JP6556156B2 - Ａｐｒｉｌバリアント - Google Patents

Description

発明の分野
本発明は、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に結合する、バリアント増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）に関する。そのようなバリアントＡＰＲＩＬを含む治療薬剤は、多発性骨髄腫などの形質細胞疾患の処置に有用である。

発明の背景
多発性骨髄腫
多発性骨髄腫（骨髄腫）は、形質細胞の骨髄悪性腫瘍である。異常な形質細胞の集団が骨髄に凝集し、そこでそれらは正常な血液細胞の産生を妨げる。骨髄腫は、米国において２番目に一般的な血液悪性腫瘍であり（非ホジキンリンパ腫の次）、血液悪性腫瘍の１３％を、および全てのがんの１％に相当する。この疾患は、死の前に病的骨折、感染への感受性、腎臓そして骨髄の機能不全を引き起こすことから、苦痛と医療出費の点で負担となる。

多くのリンパ腫と異なり、骨髄腫は現在不治である。リンパ腫に用いられる標準的な化学療法薬は、大部分が骨髄腫には効果的でない。加えて、形質細胞ではＣＤ２０の発現が消失しているため、この疾患に対してリツキシマブを使用することはできない。ボルテゾミブやレナリドミドなどの新しい薬剤は部分的に効果的だが、長期にわたる寛解を導くことはできない。

そのため、上昇した効果および改善した長期間の効果を有する、骨髄腫の治療のための代替の薬剤への必要性が存在する。

ＢＣＭＡ
ＢＣＭＡ（ＴＮＦＲＳＦ１７としても公知）は、専らＢ系列造血細胞または樹状細胞において発現する、形質細胞特異的表面抗原である。これはＴＮＦ受容体ファミリーの一員である。ＢＣＭＡはナイーブＢ細胞では発現されないが、形質細胞芽へのＢ細胞分化の間にはアップレギュレートされ、記憶Ｂ細胞、形質細胞芽、および骨髄形質細胞では明瞭に発現される。ＢＣＭＡは、初代骨髄腫細胞の大部分においても発現される。樹状細胞において検出される低レベルのｍＲＮＡを除き、ＢＣＭＡ発現は、他の組織において消失しているようであり、これは多発性骨髄腫に対する新規の治療のための標的としての可能性を示す。

ＢＣＭＡは、図１で模式的に示される相互接続したリガンドと受容体とのネットワーク内で機能する。２つの他のＴＮＦ受容体（活性化Ｔ細胞ならびに全てのＢ細胞で見出される膜貫通型活性化因子およびカルシウム調節因子およびシクロフィリンリガンド相互作用因子（ＴＡＣＩ、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂとしても公知）、ならびにＢリンパ球で主に発現するＢＡＦＦ−Ｒ（ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ））は、ＢＣＭＡとリガンドＡＰＲＩＬおよびＢＡＦＦを共有する。多発性骨髄腫細胞は、いくつかの症例においてはＴＡＣＩを、そしてほとんどの症例においてはＢＣＭＡを発現するが、ＢＡＦＦ−Ｒは全く発現しない。

天然のリガンドＡＰＲＩＬは、ＢＣＭＡ標的治療としてまたはＢＣＭＡ標的治療の一部として有用である可能性がある。しかしながら、ＴＡＣＩは、活性化Ｔ細胞および全てのＢ細胞において見出されるため、ＴＡＣＩとの交差反応が、問題となる可能性があり、そのため、骨髄腫細胞上のＢＣＭＡを指向する薬剤を用いた処置は、非がん性のＢ細胞およびＴ細胞部分集団の病理学的枯渇（ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）もまた引き起こし得る。

ＡＰＲＩＬはまた、形質細胞、特に多発性骨髄腫などの状態における悪性の形質細胞の存在を同定するための診断的適用に有用である可能性がある。しかしながら、この場合もまた、ＡＰＲＩＬのＴＡＣＩにもまた結合する能力は、ＡＰＲＩｌに基づく診断が通常活性化Ｔ細胞およびＢ細胞も同定することを意味し、その結果は多義的であることを意味する。

そのため、これらの欠点を伴わない抗ＢＣＭＡ治療および診断を開発する必要性が存在する。

本発明の態様の概要
本発明者らは、野生型ＡＰＲＩＬよりも（ｔｈａｔ）高いＢＣＭＡ：ＴＡＣＩ結合比率を有する、ＢＣＭＡ結合リガンドＡＰＲＩＬの活性化させ、発展させた変異体を有する。これらの変異体は、より高い程度のＢＣＭＡに対する特異性を示すため、治療的適用および診断的適用のためのより焦点を当てたＢＣＭＡ発現細胞の標的化を提供する。

そのため、本発明の第一の態様において、バリアント増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）を提供し、これは、野生型ＡＰＲＩＬよりも高いＢＣＭＡに対する結合アフィニティー、および／または野生型ＡＰＲＩＬと比較して変化した結合動態、および／または野生型ＡＰＲＩＬよりも高いＢＣＭＡ：ＴＡＣＩ（膜貫通型活性化因子およびカルシウム調節因子およびシクロフィリンリガンド相互作用因子）結合比率を有し、以下の位置の１つまたはそれより多くでの変異を含む：Ａ１２５、Ｖ１７４、Ｔ１７５、Ｍ２００、Ｐ２０１、Ｓ２０２、Ｈ２０３、Ｄ２０５およびＲ２０６。

バリアントＡＰＲＩＬは、以下の単一変異の１つを含み得る：
Ａ１２５Ｔ、
Ｖ１７４Ｔ、Ｖ１７４Ｇ，
Ｔ１７５Ｈ、Ｔ１７５Ｓ、Ｔ１７５Ｇ，
Ｍ２００Ｃ、Ｍ２００Ｌ、Ｍ２００Ｇ、Ｍ２００Ｓ、Ｍ２００Ａ、Ｍ２００Ｎ、
Ｐ２０１Ｖ、Ｐ２０１Ａ、Ｐ２０１Ｇ、Ｐ２０１Ｒ、Ｐ２０１Ｙ、Ｐ２０１Ｗ、
Ｓ２０２Ｇ、Ｓ２０２Ｆ、Ｓ２０２Ｄ、Ｓ２０２Ｖ、Ｓ２０２Ｐ、Ｄ２０５Ｐ。

バリアントＡＰＲＩＬは、以下の位置での変異の組み合わせを含み得る：Ｖ１７４およびＴ１７５、またはＶ１７４およびＭ２００、またはＶ１７４およびＳ２０２、またはＶ１７５およびＭ２００、またはＶ１７５およびＳ２０２、またはＤ２０５およびＲ２０６、またはＶ１７４、Ｔ１７５およびＭ２００、またはＶ１７４、Ｔ１７５およびＳ２０２、またはＴ１７５、Ｄ２０５およびＲ２０６、またはＭ２００、Ｄ２０５およびＲ２０６、またはＶ１７４、Ｔ１７５、Ｍ２００およびＳ２０２、またはＴ１７５、Ｓ２０２、Ｄ２０５およびＲ２０６。

バリアントＡＰＲＩＬは、以下の変異の組み合わせの１つを含み得る：
Ｖ１７４ＴおよびＴ１７５Ａ、またはＶ１７４ＴおよびＭ２００Ｇ、またはＴ１７４ＳおよびＳ２０２Ｇ、または
Ｖ１７４ＴおよびＳ２０２Ｖ、またはＶ１７４ＧおよびＳ２０２Ｇ、またはＶ１７４ＧおよびＳ２０２Ｅ、または
Ｖ１７４ＧおよびＳ２０２Ａ、またはＶ１７４ＧおよびＳ２０２Ｇ、またはＶ１７４ＥおよびＳ２０２Ｙ、または
Ｔ１７５ＡおよびＳ２０２Ｅ、またはＴ１７５ＧおよびＳ２０２Ｇ、またはＴ１７５ＧおよびＳ２０２Ｖ、または
Ｔ１７５ＡおよびＳ２０２Ｐ、またはＴ１７５ＡおよびＭ２００Ｇ、またはＴ１７５ＳおよびＳ２０２Ｇ、または
Ｓ２０２ＶおよびＨ２０３Ｎ、またはＤ２０５ＨおよびＲ２０６Ｌ、またはＤ２０５ＰおよびＲ２０６Ｋ、または
Ｄ２０５ＰおよびＲ２０６Ｎ、またはＤ２０５ＳおよびＲ２０６Ｐ、またはＤ２０５ＲおよびＲ２０６Ｇ、または
Ｄ２０５ＰおよびＲ２０６Ｉ、またはＤ２０５ＳおよびＲ２０６Ｈ、または
Ｖ１７４Ｔ、Ｔ１７５ＡおよびＳ２０２Ｅ、またはＶ１７４Ｔ、Ｔ１７５ＡおよびＭ２００Ｇ、または
Ｔ１７５Ａ、Ｄ２０５ＰおよびＲ２０６Ｎ、またはＴ１７５Ａ、Ｄ２０５ＳおよびＲ２０６Ｈ、または
Ｍ２００Ｇ、Ｄ２０５ＰおよびＲ２０６Ｎ、またはＭ２００Ｇ、Ｄ２０５ＳおよびＲ２０６Ｈ、または
Ｖ１７４Ｔ、Ｔ１７５Ａ、Ｍ２００ＧおよびＳ２０２Ｅ、または
Ｔ１７５Ａ、Ｓ２０２Ｅ、Ｄ２０５ＰおよびＲ２０６Ｎ、または
Ｔ１７５Ａ、Ｓ２０２Ｅ、Ｄ２０５ＳおよびＲ２０６Ｈ。

本発明はまた、Ｍ２００Ｇ変異を含むバリアント増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）を提供する。

本発明はまた、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよびエクトドメインを含み、当該抗原結合ドメインが、本発明の第一の態様のいずれかにしたがうバリアントＡＰＲＩＬを含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。

本発明はまた、抗原結合ドメインおよびＴ細胞活性化ドメインを含み、当該抗原結合ドメインが、本発明の第一の態様にしたがうバリアントＡＰＲＩＬを含む、二重特異性Ｔ細胞誘導体（ＢｉＴＥ）を提供する。

第二の態様において、本発明は、本発明の第一の態様にしたがうバリアントＡＰＲＩＬ、またはそのようなバリアントＡＰＲＩＬを含むＣＡＲもしくはＢｉＴＥをコードする核酸配列を提供する。

第三の態様において、本発明は、本発明の第二の態様にしたがう核酸配列を含むベクターを提供する。

本発明はまた、本発明の第一の態様にしたがうバリアントＡＰＲＩＬを含むキメラ抗原受容体を含む細胞を提供する。

本発明はまた、キメラ抗原受容体をコードする核酸配列を含む本発明の第三の態様にしたがうベクターを細胞に形質導入するか、またはトランスフェクションする工程を含む、そのような細胞を作製するための方法を提供する。

第四の態様において、本発明は、本発明の第一の態様にしたがうバリアントＡＰＲＩＬ、そのようなバリアントＡＰＲＩＬを含むＣＡＲまたはＢｉＴＥ、そのようなＣＡＲを含む細胞、本発明の第二の態様にしたがう核酸または本発明の第三の態様にしたがうベクターを含む、治療薬剤を提供する。

本発明の第四の態様にしたがう治療薬剤を、被験体に投与する工程を含む、形質細胞障害を処置するための方法もまた提供される。

本発明の第四の態様にしたがう治療薬剤の形質細胞障害の処置における使用もまた提供される。

形質細胞障害の処置のための医薬品の製造における本発明の第四の態様にしたがう治療薬剤の使用もまた提供される。

第五の態様において、本発明は、本発明の第一の態様にしたがうバリアントＡＰＲＩＬを含む、形質細胞を検出するための診断薬剤を提供する。

形質細胞障害を診断するための本発明の第五の態様にしたがう診断薬剤もまた提供される。

本発明の第五の態様にしたがう診断薬剤を、被験体に投与する工程を含む、被験体においてインビボで形質細胞障害を診断するための方法もまた提供される。

本発明の第五の態様にしたがう診断薬剤を、被験体由来のサンプルにインビトロで添加する工程を含む、被験体において形質細胞障害を診断するための方法もまた提供される。

サンプルは、血液サンプルであるかまたはそれに由来し得る。

形質細胞障害は、形質細胞腫、形質細胞性白血病、多発性骨髄腫、マクログロブリン血症、アミロイドーシス、ワルデンストレーム型マクログロブリン血症、孤立性骨形質細胞腫、髄外性形質細胞腫、骨硬化性ミエローマ、Ｈ鎖病、意義不明の単クローン性免疫グロブリン血症およびくすぶり型多発性骨髄腫から選択され得る。

形質細胞障害は、多発性骨髄腫であり得る。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
野生型ＡＰＲＩＬよりも高いＢＣＭＡに対する結合アフィニティーを有し、かつ／または野生型ＡＰＲＩＬと比較して変化した結合動態を有し、かつ／または野生型ＡＰＲＩＬよりも高いＢＣＭＡ：ＴＡＣＩ（膜貫通型活性化因子およびカルシウム調節因子およびシクロフィリンリガンド相互作用因子）結合比率を有し、かつ以下の位置：Ａ１２５、Ｖ１７４、Ｔ１７５、Ｍ２００、Ｐ２０１、Ｓ２０２、Ｈ２０３、Ｄ２０５およびＲ２０６の１つまたはそれより多くにおける変異を含む、バリアント増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）。
（項目２）
以下の単一変異：
Ａ１２５Ｔ、
Ｖ１７４Ｔ、Ｖ１７４Ｇ、
Ｔ１７５Ｈ、Ｔ１７５Ｓ、Ｔ１７５Ｇ、
Ｍ２００Ｃ、Ｍ２００Ｌ、Ｍ２００Ｇ、Ｍ２００Ｓ、Ｍ２００Ａ、Ｍ２００Ｎ、
Ｐ２０１Ｖ、Ｐ２０１Ａ、Ｐ２０１Ｇ、Ｐ２０１Ｒ、Ｐ２０１Ｙ、Ｐ２０１Ｗ、
Ｓ２０２Ｇ、Ｓ２０２Ｆ、Ｓ２０２Ｄ、Ｓ２０２Ｖ、Ｓ２０２Ｐ、Ｄ２０５Ｐ
の１つを含む、項目１に記載のバリアントＡＰＲＩＬ。
（項目３）
以下の位置における変異の組み合わせ：Ｖ１７４およびＴ１７５、またはＶ１７４およびＭ２００、またはＶ１７４およびＳ２０２、またはＶ１７５およびＭ２００、またはＶ１７５およびＳ２０２、またはＤ２０５およびＲ２０６、またはＶ１７４、Ｔ１７５およびＭ２００、またはＶ１７４、Ｔ１７５およびＳ２０２、またはＴ１７５、Ｄ２０５およびＲ２０６、またはＭ２００、Ｄ２０５およびＲ２０６、またはＶ１７４、Ｔ１７５、Ｍ２００およびＳ２０２、またはＴ１７５、Ｓ２０２、Ｄ２０５およびＲ２０６
を含む、項目１に記載のバリアントＡＰＲＩＬ。
（項目４）
以下の変異の組み合わせ：
Ｖ１７４ＴおよびＴ１７５Ａ、またはＶ１７４ＴおよびＭ２００Ｇ、またはＴ１７４ＳおよびＳ２０２Ｇ、または
Ｖ１７４ＴおよびＳ２０２Ｖ、またはＶ１７４ＧおよびＳ２０２Ｇ、またはＶ１７４ＧおよびＳ２０２Ｅ、または
Ｖ１７４ＧおよびＳ２０２Ａ、またはＶ１７４ＧおよびＳ２０２Ｇ、またはＶ１７４ＥおよびＳ２０２Ｙ、または
Ｔ１７５ＡおよびＳ２０２Ｅ、またはＴ１７５ＧおよびＳ２０２Ｇ、またはＴ１７５ＧおよびＳ２０２Ｖ、または
Ｔ１７５ＡおよびＳ２０２Ｐ、またはＴ１７５ＡおよびＭ２００Ｇ、またはＴ１７５ＳおよびＳ２０２Ｇ、または
Ｓ２０２ＶおよびＨ２０３Ｎ、またはＤ２０５ＨおよびＲ２０６Ｌ、またはＤ２０５ＰおよびＲ２０６Ｋ、または
Ｄ２０５ＰおよびＲ２０６Ｎ、またはＤ２０５ＳおよびＲ２０６Ｐ、またはＤ２０５ＲおよびＲ２０６Ｇ、または
Ｄ２０５ＰおよびＲ２０６Ｉ、またはＤ２０５ＳおよびＲ２０６Ｈ、または
Ｖ１７４Ｔ、Ｔ１７５ＡおよびＳ２０２Ｅ、またはＶ１７４Ｔ、Ｔ１７５ＡおよびＭ２００Ｇ、または
Ｔ１７５Ａ、Ｄ２０５ＰおよびＲ２０６Ｎ、またはＴ１７５Ａ、Ｄ２０５ＳおよびＲ２０６Ｈ、または
Ｍ２００Ｇ、Ｄ２０５ＰおよびＲ２０６Ｎ、またはＭ２００Ｇ、Ｄ２０５ＳおよびＲ２０６Ｈ、または
Ｖ１７４Ｔ、Ｔ１７５Ａ、Ｍ２００ＧおよびＳ２０２Ｅ、または
Ｔ１７５Ａ、Ｓ２０２Ｅ、Ｄ２０５ＰおよびＲ２０６Ｎ、または
Ｔ１７５Ａ、Ｓ２０２Ｅ、Ｄ２０５ＳおよびＲ２０６Ｈ
の１つを含む、項目１に記載のバリアントＡＰＲＩＬ。
（項目５）
変異Ｍ２００Ｇを含む、バリアント増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）。
（項目６）
抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよびエンドドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、該抗原結合ドメインが、前述の項目のいずれかに記載のバリアントＡＰＲＩＬを含む、キメラ抗原受容体。
（項目７）
抗原結合ドメインおよびＴ細胞活性化ドメインを含む二重特異性Ｔ細胞誘導体（ＢｉＴＥ）であって、該抗原結合ドメインが、項目１〜５のいずれかに記載のバリアントＡＰＲＩＬを含む、二重特異性Ｔ細胞誘導体。
（項目８）
項目１〜５のいずれかに記載のバリアントＡＰＲＩＬ、項目６に記載のキメラ抗原受容体または項目７に記載の二重特異性Ｔ細胞誘導体をコードする核酸配列。
（項目９）
項目８に記載の核酸配列を含む、ベクター。
（項目１０）
項目６に記載のキメラ抗原受容体を含む、細胞。
（項目１１）
項目１０に記載の細胞を作製するための方法であって、キメラ抗原受容体をコードする核酸配列を含む、項目９に記載のベクターを用いて、細胞を形質転換またはトランスフェクションする工程を含む、方法。
（項目１０）
形質細胞障害を処置するための方法であって、項目１０に記載の細胞または項目７に記載の二重特異性Ｔ細胞誘導体を被験体に投与する工程を含む、方法。
（項目１１）
形質細胞障害の処置における使用のための、項目７に記載の二重特異性Ｔ細胞誘導体の項目１０に記載の細胞。
（項目１２）
形質細胞障害を処置するための医薬品の製造における、項目７に記載の二重特異性Ｔ細胞誘導体の項目１０に記載の細胞の使用。
（項目１３）
項目１〜５のいずれかに記載のバリアントＡＰＲＩＬを含む、形質細胞を検出するための診断薬剤。
（項目１４）
形質細胞障害を診断するための項目１３に記載の診断薬剤。
（項目１５）
インビボで被験体における形質細胞障害を診断するための方法であって、項目１〜５のいずれかに記載のバリアントＡＰＲＩＬを、該被験体に投与する工程を含む、方法。
（項目１６）
被験体における形質細胞障害を診断するための方法であって、項目１〜５のいずれかに記載のバリアントＡＰＲＩＬを、インビトロで該被験体由来のサンプルに添加する工程を含む、方法。
（項目１７）
前記サンプルが、血液サンプルであるか、または血液サンプルに由来する、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記形質細胞障害が、形質細胞腫、形質細胞性白血病、多発性骨髄腫、マクログロブリン血症、アミロイドーシス、ワルデンストレーム型マクログロブリン血症、孤立性骨形質細胞腫、髄外性形質細胞腫、骨硬化性ミエローマ、Ｈ鎖病、意義不明の単クローン性免疫グロブリン血症およびくすぶり型多発性骨髄腫より選択される、項目１０または１５〜１７のいずれかに記載の方法。
（項目１９）
前記形質細胞障害が、多発性骨髄腫である、項目１８に記載の方法。

ＡＰＲＩＬおよびＢＡＦＦのリガンド特異性と機能割り当て Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ、ＴＮＦＳＦ１３Ｂ）は、ＢＡＦＦ−Ｒ（ＢＡＦＦ−Ｒ、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ）、Ｂ細胞膜抗原（ＢＣＭＡ、ＴＮＦＲＳＦ１７）、ならびに膜貫通型活性化因子およびカルシウム調節因子およびシクロフィリンリガンド相互作用因子（ＴＡＣＩ、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ）と相互作用する一方、増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ、ＴＮＦＳＦ１３）は、ＢＣＭＡ、ＴＡＣＩ、およびプロテオグリカンと相互作用する。ＢＡＦＦ−Ｒ活性化は、末梢Ｂ細胞生存に影響を及ぼす一方、ＢＣＭＡは形質細胞生存に影響を及ぼし得る。ＡＰＲＩＬのプロテオグリカンとの相互作用は、ＡＰＲＩＬのアミノ末端を含む酸性硫酸化グルコサミノグリカン側鎖に関係する。 骨髄腫でのＢＣＭＡの発現データ ３９人の多発性骨髄腫患者由来の骨髄サンプルから骨髄腫細胞を、ＣＤ１３８＋磁気ビーズ選択により単離した。これら細胞を、ＰＥと結合化された抗ＢＣＭＡモノクローナル抗体Ｊ６ＭＯ（ＧＳＫ）により染色した。抗原のコピー数は、ＰＥ Ｑｕａｎｔｉｂｒｉｔｅ ｂｅａｄｓ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）を使用し、製造者の指示通りに定量した。抗原コピー数の箱ひげ図が、プロットされた範囲、四分位数、および中央値と共に提示する。我々は、その範囲が、細胞あたり３４８．７〜４２６８．４のＢＣＭＡコピーであり、平均値が１１８１、中央値が１０８４．９であることを見出した。 キメラ抗原受容体の標準的なデザイン キメラ抗原受容体の典型的な構成を示す。これらはＩ型膜貫通タンパク質である。エクトドメインは抗原を認識する。これは、スペーサードメインに接続された一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）に由来する抗体からなる。これは今度は、膜において分子を固定するように働く、膜貫通ドメインに連結される。最後に、これは細胞に細胞内シグナルを伝達するように働くエンドドメインに連結される。これは１つまたは複数のシグナリングドメインからなる。 生成された異なるＡＰＲＩＬに基づくＣＡＲのデザイン。 図３に示されるＣＡＲデザインは、ｓｃＦｖが、抗原結合ドメインとしてはたらけるように、ＡＰＲＩＬの修飾形態に置換されるように修飾された：ＡＰＲＩＬは、プロテオグリカン結合アミノ末端が欠失されるように短縮化された。次いでシグナルペプチドが、タンパク質を細胞表面へ指向させるように、短縮型ＡＰＲＩＬアミノ末端に接続された。３つのＣＡＲが、このＡＰＲＩＬに基づく結合ドメインを用いて生成された：Ａ．第一のＣＡＲにおいて、ヒトＣＤ８ストーク（ｓｔａｌｋ）ドメインがスペーサードメインとして使用された。Ｂ．第二のＣＡＲにおいて、ＩｇＧ１由来のヒンジがスペーサードメインとして使用された。Ｃ．第三のＣＡＲにおいて、Ｆｃ受容体結合を減少するために、Ｈｏｍｂａｃｈら（２０１０ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． １７：１２０６−１２１３）によって記載されたｐｖａ／ａ変異を用いて修飾された、ヒトＩｇＧ１由来のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインがスペーサーとして使用された（以後Ｆｃ−ｐｖａａとして参照される）。全てのＣＡＲにおいて、これらのスペーサーはＣＤ２８の膜貫通ドメイン、そして次いでＣＤ２８、ＯＸ４０およびＣＤ３ゼータエンドドメインの融合物を含む三者のエンドドメインに連結される（Ｐｕｌｅ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ，２００５：Ｖｏｌｕｍｅ １２；Ｉｓｓｕｅ ５；Ｐａｇｅｓ ９３３−４１）。 上記３つのＡＰＲＩＬ−ＣＡＲのアノテーションされたアミノ酸配列 Ａ：は、ＣＤ８ストークＡＰＲＩＬ ＣＡＲのアノテーションされたアミノ酸配列を示す； Ｂ：は、ＡＰＲＩＬ ＩｇＧ１ヒンジに基づくＣＡＲのアノテーションされたアミノ酸配列を示す； Ｃ：は、ＡＰＲＩＬ Ｆｃ−ｐｖａａに基づくＣＡＲのアノテーションされたアミノ酸を示す。 異なるＡＰＲＩＬに基づくＣＡＲの発現およびリガンド結合 Ａ．受容体を、レトロウイルス遺伝子ベクターにおいて、マーカー遺伝子短縮型ＣＤ３４と共発現した。形質導入細胞でのマーカー遺伝子の発現は、形質導入の確認を可能にする。 Ｂ．Ｔ細胞に、ＣＤ８ストークのスペーサー、ＩｇＧ１ヒンジ、またはＦｃスペーサーのいずれかを有するＡＰＲＩＬに基づくＣＡＲを形質導入した。これらの受容体を細胞表面において安定に発現させることができたか否かを試験するために、次いでＴ細胞を抗ＡＰＲＩＬ−ビオチン／ストレプトアビジンＡＰＣおよび抗ＣＤ３４によって染色した。フローサイトメトリー解析を行った。ＡＰＲＩＬは、３つのＣＡＲにおいて細胞表面で同等に検出され、これはそれらが同等に安定して発現されることを示唆する。 Ｃ．次に、ＣＡＲのＴＡＣＩおよびＢＣＭＡ認識能を決定した。形質導入されたＴ細胞を、マウスＩｇＧ２ａ Ｆｃに融合させたリコンビナントＢＣＭＡまたはＴＡＣＩ融合物のいずれかと一緒に、抗マウス二次および抗ＣＤ３４によって染色した。３つの受容体の構成は全て、ＢＣＭＡおよびＴＡＣＩの両方への結合を示した。驚くべき発見は、ＢＣＭＡへの結合が、ＴＡＣＩへの結合よりも大きいように見えることであった。更に驚くべき発見は、３つのＣＡＲが全て同等に発現したが、ＢＣＭＡおよびＴＡＣＩを認識するという点で、Ｆｃスペーサーを有するＣＡＲよりもＣＤ８ストークおよびＩｇＧ１ヒンジＣＡＲが良好であることであった。 同上 異なるＣＡＲコンストラクトの機能 ３つの異なるＡＰＲＩＬに基づくＣＡＲの機能分析を行った。何も形質導入していない（ＮＴ）、または異なるＣＡＲを発現するように形質導入した、いずれかの正常ドナー末梢血Ｔ細胞。形質導入は、同等のタイター上清を使用して行った。次いで、非特異的なＮＫ活性を除去するために、これらのＴ細胞よりＣＤ５６を枯渇させ、そしてエフェクターとして使用した。何も形質導入していない（ＮＴ）、またはＢＣＭＡもしくはＴＡＣＩを発現するように形質導入した、いずれかのＳｕｐＴ１細胞を標的として使用した。示されるデータは、５回の独立した実験からの平均値および標準偏差である。 Ａ．ＢＣＭＡおよびＴＡＣＩを発現するＴ細胞の特異的な殺傷を、クロム放出を使用して決定した。 Ｂ．インターフェロンγ放出も決定した。標的およびエフェクターを１：１の比率で共培養した。２４時間後、上清中のインターフェロンγをＥＬＩＳＡによって分析した。 Ｃ．ＣＡＲ Ｔ細胞の増殖／生存も、更に６日間インキュベートした同じ共培養中のＣＡＲ Ｔ細胞の数を計数することによって決定した。３つのＣＡＲは全て、ＢＣＭＡおよびＴＡＣＩを発現する標的に対する応答を指向した。ＢＣＭＡへの応答は、ＴＡＣＩよりも大きかった。 ＡＰＲＩＬ ＣＡＲ Ｔ細胞による初代骨髄腫細胞の殺傷 ほとんどの初代骨髄腫細胞は、それらの表面に少数のＢＣＭＡ分子を発現するため、低密度発現にも拘らず初代骨髄腫細胞の殺傷が生じるか否かを検証した。図２において記載されたＢＣＭＡ発現の範囲に相当する３症例を選択した：第一は不明瞭な発現を有する（平均より低い）；第二の症例は中間的な発現を有する（ほぼ平均の発現）そして第三は明瞭な発現を有した（平均の発現より上）。３症例全てについてのアイソタイプ対照に対するＢＣＭＡ染色のヒストグラムは、左に示される。この分析においては、ＣＤ８ストークおよびヒンジのＡＰＲＩＬ ＣＡＲのみを試験した。左に、開始数と比較した骨髄腫細胞の生存が、骨髄腫細胞とＣＡＲ Ｔ細胞との１：１共培養後３日目および６日目で示される。６日目までに、不明瞭なＢＣＭＡ発現を有する骨髄腫細胞を含む、９５％超の骨髄腫細胞が排除された。 ＢＣＭＡ標的化のために有用な新規ＡＰＲＩＬ変異体を開発するために使用した方法。 Ａ．候補のＡＰＲＩＬ分子を、ＣＤ８ストークＣＡＲ構成（しかし、シグナリングエンドドメインを含まない）で表示させ、口蹄疫２Ａ配列を使用してＣＤ３４と共発現させた。 Ｂ．結晶データからＢＣＭＡの特異性またはアフィニティーに重要でありそうな残基を、プライマーとしてコードするコドンに対して縮重である（degenerate）オリゴヌクレオチドを使用するスプライシングオーバーラップ（splicing-by-overlap）ＰＣＲによって無作為化した。これらのＰＣＲ産物を、ＣＤ８ストークＣＡＲ構成内にライゲーションし、細菌を形質転換するために使用した。個々の細菌コロニー（それぞれ単一の変異体を含む）を培養した。プラスミドＤＮＡをこれらの培養物から単離し、２９３Ｔ細胞にトランスフェクションするために使用した。トランスフェクション後、２９３Ｔ細胞を、マーカー遺伝子を伴うＢＣＭＡ−Ｆｃ融合物またはＴＡＣＩ−Ｆｃ融合物のいずれかで別個に染色した。 Ｃ．どのようにＢＣＭＡおよびＴＡＣＩに対する相対的な結合を、スクリーニングの間に推定したか：ＢＣＭＡまたはＴＡＣＩのいずれかに対するＣＤ３４染色の蛍光強度の傾斜を計算した。次に、野生型ＡＰＲＩＬの傾斜に対するこの傾斜の比率を計算した。この値を、読み出しとして使用した。 ＡＰＲＩＬ変異体の要約−単一残基変異。 ＢＣＭＡ−ＦｃおよびＴＡＣＩ−Ｆｃに対する結合で変化を示す変異体を、野生型ＡＰＲＩＬのものと比較して要約している。 ＡＰＲＩＬ変異体の要約−複数残基変異。 見込みのある変異体を、他の変異体と１回または複数回のいずれかで交差させ、特性評価した。ＢＣＭＡ−ＦｃおよびＴＡＣＩ−Ｆｃに対する結合の変化が、ここで再び野生型ＡＰＲＩＬと比較して示される。 いくつかの選択された変異体のＢＣＭＡ−ＦＣ、ＴＡＣＩ−ＦＣおよびＡＰＲＩＬ結合 選択された変異体のフローサイトメトリープロットが表に示される。第一の列は、ＣＤ３４の染色に対するＢＣＭＡ−Ｆｃの染色を示す。第二の列は、ＣＤ３４の染色に対するＴＡＣＩ−Ｆｃの染色を示す。第三の列は、ＣＤ３４の染色に対するＡＰＲＩＬの染色を示す。第一の行は、対照としての野生型ＡＰＲＩＬの染色を示す。第二の行は、ＣＤ３４単独の対照を示す。 同上 同上 同上 同上 同上 ＡＰＲＩＬに基づくＣＡＲと短縮型ＣＤ３４を共発現するベクター スクリーニングのために使用したベクターを発現する細胞株を、ＢＣＭＡ−ＦｃまたはＴＡＣＩ−Ｆｃのいずれかとインキュベートし、そして抗ＣＤ３４および抗ヒトＦｃ ＰＥの両方、ならびにＦＩＴＣを付与したｍＡｂによって染色した。次いで細胞をフローサイトメトリーによって研究した。これは、マーカー遺伝子ＣＤ３４に関するＢＣＭＡおよびＴＡＣＩの結合の典型的なパターンを示す。 古典的なＣＡＲを説明する模式図 Ｂ：生成された異なるＡＰＲＩＬに基づくＣＡＲのデザイン。 シグナルペプチドを短縮型ＡＰＲＩＬアミノ末端に接続した。これを異なるスペーサー：Ｆｃ受容体結合を減少させるために、Ｈｏｍｂａｃｈら（２０１０ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． １７：１２０６−１２１３）によって記載されたｐｖａａ変異を用いて修飾されたヒトＩｇＧ１のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン；ヒトＣＤ８αのストーク；ならびにＩｇＧ１のヒンジのいずれかに融合した。これらスペーサーを、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＯＸ４０エンドドメイン、およびＣＤ３ゼータエンドドメインを含有する三者のエンドドメインに連結した。 異なるＣＡＲの発現 受容体を、ＩＲＥＳ配列を使用して高感度青色蛍光タンパク質２（ｅＢＦＰ２）と共発現させた。初代ヒトＴ細胞に形質導入し、抗ＡＰＲＩＬ−ビオチン／ストレプトアビジンＡＰＣによって染色した。フローサイトメトリー解析を行った。ｅＢＦＰ２シグナルは、ＡＰＲＩＬ検出に対して示される。３つのＣＡＲは全て安定に発現した（３つの異なる正常ドナーＴ細胞を使用して行われた３回の独立実験の代表的な実験）。 クロム放出分析 エフェクターとして、何も形質導入していない（ＮＴ）か、または異なるスペーサーのＣＡＲを発現するように形質導入したかの、いずれかの正常ドナー末梢血Ｔ細胞、および標的として、何も形質導入していない（ＮＴ）か、またはＢＣＭＡもしくはＴＡＣＩを発現するように形質導入したかのいずれかのＳｕｐＴ１細胞を使用。Ｔ細胞は、ＮＫ活性を減少させるためにＣＤ５６を枯渇させた。これは３回の独立した実験の代表であり、そして一例として示される。累積の殺傷データは、図７Ａに示される。ＢＣＭＡおよびＴＡＣＩを発現するＴ細胞の特異的な殺傷が、陰性標的細胞に対する無活性と一緒に観察される。 インターフェロンガンマ放出 エフェクターと標的の１：１共培養由来を、ＥＬＩＳＡによって計測した。ＣＤ８ストークのコンストラクトは、最高の特異性を有するようである一方で、ヒンジコンストラクトは、最多のインターフェロン放出をもたらし、これらはいくらかの非特異的活性を実証する。これは、３回の独立した実験の代表であり、一例として示される。累積のインターフェロンガンマ放出データは、図７Ｂに示される。 初代骨髄腫上のＢＣＭＡ発現の例 ラット抗ヒトＢＣＭＡ ｍＡｂ Ｖｉｃｋｙ１によって染色した、骨髄腫サンプルの４例を示す。第一のパネルは、形質細胞性白血病（骨髄腫の異常であり、進行した、かつ侵襲性の形態）の患者における、明瞭なＢＣＭＡ染色を示す。他３症例は、医学的かつ形態的に典型的な骨髄腫である。それらは典型的に見られる、中間的または不明瞭な染色を示す。アイソタイプ対照（灰色）での染色を重ねた。これらは、図２に示される累積のＢＣＭＡ発現データの例である。 Ｖ５エピトープタグを有するＡＰＲＩＬ−ＣＡＲのアミノ酸配列。 Ａ：ｄＡＰＲＩＬ−ＨＣＨ２ＣＨ３ｐｖａａ−ＣＤ２８ＯＸＺ Ｂ：ｄＡＰＲＩＬ−ＣＤ８ＳＴＫ−ＣＤ２８ＯＸＺ Ｃ：ｄＡＰＲＩＬ−ＨＮＧ−ＣＤ２８ＯＸＺ この図における配列は、異なるシグナルペプチドを有し、かつＶ５タグを有さない点で、図５における配列とは異なる。 ＢＣＭＡ特異的ＡＰＲＩＬ変異体のスクリーニングの要約 ＢＣＭＡ−ＦｃおよびＴＡＣＩ−Ｆｃに対する結合の変化。これは、最初のスクリーニングデータのミニプレップＤＮＡの例である。変異体を、それぞれのバッチで確認した野生型ＡＰＲＩＬと比較してＡＰＲＩＬ変異体の平均ＭＦＩグラディエントを表すことにより実験間の変動を補正したバッチでスクリーニングした。 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 ＢＣＭＡ特異的ＡＰＲＩＬ変異体の配列アラインメント 無作為変異誘発プロセスの間に選択されたミニプレップ物を、ＢＣＭＡ−ＦｃおよびＴＡＣＩ−Ｆｃでの染色によって発現についてスクリーニングした。有用な可能性を有する変異体または有益な表現型を有する変異体を、キャピラリーシークエンスによって配列決定し、それらが由来した元のＡＰＲＩＬ配列とアライメントした。この図で示されるものは、そのようなスクリーニングプロセスの間に同定された変異体の例のアラインメントである。 同上 標的残基におけるグリシン置換で変化したＢＣＭＡおよびＴＡＣＩ結合のグラフ ＡＰＲＩＬ ＣＡＲ Ｔ細胞のインビボ機能の実証 尾静脈注射を介して１×１０^７ ＭＭ１．ｓ．ＦＬｕｃ細胞を受容した、６匹の３ヶ月齢メスＮＳＧマウス。マウスは、８日目および１３日目に生物発光によってイメージングした。１３日目でのイメージングの後に、４匹のマウスは尾静脈注射を介して５×１０^６ ＡＰＲＩＬ ＣＡＲ Ｔ細胞を受容した。マウスは１３日目および１８日目にイメージングした。ＣＡＲ Ｔ細胞を受容したマウスは、（＊）により示される。骨髄腫の寛解は、処置したマウスの全てにおいて１８日目までに観察されたが、一方で無処置マウスにおける疾患は進行した。 同上 Ａ：設計および構築した異なるＡＰＲＩＬ−ＢｉＴＥ構成 （１）ＩｇＧ１ヒンジによって短縮型ＡＰＲＩＬに連結したＯＫＴ３ ｓｃＦｖ、（２）（ＳＧＧＧＧＳ）３リンカーを介して短縮型ＡＰＲＩＬに連結したＯＫＴ３ ｓｃＦｖ、（３）ＣＤ８ストークを介して短縮型ＡＰＲＩＬに連結したＯＫＴ３ ｓｃＦｖ、（４）ＩｇＧ１ヒンジを介してＯＫＴ３ ｓｃＦｖに連結した短縮型ＡＰＲＩＬ、（５）（ＳＧＧＧＧＳ）３リンカーを介してＯＫＴ３ ｓｃＦｖに連結した短縮型ＡＰＲＩＬ、（６）ＣＤ８スペーサーを介してＯＫＴ３ ｓｃＦｖに連結した短縮型ＡＰＲＩＬ。コンストラクト（３）および（６）は、ＣＤ８スペーサーにおけるジスルフィド結合によってホモダイマーを形成するはずである。Ｂ：ＡＰＲＩＬｉＴＥの結合における細胞間相互作用での分子集合の模式図。 同上 異なるＡＰＲＩＬｉＴＥコンストラクトをトランスフェクションした２９３Ｔ細胞由来の上清のウェスタンブロット。ブロットは、抗ＡＰＲＩＬを用いて行った。 ＡＰＲＩＬｉＴＥ１、３および６の野生型ＳｕｐＴ１細胞ならびにＢＣＭＡおよびＴＡＣＩを発現するように改変されたＳｕｐＴ１細胞との結合。染色は抗ＡＰＲＩＬビオチン／ストレプトアビジンＡＰＣによるものである。Ａｐｒｉｌｉｔｅは、野生型ＳｕｐＴ１細胞への結合は示さないが、ＢＣＭＡ発現細胞には結合し、かつより少ない程度でＴＡＣＩ発現細胞に結合する。 野生型ＪｕｒｋａｔへのＡＰＲＩＬｉＴＥの結合、しかしＴ細胞受容体のないＪｕｒｋａｔへの非結合。これは、ＡＰＲＩＬｉＴＥがＴ細胞受容体に結合することを実証する。 ブランクの培地または３種のＡＰＲＩＬｉＴＥ存在下でのＴ細胞と何も導入していないか、または改変したＳｕｐＴ１細胞との１：１共培養。 ＡＰＲＩＬｉＴＥ１、３および６の存在下で、共培養３日間後に、ＢＣＭＡ発現ＳｕｐＴ１細胞の完全な消失が観察された。 原発性骨髄腫でのＢＣＭＡ発現の例。ラット抗ヒトＢＣＭＡ ｍＡｂ Ｖｉｃｋｙ１によって染色した骨髄腫サンプルの４例を示す。最初のパネルは、形質細胞白血病（異常であり、進行した、かつ侵襲性の形態の骨髄腫）を有する患者での明瞭なＢＣＭＡの染色を示す。他の３つの症例は臨床的かつ形態的に典型的な骨髄腫である。これらは典型的に見られる中間的または不明瞭な染色を示す。アイソタイプ対照（灰色）での染色を重ね合わせている。 ＡＰＲＩＬｉＴＥのアミノ酸配列 Ａ：ＡＰＲＩＬｉＴＥ＃０１、Ｂ：ＡＰＲＩＬｉＴＥ＃０３、Ｃ：ＡＰＲＩＬｉＴＥ＃０６ アイソタイプ対照の上に重ねたＢＣＭＡについての骨髄腫サンプルの染色。これらの骨髄腫細胞はＢＣＭＡを発現するが、低いレベルである。 １日目での共培養および対照の低倍率鏡検。ＡＰＲＩＬｉＴＥの存在下で、骨髄腫細胞と培養したときに、Ｔ細胞の明確な凝集／活性化を見ることができる。 骨髄腫細胞単独、末梢血Ｔ細胞との共培養での、それら両方のＡＰＲＩＬｉＴＥ＃３および＃６の非存在下または存在下でのインターフェロンガンマの放出。 培養液中での骨髄腫細胞の共培養物の６日目での生存率。試験した両方のＡＰＲＩＬｉＴＥは、ＰＢＭＣの存在下で原発性骨髄腫細胞の効果的な殺傷をもたらす。 ＢｉＴＥ構成における多様なＡＰＲＩＬ変異体の機能の試験 ４人の正常ドナーＰＢＭＣを、ＷＴ ＡＰＲＩＬまたは多様な変異体のいずれかに基づく異なるＢｉＴＥの存在下で、ＳｕｐＴ１細胞と共に、ＢＣＭＡを発現するように改変したＳｕｐＴ１細胞と共に、ＴＡＣＩを発現するように改変したＳｕｐＴ１細胞と共に、または単独でインキュベートした。インターフェロンガンマレベルを、２４時間後に計測した。

詳細な説明
ＡＰＲＩＬ
本発明は、バリアント増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）に関し、これは、野生型ＡＰＲＩＬよりも高いＢＣＭＡに対する結合アフィニティー、および／または野生型ＡＰＲＩＬと比較して変化した結合動態、および／または野生型ＡＰＲＩＬよりも高いＢＣＭＡ：ＴＡＣＩ（膜貫通型活性化因子およびカルシウム調節因子およびシクロフィリンリガンド相互作用因子）結合比率を有する。ＡＰＲＩＬはまた、ＴＮＦＳＦ１３としても公知である。

用語「バリアント」は、「変異体」または「改変された」と同義であり、置換（単数または複数）、付加（単数または複数）または欠失（単数または複数）などの１つまたはそれより多くの変異を含むＡＰＲＩＬを意味する。典型的に、当該変異は置換である。

ＡＰＲＩＬの野生型配列は、ＵＮＩＰＲＯＴ／Ｏ７５８８８で入手可能であり、以下に示される（配列番号１）。これはシグナルペプチドを有さないという点で古典的な分泌タンパク質ではない。これはフーリン切断部位”ＫＱＫＫＱＫ”（配列番号１において下線を引かれている）を有する。アミノ末端はプロテオグリカン結合に関係する。

Ｋｉｍｂｅｒｌｅｙら（２００９、ＦＡＳＥＢ Ｊ ２３：１５８４〜１５９５）は、ＡＰＲＩＬシグナリングにおけるヘパリン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）相互作用の役割を検証する研究である。点変異は、以下のように生成された：
１）Ｒ１４６Ｓ、Ｒ１８９Ｓ、Ｈ２２０Ｅの３つの点変異を含む、ＡＰＲＩＬ−トリプル（ＷＴ−トリプルと示される）、
２）疎水性モチーフ（ＱＫＱＫＫ^１１３Ｑ）に３つの点変異を含む、ＡＰＲＩＬ−ＨＳＰＧ（ＨＳＰＧと示される）、
３）これらの部位の両方で６つ全てのアミノ酸が変異した、ＡＰＲＩＬ−ＨＳＰＧ−トリプル（ＨＳＰＧ−トリプルと示される）。
４）ＨＳＰＧに結合することができるが、ＴＡＣＩにもＢＣＭＡにも結合する能力を欠失する（図２）ＡＰＲＩＬの形態であり、その受容体結合領域内に重要なアルギニンからアラニンへの変異を含む、ＡＰＲＩＬ−Ｒ２３１Ａ。

ＡＰＲＩＬ−Ｒ２３１Ａを除く全ての変異体は、ＢＣＭＡとＴＡＣＩとの両方に結合する能力を保持した。Ｒ２３ＩＡ変異体は、両方の受容体に対する結合の完全な消失を示したが、ＨＳＰＧに結合する能力を保持した。

本発明のバリアントＡＰＲＩＬは、ＡＰＲＩＬのＢＣＭＡ結合部位を含み得る。バリアントＡＰＲＩＬは、ＢＣＭＡ結合部位を含む、ＡＰＲＩＬのフラグメントを含み得る。

バリアントＡＰＲＩＬは、当該分子のアミノ末端端部を欠失した短縮型ＡＰＲＩＬを含み得る。短縮型ＡＰＲＩＬは、ＢＣＭＡおよびＴＡＣＩ結合を保持するが、プロテオグリカン結合は失い得る。短縮型ＡＰＲＩＬは、フーリン切断部位、またはその直後で切断され得る。短縮型ＡＰＲＩＬは、配列番号１として示される野生型ＡＰＲＩＬ分子からアミノ末端１１６アミノ酸を欠失し得る。短縮型ＡＰＲＩＬは、配列番号２として示される配列（配列番号１の太字で示される部分に対応する）またはそのバリアントを含み得る。これは、ＢＣＭＡおよびＴＡＣＩ結合に必要とされる分子の一部に対応する。

バリアントＡＰＲＩＬまたはバリアント短縮型ＡＰＲＩＬは、野生型ＡＰＲＩＬよりも（ｔｈａｔ）特異的にさせる、結合特性を有する。例えば、いくつかの実施形態または適用において、バリアントＡＰＲＩＬは、野生型ＡＰＲＩＬよりも高いＢＣＭＡに対するアフィニティーを有する。いくつかの実施形態または適用において、バリアントＡＰＲＩＬは、野生型ＡＰＲＩＬとは異なるＢＣＭＡに対する結合動態を有する。いくつかの適用において、バリアントＡＰＲＩＬは、野生型ＡＰＲＩＬまたはその組み合わせよりも高いＢＣＭＡ：ＴＡＣＩ結合比率を有する。変異体ＡＰＲＩＬは、以下の位置の１つまたはそれより多くにおける変異を含む：Ａ１２５、Ｖ１７４、Ｔ１７５、Ｍ２００、Ｐ２０１、Ｓ２０２、Ｈ２０３、Ｄ２０５およびＲ２０６（配列番号１において灰色で示される）。

特に、バリアントＡＰＲＩＬは、以下の単一変異の１つを含み得る（配列番号３〜２６）：
Ａ１２５Ｔ、
Ｖ１７４Ｔ、Ｖ１７４Ｇ、
Ｔ１７５Ｈ、Ｔ１７５Ｓ、Ｔ１７５Ｇ、
Ｍ２００Ｃ、Ｍ２００Ｌ、Ｍ２００Ｇ、Ｍ２００Ｓ、Ｍ２００Ａ、Ｍ２００Ｎ、
Ｐ２０１Ｖ、Ｐ２０１Ａ、Ｐ２０１Ｇ、Ｐ２０１Ｒ、Ｐ２０１Ｙ、Ｐ２０１Ｗ、
Ｓ２０２Ｇ、Ｓ２０２Ｆ、Ｓ２０２Ｄ、Ｓ２０２Ｖ、Ｓ２０２Ｐ、Ｄ２０５Ｐ。

これらの変異体は、ＢＣＭＡ標的化に有用であり得る様式で、ＢＣＭＡおよびＴＡＣＩに対する結合を変化させることが決定された。ＢＣＭＡおよびＴＡＣＩに対する相対的な結合は表１に示され、図１２で示されるいくつかの例とともに図１０で説明される。

バリアントＡＰＲＩＬは、以下の位置における変異の組み合わせを含み得る：Ｖ１７４およびＴ１７５、またはＶ１７４およびＭ２００、またはＶ１７４およびＳ２０２、またはＶ１７５およびＭ２００、またはＶ１７５およびＳ２０２、またはＳ２０２およびＨ２０３、またはＤ２０５およびＲ２０６、またはＶ１７４、Ｔ１７５およびＭ２００、またはＶ１７４、Ｔ１７５およびＳ２０２、またはＴ１７５、Ｄ２０５およびＲ２０６、またはＭ２００、Ｄ２０５およびＲ２０６、またはＶ１７４、Ｔ１７５、Ｍ２００およびＳ２０２、またはＴ１７５、Ｓ２０２、Ｄ２０５およびＲ２０６。

特に、バリアントＡＰＲＩＬは、以下の特定の組み合わせた変異の１つを含み得る：
Ｖ１７４ＴおよびＴ１７５Ａ、またはＶ１７４ＴおよびＭ２００Ｇ、またはＴ１７４ＳおよびＳ２０２Ｇ、または
Ｖ１７４ＴおよびＳ２０２Ｖ、またはＶ１７４ＧおよびＳ２０２Ｇ、またはＶ１７４ＧおよびＳ２０２Ｅ、または
Ｖ１７４ＧおよびＳ２０２Ａ、またはＶ１７４ＧおよびＳ２０２Ｇ、またはＶ１７４ＥおよびＳ２０２Ｙ、または
Ｔ１７５ＡおよびＳ２０２Ｅ、またはＴ１７５ＧおよびＳ２０２Ｇ、またはＴ１７５ＧおよびＳ２０２Ｖ、または
Ｔ１７５ＡおよびＳ２０２Ｐ、またはＴ１７５ＡおよびＭ２００Ｇ、またはＴ１７５ＳおよびＳ２０２Ｇ、または
Ｓ２０２ＶおよびＨ２０３Ｎ、またはＤ２０５ＨおよびＲ２０６Ｌ、またはＤ２０５ＰおよびＲ２０６Ｋ、または
Ｄ２０５ＰおよびＲ２０６Ｎ、またはＤ２０５ＳおよびＲ２０６Ｐ、またはＤ２０５ＲおよびＲ２０６Ｇ、または
Ｄ２０５ＰおよびＲ２０６Ｉ、またはＤ２０５ＳおよびＲ２０６Ｈ、または
Ｖ１７４Ｔ、Ｔ１７５ＡおよびＳ２０２Ｅ、またはＶ１７４Ｔ、Ｔ１７５ＡおよびＭ２００Ｇ、または
Ｔ１７５Ａ、Ｄ２０５ＰおよびＲ２０６Ｎ、またはＴ１７５Ａ、Ｄ２０５ＳおよびＲ２０６Ｈ、または
Ｍ２００Ｇ、Ｄ２０５ＰおよびＲ２０６Ｎ、またはＭ２００Ｇ、Ｄ２０５ＳおよびＲ２０６Ｈ、または
Ｖ１７４Ｔ、Ｔ１７５Ａ、Ｍ２００ＧおよびＳ２０２Ｅ、または
Ｔ１７５Ａ、Ｓ２０２Ｅ、Ｄ２０５ＰおよびＲ２０６Ｎ、または
Ｔ１７５Ａ、Ｓ２０２Ｅ、Ｄ２０５ＳおよびＲ２０６Ｈ。

これらの特定の組み合わせた変異は、ＢＣＭＡ標的化に有用な様式でＢＣＭＡおよびＴＡＣＩに対する結合を変化させることが示された（表２および図１１を参照）。

Ｔ細胞活性化
本発明は、
（ｉ）Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に結合し、本発明の第一の態様にしたがう変異体ＡＰＲＩＬを含む、第一のドメインおよび
（ｉｉ）Ｔ細胞を活性化させることのできる第二のドメイン
を含む、二重特異性分子もまた提供する。

本発明の分子の第二のドメインは、Ｔ細胞を活性化させることができる。Ｔ細胞は、ＭＨＣ分子によって抗原提示細胞の表面に提示されたときに抗原性ペプチドを認識する、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を細胞表面に有する。そのような抗原認識は、Ｓｒｃファミリーキナーゼによる免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）のリン酸化をもたらし、これは更なるキナーゼのリクルートを引き起こし、Ｃａ^２＋の放出を含むＴ細胞活性化をもたらす。

第二のドメインは、ＴＣＲによる抗原特異的認識によって引き起こされるものと同じパスウェイを引き起こすことによって、Ｔ細胞活性化を引き起こし得る。

ＣＤ分類３（ＣＤ３）
本発明の二重特異性分子の第二のドメインは、ＣＤ３に結合し得る。

ＣＤ３は、ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖および２つのＣＤ３ε鎖の４つの別個の鎖から構成されるタンパク質複合体である。ＣＤ３は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）およびＴ細胞の表面におけるζ鎖と相互作用し、活性化シグナルを生成する。ＴＣＲ、ζ鎖およびＣＤ３分子は、共にＴＣＲ複合体を構成する。

Ｔ細胞上でのＣＤ３の集合（例えば固定した抗ＣＤ３抗体による）は、Ｔ細胞受容体の結合に類似したＴ細胞の活性化を導くが、そのクローンの典型的な特異性には非依存的である。

Ｔ細胞活性の調節におけるその中心的な役割のため、ＴＣＲ／ＣＤ３に結合することのできる分子を開発する試みがある。この取り組みの多くは、ヒトＣＤ３抗原に特異的な抗体の生成にフォーカスしている。

第二のドメインは、ＯＫＴ３、ＷＴ３２、抗ｌｅｕ−４、ＵＣＨＴ−１、ＳＰＶ−３ＴＡ、ＴＲ６６、ＳＰＶ−Ｔ３Ｂ、またはアフィニティー調整されたそれらのバリアントなどの、ＣＤ３に特異的に結合する抗体またはその一部を含み得る。

本明細書中で使用する場合、「抗体」は、少なくとも１つの相補性決定領域ＣＤＲを含む抗原結合部位を有するポリペプチドを意味する。抗体は、３つのＣＤＲを含み、かつドメイン抗体（ｄＡｂ）の抗原結合部位と同等の抗原結合部位を有し得る。抗体は、６つのＣＤＲを含み得、古典的な抗体分子の抗原結合部位と同等の抗原結合部位を有し得る。ポリペプチドの残りは、抗原結合部位のための適当な足場を提供し、そしてそれを抗原と結合するために抗原結合部位を適切な手段で提示する、任意の配列であり得る。抗体は、免疫グロブリン分子全体またはその一部（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）’_２、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）フラグメント、ナノボディ、または一本鎖可変ドメイン（３つのＣＤＲを有するＶＨ鎖またはＶＬ鎖であり得る）など）であり得る。抗体は二機能性抗体であり得る。抗体は非ヒト、キメラ、ヒト化、または完全ヒトのものであり得る。

代替的に、第二のドメインは、免疫グロブリン由来ではないか、または免疫グロブリンに基づかないＣＤ３結合分子を含み得る。多数の「抗体模倣」設計リピートタンパク質（ＤＲＰ）が開発され、非抗体ポリペプチドの結合能が利用されている。そのような分子としては、アンキリンまたはロイシンリッチリピートタンパク質（例えば、ＤＡＲＰｉｎｓ（設計アンキリンリピートタンパク質）、アンチカリン、アビマー、およびヴァーサボディ（Ｖｅｒｓａｂｏｄｙ））が挙げられる。

本発明の二重特異性分子の第二のドメインは、ＦＤＡによって認可された最初のモノクローナル抗体である、モノクローナル抗体ＯＫＴ３の全長または一部を含み得る。ＯＫＴ３は、ＡＴＣＣ ＣＲＬ ８００１から入手可能である。この抗体の配列は、米国特許第７，３８１，８０３号において公開されている。

第二のドメインは、ＯＫＴ３由来の１つまたはそれより多くのＣＤＲを含み得る。第二の結合ドメインは、ＯＫＴ３重鎖由来のＣＤＲ３および／またはＯＫＴ３軽鎖由来のＣＤＲ３を含み得る。第二の結合ドメインは、以下に示されるＯＫＴ３由来の６つ全てのＣＤＲを含み得る。
重鎖
ＣＤＲ１：（配列番号５９）ＫＡＳＧＹＴＦＴＲＹＴＭＨ
ＣＤＲ２：（配列番号６０）ＩＮＰＳＲＧＹＴＮＹＮＱＫＦＫＤ
ＣＤＲ３：（配列番号６１）ＹＹＤＤＨＹＣＬＤＹ
軽鎖
ＣＤＲ１：（配列番号６２）ＳＡＳＳＳＶＳＹＭＮ
ＣＤＲ２：（配列番号６３）ＲＷＩＹＤＴＳＫＬＡＳ
ＣＤＲ３：（配列番号６４）ＱＱＷＳＳＮＰＦＴ

第二の結合ドメインは、ＯＫＴ３由来のＣＤＲ配列を含むｓｃＦｖを含み得る。第二の結合ドメインは、配列番号６５として以下に示されるｓｃＦｖ配列、またはＣＤ３結合能を保持し、少なくとも８０％の配列同一性を有する、そのバリアントを含み得る。

配列番号６５由来のバリアント配列は、配列番号６５として示される配列と少なくとも８０、８５、９０、９５、９８もしくは９９％の配列同一性を有し得、かつ同等または改良されたＣＤ３結合能および／またはＴＣＲ活性化能を有し得る。

二重特異性Ｔ細胞誘導体（ＢＩＴＥＳ）
ＢｉＴＥＳは、標的抗原をＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に接近させる、新しいクラスの治療薬である。その本来の設計は、一方のｓｃＦｖは抗原を標的とし、そして他方はＴ細胞を活性化させる、リンカーによって一緒に連結された２つのｓｃＦｖであった。

ＢｉＴＥは、一般的に、短い５残基ペプチドリンカー（ＧＧＧＧＳ）を介して、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖを抗標的抗原ｓｃＦｖに融合させることによって作製される。１９９５年に、ＣＨＯ細胞においてＥｐＣＡＭ（上皮１７−１Ａ抗原）およびヒトＣＤ３を標的とするタンデムｓｃＦｖが産生された。この新種の二重特異性抗体の構成は、共シグナリングの非存在下で無刺激のヒトＰＢＭＣを使用して、多様な細胞株に対してナノモル濃度で高度に細胞毒性であることが証明された。後に、マウス抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖとマウス抗ＣＤ３ ｓｃＦｖとの間の融合物が創出された。この分子は、共シグナリング（例えばＣＤ２８を通じた）の必要なしに、効果的な細胞毒性を含む傑出したインビトロ特性を実証した。

マウス抗ヒトＣＤ３×抗ヒトＣＤ１９であるブリナツモマブは、開発された最初のＢｉＴＥであり、かつ臨床試験で最も進行したＢｉＴＥである。この候補はリンパ腫および白血病への処置として研究されている。

抗ヒトＥｐＣＡＭ×抗ヒトＣＤ３ ＴａＦｖであるＭＴ１１０は、臨床試験において試験された２番目のＢｉＴＥであり、かつ広範な固形腫瘍に初めて指向された。ＭＴ１１０のインビトロ特性評価は、腫瘍細胞株においてＭＴ１０３で得られた結果を再現し、それによってＢｉＴＥ構成の普遍性を実証した。ＭＴ１１０は現在、肺がん、大腸がんおよび胃腸がん患者についての臨床試験中である。
本発明の二重特異性分子は、ＢｉＴＥ様の構成に基づくが、標的抗原に結合するｓｃＦｖまたは他の抗体に基づく結合ドメインを有する代わりに、ＢＣＭＡについてのリガンド（すなわちＡＰＲＩＬ）に基づく結合ドメインを有する。

この「ＡＰＲＩＬｉＴＥ」構成は、様々な理由で古典的なｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ構成と比較して好ましい：（ａ）単一ドメイン−ｓｃＦｖ融合物は、他の構成よりも安定であり、かつ作製が容易でありそうである；（ｂ）細胞表面でのＢＣＭＡおよびＡＰＲＩＬの集合は、それぞれの結合パートナーの三量体化を必要とする。これは、タンパク質レベルでのＴ細胞活性化ドメインの集合を誘導し、このタンパク質を高度に特異的に、かつ高度に強力にする。

本発明の分子は、以下のアミノ酸配列の１つを含み得るが、ＡＰＲＩＬに相当する配列の一部における以下の位置の１つに変異を含み得る（配列番号１に示される位置番号を参照して）：Ｓ２０２、Ｐ２０１、Ｍ２００、Ｔ１７５、Ｖ１７４、Ａ１２５、Ｈ２０３、Ｄ２０５およびＲ２０６：

本発明の分子は、そのバリアント配列が、本発明の第一の態様において定義されるような分子、すなわち
（ｉ）Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に結合し、かつ増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）の少なくとも一部を含む第一のドメイン、および
（ｉｉ）Ｔ細胞を活性化させることのできる第二のドメイン
を含む二重特異性分子である限り、配列番号６６、６７または６８として示される配列の少なくとも８０、８５、９０、９５、９８または９９％の配列同一性を有するバリアントを含み得る。

シグナルペプチド
本発明の二重特異性分子は、その産生を補助するシグナルペプチドを含み得る。シグナルペプチドは、二重特異性分子が宿主細胞上清から採取され得るように、宿主細胞による二重特異性分子の分泌を引き起こし得る。

シグナルペプチドのコアは、単一のアルファヘリックスを形成する傾向を有する、疎水性アミノ酸の長いストレッチを含み得る。シグナルペプチドは、移行の間にポリペプチドの適切なトポロジーに強制することを補助する、アミノ酸の短い正に荷電されたストレッチより開始し得る。シグナルペプチドの端部には、典型的にシグナルペプチダーゼによって認識され、かつ切断されるアミノ酸のストレッチがある。シグナルペプチダーゼは、移行間または完了の後のいずれかに切断し、遊離シグナルペプチドおよび成熟タンパク質を生成し得る。次いで遊離シグナルペプチドは、特異的なプロテアーゼによって消化される。

シグナルペプチドは、分子のアミノ末端にあり得る。

二重特異性分子は、以下の一般式を有し得る：
シグナルペプチド−第一のドメイン−第二のドメイン。

シグナルペプチドは、配列番号６９もしくは７０を含み得るか、またはシグナルペプチドが、依然として二重特異性分子の分泌を引き起こすように機能する限り、５つ、４つ、３つ、２つもしくは１つのアミノ酸変異（挿入、置換もしくは付加）を有するそれらのバリアントを含み得る。
配列番号６９：ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧ
配列番号７０：ＭＧＴＳＬＬＣＷＭＡＬＣＬＬＧＡＤＨＡＤＧ

配列番号６９および７０のシグナルペプチドは、コンパクトでありかつ高度に効率的である。それらは、末端グリシンの後ろで約９５％の切断をもたらすことが予測され、これは、シグナルペプチダーゼによる効率的な除去をもたらす。

スペーサー
本発明の分子は、第一のドメインと第二のドメインとを連結させ、この２つのドメインを空間的に離すためのスペーサー配列を含み得る。

スペーサー配列は、例えば、ＩｇＧ１ヒンジまたはＣＤ８ストークを含み得る。リンカーは、代替的にＩｇＧ１ヒンジまたはＣＤ８ストークと同様の長さおよび／またはドメイン配置特性を有する、代替的リンカー配列を含み得る。

スペーサーは、短いスペーサー（例えば１００未満、８０未満、６０未満または４５未満のアミノ酸を含むスペーサー）であり得る。スペーサーは、ＩｇＧ１ヒンジもしくはＣＤ８ストーク、またはそれらの修飾された形態であるか、またはそれらを含み得る。

これらのリンカーのためのアミノ酸配列の例は、以下に挙げられる。
配列番号７１（ＩｇＧ１ヒンジ）：ＡＥＰＫＳＰＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＫＤＰＫＳＧＧＧＧＳ
配列番号７２（ＣＤ８ストーク）：
ＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤ

ＣＤ８ストークは、ホモダイマーの形成を誘導し得るような配列を有する（図２を参照）。これが望ましくない場合、１つもしくはそれより多くのシステイン残基を、ＣＤ８ストークの配列から置換してもよいし、または除去してもよい。本発明の二重特異性分子は、スペーサーであって、配列番号７２として示される配列、または少なくとも８０、８５、９０、９５、９８もしくは９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含むか、またはそれらからなるスペーサーを含み得、ただし、そのバリアント配列は、第一のドメインおよび第二のドメインのおよそ同等の配置をもたらす分子であり、かつ／またはそのバリアント配列は、二重特異性分子のホモダイマー化を引き起こす。

本発明の分子は、以下の一般式を有し得る。
シグナルペプチド−第一のドメイン−スペーサー−第二のドメイン。

スペーサーは、チェーンブレークを導入するための１つまたはそれより多くのリンカーモチーフもまた含み得る。チェーンブレークは、２つの別個のドメインを離れさせるが、異なる角度における配向を可能にする。そのような配列として、配列ＳＤＰおよび配列ＳＧＧＧＳＤＰ（配列番号７３）が挙げられる。

リンカーは、ＳＧＧＧＧＳ（配列番号７４）などのセリン−グリシンリンカーを含み得る。

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）（キメラＴ細胞受容体、人工Ｔ細胞受容体およびキメラ免疫受容体としても公知）は、免疫エフェクター細胞上に任意の特異性を移植する、改変された受容体である。古典的なＣＡＲ（図３）において、モノクローナル抗体の特異性は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞上に移植される。ＣＡＲをコードする核酸は、例えばレトロウイルスベクターを使用して、Ｔ細胞またはＮＫ細胞中に導入され得る。このようにして、多数のがん特異的Ｔ細胞またはＮＫ細胞は、養子細胞移入のために生成させることができる。このアプローチの早期臨床的研究は、最初にＢ細胞悪性腫瘍を処置するために全Ｂ細胞抗原ＣＤ１９を標的としたときに、いくつかのがんにおける有効性を示した。

ＣＡＲの標的抗原結合ドメインは、一般的にスペーサーおよび膜貫通ドメインを介してシグナリングエンドドメインに融合される。ＣＡＲが標的抗原に結合するとき、これは標的抗原が発現されるＴ細胞へ活性化シグナルの伝達をもたらす。

ＣＡＲは、
（ｉ）Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）結合ドメインとして作用するバリアントＡＰＲＩＬ、
（ｉｉ）任意選択のスペーサー、
（ｉｉｉ）膜貫通ドメインおよび
（ｉｖ）エンドドメイン
を含み得る。

エンドドメインは、細胞内Ｔ細胞シグナリングドメインを含み得るかまたはこれと会合し得る。

本発明のＣＡＲは、以下のアミノ酸配列の１つを含み得るが、ＡＰＲＩＬに相当する配列の一部における以下の位置の１つにおいて変異を含み得る（配列番号１に示される位置番号を参照して）：Ｓ２０２、Ｐ２０１、Ｍ２００、Ｔ１７５、Ｖ１７４、Ａ１２５、Ｈ２０３、Ｄ２０５およびＲ２０６。

本発明の分子は、配列番号７５、７６、７７、７８、７９または８０として示される配列の、少なくとも８０、８５、９０、９５、９８または９９％の配列同一性を有するバリアントを含み得、ただし、バリアント配列は、本発明の第一の態様において定義される分子、すなわち、
（ｉ）ＢＣＭＡ結合ドメイン、
（ｉｉ）任意選択のスペーサードメイン、
（ｉｉｉ）膜貫通ドメインおよび
（ｉｖ）エンドドメイン
を含むＣＡＲであり、かつＡＰＲＩＬに相当する配列の一部において以下の位置の１つにおいて変異を含む（配列番号１に示される位置番号を参照して）：Ｓ２０２、Ｐ２０１、Ｍ２００、Ｔ１７５、Ｖ１７４、Ａ１２５、Ｈ２０３、Ｄ２０５およびＲ２０６。

２つのポリペプチド配列間の同一性パーセンテージは、ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．において自由に入手できるＢＬＡＳＴなどのプログラムによって容易に決定され得る。

核酸配列
本発明は、上記で定義されるようなバリアントＡＰＲＩＬ、バリアントＡＰＲＩＬを含むＣＡＲまたはバリアントＡＰＲＩＬを含むＢｉＴＥをコードする核酸配列もまた提供する。

核酸配列は、ＲＮＡまたはＤＮＡであり得、二本鎖または一本鎖であり得る。

ＡＰＲＩＬ−ＢｉＴＥをコードする核酸配列は、配列番号８１〜８３として示される。本発明の核酸配列は、配列番号８１、８２または８３によってコードされる通りのアミノ酸配列をコードし得るが、ＡＰＲＩＬに相当する配列の一部において以下の位置の１つにおいて変異を含み得る（配列番号１に示される位置番号を参照して）：Ｓ２０２、Ｐ２０１、Ｍ２００、Ｔ１７５、Ｖ１７４、Ａ１２５、Ｈ２０３、Ｄ２０５およびＲ２０６。

ＡＰＲＩＬ−ＣＡＲをコードする核酸配列は、配列番号８４〜８９として示される。本発明の核酸配列は、配列番号８４、８５、８６、８７、８８または８９によってコードされる通りのアミノ酸配列をコードし得るが、ＡＰＲＩＬに相当する配列の一部において以下の位置の１つにおいて変異を含み得る（配列番号１に示される位置番号を参照して）：Ｓ２０２、Ｐ２０１、Ｍ２００、Ｔ１７５、Ｖ１７４、Ａ１２５、Ｈ２０３、Ｄ２０５およびＲ２０６。

核酸配列は、上記で言及されるバリエーションを含む配列番号８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８または８９によってコードされるアミノ酸配列と同じアミノ酸配列をコードし得るが、遺伝暗号の縮重に起因して、異なる核酸配列を有し得る。核酸配列は、本発明の第一の態様で定義される分子をコードする限り、配列番号８１〜８９として示される配列と、少なくとも８０、８５、９０、９５、９８、または９９％の同一性を有し得る。

核酸配列は、配列番号８１〜８９によってコードされるアミノ酸配列をコードし得るが、以下の単一変異の１つを含み得る（配列番号２２〜４５）。
Ａ１２５Ｔ、
Ｖ１７４Ｔ、Ｖ１７４Ｇ、
Ｔ１７５Ｈ、Ｔ１７５Ｓ、Ｔ１７５Ｇ、
Ｍ２００Ｃ、Ｍ２００Ｌ、Ｍ２００Ｇ、Ｍ２００Ｓ、Ｍ２００Ａ、Ｍ２００Ｎ、
Ｐ２０１Ｖ、Ｐ２０１Ａ、Ｐ２０１Ｇ、Ｐ２０１Ｒ、Ｐ２０１Ｙ、Ｐ２０１Ｗ、
Ｓ２０２Ｇ、Ｓ２０２Ｆ、Ｓ２０２Ｄ、Ｓ２０２Ｖ、Ｓ２０２Ｐ、Ｄ２０５Ｐ。

核酸配列は、配列番号８１〜８９によってコードされるアミノ酸配列をコードし得るが、以下の位置における変異の組み合わせを含み得る：Ｖ１７４およびＴ１７５、またはＶ１７４およびＭ２００、またはＶ１７４およびＳ２０２、またはＶ１７５およびＭ２００、またはＶ１７５およびＳ２０２、またはＤ２０５およびＲ２０６、またはＶ１７４、Ｔ１７５およびＭ２００、またはＶ１７４、Ｔ１７５およびＳ２０２、またはＴ１７５、Ｄ２０５およびＲ２０６、またはＭ２００、Ｄ２０５およびＲ２０６、またはＶ１７４、Ｔ１７５、Ｍ２００およびＳ２０２、またはＴ１７５、Ｓ２０２、Ｄ２０５およびＲ２０６。

核酸配列は、配列番号８１〜８９によってコードされるアミノ酸配列をコードし得るが、以下の特定の変異の組み合わせの１つを含み得る：
Ｖ１７４ＴおよびＴ１７５Ａ、またはＶ１７４ＴおよびＭ２００Ｇ、またはＴ１７４ＳおよびＳ２０２Ｇ、または
Ｖ１７４ＴおよびＳ２０２Ｖ、またはＶ１７４ＧおよびＳ２０２Ｇ、またはＶ１７４ＧおよびＳ２０２Ｅ、または
Ｖ１７４ＧおよびＳ２０２Ａ、またはＶ１７４ＧおよびＳ２０２Ｇ、またはＶ１７４ＥおよびＳ２０２Ｙ、または
Ｔ１７５ＡおよびＳ２０２Ｅ、またはＴ１７５ＧおよびＳ２０２Ｇ、またはＴ１７５ＧおよびＳ２０２Ｖ、または
Ｔ１７５ＡおよびＳ２０２Ｐ、またはＴ１７５ＡおよびＭ２００Ｇ、またはＴ１７５ＳおよびＳ２０２Ｇ、または
Ｓ２０２ＶおよびＨ２０３Ｎ、またはＤ２０５ＨおよびＲ２０６Ｌ、またはＤ２０５ＰおよびＲ２０６Ｋ、または
Ｄ２０５ＰおよびＲ２０６Ｎ、またはＤ２０５ＳおよびＲ２０６Ｐ、またはＤ２０５ＲおよびＲ２０６Ｇ、または
Ｄ２０５ＰおよびＲ２０６Ｉ、またはＤ２０５ＳおよびＲ２０６Ｈ、または
Ｖ１７４Ｔ、Ｔ１７５ＡおよびＳ２０２Ｅ、またはＶ１７４Ｔ、Ｔ１７５ＡおよびＭ２００Ｇ、または
Ｔ１７５Ａ、Ｄ２０５ＰおよびＲ２０６Ｎ、またはＴ１７５Ａ、Ｄ２０５ＳおよびＲ２０６Ｈ、または
Ｍ２００Ｇ、Ｄ２０５ＰおよびＲ２０６Ｎ、またはＭ２００Ｇ、Ｄ２０５ＳおよびＲ２０６Ｈ、または
Ｖ１７４Ｔ、Ｔ１７５Ａ、Ｍ２００ＧおよびＳ２０２Ｅ、または
Ｔ１７５Ａ、Ｓ２０２Ｅ、Ｄ２０５ＰおよびＲ２０６Ｎ、または
Ｔ１７５Ａ、Ｓ２０２Ｅ、Ｄ２０５ＳおよびＲ２０６Ｈ。

ベクター
本発明は、本発明にしたがう核酸配列を含むベクターも提供する。そのようなベクターは、本発明の第一の態様にしたがうバリアントＡＰＲＩＬを発現し、かつ産生するよう、宿主細胞に核酸配列を導入するために使用され得る。

ベクターは、例えばプラスミドもしくは合成ｍＲＮＡ、またはレトロウイルスベクターもしくはレンチウイルスベクターなどのウイルスベクターであり得る。

ベクターは、エフェクター細胞にトランスフェクションまたは形質導入する能力を有し得る。

細胞
本発明は、本発明にしたがう核酸を含む宿主細胞も提供する。

本発明は、本発明にしたがうＣＡＲを含む細胞もまた提供する。

細胞は、Ｔ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などの免疫細胞であり得る。細胞は、初代細胞または細胞株由来の細胞であり得る。

本発明は、本発明の複数のＣＡＲを発現する細胞を含む細胞組成物もまた提供する。

本発明は、キメラ抗原受容体をコードする核酸配列を含む本発明のベクターを、細胞に形質導入する工程またはトランスフェクションする工程を含む、本発明にしたがう細胞を作製するための方法もまた提供する。

細胞は、エキソビボでトランスフェクションまたは形質導入され得、その後同じ被験体または異なる被験体へ再移植され得る。

治療薬剤
本発明は、上記で定義される通りのバリアントＡＰＲＩＬ、核酸、ベクター、ＣＡＲ発現細胞またはＢｉＴＥを含む治療薬剤を提供する。

治療薬剤は、薬剤を形質細胞などのＢＣＭＡ発現細胞へと標的化するための標的化部分としてバリアントＡＰＲＩＬを含み得る。治療薬剤は、例えば形質細胞に直接作用するか、または形質細胞に作用するために免疫系の他の細胞をリクルートすることによって治療効果（ａｆｆｅｃｔ）を発揮する、機能ドメインもまた含み得る。

バリアントＡＰＲＩＬは、細胞傷害性薬物などの薬物と結合され得る。

バリアントＡＰＲＩＬは、キメラ抗原受容体または二重特異性Ｔ細胞誘導体（ＢｉＴＥ）の一部であり得る。

薬学的組成物
本発明は、本発明の治療薬剤を、薬学的に許容されるキャリア、希釈液、もしくは賦形剤、および任意に１つまたは複数の更に薬学的に有効なポリペプチド、および／もしくは化合物を一緒に含む薬学的組成物にも関する。そのような製剤は、例えば、静脈注入に適した形式であり得る。

処置の方法
本発明の治療薬剤および薬学的組成物は、がん性の疾患、特に亢進したＢＣＭＡ発現に関連する形質細胞障害またはＢ細胞障害の治療のために使用され得る。

形質細胞障害は、形質細胞腫、形質細胞性白血病、多発性骨髄腫、マクログロブリン血症、アミロイドーシス、ワルデンストレーム型マクログロブリン血症、孤立性骨形質細胞腫、髄外性形質細胞腫、骨硬化性ミエローマ（ＰＯＥＭＳ症候群）、およびＨ鎖病と意義不明の単クローン性免疫グロブリン血症／くすぶり型多発性骨髄腫を含む。

その疾患は、多発性骨髄腫であり得る。

上昇したＢＣＭＡ発現レベルに相関するＢ細胞障害の例は、ＣＬＬ（慢性リンパ性白血病）および非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）である。本発明の二重特異性結合薬剤は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、多発性硬化症（ＭＳ）、および関節リウマチ（ＲＡ）のような自己免疫疾患の治療においても使用され得る。

本発明の方法は、がん性の疾患、特に亢進したＢＣＭＡ発現に相関する形質細胞障害またはＢ細胞障害の治療のためであり得る。

疾患の処置のための方法は、本発明の薬剤または組成物の治療上の使用に関係する。この点で、薬剤または組成物は疾患に付随する少なくとも１つの症状を小さくする、減少する、もしくは改善する、および／または疾患の進行を遅延する、減少する、もしくは阻止するために、既存の疾患または状態を有する被験体に投与され得る。本発明の方法は、形質細胞などのＢＣＭＡ発現細胞のＴ細胞媒介性の殺傷を引き起こすか、または促進し得る。

診断
本発明は、本発明のバリアントＡＰＲＩＬを含む、形質細胞を検出するための診断薬剤もまた提供する。

診断薬剤は、放射性ラベルもしくは蛍光ラベルまたは色素などの検出可能なラベルもまた含み得る。

診断薬剤は、形質細胞障害を診断するためのものであり得る。

診断方法は、インビボまたはインビトロで行われ得る。インビボ法において、診断薬剤は被験体へ投与される。

インビトロ法において、バリアントＡＰＲＩＬは、インビトロで被験体由来のサンプルへ添加される。当該サンプルは、形質細胞を含み得る。当該サンプルは、ＰＢＭＣサンプルなどの血液サンプルであるか、またはそれに由来し得る。

ここで本発明がさらに実施例によって記載されるが、これは本発明の実施において当業者を支援することに役立つことを意図しており、本発明の範囲を制限することを何ら意図しない。

実施例１ 骨髄腫への標的としてのＢＣＭＡの特性評価
初代骨髄腫細胞を、明らかに疾患を有することが知られている多発性骨髄腫患者由来の、新鮮な骨髄サンプルでのＣＤ１３８免疫磁気的選択を行うことによって単離した。これら細胞は、ＰＥと結合体化されたＢＣＭＡ特異的Ｊ６ＭＯ ｍＡｂ（ＧＳＫ）により染色した。同時に、既知の数の結合部位を有するビーズの標準が、ＰＥ Ｑｕａｎｔｉｂｒｉｔｅ ｂｅａｄ ｋｉｔ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）を使用して、製造者の指示通りに生成した。骨髄腫細胞でのＢＣＭＡコピー数は、骨髄腫細胞からの平均蛍光強度と、ビーズより得られた標準曲線とを相関させることによって得ることができた。骨髄腫細胞表面でのＢＣＭＡコピー数の範囲は低く：細胞あたり３４８．７〜４２６８．４ ＢＣＭＡコピーであり、平均値が１１８１、中間値が１０８４．９（図２）であることが見出された。これは、ＣＡＲへの古典的な標的である、例えばＣＤ１９およびＧＤ２などより相当低い。初代骨髄腫細胞でのＢＣＭＡ発現の存在は、Ｖｉｃｋｙ−１抗体（Ａｂｃａｍ Ａｂ１７３２３）によっても確認され、この例は図１８に示される。

実施例２ ＡＰＲＩＬに基づくＣＡＲのデザインおよび構築
天然形態におけるＡＰＲＩＬは、分泌型ＩＩ型タンパク質である。ＣＡＲのためのＢＣＭＡ結合ドメインとしてのＡＰＲＩＬの使用、およびこのタンパク質を安定に、かつこの形態でのＢＣＭＡへの結合を保持するためには、このＩＩ型分泌タンパク質のＩ型膜結合タンパク質への転換を必要とする。候補分子を生成するために、ＡＰＲＩＬの先端のアミノ末端を欠失させて、プロテオグリカンへの結合を除去した。次に、新生タンパク質を小胞体へ、そしてそこから細胞表面へと指向させるために、シグナルペプチドを付加した。また、使用したスペーサーの性質が、ＣＡＲの機能を変化させ得るため、３つの異なるスペーサードメインを試験した：（ｉ）Ｆｃ結合モチーフを除去するために変化させたヒトＩｇＧ１スペーサー；（ｉｉ）ＣＤ８ストーク；および（ｉｉｉ）ＩｇＧ１ヒンジ単独、を含むＡＰＲＩＬに基づくＣＡＲが生成された（図４に漫画および図５にアミノ酸配列、ならびに図１９にも異なるシグナルペプチドおよびＶ５エピトープタグを有する点で、図５に示される配列とは異なるアミノ酸配列）。これらＣＡＲは、マーカータンパク質（短縮型ＣＤ３４）が、便利なマーカー遺伝子として共発現できるように、バイシストロニックなレトロウイルスベクター（図６Ａ）に発現させた。

実施例３ ＡＰＲＩＬに基づくＣＡＲの発現および機能
本研究の目的は、構築されたＡＰＲＩＬに基づくＣＡＲが、細胞表面に発現するか否か、およびＡＰＲＩＬが本来のタンパク質を形成するようにフォールディングされるか否かを試験することであった。Ｔ細胞にこれらの異なるＣＡＲコンストラクトを形質導入し、そして市販の抗ＡＰＲＩＬ ｍＡｂを使用した染色と同時にマーカー遺伝子についての染色を行い、そしてフローサイトメトリーによって解析した。この実験の結果は、図６Ｂに示され、ここでＡＰＲＩＬ結合は、マーカー遺伝子の蛍光に対してプロットしている。これらデータは、この形式においてＡＰＲＩＬに基づくＣＡＲは細胞表面に発現しており、かつＡＰＲＩＬは、抗ＡＰＲＩＬ ｍＡｂにより認識されるのに十分にフォールディングされることを示す。

次に、この構成のＡＰＲＩＬは、ＢＣＭＡおよびＴＡＣＩを認識できるか否かを決定した。リコンビナントＢＣＭＡおよびＴＡＣＩを、マウスＩｇＧ２ａ−Ｆｃとの融合物として生成した。これらリコンビナントタンパク質を、形質導入されたＴ細胞とインキュベートした。この後に、細胞を洗浄し、そして抗マウスの蛍光物質と結合体化された抗体、および異なる蛍光物質と結合体化された、マーカー遺伝子を検出するための抗体によって染色した。細胞をフローサイトメトリーにより解析し、その結果は図６Ｃに提示される。異なるＣＡＲは、ＢＣＭＡおよびＴＡＣＩの両方に結合することができた。驚くべきことに、ＣＡＲはＴＡＣＩよりも良好にＢＣＭＡに結合することができた。また驚くべきことに、ＣＤ８ストークまたはＩｇＧ１ヒンジスペーサーを有するＣＡＲは、Ｆｃスペーサーを有するＣＡＲよりも良好に、ＢＣＭＡおよびＴＡＣＩに結合することができた。

実施例４ ＡＰＲＩＬに基づくキメラ抗原受容体は、ＢＣＭＡ発現細胞に対して活性的である
正常ドナー由来Ｔ細胞に、異なるＡＰＲＩＬ ＣＡＲを形質導入し、そして野生型、またはＢＣＭＡおよびＴＡＣＩを発現するように改変した、いずれかのＳｕｐＴ１細胞に対して試験した。機能を決定するために、数種の異なる分析を使用した。古典的なクロム放出分析を行った。ここで、標的細胞（ＳｕｐＴ１細胞）を、^５１Ｃｒを用いて標識し、そしてエフェクター（形質導入されたＴ細胞）と、異なる比率で混合した。標的細胞の溶解は、共培養上清中の^５１Ｃｒを計数することにより、決定した（図６Ａは累積のデータを示し、異なるエフェクター：標的比での単独の分析からのデータ例は、図１６に示される）。

加えて、ＳｕｐＴ１細胞と１：１で培養したＴ細胞由来上清を、インターフェロンガンマについてＥＬＩＳＡによって分析した（図６Ｂは累積のデータを示し、単独の分析からのデータ例は図１７に示される）。ＳｕｐＴ１細胞との共培養の１週間後でのＴ細胞増加量の計測も行った（図６Ｃ）。Ｔ細胞は、計数ビーズを用いて調整したフローサイトメトリーによって計数した。これら実験データは、ＡＰＲＩＬに基づくＣＡＲが、ＢＣＭＡを発現する標的を殺傷することができることを示す。更にこれらデータは、ＣＤ８ストークまたはＩｇＧ１ヒンジに基づくＣＡＲが、Ｆｃ−ｐｖａａに基づくＣＡＲよりも良好に挙動したことを示す。

実施例５ ＡＰＲＩＬに基づくＣＡＲは、原発性骨髄腫細胞を殺傷することができる
上記データは、原理的にはＡＰＲＩＬに基づくＣＡＲを作製することができることを実証しているため、励まされる。しかしながら、ほとんどの原発性骨髄腫細胞は、その表面において少数のＢＣＭＡ分子を発現するため、そのようなＡＰＲＩＬに基づくＣＡＲが、特に低密度発現の症例において、原発性骨髄腫細胞の殺傷を引き起こすか否かについて調べた（ｉｎｖｅｓｔｉａｇａｔｅｄ）。図２において記載されたＢＣＭＡ発現の範囲に相当する３症例を選択した：第一は不明瞭な発現を有する（平均より低い）；第二の症例は中間的な発現を有する（ほぼ平均の発現）、そして第三は明瞭な発現を有した（平均の発現よりも上）。図８は、ＢＣＭＡ発現を説明するために、左に３症例全てについてのアイソタイプ対照に対するＢＣＭＡ染色のヒストグラムを示す。異なるスペーサーを有するＡＰＲＩＬに基づくＣＡＲを比較したときに、ＣＤ８ストークのスペーサーおよびＩｇＧ１ヒンジスペーサーを有するＣＡＲが、Ｆｃ−ｐｖａａで間隔を開けられたＣＡＲよりも良好に挙動することが決定されたため、この分析においてはＣＤ８ストークおよびヒンジのＡＰＲＩＬ ＣＡＲのみを試験した。左に、骨髄腫細胞とＣＡＲ Ｔ細胞の１：１共培養後３日および６日での、開始数と比較した骨髄腫細胞の生存を示す。６日までに、不明瞭なＢＣＭＡ発現を有する骨髄腫細胞を含む、９５％超の骨髄腫細胞が排除された。不明瞭にＢＣＭＡを発現する骨髄腫細胞は、高度に発現するものよりも殺傷の速度は遅いが、ＡＰＲＩＬ ＣＡＲによって標的とされ得る。

実施例６ 一連の「ＡＰＲＩＬＩＴＥＳ」の構築
本発明者らは、図２４Ａに示されるように、ＯＫＴ３由来のｓｃＦｖをＡＰＲＩＬの細胞外ドメインへと連結させる一連の二重特異性誘導体を構築した。数種の設計の検討を、これらの分子の構築の間に行った：（ａ）プロテオグリカンに結合するＡＰＲＩＬのアミノ末端を、非特異的結合を防ぐために短縮化した、（ｂ）コンストラクト４、５および６において、シグナルペプチドをＡＰＲＩＬの成熟エクトドメインに結合させた、（ｃ）ＯＫＴ３を、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを連結させるリンカーを含むｓｃＦｖとして再構成した、（ｄ）多様な異なるスペーサーを、ｓｃＦｖとＡＰＲＩＬとの間で試行した。

多様な異なる構成は、以下の通りである。
（１）ＩｇＧ１ヒンジによって短縮型ＡＰＲＩＬに連結させたＯＫＴ３ ｓｃＦｖ、
（２）（ＳＧＧＧＧＳ）３リンカーを介して短縮型ＡＰＲＩＬに連結させたＯＫＴ３ ｓｃＦｖ、
（３）ＣＤ８ストークを介して短縮型ＡＰＲＩＬに連結させたＯＫＴ３ ｓｃＦｖ、
（４）ＩｇＧ１ヒンジを介してＯＫＴ３ ｓｃＦｖに連結させた短縮型ＡＰＲＩＬ、
（５）（ＳＧＧＧＧＳ）３リンカーを介してＯＫＴ３ ｓｃＦｖに連結させた短縮型ＡＰＲＩＬおよび
（６）ＣＤ８スペーサーを介してＯＫＴ３ ｓｃＦｖに連結させた短縮型ＡＰＲＩＬ。
コンストラクト（３）および（６）は、ＣＤ８スペーサーにおけるジスルフィド結合を通じてホモダイマーを形成する。コンストラクト（１）、（３）および（６）についてのアミノ酸配列は、図３０に示される。

実施例７ ２９３Ｔ細胞におけるＡＰＲＩＬｉＴＥの発現
２９３ Ｔ細胞に、上記に列挙されるＡＰＲＩＬｉＴＥコンストラクトをコードする発現プラスミドをトランスフェクションした。２９３Ｔ細胞由来の上清をアクリルアミドゲル上で流し、タンパク質を膜に転写した。その後、膜を、ＡＰＲＩＬを認識する抗体を用いて染色した。この結果は、図２５に示される。タンパク質１、３および６が、予想される分子量において検出された。タンパク質２、４および５は検出されず、これは、これらの構造が不安定であることを示す。

実施例８ ＴＣＲおよびＢＣＭＡへの結合
その後、これらのタンパク質が、一方の末端でＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と、および他方の末端でＢＣＭＡとのいずれにも結合できるか否かを検証した。トランスフェクションした２９３Ｔ細胞由来の上清を、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞およびＴＣＲαβノックアウトを有するＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞クローンを染色するために使用した。これは、ＡＰＲＩＬｉＴＥが、ＴＣＲに結合することを実証する（図２６ｂ）。その後、ＢＣＭＡを発現するように改変したＳｕｐＴ１細胞およびＴＡＣＩを発現するように改変したＳｕｐＴ１細胞を、二次抗ＡＰＲＩＬビオチン次いでストレプトアビジンＰＥを使用して、上記の上清で染色した。この結果は、図２６ａに示される。ＡＰＲＩＬｉＴＥ１、３および６はＢＣＭＡに結合し、そしてＴＡＣＩにはより少ない程度で結合したことが見出された。

実施例９ 安定なＡＰＲＩＬＩＴＥは、ＩＦＮγ放出を引き起こす
正常ドナーＴ細胞を、異なるＳｕｐＴ１と１：１で培養した。使用したＳｕｐＴ１は、形質導入なし、ＢＣＭＡを発現するように改変したものまたはＴＡＣＩを発現するように改変したもののいずれかであった。この結果は、図２７に示される。Ｔ細胞は、いずれかのＡＰＲＩＬｉＴＥの存在下で、ＢＣＭＡまたはＴＡＣＩで改変したＳｕｐＴ１細胞を用いて曝露した場合にのみＩＦＮγを放出することが見出された。ＢＣＭＡに対する応答は、ＴＡＣＩに対する応答よりも大きかった。

実施例１０ 安定なＡＰＲＩＬＩＴＥは、ＢＣＭＡ＋標的のＴ細胞媒介性の殺傷を引き起こす
Ｔ細胞を、ＡＰＲＩＬｉＴＥ１、３および６の非存在下または存在下で、野生型ＳｕｐＴ１細胞と、ＢＣＭＡを発現するＳｕｐＴ１細胞とおよびＴＡＣＩを発現するＳｕｐＴ１細胞と１：１で培養した。この結果は、図２８に示される。残存Ｔ細胞は、ＡＰＲＩＬｉＴＥの添加なしの条件で存在するＳｕｐＴ１細胞の比率として示される。

実施例１１ 原発性骨髄腫細胞におけるＢＣＭＡ発現の検証
４種の異なる骨髄腫サンプルを、ラット抗ヒトＢＣＭＡ ｍＡｂ Ｖｉｃｋｙ１を用いて染色した。この結果は、図２９に示される。臨床的および形態的に典型的な骨髄腫（パネル２〜４）において、中間的または不明瞭な染色が見られる。

実施例１２ 原発性骨髄腫細胞におけるＡＰＲＩＬｉＴＥの効果の検証
既知の多発性ＢＣＭＡ＋骨髄腫を有する２人の患者由来の診断用骨髄吸引物由来の残りの材料を使用した。ＣＤ１３８磁気ビーズ選択を、吸引物から骨髄腫細胞を精製するために行った。これらの細胞を、完全培養培地において４８時間静置し、ＢＣＭＡについての染色を、実際にＢＣＭＡ陽性であることを確認するために行った。骨髄腫細胞はＢＣＭＡを発現するが、低レベルであることが見出された（図３１）。

次に、ＯＫＴ３およびＣＤ２８．２を使用して刺激した正常ドナー末梢単核細胞を、ＣＤ５６枯渇させ、ＮＫ細胞を除去した。ＣＤ５６を枯渇させたＰＢＭＣとＣＤ１３８選択した原発性骨髄腫細胞との１：１共培養を、ＡＰＲＩＬＩＴＥ＃０３および＃０６のいずれかの非存在下または存在下で行った。ＡＰＲＩＬｉＴＥ＃０１を試験するためには、材料が不十分であった。共培養物を、顕微鏡によって観察した。上清へのインターフェロンガンマの放出を、ＥＬＩＳＡによって測定した。骨髄腫細胞の生存を、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ／ＰＩ染色およびビーズカウント調整フローサイトメトリーによって測定した。

明らかな集合（Ｔ細胞活性化の指標）が、共培養において見られた（図３２を参照）。インターフェロンガンマ放出は、ＰＢＭＣをＡＰＲＩＬｉＴＥの存在下で骨髄腫細胞と培養した条件で観察されたが、ＳｕｐＴ１．ＢＣＭＡ細胞と共培養したときよりも低い絶対量であった（図３３）。骨髄腫細胞の殺傷は、ＰＢＭＣが、ＡＰＲＩＬｉＴＥと共に存在する場合での共培養の６日後でも観察された（図３４）。

これらの発見は、ＡＰＲＩＬｉＴＥが、原発性骨髄腫細胞の存在下で、骨髄腫細胞のＴ細胞媒介性の殺傷を引き起こすのに十分なレベルでＴ細胞活性化を引き起こすことを実証する。

実施例１３ インビボでのＡＰＲＩＬｉＴＥの試験
ｈｕＳＣＩＤモデルを使用した：ＮＳＧ（ｎｏｄ−ｓｃｉｄガンマ、ＮＯＤ−ｓｃｉｄ ＩＬ２Ｒガンマ^ｎｕｌｌ）マウスに典型的なレベルのＢＣＭＡを発現する骨髄腫細胞株を異種移植する。これらの系統を、生物発光イメージングによって疾患を測定するために、ホタルルシフェラーゼを発現するように改変する。正常ドナーＰＢＭＣを、付随するＡＰＲＩＬｉＴＥの腹腔内投与の間に尾静脈を介して投与する。以下を順に測定する（１）ＡＰＲＩＬｉＴＥの血清レベル、（２）ヒトインターフェロンガンマの血清レベル、（３）フローサイトメトリーによる末梢血Ｔ細胞の増加量、生着および活性化、（４）腫瘍の生物発光測定。次に、以下を測定する：（１）骨髄の組織学による腫瘍の負荷、（２）骨髄、脾臓、血液およびリンパ節のフローサイトメトリーによるＴ細胞の増殖および生着および（３）残りの組織を、いずれかの毒性について肉眼および免疫組織学的に調べる。

実施例１４ ＢＣＭＡ標的化に特に適切なＡＰＲＩＬ変異体の生産
目的は、ＣＡＲのためにより適切であり得る結合を有するＡＰＲＩＬ変異体を生成することであった。Ｈｙｍｏｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ，２００４，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｖｏｌｕｍｅ ２８０；Ｉｓｓｕｅ ８；Ｐａｇｅｓ ７２１８−２７によって記載された結晶データならびにＲＣＳＢデポジット１ＸＵ１および１ＸＵ２からの結晶データを使用して、ＢＣＭＡへの結合を変化させ得るか、またはＴＡＣＩよりもＢＣＭＡに対する特異性を上昇させ得る数種の残基を選択した。

有用な性質を有するこれらの残基における変異を同定するための戦略は、図３１Ｂにおいて概説される。変異のためにコドンに対して縮重であるオリゴヌクレオチドを用いたスプライシングオーバーラップＰＣＲを使用して、変異体ＡＰＲＩＬのライブラリーを、重要な変異について生成し、無作為化した。これらのライブラリーを、ＣＤ８ストーク上にＡＰＲＩＬを提示し、かつＣＤ３４を口蹄疫２Ａペプチドと共に共発現する、図３１Ａに示される足場にライゲーションした。このコンストラクト由来の典型的な発現は、図９に示される。これらのライゲーション産物をコンピテント細菌に形質転換し、単一コロニーを取り、個別に増加させ、そしてそのＤＮＡを抽出し、そして２９３Ｔ細胞にトランスフェクションした。

次いで２９３Ｔ細胞を別個にリコンビナントヒトＢＣＭＡ−ＦｃまたはＴＡＣＩ−Ｆｃのいずれかとインキュベートした。その後、細胞を洗浄し、Ｊａｃｋｓｏｎポリクローナル抗Ｆｃ Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ ４８８を用いて二次的に染色し、マーカー遺伝子を抗ＣＤ３４ ＡＰＣを用いて染色した。ＡＰＲＩＬ変異体を野生型ＡＰＲＩＬおよびそれぞれのバッチにおける対照としてのＣＤ３４単独を用いて、この方法でバッチでスクリーニングした。ＣＤ３４陽性の事象を、図３１に示される番号の４つのゲートに分割した。Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ ４８８平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、それぞれのゲートについて計算し、多様なゲートのＭＦＩ間の平均グラディエントを、以下の式を使用して計算した：［（ＭＦＩ．１−ＭＦＩ．２）＋（ＭＦＩ．２−ＭＦＩ．３）＋（ＭＦＩ．３−ＭＦＩ．４）］／３（図３１Ｃにおいて説明される）。

この方法で、平均ＭＦＩグラディエントを、それぞれのＡＰＲＩＬ変異体についてのＢＣＭＡおよびＴＡＣＩへの結合について計算した。それぞれの変異体について、ＢＣＭＡ結合およびＴＡＣＩ結合の平均ＭＦＩグラディエントを、それぞれのバッチにおけるＡＰＲＩＬ ＷＴ対照への結合の比率に変換した。有用な可能性のある変異体を生じるプラスミドを、キャピラリーシークエンスによって配列決定した。

この最初のスクリーニングの結果は、表１に要約され、図１０で説明される。

その後、変異体のクラスを単一変異について概説されるものと同様の戦略によって一緒に組み合わせたが、更なる変異を導入するために変異体ＡＰＲＩＬをコードするプラスミドを鋳型として使用した。この取り組みの結果は、表２に要約され、図１１で説明される。野生型よりもはるかに高いＢＣＭＡに対するアフィニティーを有する変異体を生成することが可能であった（例えば、変異体Ｄ２０５Ｒ、Ｒ２０６Ｇ）。本発明者らは、野生型ＡＰＲＩＬと同程度のＢＣＭＡ結合を有するが、ＴＡＣＩに結合しない変異体を生成することができた（例えば、変異体Ｔ１７５Ａ、Ｓ２０２Ｐ）。本発明者らは、野生型よりも低いＢＣＭＡへの結合を有するが（これは、逆説的に低密度抗原の認識を改善し得る）、ＴＡＣＩに結合しない変異体もまた生成することができた（例えば、Ｖ１７４Ｔ、Ｔ１７５Ａ、Ｍ２００Ｇ、Ｓ２０２Ｅ）。

最も見込みのある変異体由来のラージスケールの高品質のプラスミドＤＮＡを生成し、トランスフェクションおよび発現データの反復を行った。これらのデータは、図１２に示される。

実施例１５ Ｆｃスペーサーに融合された分泌型および短縮型のＡＰＲＩＬは、ＢＣＭＡおよびＴＡＣＩを認識する
ＣＡＲ形式（すなわち、膜貫通ドメインに融合し、そして細胞膜に固定した）における短縮型ＡＰＲＩＬが、ＢＣＭＡおよびＴＡＣＩに結合できるか否か調べるために、基本的なＣＡＲを、自己切断する口蹄疫２Ａペプチドを用いて、便利なマーカー遺伝子としての短縮型ＣＤ３４と共に、インフレームで改変した。このコンストラクトを発現する安定なＳＵＰＴ１細胞株を樹立した。ヒト（および他種、示されない）Ｉｇ Ｆｃドメインに融合した分泌型の短縮型ＢＣＭＡおよびＴＡＣＩもまた生成し、そしてリコンビナントタンパク質を産生した。ＢＣＭＡ−ＦｃとＴＡＣＩ−Ｆｃとの両方が、改変されたＳＵＰＴ１細胞株に結合することが示された。ＣＤ３４マーカー遺伝子を発現する細胞のみが、ＢＣＭＡ−ＦｃおよびＴＡＣＩ−Ｆｃに結合することが見出された（図９）。

実施例１６ ＡＰＲＩＬに基づくキメラ抗原受容体は、Ｔ細胞の表面で安定に発現される
ＣＡＲスペーサードメインは、感度および特異性を変化させ得る。３つのスペーサードメインを有する、３つの型のＡＰＲＩＬに基づくＣＡＲが生成された：（ｉ）Ｆｃ結合モチーフを除去するために改変したヒトＩｇＧ１スペーサー；（ｉｉ）ＣＤ８ストーク；および（ｉｉｉ）ＩｇＧ１ヒンジ単独（図１４Ｂ）。初代ヒトＴ細胞にこれらの異なるＣＡＲを形質導入し、そして市販の抗ＡＰＲＩＬ ｍＡｂを使用して染色した（図１５）。

実施例１７ ＡＰＲＩＬに基づくキメラ抗原受容体は、同種の標的を発現する細胞に対して活性的である
通常ドナー由来Ｔ細胞に、異なるＡＰＲＩＬ ＣＡＲを形質導入し、そして野生型、またはＢＣＭＡおよびＴＡＣＩを発現するように改変したＳｕｐＴ１細胞に対して試験した。機能を決定するために、数種の異なる分析を使用した。古典的なクロム放出分析を行った。ここで、標的細胞（ＳｕｐＴ１細胞）は^５１Ｃｒを用いて標識し、そして異なる比率でエフェクター（形質導入されたＴ細胞）と混合した。標的細胞の溶解は、共培養上清中の^５１Ｃｒを計数することによって決定した（図１６）。

加えて、ＳｕｐＴ１細胞と１：１で培養したＴ細胞由来上清を、インターフェロンガンマについてＥＬＩＳＡによって分析した（図１７）。

ＳｕｐＴ１細胞との共培養の１週間後のＴ細胞増加量の計測もまた行った。Ｔ細胞は、計数ビーズにより調整されたフローサイトメトリーによって計数した。最初のデータ（示されない）は、ＣＤ８ストークに基づくコンストラクトが、他のコンストラクトよりも多いＴ細胞増殖を引き起こすことを示すようである。

実施例１８ ＢＣＭＡ特異的ＡＰＲＩＬ変異体の生産
ＡＰＲＩＬ変異体を、特定のコドンを標的とする縮重プライマーを使用して生成した。これらのコドンを、ＡＰＲＩＬ−ＢＣＭＡ結合およびＡＰＲＩＬ−ＴＡＣＩ結合のインシリコ解析を通じて同定した。この解析から、ＴＡＣＩ結合に関係するようであるが、ＢＣＭＡ結合には関係しないようである残基を標的とした。

（ｉ）細胞表面発現ＣＤ３４および（ｉｉ）ＡＰＲＩＬ変異体をコードするプラスミドを産生した。その後、このプラスミドを細菌に形質転換し、プレーティングし、単一コロニーを取り、別個に増やし、そしてそのＤＮＡを抽出し、２９３Ｔ細胞にトランスフェクションした。

単一のＡＰＲＩＬ変異体およびＣＤ３４を発現するＴ細胞をそれぞれ２等分し、０．１μｇ ＲＮＤヒトＢＣＭＡ−ｈＦｃまたはＴＡＣＩ−ｈＦｃキメラと個別にインキュベートした。その後、細胞を洗浄し、ＪａｃｋｓｏｎポリクローナルａｈＦｃ Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ ４８８およびＢＤ ａＣＤ３４ ＡＰＣを用いて二次的に染色した。

ＡＰＲＩＬ変異体を、この方法で、それぞれのバッチにおける対照として野生型ＡＰＲＩＬを用いてバッチでスクリーニングした。ＣＤ３４陽性の事象を、図９に示される番号の４つのゲートに分割した。Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ ４８８平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、それぞれのゲートについて計算し、多様なゲートのＭＦＩ間の平均グラディエントを、以下の式を使用して計算した：［（ＭＦＩ．１−ＭＦＩ．２）＋（ＭＦＩ．２−ＭＦＩ．３）＋（ＭＦＩ．３−ＭＦＩ．４）］／３。

この方法において、平均ＭＦＩグラディエントを、それぞれのＡＰＲＩＬ変異体についてのＢＣＭＡおよびＴＡＣＩへの結合について計算した。それぞれの変異体について、ＢＣＭＡおよびＴＡＣＩ結合の平均ＭＦＩグラディエントを、関連するスクリーニングのバッチにおけるＡＰＲＩＬ野生型の対照に対する結合の比率に変換した。その後、野生型よりも高いＢＣＭＡ：ＴＡＣＩ結合比率を示す変異体を配列決定した。

この結果は、図２０に示され、重要な変異体の配列は、図２１に示される。

その後、グリシン置換の効果を標的残基について調べた。この結果は図２２に示される。この結果は、ＡＰＲＩＬ_ＷＴにおける残基Ｓ２０２、Ｐ２０１、Ｍ２００、Ｔ１７５、Ｖ１７４、Ａ１２５、Ｈ２０３、Ｄ２０５およびＲ２０６が、ＢＣＭＡよりもＴＡＣＩへの結合に比較的重要であることを示す。

実施例１９ ＡＰＲＩＬ ＣＡＲ Ｔ細胞のインビボ機能の実証
インビボでのＡＰＲＩＬ ＣＡＲ Ｔ細胞機能を実証するために、ヒト／マウスキメラモデルにおいてＡＰＲＩＬ ＣＡＲ Ｔ細胞を試験した。ＭＭ１．ｓ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２９７４）は、中間的なレベルのＢＣＭＡを発現するヒト骨髄腫細胞株である。本発明者らは、細胞株ＭＭ１．ｓ．ＦＬｕｃを得るために、この細胞株をホタルルシフェラーゼを発現するように改変した。

ＮＯＤ ｓｃｉｄ ｇａｍｍａ（ＮＳＧ： ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１^{Ｗｊｌ／ＳｚJ}）マウスは、いくつかのヒト細胞株およびヒト末梢血リンパ
球を移植することのできる、重度免疫不全マウスである。３ヶ月齢メスＮＳＧマウスに、いずれの予備治療もなしに、尾静脈注射を介して１×１０^７のＭＭ１．ｓ．ＦＬｕｃ細胞を与えた。移植は、一連の生物発光イメージングによって決定した（図２３）。全てのマウスにおいて、強固であり、かつ増加する髄内移植が観察された。１３日目に、５×１０^６のＡＰＲＩＬ−ＨＮＧ−ＣＤ２８ＯＸＺ ＣＡＲ Ｔ細胞を、尾静脈注射により投与した。一連の生物発光を行い、これは全ての処置されたマウスにおいて、ＭＭ１．ｓ負荷量における急速な減少から完全な寛解を示した（図２３）。このＣＡＲ治療への応答は、フローサイトメトリーおよび免疫組織化学によって確認した。

実施例２０ ＢｉＴＥ構成における多様なＡＰＲＩＬ変異体の機能の試験
４種の正常ドナーのＰＢＭＣを、ＷＴ ＡＰＲＩＬまたは多様な変異体のいずれかに基づく異なるＢｉＴＥＳの存在下で、ＳｕｐＴ１細胞と、ＢＣＭＡを発現するように改変したＳｕｐＴ１細胞と、ＴＡＣＩを発現するように改変したＳｕｐＴ１細胞と、または単独でインキュベートした。インターフェロンガンマレベルを２４時間後に測定した。この結果は、図３５に示される。変異体Ｍ２００Ｇは、野生型よりも顕著に改善したＢＣＭＡ対ＴＡＣＩ特異性を示す。

上記の明細書の中で言及されている全ての刊行物は、本明細書中に参照により援用される。記載された方法の種々の改変および変化、ならびに本発明のシステムは、本発明の範囲および主旨から逸脱することなく、当事者に明白であろう。本発明は具体的な好ましい実施形態に関連して記載したが、特許請求の範囲に記載の発明は、そのような具体的な実施形態に過度に限定されるべきでないことが理解されるべきである。実際に、記載された手法についての発明を遂行するための、分子生物学、細胞免疫学、または関連する分野の当事者にとって明らかな、本発明を実施するための記載された態様の種々の改変は、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。

Claims (18)

1. 野生型ＡＰＲＩＬよりも高いＢＣＭＡに対する結合アフィニティーを有し、かつ／または野生型ＡＰＲＩＬと比較して変化した結合動態を有し、かつ／または野生型ＡＰＲＩＬよりも高いＢＣＭＡ：ＴＡＣＩ（膜貫通型活性化因子およびカルシウム調節因子およびシクロフィリンリガンド相互作用因子）結合比率を有し、かつ以下の単一変異：Ｍ２００Ｃ、Ｍ２００Ｌ、Ｍ２００Ｇ、Ｍ２００Ｓ、Ｍ２００Ａ、Ｍ２００Ｎの１つを含む、バリアント増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）。
2. 以下の変異の組み合わせ：
   Ｖ１７４ＴおよびＭ２００Ｇ、またはＴ１７５ＡおよびＭ２００Ｇ、またはＶ１７４Ｔ、Ｔ１７５ＡおよびＭ２００Ｇ、またはＭ２００Ｇ、Ｄ２０５ＳおよびＲ２０６Ｈ
   の１つを含む、請求項１に記載のバリアントＡＰＲＩＬ。
3. 変異Ｍ２００Ｇを含む、請求項１に記載のバリアント増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）。
4. 抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよびエンドドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、該抗原結合ドメインが、請求項１〜３のいずれかに記載のバリアントＡＰＲＩＬを含む、キメラ抗原受容体。
5. 抗原結合ドメインおよびＴ細胞活性化ドメインを含む二重特異性Ｔ細胞誘導体（ＢｉＴＥ）であって、該抗原結合ドメインが、請求項１〜３のいずれかに記載のバリアントＡＰＲＩＬを含む、二重特異性Ｔ細胞誘導体。
6. 請求項１〜３のいずれかに記載のバリアントＡＰＲＩＬ、請求項４に記載のキメラ抗原受容体または請求項５に記載の二重特異性Ｔ細胞誘導体をコードする核酸。
7. 請求項６に記載の核酸を含む、ベクター。
8. 請求項４に記載のキメラ抗原受容体を含む、細胞。
9. 請求項８に記載の細胞を作製するための組成物であって、キメラ抗原受容体をコードする核酸を含む、請求項７に記載のベクターを含み、該細胞は、該ベクターで形質転換またはトランスフェクションされる、組成物。
10. 形質細胞障害を処置するための組成物であって、請求項８に記載の細胞または請求項５に記載の二重特異性Ｔ細胞誘導体を含む、組成物。
11. 形質細胞障害を処置するための医薬品の製造における、請求項８に記載の細胞または請求項５に記載の二重特異性Ｔ細胞誘導体の使用。
12. 形質細胞を検出するための組成物であって、請求項１〜３のいずれかに記載のバリアントＡＰＲＩＬを含む診断薬剤を含む、組成物。
13. 形質細胞障害を診断するための請求項１２に記載の組成物。
14. インビボで被験体における形質細胞障害を診断するための組成物であって、請求項１〜３のいずれかに記載のバリアントＡＰＲＩＬを含む、組成物。
15. 被験体における形質細胞障害を診断するための組成物であって、請求項１〜３のいずれかに記載のバリアントＡＰＲＩＬを含み、インビトロで該被験体由来のサンプルに添加されることを特徴とする、組成物。
16. 前記サンプルが、血液サンプルであるか、または血液サンプルに由来する、請求項１５に記載の組成物。
17. 前記形質細胞障害が、形質細胞腫、形質細胞性白血病、多発性骨髄腫、マクログロブリン血症、アミロイドーシス、ワルデンストレーム型マクログロブリン血症、孤立性骨形質細胞腫、髄外性形質細胞腫、骨硬化性ミエローマ、Ｈ鎖病、意義不明の単クローン性免疫グロブリン血症およびくすぶり型多発性骨髄腫より選択される、請求項１０または１４〜１６のいずれかに記載の組成物。
18. 前記形質細胞障害が、多発性骨髄腫である、請求項１７に記載の組成物。