durante hasta 24 h. Las células fijadas y almacenadas se sometieron a centrifugación y se re suspendieron en tampón Fix/Perm a RT durante 20 min. Las células luego se lavaron 2 veces con tampón de tinción (D- PBS, 1% de BSA, 0.1% de saponina) y se re- suspendieron en 0.1 ml de tampón de tinción. Las células se tiñeron durante 60 min sobre hielo con 15 µl de anticuerpos monoclonales con caspasa 3 anti- escindida marcada con biotina (BD Biosciences, Mississauga, ON) . Las células se lavaron en tampón de tinción y se cont ra-t iñeron con Strepavidin-PE (Sigma, St . , Louis, MO) durante 30 min. sobre hielo.

Las células se lavaron en tampón de tinción 2 veces y • se re-suspendieron en D-PBS, 1% de BSA para el análisis en un citómetro de flujo. 3 . Análisis ci tométri co de flujo . Las células teñidas se analizaron en un citómetro de flujo FACSCalibur (BD Biosciences, Mississauga, ON) . De 30 a 50 mil casos se recolectaron para cada muestra. Las células vivas y los codocitos se activaron utilizando los parámetros de dispersión directa y lateral seguida por la activación de la población de codocitos marcada con DDAO-SE sobre el canal de FL4 (véase también la Fig. IB) . La expresión de caspasa 3 escindida (canal FL2) luego se determinó utilizando los codocitos activaron con DDAO-SE en un diagrama de puntos FL4 contra FL2.

H. Análisis ELISPOT de IFN-? El análisis ELISPOT se realizó utilizando placas de filtro de 96 cavidades Millipore MultiScreen-HA (Millipore Cat No. MAHAS4510) . Las placas se recubrieron con 5 µg/ml de mAb anti-IFN-? en tampón de carbonato pH 9.5 (Sigma, St., Louis, MO) durante la noche a 4°C y se bloquearon con D-PBS, 2% de BSA. Se agregaron linfocitos T humanos o murinos ( 100 , 000/cavidad) , según se indica y se incubaron con péptidos relevantes o no relevantes durante la noche. Las placas se lavaron y se incubaron con el mAb anti-IFN-? marcado con biotina durante 1 h a RT . Las placas se lavaron y luego se trataron con 1:5,000 de dilución de fosfatasa con Extravidin-alcalina (Sigma) durante 1 h a R . Las placas se desarrollaron con substrato de BCIP/NBT (Sigma) hasta que todas las manchas estuvieron claramente visibles. Las placas desarrolladas se secaron y se contaron sobre un lector ELISPOT AID Versión 3.1.1 (Cell Technologies, USA) . Las células tratadas con PMA e Ionomicina (Sigma) se utilizaron como controles positivos en todos los experimentos.

I. Análisis para liberación de 51Cr Los codocitos (P815, P815-A2/Kb, EL4, y linfocitos T2) se marcaron con 100 µCi Na251Cr04 en medio de cultivo celular que contenía 10"% de FCS durante 45 min a 37°C. Las células se lavaron en el medio de cultivo y se pulsaron con los péptidos control específicos o no específicos (1 a 3 µg/ml) durante 1 h si el protocolo lo requiere. Las células pulsadas se lavaron una vez en el medio de cultivo y se re-suspendieron a 30,000 células/ml. Las células efectoras (MLR murino, células de bazo re-estimuladas con péptido, o líneas de linfocitos T humanos activados con péptidos) se agregaron a diferentes proporciones de E:T, según se indica en los resultados. En algunos experimentos, las células efectoras se diluyeron con linfocitos que no habían recibido tratamiento previo antes de la adición a diversas proporciones de E:T para el análisis para liberación de 51Cr. Después de 4 h de incubación, 25 µl del sobrenadante de análisis se colocaron en una Lumaplate de 96 cavidades (Packard) . Las placas se secaron y se contaron por radioactividad utilizando un contador de centelleo TopCount NXT v2.12 (Packard) . Los resultados se expresan como % de lisis específica calculado como (Liberación experimental - Liberación espontánea/Liberación total - liberación espontánea) x 100.

J. Tinción con el pentámero HLA Las líneas de linfocitos T humanos HLA-A*0201 péptido-especí fieos con gag de VIH ' y péptido-específico CAPÍ de CEA se tiñeron con el pentámeros del péptido HLA recombinante conjugado con PE (Prol mune, Oxford, UK) . Un pentámero de HLA~A*0201 que contenía la secuencia SLYNTVATL del gag de VIH (Prolmmune code 010) se utilizó para teñir las líneas VIH-especí ficas , mientras que un pentámero HLA-A*0201 que contenía el péptido YLSGANLNL de CEA (Prolmmune code 075) se utilizó para teñir la línea péptido-específica CAPÍ. En ambos casos, una línea de linfocitos T restringida con HLA-A*0201 que consistía de un porcentaje similar de linfocitos T' de CD8+ se utilizó como un control de tinción con pentámero no específico. Los linfocitos T se lavaron y se re- suspendieron a 2 x 106 célula/ml en tampón de tinción con pentámeros (PSB) que consistió de D-PBS, 0.1% de NaN3, 0.1% de BSA. Las células se tiñeron con 10 µl de Pro5MR durante 20 min a RT, se lavaron y luego se tiñeron en PSB con 5 µí de CD8-FITC anti-humano (BD Biosciences) durante 20 min a RT . Las células se lavaron en PSB y se fijaron en D-PBS, 1% de paraformaldehído y se hicieron circular a través de un analizador para citometría de flujo FACScalibur. Las células pent ámero-positivas se detectaron y se cuantificaron mediante una primera activación en células vivas utilizando discriminadores de difusión directa y difusión lateral y luego se analizaron en un diagrama de dos colores que muestra la fluorescencia de CD8+ en el eje x y la fluorescencia del pentámero+ en el eje y. Los resultados se muestran como % de células del pentámero para cada cultivo.

Ejemplo 2 A. Procedimiento de análisis y selección del tinte para rastreo de codocitos Uno de los primeros problemas que se resuelven es el problema de encontrar un tinte para rastreo de codocitos eficaz que no interfiriera con la señal de caspasa 3 durante el análisis FACS. Para aumentar al máximo la sensibilidad, se decidió utilizar una caspasa 3 anti-escindida primaria marcada con biotina seguida por una fluorescencia brillante para contra-tinción con Strepavidin-PE en el canal FL2. Como resultado, se buscó un tinte para rastreo celular no tóxico que tuviera fluorescencia en el canal de infrarrojo lejano (FL4) y que no requiriera ninguna compensación con el canal FL2. Se encontró que DDAO-SE (Soluciones de Análisis Molecular) reunió estos requisitos. Como se muestra en la Fig. 1A, se encontró que DDAO-SE tiñe reproducible y establemente una variedad de líneas celulares murinas y humanas durante hasta 15 h, incluyendo P815, EL-4, melanoma B16F10, cáncer de mama 4T1, linfoma T2 humano, y células COS, sin la inducción de escisión de caspasa 3 no específica. Utilizando codocitos teñidos con DDAO-SE, se probó primero el análisis para la escisión de caspasa 3 para medir la actividad CTL en las respuestas de linfocitos T alogeneicos murinos. Las respuestas de linfocitos mezclados de células de bazo C57BL/6 anti- Balb/c y Balb/c anti-C57BL/6 se probaron después de 5 días de cultivo en comparación con la liberación de 51Cr. Las células efectoras se mezclaron con codocitos (células P815 o EL-4) a diferentes proporciones y se incubaron durante diferentes intervalos de tiempo y se fijaron y se tiñeron con caspasa 3 anti-escindida. La Fig. IR muestra la estrategia de activación empleada para enumerar el porcentaje de codocitos con caspasa 3 escindida. En todos los experimentos se utilizó este procedimiento. Se utilizaron diagramas de difusión directa (FSC) y difusión lateral (SSC) para aislar la población de codocitos DDAO-SE+ vivos (canal FL4) como se muestra (R2 y R3 ) . Las activaciones R2 y R3 se combinaron y se utilizaron para determinar el porcentaje de blancos DDAO-SE+, escindidos con caspasa 3 (canal FL2) . Esta estrategia de activación aseguró únicamente los blancos vivos se tomaron en consideración. Con los experimentos con células efectoras MLR de C57BL/6 anti-Balb/c con blancos P815 (proporción 1:1 E:T) se encontró que la inducción de escisión de caspasa 3 fue específica para los blancos P815 de H-2d y no se detectó ninguna escisión marcada en los blancos EL4 de H-2b (Fig 2A! El transcurso de tiempo mostrado en la Fig. 2A y 2B también muestra que la señal de escisión de. caspasa 3 fue máxima después de 1 h de incubación en este caso. Se encontraron resultados similares cuando se probaron células efectoras MLR de Balb/c anti-C57BL/6 (Fig. 2B) . En resumen, el análisis para escisión de caspasa 3 exhibió la misma especificidad como lo fue al utilizar un análisis para liberación de 51Cr de 4-horas para medir la actividad CTL alo-especí fica en el MLR (datos no mostrados) . Con el fin de confirmar que la escisión de caspasa 3 en codocitos. dependió de los granulos citotóxicos secretados por CTL, se incubaron células efectoras MLR de C57BL/6 anti-Balb/c con Concanamicina A, utilizada como un inhibidor de desgranulación CTL en los análisis CTL, antes de mezclar con los blancos. Concanamicina A inhibió la aparición de la escisión de caspasa 3 en los codocitos P815 (Fig. 2C) . Se obtuvieron resultados similares con un análisis realizado utilizando el reactivo de la línea CTL humana contra el péptido CAPÍ proveniente del antígeno tumoral CEA (datos no mostrados) . Además, la inhibición de la actividad de caspasa 3 utilizando el inhibidor de caspasa, Z-DEVD-FMK, o un inhibidor de caspasa general, Z-VAD-FMK, no evitó la aparición de caspasa 3 escindida en los blancos P815 de C57BL/6 Anti-Balb/c MLR (datos no mostrados) . Conjuntamente, estos resultados indican que la escisión de caspasa 3 en codocitos depende de las granzimas secretadas por CTL y no se activa por la caspasa 3 activada endógenamente, u otras caspasas para escindir la caspasa 3 en el blanco durante el proceso de exterminio. El análisis para la escisión de caspasa 3 se comparó con el análisis para liberación de 51Cr en dos sistemas de análisis diferentes, el sistema MLR anti-Balb/c de C57B1/6 murino y en una respuesta a la vacunación con péptidos en ratones transgénicos HLA-A2.1/Kb (Fig. 3) . En el modelo MLR, el análisis para escisión de caspasa 3 mostró la misma especificidad y fiabilidad como el análisis para liberación de 51Cr. Sin embargo, fue notablemente más sensible siendo capaz de detectar la actividad CTL a las proporciones de E:T. por debajo de 5:1 (Fig. 3A) . Las células de bazo de ratones vacunados con un péptido antigénico de melanoma TRP2 humano también se probaron para la actividad CTL contra los codocitos pulsados con péptidos P815-A2/Kb (Fig. 3B) El análisis para escisión de caspasa 3 proporcionó resultados similares a la liberación de 51Cr cuando se probaron las células de bazo re-estimuladas con péptidos a una proporción E:T de 40:1 y 10:1. Nuevamente, como antes, el análisis mostró un grado significativamente mayor de sensibilidad con mayores proporciones de actividad CTL específica detectadas ' a la proporción E:T de 10:1 (Fig. 3B) .

B. Uso del análisis para escisión de caspasa 3 para supervisar las respuestas CTL contra las vacunas con vectores virales El análisis CTL para escisión de caspasa 3 se comparó con el análisis ELISPOT de IFN-? para medir las respuestas de anulación a CD8+ péptido-especí ficas gplOO después de inmunización de ratones transgénicos HLA-A2.1/Kb con 2 x 107 ufp ALVAC-gplOO. Los ratones se prepararon y se les administró un refuerzo, y las células de bazo se re-estimularon con 0.2 µg/ml de una mezcla de péptidos gplOO de unión con HLA-A2.1 durante 5 días y luego se sometieron a análisis de células efectoras utilizando ya sea escisión de caspasa 3 o ELISPOT de IFN-?. El análisis para escisión de caspasa 3 utilizó células gplOO marcadas con DDAO-SE o P815 pulsadas con péptido control transfectadas establemente con el plásmido HLA-A2.1/Kb. Se utilizó un procedimiento similar en los análisis ELISPOT, excepto que las células P815-A2/Kb no se marcaron con DDAO-SE (véase la sección de métodos) . Se utilizaron cinco ratones de replicación en cada análisis para probar la precisión de los resultados entre los animales individuales utilizando el análisis para escisión de caspasa 3 como una lectura.' La Fig. 4 muestra los resultados de dos experimentos por separado en comparación con la lectura para la escisión de caspasa 3 para las respuestas de linfocitos T a CD8+ con gplOO péptido-específico contra ELISPOT. Ambos análisis proporcionaron resultados comparables sin reactividad no específica en ratones inmunizados con un vector control ALVAC vacío. La difusión entre animales individuales fue una baja indicación de que la supervisión de las respuestas de linfocitos T a CD8+ utilizando la escisión de caspasa 3 en los blancos CTL puede medir con precisión las respuestas de linfocitos T a CD8+ antígeno-específicos después de la vacunación con alta precisión. Estos resultados indican que la medición de la escisión de caspasa 3 en codocitos CTL en sistemas murinos es un análisis alternativo viable para la liberación de 51Cr y tiene el mismo- grado de especificidad aunque es notablemente más sensible que la liberación de 51Cr. Además, la medición de la actividad CTL vía la escisión de caspasa 3 también se puede utilizar como un análisis funcional de apoyo para ELISPOT de IFN-? o como un análisis sustituto para el ELISPOT cuando están disponibles codocitos que expresan el antígeno o péptido blanco.

C. Análisis CTL para la escisión de caspasa 3 para supervisar las respuestas de linfocitos T humanos antígeno-específicos En un primer conjunto de estudios, se generaron líneas de linfocitos T humanos a partir de donadores HLA-A*0201+ contra un péptido rev de VIH nonáraero, , un péptido gag de VIH, o contra el péptido CAPÍ del antígeno CEA tumor-asociado. Todas las líneas de linfocitos T se generaron a partir de donadores normales, sin infección con VIH y sin cáncer mediante ciclos repetidos de estimulación y proliferación con péptidos con IL-2 e IL-7 como se señala en los métodos. Después del tercero o cuarto ciclo de estimulación, se obtuvieron rutinariamente líneas de linfocitos T que consisten de >85% de linfocitos T para TCRaß+, CD8+, CD16", CD56". Estos linfocitos T se probaron para la actividad de células efectoras utilizando la supervisión para escisión de caspasa 3. El análisis ELISPOT de IFN-? confirmó la presencia de linfocitos T péptido-especí fieos después del tercer y cuarto ciclo de estimulación. Éstos variaron de 1:100 a 1:250 para las líneas tanto péptido-especí ficas de VIH como las péptido- específicas de CEA (datos no mostrados) . La Fig. 5A muestra los resultados típicos del análisis para escisión de caspasa 3 para supervisar la actividad de linfocitos T humanos activados utilizando una línea de linfocitos T restringida con HLA-A2.1 específica para un péptido proveniente de rev de VIH. Los linfocitos T activados se mezclaron con blancos T2 pulsados a una proporción E:T d'é 5:1 ó 1:1 (Fig. 5A) . El análisis probó ser específico únicamente con nivel mínimo de escisión de caspasa 3 en los blancos T2 pulsados con un péptido de unión con HLA-A*0201 no específico proveniente del antígeno de CMV pp65. En la Fig. 5B, se compararon los resultados del análisis para escisión de caspasa 3 de tal forma que otro análisis CTL con base en FACS detecta la apoptosis en blancos utilizando tinción con Annexin-V y 7-AAD. (Fischer et al., 2002) con un equipo (BD Bisciences) utilizando líneas de linfocitos T específicos para el epítope CAPÍ HLA-A2.1 de CEA. Las líneas de linfocitos T (4a. estimulación) se diluyeron con PBMC autólogo que no había recibido tratamiento previo proveniente del donador a las proporciones indicadas y mezcladas con un número igual (100,000) de codocitos T2 pulsados con péptidos. Ambos análisis proporcionaron resultados comparables con una sensibilidad de nivel similar (Fig.5B) . Sin embargo, se observó en diversos experimentos que el análisis de Annexin-V + 7-AAD tuvo un antecedente no específico significativamente superior. Además, se encontró que no hubo variación considerable en el nivel de fluorescencia con Annexin V entre las muestras (datos no mostrados) . La Annexin V que se une a la fosfatidil serina es sensible Ca 2 + y ligeras alteraciones en la concentración de Ca 2 + pueden alterar el equilibrio de unión con Annexin-V. Esta variación de la fluorescencia con tinción no se encontró con la tinción para la escisión de caspasa 3. Además del antecedente inferior, el análisis para escisión de caspasa 3 exhibió un grado significativo de sensibilidad para el rastreo de la actividad CTL, como se muestra por la detección de la actividad CTL específica a la dilución 1:7 de células efectoras (Fig. 5B; escisión de caspasa 3) . También se determinó la frecuencia de los linfocitos T CAP1- específicos en la línea T utilizada en la Fig. 5B con el análisis ELISPOT de IFN-? (no mostrados) y se encontró una frecuencia de 1:237. Con base en estos resultados, se estimó que la frecuencia de linfocitos T CAPl-especí fieos a las diluciones de 1:3 y 1:7 en la Fig. 5B fue de 1:711 (0.14%) y 1:1659 (0.06%), respectivamente. Esto sugiere que el análisis es sensible y capaz de detectar linfocitos T CD8 + antí geno-específicos raros, especialmente contra TAA donde las frecuencias CTL pueden ser bastante bajas.

,D . Sensibilidad del análisis CTL con base en la escisión de caspasa 3 Para probar adicionalmente los límites de sensibilidad del análisis, se realizaron una serie de experimentos con células efectoras MLR de ratón y líneas de linfocitos T humanos péptido-especí fieos activados en los cuales las células efectoras se diluyeron hasta 1:199 con células de bazo singeneicas que no habían recibido tratamiento previo o con PBMC autólogo que no había recibido tratamiento previo, respectivamente . El primer experimento se realizó con células efectoras MLR de C57BL/6 Anti-Balb/c diluidas después de recolectar el MLR a 1:0 (sin dilución) a 1:199 con esplenocitos C57BL/6 singeneicos que no han recibido tratamiento previo (Fig. 6) . Las efectoras diluidas se incubaron con células P815 marcadas con DDAO-SE-a una proporción de 1:1. Los codocitos solos, y esplenocitos que no han recibido tratamiento previo sirvieron como los controles negativos para la actividad CTL y los blancos EL-4 marcados con DDAO-SE sirvieron como los controles de especificidad. La escisión de caspasa 3 exhibió un alto grado de sensibilidad, como se muestra por la presencia de la escisión caspasa 3 significativa incluso cuando las células efectoras MLR se diluyeron a una proporción de 1:199 con los esplenocitos que no han recibido tratamiento previo (Fig. 6) . Se observó un nivel insignificante de la escisión de caspasa 3 en todas las diluciones en los blancos EL4 no específicos (Fig. 6) . El porcentaje de esplenocitos CD8+ alo-reactivos en un MLR murino típico se ha encontrado que es tan alto como 1:10. Así, suponiendo que esta frecuencia de efectoras anti-Balb/c estuvo presente en el MLR, a la dilución de 1:199 con esplenocitos que no han recibido tratamiento previo el análisis pudo detectar la actividad CTL a una frecuencia 1:2,000 (0.05%) de células efectoras. Este experimento se repitió al menos 3 veces con resultados similares. Se realizó un experimento de dilución similar con líneas de linfocitos T restringidos .con HLA-A*0201 humano péptido-especí fico de VIH después de 3 a 4 ciclos de estimulación de una mezcla de PBMC que no había recibido tratamiento previo (Fig. 7) . En el experimento mostrado en la Fig. 9A, el análisis ELISPOT de IFN-? estimó que la frecuencia de los linfocitos T péptido-específicos de VIH en los cultivos fue de 1:156 (0.64%) después de 3 estimulaciones. Éstos cultivos de linfocitos T se diluyeron con PBMC autólogo que no había recibido tratamiento previo a una proporción de 1:0 a 1:199. Como antes, los codocitos del linfoma T2 marcados con DDAO-SE solo y con PBMC que no había recibido tratamiento previo menos los linfocitos T activados incubados con los blancos T2 pulsados con el péptido de VIH se utilizaron como controles negativos, mientras que los linfocitos T2 pulsados con el péptido pp65 CMV de unión con HLA-A*0201 se utilizaron como un control para especificidad. Como se muestra en las Fig. 7B y 9B, la medición de la escisión de caspasa 3 fue notablemente sensible para detectar la actividad significativa a diluciones de células efectoras tan bajas como 1:99 y 1:199. Una proporción de escisión de caspasa 3 del 5.7% y 6% se observó a 1:99 y 1:199, respectivamente, en los linfocitos T2 pulsados con el péptido de VIH, mientras que se observó una escisión de caspasa 3 de sólo el 2.1% y 2.2% en los blancos 'pulsados con el péptido CMV de p?65 no específico. Este bajo porcentaje de células escindidas con caspasa 3 con el péptido CMV no aumentó a medida que disminuyó 'la dilución de células efectoras. El porcentaje de escisión de caspasa 3 en los blancos menos las efectoras y con PBMC que no ha recibido tratamiento previo más los blancos fue menor al 2%- (Fig. 7B) . Al .igual que una prueba adicional de la sensibilidad del análisis, también se tiñeron líneas de linfocitos T gag-especí fieos de VIH con un pentámero del péptido HLA (Prolmmune, Oxford, UK) que tiñó directamente el TCR de los linfocitos T antígeno-específicos (Fig. 7C) . La Fig. 7C muestra los resultados de la tinción con pentámeros en los mismos linfocitos T utilizados en el análisis para escisión de caspasa 3 mostrado en la Fig. 7B. Este análisis reveló que el análisis para escisión de caspasa 3 tuvo un nivel comparable de sensibilidad como la tinción con el pentámero HLA. La frecuencia de linfocitos T péptido-específicos gag de VIH en el análisis para escisión de caspasa 3 (Fig. 7B) , con base en la frecuencia ELISPOT de IFN-?, fue 1:15,444 (0.007%) y 1:31,044 (0.003%) para las diluciones de 1:99 y 1:199 de las efectoras, respectivamente. Esto representa un alto nivel de sensibilidad haciendo que el análisis sea útil para cuantificar la actividad CTL cuando las frecuencias de linfocitos T antígeno-especí fieos son considerablemente bajas. Además, los métodos con base en pentámeros o tetrámeros diferentes, son una medida de la función de 'linfocitos T y no sólo la frecuencia del linfocitos T.

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Claims (8)

1. REIVINDICACIONES 1. Un método para detectar la actividad citotóxica de una población de células efectoras inmunológicas contra una población de codocitos, el método comprende los pasos de, en combinación: a) exponer una población de células efectoras inmunológicas a una población de codocitos; b) incubar las células durante un periodo de tiempo suficiente y bajo condiciones adecuadas para que una célula efectora inmunológica afecte al codocito de tal forma que se active una trayectoria apoptótica en el codocito; c) fijar y permeabilizar la población mezclada de células; d) exponer la población mezclada de células a un reactivo detectable que tenga la capacidad de unir una proteína o un fragmento de la misma para que experimente un cambio durante o como resultado del proceso apoptótico; y, . e) detectar el reactivo detectable.
2. 2. El método según la reivindicación 1, en donde las células efectoras inmunológicas son linfocitos T.
3. 3. El método según la reivindicación 1, en donde los codocitos son células infectadas viralmente o células tumorales.
4. 4. El método según la reivindicación 1, en donde la proteína del paso d) es una caspasa.
5. 5. El método según la reivindicación 4, en donde la caspasa es la caspasa-3.
6. 6. El método según la reivindicación 1, en donde ei reactivo detectable es un anticuerpo.
7. 7. El método según la reivindicación 1, en donde el reactivo detectable es un anticuerpo marcado fluorescentemente .
8. 8. El método según la reivindicación 1, en donde la detección del paso e) se lleva a cabo utilizando un citómetro de flujo.