CN101065669A

CN101065669A - 细胞毒性测定法

Info

Publication number: CN101065669A
Application number: CNA200580002955XA
Authority: CN
Inventors: P·邓; L·何; L·拉德万伊; D·萨尔哈
Original assignee: Sanofi Pasteur Inc
Current assignee: Sanofi Pasteur Inc
Priority date: 2004-01-23
Filing date: 2005-01-21
Publication date: 2007-10-31
Also published as: AU2005224597A1; EP1706744A2; CA2559394A1; JP2007522447A; ZA200605715B; WO2005090990A2; KR20070001930A; IL176938A0; WO2005090990A3; MXPA06008336A; BRPI0506488A

Abstract

本发明涉及用流式细胞仪检测细胞毒性相关酶的切割来检测CTL活性的方法。

Description

细胞毒性测定法

发明领域

本发明涉及用流式细胞术检测细胞毒性相关酶的切割来检测CTL活性的方法。

发明背景

30多年来，⁵¹Cr释放测定法是测量免疫应答期间CTL活性的金标准。然而，该测定法有许多技术局限，并且最近的数据对于⁵¹Cr释放测定法的生理学相关性和它是否是针对体内靶细胞，特别是实体瘤中靶细胞测量的CTL活性的真实测量产生了质疑。体外CTL测定法中靶细胞的裂解可以通过两种不同的机制诱导：1)当穿孔素简单地插入到靶细胞膜时介导的细胞膜破裂；和2)由粒酶B和粒酶A通过穿孔素进入靶细胞的作用和/或靶细胞表面的小泡融合事件诱导的DNA断裂(细胞凋亡)。⁵¹Cr释放测定法测量这两种读出的第一种。后一种机制具有更大生理学相关性并且对于靶细胞杀死是体内所需的。最近的观察表明通过⁵¹Cr释放测定法对效应细胞细胞毒性的测量可能不准确或者在一些情况中，甚至是不相关的。基于这些观察，研究人员必须认识到基于⁵¹Cr释放测定法测定为细胞毒性的效应细胞可能实际上不是能够通过体内DNA断裂杀死肿瘤细胞的CTL。这可以解释癌症免疫治疗文献中的许多结果，其中体外监控的效应细胞应答可能不与患者中疫苗功效相关。例如，使用⁵¹Cr释放测定法通过产生的阳性效应细胞细胞毒性日期选择的肽疫苗可能不能准确地反映通过DNA断裂在体内诱导CTL裂解中有活性的实际表位。此外，在基于⁵¹Cr的测定的使用中存在许多其他问题，包括需要使用有害的放射性，和与闪烁计数器使用有关的问题。

JAM测定法是较新的方法，其解决了⁵¹Cr-释放的一些问题。尽管它有效测量DNA断裂，但是它存在严重的局限，因为需要用诸如³H-胸苷或者¹²⁵I-脱氧尿苷标记靶细胞的DNA。该方法总是在CTL测定前导致DNA损伤和靶细胞的生理改变。此外，³H-胸苷标记方法不提供与⁵¹Cr相同程度的灵敏性，并且¹²⁵I是危险的试剂，需要对实验室工作人员和实验室区域的相当大的铅屏。总之，在CTL攻击期间测量靶细胞中细胞凋亡诱导和DNA断裂的非放射性方法将是更理想的测定法，特别当预计该方法用于临床试验监控时。

用荧光天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶底物检测天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶切割也已经用于证明细胞毒性T细胞活性(Liu，等人，Visualization and quantification of T cell-mediated cytotoxicityusing cell-permeable fluorogenic caspase substrates.Nature Medicine，Jan.2003，9(1)：4-5.)。此外，已经介绍了用于计数抗原特异的CD8⁺T细胞的其他高度灵敏的方法，如细胞内细胞因子染色、ELISPOT测定和用I类MHC四聚体对T细胞染色。然而，这些测定法不测量最终的细胞溶解功能，其在分析抗肿瘤免疫应答中特别重要。缺少提供适宜水平的灵敏性、特异性、安全性和易于使用性的测定法。本文提供了用于检测CTL活性的新的且灵敏的测定系统。

发明概述

本发明提供了细胞毒性测定法，其检测靶细胞与效应细胞接触后靶细胞中DNA断裂和/或细胞凋亡相关的改变。在一个实施方案中，用检测天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶的切割或者组蛋白的磷酸化的一种或多种试剂进行测定。在优选实施方案中，用单克隆抗体检测天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶的切割。在另一优选实施方案中，用单克隆抗体检测组蛋白的磷酸化。在其他实施方案中，用至少一种单克隆抗体偶联流式细胞术分析检测切割的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶和/或磷酸化的组蛋白。

附图简述

图1.靶细胞标记染料的稳定性和开发用来使用天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3-切割监控靶细胞中CTL活性的门控(gating)策略。A.DDAO-SE细胞示踪染料明亮并且稳定地标记CTL靶细胞系。所示为许多常用的悬浮培养的和贴壁细胞系的染色，这些细胞系为：P815、EL4、T2淋巴瘤、NIH 3T3、4T1乳腺癌和B16F10黑素瘤。将细胞用DDAO-SE染色并温育所指出的时间间隔(0、1、3或15小时)，并通过FACS分析。显示了每种细胞系的平均荧光强度和变异系数(CV)。显示了两个相似实验中的一个的结果。B.用于计数DDAO-SE标记的靶中天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3-切割的门控策略。显示了具有C57BL/6抗-Balb/e MLR细胞的DDAO-SE标记的P815细胞的实例。第一个图显示了对整个群体(R1)进行门控时的FSC相对于SSC。然后用SSC和FSC相对于FL4荧光(DDAO-SE阳性)分析门控R1细胞。如所示的门控了DDAO-SE阳性细胞(R2和R3)，其中低FSC(死亡)细胞除外。然后用FL2(PE标记的切割的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3)相对于FL4(DDAO-SE)分析R2*R3细胞以测定细胞凋亡的靶(R4)的百分数。

图2.用天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3切割测定法测量鼠MLR中CTL活性和靶中天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3切割对CTL的穿孔素和粒酶分泌的依赖。将C57BL/6抗-Balb/c或Balb/c抗-C57BL/6MLR效应细胞与标记的P815靶(A)温育不同的时间间隔(0.5、1、2和3小时)，然后如所示的对天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3切割染色。仅用抗Balb/c MLR效应子发现了天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3切割。B.将用DDAO-SE标记的P815或者EL4靶与C57BL/6抗-Balb/c或Balb/c抗-C57BL/6MLR效应子温育如所示的不同时间间隔。显示了天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3切割的靶细胞的百分数。结果表明该测定法的特异性，其中MLR效应子仅杀死H-2不匹配的靶。结果代表具有相似结果的三次实验。C.刀球肮霉素A——CTL的细胞溶解颗粒分泌的抑制剂——防止与C57BL/6抗-Balb/c MLR效应细胞温育的P815靶中的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3切割。将5天的MLR培养物分离并用首次用于实验的同基因C57BL/6脾淋巴细胞以1∶1、1∶3、1∶9稀释或者不稀释，如所示。将稀释的效应子与经标记的P815细胞温育。对照是不用MLR细胞的首次用于实验的C57BL/6脾细胞或者仅标记的P815细胞。3小时后对天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3-切割将测定染色。

图3.天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3切割测定法和⁵¹Cr释放用于监控CTL活性的比较，其中使用在小鼠中基于肽的疫苗反应后分离的鼠MLR效应子和CTL。A.将来自鼠MLR(b→d)的效应细胞与100,000个P815或者EL4靶细胞(对照)在4小时的测定中以所示的E∶T比率进行温育。对于⁵¹Cr释放测定，我们以16∶1稀度开始并稀释到0.2∶1，而天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3测定法以1∶1到0.1∶1E∶T比率进行测试。显示了两个相似实验之一的结果。B.对于监控来自肽免疫的小鼠的回忆应答，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3切割测定法与⁵¹Cr释放测定同样可靠和特异。用黑素瘤TRP2肽免疫小鼠并以所指出的E∶T比率进行测试。

图4.小鼠中基于病毒载体的接种后，用天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3-切割CTL测定法监控CD8⁺T细胞应答产生了与IFN-γELISPOT分析相当的结果。用ALVAC-gp100免疫HLA-A2.1/K^b转基因小鼠并用gp100肽库再次刺激脾细胞5天。分离存活细胞，并以每孔100,000个细胞以20∶1 E∶T比率用天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3切割测定测试CTL活性(左图)，或者在ELISPOT测定法中测试IFN-γ产生(右图)。靶是用gp100肽或者对照A2结合的CMV pp65肽脉冲的P815-A2/K^b转染子。显示了两次独立实验的结果。点代表从单个接种的小鼠得到的结果。

图5.用天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3-切割测定法监控抗原特异的人CD8⁺T细胞应答。用如所述的肽脉冲的自体DC和活化的B细胞从HLA-A*0201⁺供体的PBMC产生原代肽-特异的人T细胞系。T细胞在测试CTL活性前经历四轮肽特异的刺激。A.对外来抗原特异的(HIV rev肽)T细胞系应用天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3-切割测定法。收获T细胞并将其与DDAO-SE-标记的T2淋巴瘤靶进行温育，所述靶已经用HIV rev或者CMV pp65肽脉冲，或者不用肽脉冲。将T细胞用首次用于实验的自体PBMC以1∶1或者1∶5比率稀释后与100,000个脉冲的靶以1∶1比率混合。如所示，将细胞温育1或3小时，并对切割的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3染色。仅靶细胞(“仅T”)也用作对照。显示了3次相似实验之一的结果。B.用天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3切割或者膜联蛋白V加上7-AAD染色测定法在自身抗原特异的(CEA CAP1肽)人T细胞系中测量的CTL活性。将效应细胞以所指出的比率用首次用于实验的自体PBMC稀释后与用CAP1特异肽或者非特异CMV pp65肽脉冲的肽脉冲的T2细胞混合。仅靶细胞(“仅T”)和来自供体的首次用于实验的PBMC用作负对照。显示了3小时温育的结果。1或者4小时温育后的得到类似结果(未显示)。显示了两次相似实验之一的结果。

图6.天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3切割是用于监控鼠CTL活性的高度灵敏的测定法。从b→d MLR收获脾细胞并将其与DDAO-SE-标记的P815靶细胞温育。将MLR效应细胞用首次用于实验的同基因脾细胞以所指示的比率稀释后与P815靶以1∶1的比率混合。测定中有10万个稀释的效应细胞和100,000个靶细胞。上图(A)显示了在MLR效应细胞的不同稀度下FACS分析后DDAO-SE对天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3切割的点图。与靶细胞混合的首次用于实验的B6脾细胞显示为负对照。B.两次独立实验的结果，显示了所指示的b→d MLR效应细胞稀度下的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3切割。将效应子和P815靶细胞温育2或4小时后对切割的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3染色。

图7.天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3切割是用于监控人CD8⁺T细胞活性的高度灵敏的测定法，与用HLA-肽五聚体进行TCR染色有相似水平的灵敏性。如以前产生HLA-A*0201-限制的HIV gag肽特异的人T细胞系并测试CTL活性。将T细胞用首次用于实验的自体PBMC以所指示的比率稀释后以1∶1的比率加入HIV或者CMV(特异性对照)肽脉冲的T2靶细胞。仅靶或者没有效应细胞的首次用于实验的PBMC用作负对照。A.点图显示了当高度稀释的HIV gag肽-特异的T细胞与用HIV gag肽或者非特异CMV pp65肽脉冲的T2细胞温育时的代表性结果。甚至在1∶199的稀度下也常规地检测到天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶切割百分数的显著差异。B.条形图，其显示了三次独立实验的平均值和标准差，所述实验测试天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3切割测定法以测量用如所示的首次用于实验的PBMC稀释的HIV gag肽特异的T细胞系中的CTL活性。在每种情况中，将150,000个稀释的效应子与150,000个DDAO-SE-标记的肽脉冲的靶进行温育。作为比较，将相同的T细胞用HLA-gag肽五聚体(ProImmune，Oxford，英国)平行地染色(C)。CMV pp65肽特异的T细胞系用作特异性对照。为了比较五聚体测定法与天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3切割测定法，为每个数据点收集150,000个门控的T细胞(向CTL测定中加入相同量的效应细胞)。

详述

本发明涉及用于进行细胞毒性测定的试剂和测定法。所述测定法适于检测免疫效应细胞介导的细胞毒性，所述免疫效应细胞包括但不限于T细胞、自然杀伤(NK)细胞、粒细胞、单核细胞、巨噬细胞等等。所述测定法一般基于靶细胞中DNA断裂和/或细胞凋亡相关的改变。例如，在某些实施方案中，检测到参与细胞凋亡过程的酶的切割。在另一实施方案中，检测到细胞凋亡过程期间DNA相关的蛋白质的特征的改变。此类改变适于用测量细胞荧光的装置，如荧光激活细胞分选仪(FACS)或者流式细胞仪检测。

在一个实施方案中，本发明涉及用于测量细胞凋亡过程期间一种或多种天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶的切割的测定法。在细胞凋亡中起作用并且可以适于此处所示测定法中检测的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶包括但不限于天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13和14。在一个实施方案中，用本文描述的测定法检测天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3。已知在细胞凋亡过程中切割的另一种酶是多腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)。天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶，尤其天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3和PARP的切割是细胞凋亡期间的早期事件并且在CTL靶中触发。除了天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶和PARP的切割，在细胞凋亡的诱导期间许多细胞内底物被磷酸化。例如，在多种细胞谱系中组蛋白H2A.X被磷酸化。对切割的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶有特异结合能力的抗体，以及对磷酸化的组蛋白H2.AX特异的抗体可通过商业途径获得并且适于用于本发明的实践中。

在某些实施方案中，在与效应细胞接触前用染料将靶细胞染色。适宜的染料包括Vial T、CFSE和DDAO-SE，每种都是本领域已知的。优选的染料是DDAO-SE(Molecular Probes)。其他适宜的染料也是本领域已知的并且可用于实践本发明。

在一个实施方案中，通过如下步骤进行本发明提供的测定法：1)制备效应细胞(E)；2)制备靶细胞(T)，包括用可检测的标记，如荧光染料标记细胞；3)将效应细胞和靶细胞以足够的E∶T比率混合；4)以足够的时间段并在适于至少一些效应细胞对至少一些靶细胞变得有细胞毒性的条件下对混合物进行温育；5)固定并透化混合的细胞；6)用可检测的试剂对细胞染色，所述试剂能够结合蛋白质或者其片段，所述蛋白质或其片段在细胞凋亡过程期间经历改变或者经历细胞凋亡过程导致的改变；和7)检测所述可检测的试剂。在一些实施方案中，通过试剂中含有的荧光标记或者部分或者通过检测结合可检测的试剂的第二种试剂可以检测所述可检测的试剂，其中所述第二种试剂可以通过该第二种试剂中含有的荧光标记或者部分检测。在优选实施方案中，所述可检测的试剂和/或第二种试剂是抗体，其可以是荧光标记的。可以通过几种公知方法的任一种检测可检测的试剂，所述方法包括但不限于FACS。在一个优选实施方案中，可检测的试剂是抗-天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3抗体(如PE缀合的单克隆兔抗活性天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3抗体(PE ConjugatedMonoclonal Rabbit Anti-Active Caspase 3Antibody)，BD PharmingenCatalog No.550914)。其他适宜的试剂是本领域已知的。

在一些实施方案中，有利地或者希望在对靶细胞染色和/或混合靶和效应细胞前用效应细胞可能应答的肽接触或者“脉冲”靶细胞。例如，可以用对应于传染物如HIV或者肿瘤抗原的氨基酸序列的肽脉冲靶细胞。其中，适宜的肿瘤抗原包括，例如，gp100(Cox等人，Science，264：716-719(1994))、MART-1/Melan A(Kawakami等人，J.Exp.Med.，180：347-352(1994))、gp75(TRP-1)(Wang等人，J.Exp.Med.，186：1131-1140(1996))、酪氨酸酶(Wolfel等人，Eur.J.Immunol.，24：759-764(1994))、NY-ESO-1(WO 98/14464；WO99/18206)、黑素瘤蛋白聚糖(Hellstrom等人，J.Immunol.，130：1467-1472(1983))、MAGE家族抗原(即，MAGE-1、2、3、4、6和12；Van der Bruggen等人，Science，254：1643-1647(1991)；美国专利号6,235,525)、BAGE家族抗原(Boel等人，Immunity，2：167-175(1995))、GAGE家族抗原(即，GAGE-1，2；Van den Eynde等人，J.Exp.Med.，182：689-698(1995)；美国专利号6,013,765)、RAGE家族抗原(即，RAGE-1；Gaugler等人，Immunogenetics，44：323-330(1996)；美国专利号5,939,526)、N-乙酰葡糖胺转移酶-V(Guilloux等人，J.Exp.Med.，183：1173-1183(1996))、p15(Robbins等人，J.Immunol.154：5944-5950(1995))、β-连环蛋白(Robbins等人，J.Exp.Med.，183：1185-1192(1996))、MUM-1(Coulie等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92：7976-7980(1995))、依赖细胞周期蛋白的激酶-4(CDK4)(Wolfel等人，Science，269：1281-1284(1995))、p21-ras(Fossum等人，Int.J.Cancer，56：40-45(1994))、BCR-abl(Bocchia等人，Blood，85：2680-2684(1995))、p53(Theobald等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92：11993-11997(1995))、p185 HER2/neu(erb-B1；Fisk等人，J.Exp.Med.，181：2109-2117(1995))、表皮生长因子受体(EGFR)(Harris等人，Breast Cancer Res.Treat，29：1-2(1994))、癌胚抗原(CEA)(Kwong等人，J.Natl.Cancer Inst.，85：982-990(1995)美国专利号5,756,103；5,274,087；5,571,710；6,071,716；5,698,530；6,045,802；EP 263933；EP 346710；和EP 784483)；癌相关的突变的粘蛋白(即，MUC-1基因产物；Jerome等人，J.Immunol.，151：1654-1662(1993))；EBV的EBNA基因产物(即，EBNA-1；Rickinson等人，Cancer Surveys，13：53-80(1992))；人乳头瘤病毒的E7、E6蛋白(Ressing等人，J.Immunol，154：5934-5943(1995))；前列腺特异抗原(PSA；Xue等人，The Prostate，30：73-78(1997))；前列腺特异膜抗原(PSMA；Israeli，等人，Cancer Res.，54：1807-1811(1994))；独特型表位或者抗原，例如，免疫球蛋白独特型或者T细胞受体独特型(Chen等人，J.Immunol.，153：4775-4787(1994))；KSA(美国专利号5,348,887)、驱动蛋白2(Dietz，等人，Biochem Biophys Res Commun2000Sep 7；275(3)：731-8)、HIP-55、TGF β-1抗细胞凋亡因子(Toomey，等人，Br J Biomed Sci 2001；58(3)：177-83)、肿瘤蛋白质D52(BryneJ.A.，等人，Genomics，35：523-532(1996))、H1FT、NY-BR-1(WO01/47959)、NY-BR-62、NY-BR-75、NY-BR-85、NY-BR-87和NY-BR-96(Scanlan，M.Serologic and Bioinformatic Approches to theIdentification of Human Tumor Antigens，in Cancer Vaccines 2000，Cancer Research Institute，New York，NY)，包括其野生型、修饰的、突变的形式。

在一些实施方案中，靶细胞和效应细胞温育的时间可以改变。例如，可以希望在进一步分析前将混合物温育1、2、3、4、5、6小时或者更长时间。

本发明的其他方面包括用于实施本文描述的测定法的试剂盒。试剂盒可以包括用于制备效应细胞的材料、适宜数目的效应细胞、用于染色靶细胞的荧光染料、装置(如96孔板，在该装置中靶细胞和效应细胞可以混合并温育)、固定和透化细胞所需的材料、可检测的试剂和/或第二种试剂。此类材料的不同组合可以组织为试剂盒以便帮助技术人员实施本发明的测定法。

根据下面用于阐明的实施例可以更好地理解本发明和其许多优点。

实施例

实施例1

材料和方法

A.试剂和细胞培养基

抗-切割的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3(对人和小鼠蛋白质都反应)用藻红蛋白(PE)标记并且购自BD Biosciences(Mississauga，ON)。抗-磷酸-组蛋白H2A.X-FITC购自Upstate Cell SignalingSolutions(Lake Placid，NY)。细胞示踪染料DDAO-SE购自MolecularProbes(Eugene，OR)。所有细胞培养基都购自InVitrogen(Mississauga，ON)。细胞因子(IL-2、IL-2、IL-12和IL-6)购自R&D Systems(Minneapolis，MN)。用于人和小鼠IFN-γELISPOT分析的抗-IFN-γ抗体对分别购自MabTech(Amsterdam，NL)和BD Biosciences(Mississauga，ON)。⁵¹Cr(⁵¹铬酸钠)来自Amersham(Toronto，Ontario)。实验中使用下面的HLA-A2.1-结合性的和鼠H-2K^b-结合性的肽：ILKEPVHGV(HIV rev)、SLYNTVATL(HIV gag)、YLSGANLNL(CEA肿瘤抗原CAP1表位)、IMDQVPVSV、YLEPGPVTV、KTWGQYWQV(gap100黑素瘤表位)、NLVPMVATV(CMV pp65表位)、DAPIYTNV(β-半乳糖苷酶H-2K^b表位)、TPHPARIGL((β-半乳糖苷酶H-2L^d)和TLDSQVMSL(TRP-2黑素瘤表位)。在396Multiple Biomolecular Synthesizer(AdvancedChemtech，Louisville，KY)中合成肽并通过HPLC纯化。在鸡胚成纤维细胞(CEF)中增殖ALVAC-gal和ALVAC-gp100并在蔗糖垫(cushion)上通过离心从裂解的细胞进行纯化，如前所述(Ferrari等人，1997)。如前所述(Santra等人，2002)，在CEF中测定病毒效价，其以蚀斑形成单位(pfu)表示。

B.小鼠

Balb/c和C57BL/6小鼠购自Charles River(Montreal，QC)。如所描述的产生HLA-A2.1/K^b转基因小鼠(Borenstein等人，2000)。所有小鼠都在Aventis Pasteur(Sunnybrook Campus，Toronto，ON)的动物资源部(Animal Resources Department)于无特殊病原体(SPF)条件下在微型隔离器(micro-isolator)笼中按照Canadian Council on AnimalCare(CACC)的准则喂养。

C.人PBMC制剂

用Ficoll-Hypaque梯度离心(Sigma，St.Louis，MO)从白细胞提取法(leukopherisis)供体得到人PBMC。在Sunnybrook和妇女健康科学中心(Women′s Health Sciences Center)(Toronto，ON)根据规定的IRB准则在得到完全供体同意的情况下收集所有血液产品。用DNA测序对供体预筛选HLA-A*0201并且仅将阳性个体进行白细胞提取法采集。

D.鼠MLR和效应细胞和靶细胞的制备

在小鼠细胞培养基(α-MEM，10％FCS，50μM巯基乙醇、1mMGlutamax，青霉素-链霉素)从C57BL/6或Balb/c小鼠收获脾脏并用细菌分离器(Stomacher 80Biomaster，英国)制备细胞悬浮液。将细胞悬浮液通过70μm孔径的滤过器(BD Biosciences)过滤。洗涤细胞并将其重悬浮在培养基中。将刺激细胞以2000拉德(Gammacell^1000Elite，MDS Nordion)辐射并用培养基洗涤一次并以10×10⁶个细胞/ml重悬浮在培养基中。将应答细胞(20×10⁶个细胞)和辐射的刺激细胞(20×10⁶个细胞)置于垂直的T-25瓶，总计20ml。将培养物温育5天并在Lympholyte-M(Cedarlane Labs，加拿大)上以100×g离心20分钟来收获活细胞。用培养基以1.5×10⁶个/ml洗涤细胞。

E.小鼠免疫研究和体外T-细胞再刺激

用连接来自人Period 1基因的胞转肽的结合黑素瘤H-2^b的TRP-2肿瘤抗原肽进行肽免疫。该序列诱导APC中TRP-2序列的摄入并且诱导强的抗肽CTL应答。将C57BL/6小鼠用50μg TRP-2肽皮下免疫并在3周后加强。加强后3周收获脾脏并用TRP-2肽再刺激脾细胞5天，然后用⁵¹Cr释放测定法或者用天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3-切割测定法进行CTL测定。在HLA-A2.1/K^b转基因小鼠中皮下用金丝雀痘病毒载体(ALVAC-gp100)进行免疫(Borenstein等人，2000)。用2×10⁷pfu ALVAC-gp100免疫小鼠然后在2周后用相同剂量加强。加强后5周和7周收获脾细胞并用显性HLA-A2.1-结合性gp100肽库(IMDQVPVSV、YLEPGPVTV和KTWGQYWQV)以0.2μg/ml/肽再次刺激(5×10⁶个细胞/ml，24孔板中)5天。收获细胞并用IFN-γELISPOT或者天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3-切割测定法进行分析。用100,000个再活化的脾细胞与10,000个gp100肽脉冲的(2μg/ml)、用HLA-A2/K^b表达质粒稳定转染的P815(P815-A2/K^b细胞系)混合进行ELISPOT分析。

F.产生人肽特异的T细胞

用人T细胞培养基(HTC-CM)中的肽脉冲的自体成熟树突细胞(DC)刺激T-细胞富集的PBMC(PBMC的塑料粘附的阴性级分)，所述培养基组成为Iscove氏修饰的Dulbecco氏培养基、1mM Glutamax、1mM丙酮酸(Invitrogen，Mississauga，ON)、5％人AB血清、50μM2-巯基乙醇，20μg/ml庆大霉素。用含有2％人AB血清、1,000U/mlGM-CSF、1,000U/ml IL-4、4ng/ml TNF-α和100U IFN-α的HTC-CM，以一步方案在6天内从贴壁单核细胞产生成熟DC。收获DC，洗涤并用10μg/ml肽脉冲。下面的HLA-A2.1-结合性的九聚体肽用于T-细胞产生：HIV rev肽(ILKEPVHGV)、HIV gag肽(SLYNTVATL)和来自CEA肿瘤抗原的CAP1表位(YLSGANLNL)。以前已经证明这些肽结合HLA-A2.1并引起HLA-A2.1-限制的CD8⁺T-细胞应答(Stuber等人，1992；Herr等人，1996；Zaremba等人，1997)。洗涤脉冲的DC并将其用于刺激24孔板中的富含T-细胞的自体PBMC(T细胞)，其中使用0.6×10⁶个脉冲的DC与6×10⁶个T细胞的比率。培养开始时加入IL-2(10U/ml)、IL-7(5ng/ml)、IL-6(1,000U/ml)和IL-12(10ng/ml)并且4天后用IL-2(额外的10U/ml)喂饲细胞。用以前描述的(Schultze等人，1997)产生的肽脉冲的CD40配体活化的自体B淋巴细胞再次刺激2到3轮后，进行10到12天的初次活化。第三或第四轮刺激后5天进行效应细胞测定(天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3-切割、IFN-γELISPOT、使用膜联蛋白-V/7-AAD的CTL测定和HLA五聚体染色)。在一些情况中，测定前，按照说明用首次用于实验的自体PBMC稀释活化的T细胞。

G.天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3-切割测定法和染色方法

1.靶细胞标记和肽脉冲

将收获的靶细胞(P815，EL4，T2淋巴瘤细胞)用D-PBS洗涤一次。将细胞以5×10⁶个/ml重悬浮在含有溶于D-PBS中的0.6μMDDAO-SE(Molecular Probes，Eugene，OR)的标记缓冲液中并在37℃下温育15分钟。在培养基中洗涤细胞并将其以2×10⁶个细胞/ml重悬浮在培养基中并用1-3μg/ml的所示的肽脉冲1小时。在培养基中洗涤经脉冲的靶一次并以1×10⁶个细胞/ml重悬浮。

2.CTL测定法设置和抗体染色

将用肽脉冲的DDAO-SE-标记的靶细胞(O.1ml)与O.1ml效应细胞(1×10⁶个细胞/ml)在锥形聚丙烯Costar cluster管(Costar，Coming，NY)中混合。低速(200rpm)离心细胞混合物1分钟。将混合物在37℃，5％CO₂下在湿润培养箱中温育所示的时间段(0.5到5小时)。将细胞用D-PBS，1％BSA在室温(RT)下洗涤，并立即用Fix/Perm溶液(BDBiosciences，Mississauga，ON)在室温下固定并透化处理20分钟，或者在1％多聚甲醛中室温下固定20，然后在4℃下保存最长达24小时。离心固定并保存的细胞并将其在室温下重悬浮在Fix/Perm缓冲液中20分钟。然后用染色缓冲液(D-PBS，1％BSA，0.1％皂甙)洗涤细胞两次并将其重悬浮在0.1ml染色缓冲液中。在冰上用15μl生物素标记的抗切割的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3单克隆抗体(BDBiosciences，Mississauga，ON)对细胞染色60分钟。在染色缓冲液中洗涤细胞并在冰上用链霉抗生物素蛋白-PE(Sigma，St.Louis，MO)复染30分钟。在染色缓冲液中洗涤细胞两次并重悬浮在D-PBS，1％BSA中用于在流式细胞仪上分析。

3.流式细胞术分析

在FACSCalibur流式细胞仪(BD Biosciences，Mississauga，ON)上分析染色的细胞。对每个样品收集3万到5万个事件。用前向散射和侧向散射参数门控活细胞和靶细胞，然后门控FL4道(channel)上DDAO-SE-标记的靶细胞群体(也参见图1B)。然后用DDAO-SE门控的靶细胞在FL4对FL2点图中确定切割的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3表达(FL2道)。

H.IFN-γELISPOT测定法

ELISPOT测定法使用Miilipore MultiScreen-HA 96-孔滤板(Millipore目录号MAHAS4510)。将板用溶于pH9.5的碳酸盐缓冲液中的5μg/ml抗-IFN-γmAb(Sigma，St.Louis，MO)在4℃涂覆过夜并用D-PBS，2％BSA封闭。如所示的加入人或者鼠T细胞(100,000/孔)并与相关或者不相关的肽过夜温育。洗涤该板然后与生物素标记的抗-IFN-γmAb在室温温育1小时。洗涤该板，然后用1∶5,000稀度的Extravidin-碱性磷酸酶(Sigma)在室温处理1小时。用BCIP/NBT底物(Sigma)将板显色直到所有点都清晰可见。干燥显色的板并在AID3.1.1版ELISPOT读出器(Cell Technologies，美国)上计数。用PMA和离子霉素(Sigma)处理的细胞用作所有实验中的正对照。

I.⁵¹Cr-释放测定法

在含有10％FCS的细胞培养基中用100μCi Na₂ ⁵¹CrO₄在37℃标记靶细胞(P815，P815-A2/K^b，EL4，和T2细胞)45分钟。在培养基中洗涤细胞并且如果方案需要，用特异或者非特异对照肽(1到3μg/ml)脉冲细胞1小时。经脉冲的细胞在培养基中洗涤一次并以30,000个细胞/ml重悬浮。以如结果中指出的不同的E∶T比率加入效应细胞(鼠MLR，肽再刺激的脾细胞，或者肽活化的人T细胞系)。在一些实验中，在以各种E∶T比率向⁵¹Cr-释放测定法中添加前用首次用于实验的淋巴细胞稀释效应细胞。温育4小时后，将25μl测定上清液置于96孔Lumaplate(Packard)中。干燥平板并用TopCount NXT v2.12闪烁计数器(Packard)计数放射性。结果表示为以(实验释放-自发释放/总释放-自发释放)×100计算的特异裂解％。

J.HLA-五聚体染色

用PE-缀合的重组HLA-肽五聚体(ProImmune，Oxford，英国)对HIV gag肽特异的和CEA CAP1肽特异的HLA-A*0201人T细胞系染色。将含有来自HIV gag(ProImmune code 010)的SLYNTVATL序列的HLA-A*0201五聚体用于染色HIV-特异的细胞系，而将含有来自CEA(ProImmune code 075)的YLSGANLNL肽的HLA-A*0201五聚体用于染色CAP1肽特异的细胞系。在两种情况中，将由相似百分数的CD8⁺T-细胞组成的HLA-A*0201限制的T-细胞系用作非特异的五聚体染色对照。洗涤T细胞并将其以2×10⁶个细胞/ml重悬浮在五聚体染色缓冲液(PBS)中，该缓冲液由D-PBS、0.1％NaN₃、0.1％BSA组成。在室温下用10μl Pro5^TM染色细胞20分钟，洗涤，然后在PSB中用5μl抗-人CD8-FITC(BD Biosciences)在室温染色20分钟。在PSB中洗涤细胞并在D-PBS，1％多聚甲醛中固定并进行FACScalibur流式细胞术分析仪分析。检测五聚体阳性细胞并定量，这通过首先用前向散射和侧向散射辨别器门控活细胞，然后在两色图中分析来进行，所述两色图在x轴上显示CD8⁺荧光，且在y轴上显示五聚体⁺荧光。结果表示为每种培养物的五聚体⁺细胞％。

实施例2

A.测定步骤和靶细胞示踪染料的选择

我们解决的第一个问题是发现在FACS分析期间不干扰天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3信号的有效的靶细胞示踪染料的问题。为了使灵敏性最大，我们希望使用生物素标记的第一抗-切割的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3，然后为在FL2道中发出明亮荧光的链霉抗生物素蛋白-PE复染剂。结果，我们寻找无毒性的细胞示踪染料，其将在远红外(FL4)道中发荧光并且不需要FL2道的任何补偿。我们发现DDAO-SE(Molecular Probes)满足这些要求。如图1A中所示，发现DDAO-SE可再现地并且稳定地染色多种鼠和人细胞系最长达15小时，包括P815、EL-4、B16F10黑素瘤、4T1乳腺癌、人T2胸腺瘤和COS细胞，而不诱导非特异的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3切割。

使用DDAO-SE染色的靶细胞，我们首先测试了天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3切割测定法来测量鼠同基因T细胞应答中的CTL活性。培养5天后，与⁵¹Cr释放比较测试C57BL/6抗-Balb/c和Balb/c抗-C57BL/6脾细胞的混合的淋巴细胞应答。将效应细胞与靶细胞(P815或者EL-4细胞)以不同比率混合并温育不同的时间间隔并固定和用抗-切割的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3染色。图1B显示了用于计数天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3切割的靶细胞百分数的门控策略。将该方法用于所有实验中。用前向散射(FSC)和侧向散射(SSC)图分离如所示的活的DDAO-SE⁺(FL4道)靶细胞的群体(R2和R3)。将R2和R3门控物组合并用于确定DDAO-SE⁺、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3切割的(FL2道)靶的百分数。该门控策略确保仅考虑活的靶。

用C57BL/6抗-Balb/c MLR效应细胞与P815靶(1∶1的E∶T比率)进行的实验发现诱导天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3切割对于H-2^d P815靶是特异的并且在H-2^bEL4靶中没有检测到显著切割(图2A)。图2A和2B中显示的时程也表明在该情况中温育1小时后天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3切割信号是最大的。当测试Balb/c抗-C57BL/6MLR效应细胞时发现了相似结果(图2B)。总之，在测量MLR中异特异性的(allo-specific)CTL活性时，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3切割测定法显示了与使用4小时的⁵¹Cr释放测定法时相同的特异性(数据未示出)。

为了证实靶细胞中天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3的切割依赖于CTL分泌的细胞毒性颗粒，我们将C57BL/6抗-Balb/c MLR效应细胞与刀球肮霉素A(用作CTL测定中的CTL脱粒抑制剂)温育后与靶混合。刀球肮霉素A抑制P815靶细胞中天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3切割的出现(图2C)。用对来自CEA肿瘤抗原的CAP1肽反应的人CTL细胞系进行的测定得到了相似结果(数据未显示)。此外，用天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑制剂Z-DEVD-FMK或者一般的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑制剂Z-VAD-FMK对天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3活性的抑制不能防止C57BL/6抗-Balb/cMLR的P815靶中切割的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3的出现(数据未显示)。这些结果一起表明靶细胞中天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3切割依赖于CTL分泌的粒酶并且不由内源活化的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3或者杀死过程中靶中其他切割天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶触发。

在两种不同的测定系统：鼠C57B1/6抗-Balb/c MLR系统和在HLA-A2.1/K^b转基因小鼠中肽接种应答中比较了天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3切割测定法和⁵¹Cr释放测定法(图3)。在MLR模型中，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3切割测定法表现出与⁵¹Cr释放测定法相同的特异性和可靠性。然而，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3切割测定法明显更灵敏，其能够在低于0.5∶1的E∶T比率下检测CTL活性(图3A)。还测试了来自用人TRP2黑素瘤抗原肽接种的小鼠的脾细胞对于肽脉冲的P815-A2/K^b靶细胞的CTL活性(图3B)。当在40∶1和10∶1 E∶T下测试肽再刺激的脾细胞时，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3切割测定法产生了与⁵¹Cr释放测定法相似的结果。再次，和前面一样，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3切割测定法显示出更高程度的灵敏性，其在10∶1的E∶T比率下检测到更高比率的的特异CTL活性。

B.使用天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3切割测定法监控对病毒载体疫苗的CTL应答

比较天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3切割测定法和IFN-γELISPOT测定法以测量用2×10⁷pfu ALVAC-gp100免疫HLA-A2.1/K^b转基因小鼠后gp100肽特异的CD8⁺回忆应答。将小鼠接触抗原并加强，并用0.2μg/ml结合HLA-A2.1的gap100肽库再刺激脾细胞然后进行效应细胞测定，该测定使用天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3切割或者IFN-γELISPOT。天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3切割测定法使用用HLA-A2.1/K^b质粒稳定转染的DDAO-SE-标记的gap100或者对照肽脉冲的P815细胞。在ELISPOT测定中使用相似方法，只是P815-A2/K^b不用DDAO-SE标记(见方法章节)。每种测定法中使用5只重复抽样小鼠来测试当将天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3切割测定法用作读出时个体动物之间的结果的精确性。图4显示了两个单独实验的结果，这两个实验比较了对于gp100肽特异的CD8⁺T细胞应答的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3切割读数对ELISPOT的读数。两种测定法产生了相当的结果，其中在用空ALVAC对照载体免疫的小鼠中没有非特异反应性。个体动物之间的分散是低的，表明用天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3切割监控CTL靶中的CD8⁺T细胞应答可以准确地以高精确性测量接种后抗原特异的CD8⁺T细胞应答。

这些结果表明鼠系统中CTL靶细胞中天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3切割的测量是⁵¹Cr释放的可行的备选测定法，并且具有相同程度的特异性，但是比⁵¹Cr释放明显更灵敏。此外，通过天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3切割测量CTL活性可以用作IFN-γELISPOT的支持性功能测定法或者当可以得到表达靶抗原或者肽的靶细胞时作为ELISPOT的替代测定法。

C.天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3切割CTL测定法用于监控抗原特异的人T细胞应答

在第一组研究中，针对9-聚体HIV rev肽、HIV gag肽，或者针对从肿瘤相关抗原CEA得到的CAP1肽从HLA-A*0201⁺供体产生人T细胞系。通过如方法中概述的肽刺激和用IL-2和IL-7增殖的重复循环从正常的、非HIV感染的和非癌性供体产生所有T细胞系。3或者4个刺激循环后，我们常规地获得由＞85％TCR αβ⁺、CD8⁺、CD16^-、CD56^-增殖性T细胞组成的T细胞系。通过监控天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3切割测试这些T细胞的效应细胞活性。IFN-γELISPOT分析证实第三和第四轮刺激后存在肽特异的T细胞。对于HIV肽特异的和CEA肽特异的细胞系，这些的范围为1∶100到1∶250(数据未显示)。

图5A显示了使用对来自HIV rev的肽特异的HLA-A2.1-限制的T细胞系，监控活化的人T细胞特异活性的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3切割测定法的一般结果。将活化的T细胞与脉冲的T2靶以5∶1或者1∶1的E∶T比率混合(图5A)。证明对于用来自pp65CMV抗原的非特异HLA-A*0201-结合性肽脉冲的T2靶中天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3切割，该测定法仅具有最低水平的特异性。在图5B中，我们比较了天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3切割测定法与另一种基于FACS的CTL测定法的结果，该基于FACS的CTL测定法使用膜联蛋白-V和7-AAD染色(Fischer等人，2002)用试剂盒(BDBisciences)，使用对CEA的CAP1HLA-A2.1表位特异的T细胞系检测靶中的细胞凋亡。将T细胞系(第4次刺激)用来自供体的首次用于实验的自体PBMC以所指出的比率稀释并与相等数目(100,000)的肽脉冲的T2靶细胞混合。两种测定法产生了相当的结果，具有相似水平的灵敏性(图5B)。然而，我们注意到许多实验中膜联蛋白-V+7-AAD测定法具有明显更高的非特异背景。此外，我们发现样品之间膜联蛋白-V荧光水平有很相当大变化(数据未显示)。结合磷脂酰丝氨酸的膜联蛋白V是Ca²⁺敏感的并且Ca²⁺浓度的轻微改变就可以改变膜联蛋白-V结合平衡。当对天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3切割染色时没有发现染色荧光的该变化。

除了较低背景，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3切割测定法还显示出在示踪CTL活性中的很大程度的灵敏性，如通过在1∶7稀度的效应细胞下检测到特异CTL活性所示的(图5B；天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3切割)。我们还测定了用于图5B与IFN-γELISPOT测定法(未显示)的T细胞系中CAP1-特异的T细胞的频率并且发现了1∶237的频率。根据这些结果，我们估计图5B中1∶3和1∶7稀度的CAP1-特异的T细胞的频率分别为1∶711(0.14％)和1∶1659(0.06％)。这提示该测定法是灵敏的并且能够检测稀有抗原特异的CD8⁺T细胞，特别是对于其中CTL频率相当低的TAA。

D.基于天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3切割的CTL测定法的灵敏性

为进一步测试该测定法的灵敏度极限，用小鼠MLR效应细胞和活化的肽-特异的人T细胞系进行了一系列实验，其中将效应细胞分别用首次用于实验的同基因脾细胞或者用首次用于实验的自体PBMC稀释到最高达1∶199。

收获MLR后使用首次用于实验的同基因C57BL/6脾细胞将C57BL/6抗-Balb/c MLR效应细胞以1∶0(无稀释)到1∶199稀释，并用所述效应细胞进行第一次实验(图6)。将稀释的效应细胞与DDAO-SE-标记的P815细胞以1∶1的比率温育。仅靶细胞和首次用于实验的脾细胞用作CTL活性的负对照并且DDAO-SE-标记的EL-4靶用作特异性对照。天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3切割显示出高度灵敏性，如甚至当将MLR效应细胞用首次用于实验的脾细胞以1∶199比率稀释时也存在明显天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3切割所证实的(图6)。在非特异的EL4靶中在所有稀度下都见到可忽略水平的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3切割(图6)。发现在一般的鼠MLR中异(allo)-反应性CD8⁺脾细胞的百分数高达1∶10。从而，假定在MLR中存在该频率的抗-Balb/c效应细胞，在用首次用于实验的脾细胞以1∶199稀释时，该测定法能够在1∶2,000(0.05％)频率的效应细胞检测CTL活性。重复该实验至少3次，得到相似结果。

来自首次用于实验的PBMC库的3到4轮刺激后，用HIV肽特异的人HLA-A*0201-限制的T细胞系进行相似的稀释实验(图7)。在图9中所示实验中，IFN-γELISPOT分析估计在3次刺激后，培养物中HIV-肽特异的T细胞的频率为1∶156(0.64％)。将这些T细胞培养物用首次用于实验的自体PBMC以1∶0到1∶199的比率稀释。如前面，仅DDAO-SE-标记的T2淋巴瘤细胞靶和与HIV肽脉冲的T2靶温育的首次用于实验的PBMC^-活化的T细胞用作负对照，而用HLA-A*0201-结合性pp65CMV肽脉冲的T2细胞用作特异性对照。如图7B和9B中所示，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3切割的测量非常灵敏，在低达1∶99和1∶199的效应细胞稀度下也检测到显著活性。在HIV肽脉冲的T2细胞中，在1∶99和1∶199的稀度下天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3切割率分别为5.7％和6％，而在非特异的pp65CMV肽脉冲的靶中，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3切割率分别仅为2.1％和2.2％。使用CMV肽的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3切割的细胞的该低百分率不随着效应细胞稀度的减小而增加。靶-效应细胞和首次用于实验的PBMC+靶细胞中天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3切割百分数小于2％(图7B)。作为该测定法灵敏性的进一步测试，我们还用直接染色抗原特异性T细胞的TCR的HLA-肽五聚体(ProImmune，Oxford，英国)染色HIV gag-特异的T细胞系(图7C)。图7C显示了用于图7B中所示天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3切割测定法中的相同T细胞上的五聚体染色结果。该分析揭示天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3切割测定法与HLA五聚体染色有相当水平的灵敏性。天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3切割测定法(图7B)中HIV gag-特异的T细胞的频率(基于IFN-γELISPOT频率)对于效应细胞的1∶99和1∶199稀度分别为1∶15,444(0.007％)和1∶31,044(0.003％)。这代表了高水平的灵敏性，使得当抗原特异的T细胞频率相当低时，该测定法可用于定量CTL活性。此外，与基于五聚体或者四聚体的方法不同，它测量T细胞功能而不仅仅测量T细胞频率。

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Claims

1.检测免疫效应细胞群体针对靶细胞群体的细胞毒性活性的方法，该方法包括如下步骤组合：

a)将免疫效应细胞群体暴露于靶细胞群体；

b)以足够的时间段且在适于免疫效应细胞影响靶细胞的条件下温育细胞，从而使得靶细胞中的细胞凋亡途径被活化；

c)固定和透化所混合的细胞群体；

d)将混合的细胞群体暴露于可检测的试剂，该试剂能够结合在细胞凋亡过程中经历改变或者由细胞凋亡过程导致改变的蛋白质或者其片段；和

e)检测所述可检测的试剂。

2.权利要求1的方法，其中所述免疫效应细胞是T细胞。

3.权利要求1的方法，其中所述靶细胞是病毒感染的细胞或者肿瘤细胞。

4.权利要求1的方法，其中步骤d)的蛋白质是天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶。

5.权利要求4的方法，其中所述天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶是天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3。

6.权利要求1的方法，其中所述可检测的试剂是抗体。

7.权利要求1的方法，其中所述可检测的试剂是荧光标记的抗体。

8.权利要求1的方法，其中用流式细胞仪完成步骤e)的检测。