ES2737690T3 - Variantes de APRIL - Google Patents

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ES2737690T3 ES15708871T ES15708871T ES2737690T3 ES 2737690 T3 ES2737690 T3 ES 2737690T3 ES 15708871 T ES15708871 T ES 15708871T ES 15708871 T ES15708871 T ES 15708871T ES 2737690 T3 ES2737690 T3 ES 2737690T3
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Kwee Yong
Lydia Lee
Neil Chaplin
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Abstract

Un ligando inductor de la proliferación (APRIL) variante, que tiene una mayor afinidad de unión a BCMA que APRIL de tipo silvestre; y/o una mayor relación de unión BCMA:TACI (activador transmembrana, modulador de calcio y agente de interacción con el ligando de la ciclofilina) que APRIL de tipo silvestre; y que comprende una de las siguientes mutaciones individuales: M200C, M200L, M200G, M200S, M200A, M200N.

Description

DESCRIPCIÓN
Variantes de APRIL
Campo de la invención
La presente invención se refiere a un ligando inductor de la proliferación (APRIL, forma siglada de a proliferationinducing ligand) variante que se une al antígeno de maduración de linfocitos B (BCMA, forma siglada de B cell maturation antigen). Los agentes terapéuticos que comprenden dicha variante de APRIL son útiles en el tratamiento de enfermedades de células plasmáticas, tales como el mieloma múltiple.
Antecedentes de la invención
Mieloma múltiple
El mieloma múltiple (mieloma) es una neoplasia maligna de la médula ósea de células plasmáticas. Se acumulan grupos de células plasmáticas anómalas en la médula ósea, donde interfieren con la producción de glóbulos sanguíneos normales. El mieloma es la segunda neoplasia maligna hematológica más común en los EE. UU. (después del linfoma no Hodgkin) y constituye el 13 % de las neoplasias malignas hematológicas y el 1 % de todos los cánceres. La enfermedad es compleja en términos de sufrimiento y de gastos médicos, ya que provoca fracturas patológicas, susceptibilidad a infección, insuficiencia renal y a continuación en la médula ósea, antes del fallecimiento.
A diferencia de muchos linfomas, el mieloma es actualmente incurable. Los agentes de quimioterapia convencionales utilizados en el linfoma son en gran medida ineficaces para el mieloma. Además, dado que la expresión de CD20 se pierde en las células plasmáticas, Rituximab no se puede utilizar contra esta enfermedad. Los nuevos agentes, tales como Bortezamib y Lenolidomida son parcialmente eficaces, pero no conducen a remisiones duraderas.
Por lo tanto, existe la necesidad de agentes alternativos para el tratamiento del mieloma que tengan una eficacia aumentada y efectos a largo plazo aumentados.
BCMA
El BCMA, también conocido como TNFRSF17, es un antígeno de superficie específico de células plasmáticas que se expresa exclusivamente en células hematopoyéticas de linaje B o en células dendríticas. Es un miembro de la familia de receptores de TNF. El BCMA no se expresa en linfocitos B vírgenes, pero se regula al alza durante la diferenciación de los linfocitos B a plasmoblastos, y se expresa intensamente en linfocitos B de memoria, en plasmoblastos y en células plasmáticas de médula ósea. El BCMA también se expresa en la mayoría de las células de mieloma primario. Aparte de los bajos niveles de ARNm detectados en células dendríticas, la expresión de BCMA parece estar ausente en otros tejidos, lo que indica el potencial como diana para nuevas terapias para el mieloma múltiple.
El BCMA actúa dentro de una red de ligandos y receptores interconectados, la cual se muestra de manera esquemática en la Figura 1. Otros dos receptores de TNF comparten los ligandos APRIL y BAFF con BCMA - el activador transmembrana, modulador de calcio y agente de interacción con el ligando de la ciclofilina (TACI, forma siglada de transmembrane activator and calcium modulator and cyclophilin ligand interactor, también conocido como TNFRSF13B), que se encuentra en los linfocitos T activados y en todos los linfocitos B; y BAFF-R (TNFRSF13C) que se expresa predominantemente en linfocitos B. Las células de mieloma múltiple expresan TACI en algunos casos y BCMA en la mayoría de los casos, pero nunca BAFF-R.
El ligando natural APRIL es potencialmente útil como parte de un agente terapéutico dirigido a BCMA. Sin embargo, la reacción cruzada con TAC i es potencialmente un problema, debido a que TACI se encuentra en los linfocitos T activados y en todos los linfocitos B, por lo que el tratamiento con un agente dirigido a BCMA en células de mieloma también puede provocar una disminución patológica de subconjuntos de linfocitos B y T no cancerosos.
APRIL también es potencialmente útil en aplicaciones de diagnóstico para identificar células plasmáticas, en particular, la presencia de células plasmáticas malignas en condiciones tales como el mieloma múltiple. Sin embargo, de nuevo, la capacidad de APRlL para unirse también a TACI significa que los diagnósticos basados en APRIL también identificarán generalmente los linfocitos T activados y todos los linfocitos B, lo que significa que los resultados sean ambiguos. Kimberley et al. describen el uso de un algoritmo para diseñar un APRIL variante que se una específicamente a b Cm A y dos variantes que se unen selectivamente a TACI (JBC; 2012; 287(44); 37434-37446)
Por lo tanto, existe la necesidad de desarrollar terapias y diagnósticos anti-BCMA que no estén asociados con estas desventajas.
Descripción de las figuras
Figura 1 - Especificidad de ligando y asignación de funciones de APRIL y BAFF
El factor activador de linfocitos B (BAFF, TNFSF13B) interactúa con el receptor de BAFF (BAFF-R, TNFRSF13C), el antígeno de membrana de linfocitos B (BCMA, TNFRSF17) y el activador transmembrana, modulador de calcio y agente de interacción con el ligando de la ciclofilina (TACI, TNFRSF13B), mientras que un ligando inductor de proliferación (APRIL, TNFSF13) interactúa con BCMA, TACI y proteoglucanos. La activación del BAFF-R afecta la supervivencia de los linfocitos B periféricos, mientras que BCMA puede afectar la supervivencia de las células plasmáticas. La interacción de APRIL con los proteoglucanos implica al extremo amino de APRIL que contiene cadenas laterales de ácido glucosaminoglucano sulfatado.
Figura 2 - Datos de expresión de BCMA en mieloma
Se aislaron células de mieloma de muestras de médula ósea de 39 pacientes con mieloma múltiple mediante una selección de CD138+ con perlas magnéticas. Estas células se tiñeron con el anticuerpo monoclonal anti-BCMA J6MO conjugado con PE (GSK). El número de copias del antígeno se cuantificó utilizando perlas de PE Quantibrite (Becton Dickenson) según las instrucciones del fabricante. Se presenta un diagrama de cajas del número de copia de antígeno junto con los valores representados de la amplitud, intercuartílicos y de las medianas. Los inventores encontraron que la amplitud es de 348,7-4268,4 copias de BCMA por célula con una media de 1181 y una mediana de 1084,9.
Figura 3 - Diseño convencional de un receptor quimérico para antígeno
Se muestra el formato típico de un receptor quimérico para antígeno. Estas son proteínas transmembrana de tipo I. Un ectodominio reconoce el antígeno. Se compone de un fragmento variable monocatenario procedente de anticuerpo (scFv) que está unido a un dominio espaciador. Este, a su vez, está conectado a un dominio transmembrana que actúa anclando la molécula en la membrana. Finalmente, este está conectado a un endodominio que actúa transmitiendo señales intracelulares a la célula. Este se compone de uno o más dominios de señalización.
Figura 4 - Diseño de los distintos CAR generados basados en APRIL.
El diseño del CAR como se muestra en la Figura 3 se modificó de manera que el scFv se reemplazó por una forma modificada de APRIL para que actúe como un dominio de unión a antígeno: APRIL se truncó de modo que el extremo amino de unión a proteoglucanos esté ausente. Después, se unió un péptido señal al extremo amino del APRIL truncado para dirigir la proteína a la superficie celular. Se generaron tres CAR con este dominio de unión basado en APRIL: A. En el primer CAR, se usó como dominio espaciador el dominio de tallo de CD8 humano. B. En el segundo CAR, se usó como dominio espaciador la bisagra de IgG1. C. En el tercer CAR, se usó como espaciador la bisagra, los dominios CH2 y CH3 de la IgG1 humana modificados con las mutaciones pva/a (en lo sucesivo denominado Fc-pvaa) descritas por Hombach et al (2010 Gene Ther. 17:1206-1213) para reducir la unión al receptor de Fc. En todos los CAR, estos espaciadores se conectaron al dominio transmembrana de CD28 y después a un endodominio tripartito que contenía una fusión del endodominio de CD28, de OX40 y de CD3-Zeta (Pule et al, Molecular therapy, 2005: Volumen 12; Número 5; páginas 933-41).
Figura 5 - Secuencia de aminoácidos glosada de los tres CAR (forma siglada de chimeric antigen receptor, receptor quimérico para antígeno) con APRIL anteriores
A: Muestra la secuencia de aminoácidos glosada del CAR con ABRIL con tallo de CD8; B: Muestra la secuencia de aminoácidos glosada del CAR basado en el tallo de IgG1 con APRIL; C: Muestra la secuencia de aminoácidos glosada del CAR basado en Fc-pvaa con APRIL.
Figura 6- Expresión y unión de ligando de distintos CAR basados en APRIL
A. Los receptores se coexpresaron con un gen marcador de CD34 truncado en un vector génico retrovírico. La expresión del gen marcador en las células transducidas permite la confirmación de la transducción. B. Los linfocitos T se transdujeron con los CAR basados en APRIL con el espaciador de tallo de CD8, de bisagra de IgG1 o espaciador de Fc. Para probar si estos receptores podrían expresarse de manera estable en la superficie celular, los linfocitos T se tiñeron después con anti-APRIL-biotina/estreptavidina APC (forma abreviada de allophycocyanin: aloficocianina) y anti-CD34. Se realizó análisis por citometría de flujo. APRIL se detectó por igual en la superficie celular en los tres CAR, lo que sugiere que se expresan de manera igualmente estable. C. A continuación, se determinó la capacidad de los CAR para reconocer TACI y BCMA. Los linfocitos T transducidos se tiñeron para BCMA recombinante o TACI fusionada a la fusión de Fc de IgG2a de ratón junto con un anti-ratón secundario y anti-CD34. Los tres formatos de receptor mostraron unión a BCMA y TACI. Un hallazgo sorprendente fue que la unión a BCMA parecía mayor que a TACI. Otro hallazgo sorprendente fue que, aunque los tres CAR se expresaron por igual, los CAR con tallo de CD8 y con bisagra de IgG1 parecían ser mejores en el reconocimiento de BCMA y TACI que con el espaciador de Fc.
Figura 7 - Función de las distintas construcciones de CAR.
Se realizaron ensayos funcionales de los tres distintos CAR basados en APRIL. Linfocitos T de sangre periférica de donante normal, ya sea no transducidos (NT) o transducidos para expresar los distintos CAR. La transducción se realizó utilizando un sobrenadante de título igual. Estos linfocitos T se empobrecieron a continuación en CD56 para eliminar la actividad NK no específica y se usaron como efectores. Se usaron como diana células SupT1 no transducidas (NT) o transducidas para expresar BCMA o TACI. Los datos mostrados son la media y la desviación típica de 5 experimentos independientes. A. La destrucción específica de linfocitos T que expresaban BCMA y TACI se determinó utilizando liberación de cromo. B. También se determinó la liberación de interferón y. Las dianas y los efectores se cocultivaron en una relación de 1:1. Después de 24 horas, el interferón y en el sobrenadante se analizó mediante ELISA. C. La proliferación/supervivencia de los linfocitos T CAR también se determinó contando el número de linfocitos T CAR en el mismo cocultivo incubado durante otros 6 días. Los 3 CAR dirigieron respuestas contra las dianas que expresaban BCMA y TACI. Las respuestas a BCMA fueron mayores que para TACI.
Figura 8 - Destrucción de células primarias de mieloma por linfocitos T CAR con APRIL
Dado que la mayoría de las células primarias de mieloma expresan un bajo número de moléculas de BCMA en su superficie, se investigó si se produce destrucción de células primarias de mieloma a pesar de la expresión de baja densidad. Se seleccionaron tres casos que representaban el intervalo de expresión de BCMA descrito en la Figura 2 : el primero tuvo una expresión tenue (menor que la media); el segundo caso tuvo una expresión intermedia (aproximadamente la expresión media) y el tercero tuvo una expresión intensa (por encima de la media). A la izquierda se muestra un histograma de la tinción con BCMA frente al control de isotipo para los tres casos. En este ensayo, solo se probaron los CAR con tallo de CD8 y bisagra de APRIL. A la izquierda, la supervivencia de las células de mieloma en comparación con los números iniciales se muestra el día 3 y el día 6 después de un cocultivo 1:1 de células de mieloma y linfocitos T CAR. Para el día 6, se había eliminado > 95 % de las células de mieloma, incluyendo las que presentaban una expresión de BCMA tenue.
Figura 9 - Métodos utilizados para desarrollar nuevos mutantes APRIL útiles para el direccionamiento a BCMA. A. Las moléculas de APRIL candidatas se presentaron en el formato de CAR con tallo de CD8 (pero sin endodominio de señalización) y se coexpresaron con CD34 utilizando la secuencia de 2A del virus de la fiebre aftosa. B. Los restos que parecían importantes para la especificidad o la afinidad por BCMA a partir de los datos cristalográficos se aleatorizaron mediante PCR de corte y empalme por solapamiento utilizando como cebadores oligonucleótidos que se degeneraron en el codón codificante. Estos productos de PCR se ligaron en el formato CAR con tallo de CD8 y se utilizaron para transformar bacterias. Se cultivaron colonias bacterianas individuales (conteniendo cada una un único mutante). El ADN plasmídico se aisló de estos cultivos y se usó para transfectar células 293T. Después de la transfección, las células 293T se tiñeron para la fusión BCMA-Fc o la fusión TACI-Fc por separado, junto con el gen marcador. C. Cómo se estimó la unión relativa a BCMA y TACI durante la exploración: se calculó la pendiente de la intensidad de fluorescencia de la tinción con CD34 frente a BCMA o TACI. A continuación, se calculó la relación de esta pendiente con la del APRIL de tipo silvestre. Este valor se usó como lectura.
Figura 10 - Resumen de mutantes de APRIL - mutaciones de restos individuales.
Las mutaciones que muestran una unión alterada a BCMA-Fc y TACI-Fc se resumen en comparación con la de APRIL de tipo silvestre.
Figura 11 - Resumen de mutantes de APRIL - mutaciones de restos múltiples.
Los mutantes promisorios se cruzaron una vez o se multiplicaron con otros mutantes y se caracterizaron. En este caso se muestra nuevamente la unión alterada a BCMA-Fc y TACI-Fc, en comparación con APRIL de tipo silvestre.
Figura 12 - Unión a BCMA-FC, TACI-FC y APRIL de algunos mutantes seleccionados
Se muestran en una tabla los gráficos de citometría de flujo de mutantes seleccionados. La primera columna muestra la tinción de BCMA-Fc frente a la de CD34. La segunda columna muestra la tinción de TACI-Fc frente a la de CD34. La tercera columna muestra la tinción de APRIL frente a la de CD34. La primera fila muestra la tinción APRIL de tipo silvestre como control. La segunda fila muestra un control de CD34 solo.
Figura 13 - Vector que coexpresa APRIL basado en CAR con CD34 truncado
Se incubó una línea celular que expresaba el vector utilizado para la exploración con BCMA-Fc o TACI-Fc, y se tiñó con Acm conjugados con PE y FITC anti-CD34 y anti-Fc humano. Las células se estudiaron mediante citometría de flujo. Esto muestra un patrón típico de unión de BCMA y TACI con respecto al gen marcador CD34.
Figura 14A - Diagrama esquemático que ilustra un CAR clásico
B: Diseño de los distintos CAR basados en APRIL generados.
Un péptido señal está unido al extremo amino de APRIL truncado. Este se fusionó con distintos espaciadores: o bien la bisagra, los dominios CH2 y CH3 de la IgG1 humana modificados con la mutación pvaa descrita por Hombach et al (2010 Gene Ther. 17:1206-1213) para reducir la unión al Receptor de Fc; el tallo de CD8a humano; y la bisagra de IgG1. Estos espaciadores se conectaron a un endodominio tripartito que contiene el dominio transmembrana de CD28, el endodominio de OX40 y el endodominio de CD3-Zeta.
Figura 15 - Expresión de distintos CAR
Los receptores se coexpresaron con una proteína de fluorescencia azul 2 potenciada (eBFP2) utilizando una secuencia IRES. Los linfocitos T humanos primarios se transdujeron y se tiñeron con anti-APRIL-biotina/estreptavidina APC. Se realizó análisis por citometría de flujo. La señal de eBFP2 se muestra nuevamente contra la detección de APRIL. Los tres CAR se expresan de forma estable (experimento representativo de 3 experimentos independientes realizados con 3 linfocitos T de donantes normales distintos).
Figura 16 -- Ensayo de liberación de cromo
Uso de linfocitos T de sangre periférica de donante normal no transducidos (NT) o transducidos para expresar los CAR con espaciadores distintos como efectores, y células SupT1 no transducidas (NT), o transducidas para expresar BCMA o TACI como dianas. Los linfocitos T se empobrecieron en CD56 para reducir la actividad NK. Este es un representante de tres experimentos independientes y se muestra como un ejemplo. en la figura 7A se muestran los datos de destrucción acumulada. Se observa destrucción específica de linfocitos T que expresan BCMA y TACI sin actividad contra las células diana negativas.
Figura 17 - Liberación de interferón gamma
Se mide por ELISA a partir de un cocultivo 1:1 de efectores y dianas. La construcción con el tallo de CD8 parece tener la mejor especificidad, mientras que la construcción con la bisagra da como resultado la mayor liberación de interferón, lo que demuestra alguna actividad no específica. Este es representativo de 3 experimentos independientes y se muestra como un ejemplo. Los datos acumulados de liberación de interferón gamma se muestran en la figura 7B.
Figura 18 -- Ejemplos de expresión de BCMA en mielomas primarios
Se muestran cuatro ejemplos de muestras de mieloma teñidas con el Acm de rata anti-BCMA humano Vicky1. El primer panel muestra una tinción de BCMA intensa en un paciente con una leucemia de células plasmáticas (una forma de mieloma inusual, avanzada y agresiva). Los otros tres casos son mielomas clínica y morfológicamente típicos. Muestran la tinción intermedia o tenue normalmente observada. La tinción con el control de isotipos (gris) está superpuesta. Estos son ejemplos de los datos acumulados de expresiones de BCMA mostrados en la figura 2.
Figura 19 - Secuencia de aminoácidos del CAR con APRIL con una etiqueta de epítopo V5.
A: dAPRIL-HCH2CH3pvaa-CD28OXZ
B: dAPRIL-CD8STK-CD28OXZ (STK: forma abreviada de stalk, tallo)
C: dAPRIL-HNG-CD28OXZ (HNG: forma abreviada de hinge, bisagra)
Las secuencias en esta figura difieren de las de la figura 5, tienen un péptido señal distinto y ninguna etiqueta V5.
Figura 20 - Resumen de la exploración de mutantes de APRIL específicos para BCMA
Unión alterada a BCMA-Fc y TACI-Fc. Este es un ejemplo de los datos iniciales de la exploración de minipreparaciones de ADN. Los mutantes se exploraron en lotes con la variación interexperimental corregida expresando el gradiente de IFM promedio del mutante APRIL en comparación con el APRIL de tipo salvaje, verificado en cada lote.
Figura 21 - Alineamiento de secuencias de los mutantes de APRIL específicos para BCMA
Las minipreparaciones seleccionadas durante el procedimiento de mutagénesis al azar se exploraron en cuanto a la expresión mediante tinción para BCMA-Fc y TACI-Fc. Los mutantes con fenotipos potencialmente útiles o informativos se secuenciaron por secuencias capilares y se alinearon con la secuencia de APRIL original de la que proceden. En esta figura se muestran alineamientos de mutantes ejemplares identificados durante tal procedimiento de exploración.
Figura 22 - Gráfico de la unión de BCMA y TACI alterada con sustituciones de glicina en los restos seleccionados
Figura 23 - demostración de la función in vivo de los linfocitos T CAR con APRIL
Seis ratones NSG hembra de 3 meses recibieron un vial de 1x107 células MM1.s.FLuc por inyección en la vena de la cola. Se tomaron imágenes de los ratones con bioluminiscencia el día 8 y el día 13. Después de tomar imágenes en el día 13, cuatro ratones recibieron 5x106 linfocitos T CAR con APRIL mediante inyección en la vena de la cola. Se tomaron imágenes de los ratones en el día 13 y el día 18. Los ratones que recibieron linfocitos T CAR se indican con (*). La remisión del mieloma se pudo observar el día 18 en todos los ratones tratados, mientras que la enfermedad progresó en los ratones no tratados.
Figura 24
A: Distintos formatos de APRIL-BiTE (forma siglada de bispecific T-cell engager, captador biespecífico de linfocitos T) diseñados y construidos
(1) scFv de OKT3 conectado a APRIL truncado mediante la bisagra de IgG1; (2) scFv de OKT3 conectado a APRIL truncado a través del enlazador (SGGGGS)3; (3) scFv de OKT3 conectado a APRIL truncado a través del tallo de CD8; (4) APRIL truncado conectado al scFv de OKT3 a través de una bisagra IgG1; (5) APRIL truncado conectado al scFv de OKT3 a través de un enlazador (SGGGGS)3; (6) APRIL truncado conectado al scFv de OKT3 a través de un espaciador de CD8. Las construcciones (3) y (6) deben formar homodímeros a través de enlaces disulfuro en el espaciador CD8.
B: diagrama esquemático del agrupamiento molecular en la interfaz célula-célula al unirse al APRILiTE.
Figura 25 - Transferencia de Western de sobrenadante de células 293T transfectadas con las distintas construcciones de APRILiTE. La transferencia se realizó con anti-APRIL.
Figura 26(a) - Unión de los APRILiTE 1, 3 y 6 a células SupT1 de tipo silvestre y células SupTI técnicamente diseñadas para expresar BCMA y TACI. La tinción es con anti-APRIL biotina/estreptavidina APC. Los Aprilite no muestran unión a las células SupT1 TS, sino que se unen a las células que expresan BCMA y, en menor medida, a las células que expresan TACI.
Figura 26(b) - Unión de los APRILiTE a Jurkats de tipo silvestre, pero no a Jurkats sin receptor de linfocitos T. Esto demuestra que los APRILiTE se unen al receptor de linfocitos T.
Figura 27 - Cocultivo 1:1 de linfocitos T y células SupT1 no transducidas o técnicamente diseñadas en presencia del blanco de medio o los 3 APRILiTE.
Figura 28 - Se observó la supresión completa de las células SupT1 que expresaban BCMA después de un cocultivo de 3 días en presencia de APRILiTE 1,3 y 6.
Figura 29 - Ejemplos de expresión de BCMA en mielomas primarios. Se muestran cuatro ejemplos de muestras de mieloma teñidas con el Acm de rata anti-BCMA humano Vicky1. El primer panel muestra una tinción de BCMA intensa en un paciente con una leucemia de células plasmáticas (una forma de mieloma inusual, avanzada y agresiva). Los otros tres casos son mielomas clínica y morfológicamente típicos. Muestran la tinción intermedia o tenue normalmente observada. La tinción con el control de isotipos (gris) está superpuesta.
Figura 30 - Secuencia de aminoácidos de los APRILiTE A: APRILiTE#01; B: APRILiTE#03; C: APRILiTE#06 Figura 31 - Tinción de muestras de mieloma para BCMA superpuestas con el control de isotipo. Estas células de mieloma expresan BCMA pero en niveles bajos
Figura 32 - Microscopía de baja potencia de cocultivos y de los controles el día 1. Se puede ver un claro agrupamiento/activación de linfocitos T cuando se cultivan con células de mieloma en presencia de un APRILiTE. Figura 33 - Liberación de interferón gamma con solo células de mieloma, cocultivadas con linfocitos T de sangre periférica, ambos en ausencia y presencia de los APRILITE#3 y #6
Figura 34 - Supervivencia en el día 6 de cocultivo de células de mieloma en cultivo. Ambos APRILiTE probados dan como resultado la destrucción eficaz de células primarias de mieloma en presencia de CMSP.
Figura 35 - Análisis de la función de diversos mutantes de APRIL en un formato BiTE
Las CMSP de cuatro donantes normales se incubaron con células SupT1, Células SupT1 técnicamente diseñadas para expresar BCMA, Células SupT1 técnicamente diseñadas para expresar TAC i o solas, en presencia de distintos BiTE basados en APRIL TS o diversos mutantes. Los niveles de interferón gamma se midieron 24 horas más tarde.
Sumario de aspectos de la invención
Los presentes inventores han activado mutantes desarrollados del ligando de unión a BCMA APRIL, que tienen una mayor relación de unión BCMA:TACI que el APRIL de tipo silvestre. Estos mutantes presentan un mayor grado de especificidad por BCMA, por lo que proporcionan un direccionamiento más focalizado de las células que expresan BCMA para aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico.
Por lo tanto, en un primer aspecto, la presente invención proporciona un ligando inductor de la proliferación (APRIL) variante, que tiene una mayor afinidad de unión a BCMA que APRIL de tipo silvestre; y/o una mayor relación de unión BCMA:TACI (activador transmembrana, modulador de calcio y agente de interacción con el ligando de la ciclofilina) que APRIL de tipo silvestre y que comprende una de las siguientes mutaciones individuales: M200C, M200L, M200G, M200S, M200A, M200N.
El APRIL variante puede comprender una de las siguientes combinaciones de mutaciones:
V174T y M200G;
o T175A o M200G;
o V174T, T175A y M200G;
o
M200G, D205P y R206N; o M200G, D205S y R206H; o
V174T, T175A, M200G y S202E.
La presente invención también proporciona un ligando inductor de la proliferación (APRIL) variante que comprende la mutación M200G.
La presente invención también proporciona un receptor quimérico para antígeno (CAR) que comprende un dominio de unión a antígeno, un dominio transmembrana y un endodominio, en donde el dominio de unión a antígeno comprende un APRIL variante de acuerdo con cualquiera de los primeros aspectos de la invención.
La presente invención también proporciona un captador biespecífico de linfocitos T (BiTE) que comprende un dominio de unión a antígeno y un dominio de activación de linfocitos T, en donde el dominio de unión a antígeno comprende un APRIL variante de acuerdo con el primero aspecto de la invención.
En un segundo aspecto, la presente invención proporciona una secuencia de ácido nucleico que codifica un APRIL variante de acuerdo con el primer aspecto de la invención, o un CAR o BiTE que comprende tal APRIL variante. En un tercer aspecto, la presente invención proporciona un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con el segundo aspecto de la invención.
La presente invención también proporciona una célula que comprende un receptor quimérico para antígeno que comprende un APRIL variante de acuerdo con el primer aspecto de la invención.
La invención también proporciona un método para la fabricación de tal célula, que comprende la etapa de transducir o transfectar una célula con un vector de acuerdo con el tercer aspecto de la invención, que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un receptor quimérico para antígeno.
En el presente documento se describe un agente terapéutico que comprende un APRIL variante de acuerdo con el primero aspecto de la invención, un CAR o BiTE que comprende tal APRIL variante. En otro aspecto, la presente solicitud proporciona una célula que comprende tal CAR, un ácido nucleico de acuerdo con el segundo aspecto de la invención o un vector de acuerdo con el tercer aspecto de la invención.
Además, se proporciona una célula o un captador biespecífico de linfocitos T de la invención para su uso en el tratamiento de un trastorno de células plasmáticas.
La presente invención también proporciona un agente de diagnóstico para la detección de células plasmáticas que comprende un APRIL variante de acuerdo con el primer aspecto de la invención.
Además, se proporciona el agente de diagnóstico de acuerdo con la invención para el diagnóstico de un trastorno de células plasmáticas.
En el presente documento se describe un método para el diagnóstico in vivo de un trastorno de células plasmáticas en un sujeto, que comprende la etapa de administrar un agente de diagnóstico de acuerdo con la invención al sujeto. Además, se proporciona un método para el diagnóstico de un trastorno de células plasmáticas en un sujeto, que comprende la etapa de añadir in vitro un agente de diagnóstico de acuerdo con la invención a una muestra procedente del sujeto.
La muestra puede ser, o proceder de, una muestra de sangre.
El trastorno de células plasmáticas se puede seleccionar de: plasmocitoma, leucemia de células plasmáticas, mieloma múltiple, macroglobulinemia, amiloidosis, macroglobulinemia de Waldenstrom, plasmocitoma óseo solitario, plasmocitoma extramedular, mieloma osteosclerótico, enfermedad de la cadena pesada, gammapatía monoclonal de importancia incierta/mieloma múltiple latente.
El trastorno de células plasmáticas puede ser mieloma múltiple.
Descripción detallada
APRIL
La presente invención se refiere a un ligando inductor de la proliferación (APRIL) variante, que tiene una mayor afinidad de unión a BCMA que APRIL de tipo silvestre; y/o una mayor relación de unión BCMA:TACI (activador transmembrana, modulador de calcio y agente de interacción con el ligando de la ciclofilina) que APRIL de tipo silvestre. También se conoce a APRIL como TNFSF13.
El término "variante" es sinónimo de "mutante" o de "técnicamente diseñado" y significa una APRIL que comprende una o más mutaciones, tal como una sustitución (o sustituciones), una adición (o adiciones) o una supresión (o supresiones). Normalmente, la mutación es una sustitución.
La secuencia de tipo silvestre de APRIL está disponible en UNIPROT/O75888 y se muestra a continuación (SEQ ID NO: 1). No es una proteína secretada clásica en el sentido que no tiene péptido señal. Tiene un sitio de escisión de furina "KQKKQK" (subrayado en la SEQ ID NO: 1). El extremo amino está implicado en la unión de proteoglucanos.
Kimberley et al (2009, FASEB J 23:1584-1595) es un estudio que investiga el papel de la interacción proteoglicanos de heparán sulfato (HSPG) en la señalización de APRIL. Las mutaciones puntuales se generaron de la siguiente manera:
1) APRIL-triple (designada TS-triple), que contiene 3 mutaciones puntuales: R146S, R189S, H220E;
2) APRIL-HSPG (designada HSPG), que contiene tres mutaciones puntuales en el motivo hidrófobo (QKQKK113Q); 3) APRIL-HSPG-triple (designada HSPG-triple), en que los 6 aminoácidos se mutaron en ambos sitios.
4) APRIL-R231A, una forma de APRIL que tiene la capacidad de unirse a los HSPG pero que carece de la capacidad de unirse a TACI o BCMA (Fig. 2), que comprende una mutación de arginina a alanina clave dentro de la región de unión al receptor.
Todos los mutantes, excepto APRIL-R231A, conservaron la capacidad de unirse tanto a BCMA como a TACI. El mutante R231A mostró una pérdida completa de unión a ambos receptores, pero mantuvo su capacidad para unirse a los HSPG.
El APRIL variante de la presente invención comprende el sitio de unión a BCMA de APRIL. El APRIL variante puede comprender un fragmento de APRIL que comprende el sitio de unión a BCMA.
El APRIL variante puede comprender un APRIL truncado, que carece del extremo amino terminal de la molécula. El APRIL truncado puede conservar la unión a BCMA y TACI pero perder la unión a proteoglucanos. El APRIL truncado se puede escindir en o inmediatamente después del sitio de escisión de furina. El APRIL truncado puede carecer de los 116 aminoácidos amino terminales de la molécula de APRIL de tipo silvestre mostrada como la SEQ ID NO: 1. El APRIL truncado puede comprender la secuencia mostrada como la SEQ ID NO: 2 (que corresponde a la porción de la SEQ ID NO: 1 que se muestra en negrita) o una variante de la misma. Esto corresponde a la porción de la molécula que se necesita para la unión a BCMA y TACI.
SEQ ID NO: 1
10 20 30 40 50 60
MPASSPFLLA PKGPPGNMGG PVREPALSVA LWLSWGAALG AVACAMALLT QQTELQSLRR
70 80 90 100 110 120
EVSRLQGTGG PSQNGEGYPW QSLPEQSSDA LEAWENGERS RKRRAVLTQA QKKQHSVLRh
130 140 150 160 170 180
VPINATSKDD SDVTEVMWQP ALRRGRGLQA QGYGVRIQDA GVYLLYSQVL FQDVTFTMGQ
190 200 210 220 230 240
WSREGQGRQ ETLFRCIRSM PSHPDRAYNS CYSAGVFHLH QGDILSVIIP RARAKLNLSP
250
HGTFLGFVKL
SEQ ID NO: 2
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMG
QVVSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHG
TFLGFVKL
El APRIL variante o el APRIL variante truncado tiene características de unión que lo hacen más específico que el APRIL de tipo silvestre. Por ejemplo, en algunas realizaciones o aplicaciones, el APRIL variante tiene una mayor para BCMA que APRIL de tipo silvestre. En algunas aplicaciones, el APRIL variante tiene una relación de unión BCMA:TACI es mayor que el APRIL de tipo silvestre o una combinación del mismo. El APRIL mutante descrito en el presente documento comprende mutaciones en una o más de las siguientes posiciones: A125, V174, T175, M200, P201, S202, H203, D205 y R206 (mostrados en gris en la SEC ID NO: 1).
En particular, el APRIL variante descrito en el presente documento puede comprender una de las siguientes mutaciones individuales: (las SEQ ID 3 a 8 y 15 a 26):
A125T,
V174T, V174G,
T175H, T175S, T175G,
P201V, P201A, P201G, P201R, P201Y, P201W,
S202G, S202F, S202D, S202V, S202P, D205P.
El APRIL variante de la presente invención comprende una de las siguientes mutaciones individuales (SEQ ID 9 a 14) M200C, M200L, M200G, M200S, M200A, M200N.
Se ha determinado que estas mutaciones alteran la unión a BCMA y TACI de una manera que puede ser útil para el direccionamiento a BCMA.
La unión relativa a BCMA y TACI se muestra en la Tabla 1, y se ilustra en la Figura 10 con algunos ejemplos mostrados en la Figura 12.
TABLA 1
Figure imgf000009_0001
SEQ ID 3 (A125T)
VLHLVPINTTSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMG QVVSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHG TFLGFVKL
SEQ ID 4 (V174T)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDTTFTMG QVVSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHG TFLGFVKL
SEQ ID 5 (V174G)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDGTFTMG QVVSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHG TFLGFVKL
SEQ ID 6 (T175H)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVHFTMG QVVSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHG TFLGFVKL
SEQ ID 7 T175S
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVSFTMG QVVSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHG TFLGFVKL
SEQ ID 8 (T175G)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVGFTMG QVVSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHG TFLGFVKL
SEQ ID 9 (M200C)
VLHLVPINAT SKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYS QVLFQDVTFTMG QVVSREGQGRQETLFRCIRSCPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHG TFLGFVKL
SEQ ID 10 (M200L)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMG QVVSREGQGRQETLFRCIRSLPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHG TFLGFVKL
SEQ ID 11 (M200G)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMG
QVVSREGQGRQETLFRCIRSGPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHG
TFLGFVKL
SEQ ID 12 (M200S)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMG
QVVSREGQGRQETLFRCIRSSPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHG
TFLGFVKL
SEQ ID 13 (M200A)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMG
QVVSREGQGRQETLFRCIRSAPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHG
TFLGFVKL SEQ ID 14 (M200N)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMG
QVVSREGQGRQETLFRCIRSNPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHG
TFLGFVKL SEQ ID 15 (P201V)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMG
QVVSREGQGRQETLFRCIRSMVSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHG
TFLGFVKL
SEQ ID 16 (P201A)
VLHLVPINAT SKDDS DVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYS QVLFQDVT FTMG
QVVSREGQGRQETLFRCIRSMASHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHG
TFLGFVKL
SEQ ID 17 (P201G)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMG
QVVSREGQGRQETLFRCIRSMGSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHG
TFLGFVKL SEQ ID 18 (P201Y)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMG
QVVSREGQGRQETLFRCIRSMYSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHG
TFLGFVKL
SEQ ID 19 (P201R)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMG
QVVSREGQGRQETLFRCIRSMRSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHG
TFLGFVKL
SEQ ID 20 (P201W)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMG
QVVSREGQGRQETLFRCIRSMWSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHG
TFLGFVKL
SEQ ID 21 (S202G)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMG
QVVSREGQGRQETLFRCIRSMPGHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHG
TFLGFVKL
SEQ ID 22 (S202F)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMG
QVVSREGQGRQETLFRCIRSMPFHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHG
TFLGFVKL
SEQ ID 23 (S202D)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMG
QVVSREGQGRQETLFRCIRSMPDHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHG
TFLGFVKL
SEQ ID 24 (S202V)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMG
QVVSREGQGRQETLFRCIRSMPVHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHG
TFLGFVKL
SEQ ID 25 (S202P)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMG
QVVSREGQGRQETLFRCIRSMPPHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHG
TFLGFVKL
SEQ ID 26 (D205P)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMG
QVVSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPPRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHG
TFLGFVKL
El APRIL variante descrito en el presente documento puede comprender una combinación de mutaciones en las siguientes posiciones: V174 y T175; o V174 y M200; o V174 y S202; o T175 y M200, o T175 y S202; o S202 y H203; o D205 y R206; o V174, T175 y M200; o V174, T175 y S202; o T175, D205 y R206; o M200, D205 y R206; o V174, T175, M200 y S202; o T175, S202, D205 y R206;
En particular, el APRIL variante descrito en el presente documento puede comprender una de las siguientes combinaciones de mutaciones:
V174T y T175A; o V174S y S202G; o
V174T y S202V; o V174G y S202G, o V174G y S202E; o
V174G y S202A; o V174G y S202G; o V174E y S202Y; o
T175A y S202E; o T175G y S202G; o T175G y S202V; o
T175A y S202P; o T175S y S202G; o
S202V y H203N; o D205H y R206L; o
D205P y R206K; o D205P y R206N; o 205S y R206P; o D205R y R206G; o
D205P y R206I; o D205S y R206H; o
V174T, T175A y S202E; o
T175A, D205P y R206N; o T175A, D205S y R206H; o
M200G, D205P y R206N; o
V174T, T175A, M200G y S202E; o
T175A, S202E, D205P y R206N; o
T175A, S202E, D205S y R206H.
El APRIL variante puede comprender una de las siguientes mutaciones combinadas específicas: V174T y M200G; o V175A y M200G; o V174T, T175A y M200G; o M200G, D205S y R206H.
Se ha demostrado que estas mutaciones combinadas específicas alteran la unión a BCMA y TACI de una manera que es útil para el direccionamiento a BCMA (véase la Tabla 2 y la Figura 11).
TABLA 2
Figure imgf000013_0001
continuación
Figure imgf000014_0001
SEQ ID 27 (V174T, T175A) VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDTAFTMGQVVSRE GQGRQETLFRCIRSMPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKL SEQ ID 28 (V174T, M200G)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDTTFTMGQVVSRE GQGRQETLFRCIRSGPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKL SEQ ID 29 (V174S, S202G) VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDSTFTMGQVVSRE GQGRQETLFRCIRSMPGHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKL SEQ ID 30 (V174T, S202V)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDTTFTMGQVVSRE GQGRQETLFRCIRSMPVHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKL SEQ ID 31 (V174G, S202G) VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDGTFTMGQVVSRE GQGRQETLFRCIRSMPGHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKL SEQ ID 32 (V174G, S202E)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDGTFTMGQVVSRE GQGRQETLFRCIRSMPEHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKL SEQ ID 33 (V174G, S202A) VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDGTFTMGQVVSRE GQGRQETLFRCIRSMPAHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKL SEQ ID 34 (V174G, S202G)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDGTFTMG
QVVSREGQGRQETLFRCIRSMPGHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHG
TFLGFVKL SEQ ID 35 (V174E, S202Y)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDETFTMG
QVVSREGQGRQETLFRCIRSMPYHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHG
TFLGFVKL SEQ ID 36 (T175A, S202E)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVAFTMG QWSREGQGRQETLFRCIRSMPEHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHG TFLGFVKL SEQ ID 37 (T175G, S202G)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVGFTMG QWSREGQGRQETLFRCIRSMPGHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHG TFLGFVKL
SEQ ID 38 (T175G, S202V)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVGFTMG QVVSREGQGRQETLFRCIRSMPVHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHG TFLGFVKL SEQ ID 39 (T175A, S202P)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVAFTMG QWSREGQGRQETLFRCIRSMPPHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHG TFLGFVKL SEQ ID 40 (T175A, M200G)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVAFTMG QVVSREGQGRQETLFRCIRSGPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHG TFLGFVKL
SEQ ID 41 T175S, S202G
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVSFTMG QWSREGQGRQETLFRCIRSMPGHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHG TFLGFVKL SEQ ID 42 (S202V H203N)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMG QVVSREGQGRQETLFRCIRSMPVNPDRAYNS CYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLS PHG TFLGFVKL SEQ ID 43 (D205H, R206L)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMG QVVSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPHLAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHG TFLGFVKL SEQ ID 44 (D205P, R206K)
VLHLVPINAT SKDDS DVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYS QVL FQDVT FTMG QVVSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPPKAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHG TFLGFVKL SEQ ID 45 (D205P, R206N)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMG QVVSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPPNAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHG TFLGFVKL
SEQ ID 46 (D205S, R206P)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMG QWSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPSPAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHG TFLGFVKL SEQ ID 47 (D205R, R206G)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMG QVVSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPRGAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHG TFLGFVKL
SEQ ID 48 (D205P, R206I)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMG QVVSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPPIAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHG TFLGFVKL SEQ ID 49 (D205S, R206H)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMG QWSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPSHAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHG TFLGFVKL
SEQ ID 50 (V174T, T175A, S202E)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDTAFTMG QVVSREGQGRQETLFRCIRSMPEHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHG TFLGFVKL SEQ ID 51 (V174T, T175A, M200G)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDTAFTMG QVVSREGQGRQETLFRCIRSGPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHG TFLGFVKL
SEQ ID 52 (T175A, D205P, R206N)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVAFTMG QVVSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPPNAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHG TFLGFVKL '
SEQ ID 53 (T175A, D205S, R206H)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVAFTMG QVVSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPSHAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHG TFLGFVKL
SEQ ID 54 M200G, D205P, R206N)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMG
QVVSREGQGRQETLFRCIRSGPSHPPNAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHG
TFLGFVKL
SEQ ID 55 (M200G, D205S, R206H)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMG
QVVSREGQGRQETLFRCIRSGPSHPSHAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHG
TFLGFVKL SEQ ID 56 (V174T, T175A, M200G, S202E)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDTAFTMG
QWSREGQGRQETLFRCIRSGPEHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHG
TFLGFVKL SEQ ID 57 (T175A, S202E, D205P, R206N)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVAFTMG
QVVSREGQGRQETLFRCIRSMPEHPPNAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHG
TFLGFVKL
SEQ ID 58 (T175A, S202E, D205S, R206H)
VLHLVPINÁTSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVAFTMG
QVVSREGQGRQETLFRCIRSMPEHPDHAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHG
TFLGFVKL ACTIVACIÓN DE LINFOCITOS T
La presente invención también proporciona una molécula biespecífica que comprende
(i) un primer dominio que se une al antígeno de maduración de linfocitos B (BCMA) y comprende un APRIL mutante de acuerdo con el primer aspecto de la invención; y
(ii) un segundo dominio que tiene la capacidad de activar un linfocito T.
El segundo dominio de la molécula de la presente invención tiene la capacidad de activar linfocitos T. Los linfocitos T tienen un receptor de linfocitos T (TCR) en la superficie celular que reconoce péptidos antigénicos cuando son presentados por una molécula de MHC en la superficie de una célula presentadora de antígenos. Dicho reconocimiento del antígeno da como resultado la fosforilación de los motivos del inmunorreceptor de activación basada en tirosina (los ITAM, forma siglada de immunoreceptor tyrosine-based activation motifs) por las quinasas de la familia Src, desencadenando el reclutamiento de quinasas adicionales, lo que da como resultado la activación de linfocitos T, incluyendo la liberación de Ca2+.
El segundo dominio puede provocar la activación de los linfocitos T al desencadenar la misma ruta desencadenada por el reconocimiento específico de antígeno por el TCR.
CÚMULO DE DIFERENCIACIÓN 3 (CD3)
El segundo dominio de la molécula biespecífica de la invención puede unirse a CD3.
CD3 es una proteína compleja compuesta por cuatro cadenas distintas: una cadena CD3y, una cadena CD38 y dos cadenas CD3e. El CD3 se asocia con el receptor de linfocitos T (TCR) y la cadena Z en la superficie de un linfocito T para generar una señal de activación. El TCR, la cadena Z y la molécula CD3 juntas forman el complejo de TCR. El agrupamiento de CD3 en los linfocitos T, por ejemplo, mediante anticuerpos anti-CD3 inmovilizados, conduce a la activación de linfocitos T, de forma similar a la interacción del receptor de linfocitos T, pero de forma independiente de su especificidad típica de clon.
Debido a su papel central en la modulación de la actividad de los linfocitos T, ha habido intentos de desarrollar moléculas que tengan la capacidad de unirse a TCR/CD3. Gran parte de este trabajo se ha centrado en la generación de anticuerpos que son específicos para el antígeno CD3 humano.
El segundo dominio puede comprender un anticuerpo o parte del mismo que se una específicamente a CD3, tal como OKT3, WT32, anti-leu-4, UCHT-1, SPV-3TA, TR66, SPV-T3B o variantes con una afinidad ajustada de los mismos.
Como se usa en el presente documento, "anticuerpo" significa un polipéptido que tiene un sitio de unión a antígeno que comprende al menos una región determinante de complementariedad CDR. El anticuerpo puede comprender 3 CDR y tener un sitio de unión a antígeno que es equivalente al de un anticuerpo de un dominio (dAb). El anticuerpo puede comprender 6 CDR y tener un sitio de unión a antígeno que es equivalente al de una molécula de anticuerpo clásica. El resto del polipéptido puede ser cualquier secuencia que proporcione un armazón adecuado para el sitio de unión a antígeno y lo presente de una manera apropiada para que se una al antígeno. El anticuerpo puede ser una molécula de inmunoglobulina completa o una parte de la misma, tal como un Fab, F(ab)'2, Fv, fragmento Fv monocatenario (ScFv), nanocuerpo o un dominio variable monocatenario (que puede ser una cadena VH o VL, que tenga 3 CDR). El anticuerpo puede ser un anticuerpo bifuncional. El anticuerpo puede ser no humano, quimérico, humanizado o completamente humano.
Alternativamente, el segundo dominio puede comprender una molécula de unión a CD3 que no procede o se basa en una inmunoglobulina. Se han desarrollado varias proteínas de repetición diseñadas (las d Rp , forma siglada de designed repeat proteins) "miméticas de anticuerpos" para explotar las capacidades de unión de los polipéptidos que no son anticuerpos. Dichas moléculas incluyen proteínas de repetición ricas en leucina o anquirina, por ejemplo, las DARPin (proteínas diseñadas de repetición de anquirina), Anticalinas, Avímeros y Versacuerpos.
El segundo dominio de la molécula biespecífica de la invención puede comprender a todo o parte del anticuerpo monoclonal OKT3, que fue el primer anticuerpo monoclonal aprobado por la FDA. OKT3 está disponible de ATCC CRL 8001. Las secuencias de anticuerpos se publican en el documento US 7.381.803.
El segundo dominio puede comprender uno o más CDR de OKT3. El segundo dominio de unión puede comprender la CDR3 de la cadena pesada de OKT3 y/o la CDR3 de la cadena ligera de OKT3. El segundo dominio de unión puede comprender las 6 CDR de OKT3, como se muestra a continuación.
Cadena pesada
CDR1: (SEQ ID NO: 59) KASGYTFTRYTMH
CDR2: (SEQ ID NO: 60) INPSRGYTNYNQKFKD
CDR3: (SEQ ID NO: 61) YYDDHYCLDY
Cadena ligera
CDR1: (SEQ ID NO: 62) SASSSVSYMN
CDR2: (SEQ ID NO: 63) RWIYDTSKLAS
CDR3: (SEQ ID NO: 64) QQWSSNPFT
El segundo dominio de unión puede comprender un scFv que comprenda las secuencias de CDR de OKT3. El segundo dominio de unión puede comprender la secuencia de scFv mostrada a continuación como la SEQ ID NO: 65 o una variante de la misma, que tenga al menos el 80 % de identidad de secuencia, que conserve la capacidad de unirse a la CD3.
SEQ ID NO: 65
QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSR
GYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWG
QGTTLTVSSSGGGGSGGGGSGGGGSQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVS
YMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATY
YCQQWSSNPFTFGSGTKLEINR
Una secuencia variante de la SEQ ID NO: 65 puede tener al menos el 80, 85, 90, 95, 98 o 99 % de identidad de secuencia y tener una unión a CD3 equivalente o mejorada, y/o capacidades de activación del TCR como la secuencia mostrada como la SEQ ID NO: 65.
CAPTADORES BI-ESPECÍFICOS DE LINFOCITOS T (los BITE)
Los BiTES son una nueva clase de tratamiento que se aproxima a un antígeno diana con el receptor de linfocitos T (TCR). El diseño original fue de dos scFv conectados entre sí mediante un enlazador con un scFv que se dirige al antígeno y el otro que activa un linfocito T.
Los BiTE se hacen comúnmente mediante la fusión de un scFv anti-CD3 a un scFv anti antígeno diana, a través de un enlazador peptídico corto de cinco restos (GGGGS). En 1995, se produjo en células CHO un scFv en tándem dirigido a EpCAM (antígeno epitelial 17-1A) y a CD3 humano. Este nuevo tipo de formato de anticuerpos biespecíficos demostró ser altamente citotóxico en concentraciones nanomolar contra varias líneas celulares, al usar PBMC humanos no estimulados en ausencia de coseñalización. Posteriormente, se creó una fusión entre un scFv murino anti-CD19 y un scFv murino anti-CD3. Esta molécula demostró propiedades sobresalientes in vitro, incluyendo una citotoxicidad eficaz, sin la necesidad de coseñalización (por ejemplo, a través de CD28).
Blinatumomab, un anti-CD3 humano x anti-CD19 humano de murino fue el primer BiTE desarrollado y es el BiTE más avanzado en ensayos clínicos. El candidato se está estudiado como un tratamiento del linfoma y la leucemia.
MT110, un TaFv anti-EpCAM humano x anti-CD3 humano, fue el segundo BiTE probado en un ensayo clínico y el primero dirigido a un amplio espectro de tumores sólidos. Las caracterizaciones in vitro de MT110 han recapitulado los resultados obtenidos con MT103 en líneas celulares tumorales, demostrando de este modo la generalidad del formato BiTE. MT110 se encuentra actualmente en un ensayo clínico para pacientes con cáncer de pulmón, colorrectal y gastrointestinal.
La molécula biespecífica de la presente invención se basa en un formato similar a BiTE, pero en lugar de tener un scFv u otro dominio de unión basado en anticuerpos que se une al antígeno diana, tiene un dominio de unión basado en el ligando para BCMA, en concreto, APRIL.
Este formato "APRILiTE" es favorable en comparación con un formato clásico de scFv-scFv por diversas razones: (a) una fusión de scFv de único dominio es probablemente más estable y más fácil de fabricar que otros formatos; (b) el ensamblaje de BCMA y APRIL en la superficie celular requiere la trimerización de cada compañero de unión. Esto induce la agrupación del dominio de activación de linfocitos T a un nivel de proteína, lo que hace que la proteína sea altamente específica y altamente potente.
La molécula de la presente invención puede comprender una de las siguientes secuencias de aminoácidos, pero con una de las siguientes mutaciones individuales en la porción de la secuencia correspondiente a APRIL (con referencia a la numeración de posiciones mostrada en la SEQ ID NO: 1): M200C, M200L, M200G, M200S, M200A, M200N.
SEQ ID NO: 66
METDTLLLWVLLLWVPGSTGQVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMH
WVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDS
AVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSSGGGGSGGGGSGGGGSQIVLTQSPAI
MSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGS
GSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINRSDPAEPKSPDKTH
TCPPCPKDPKSGGGGSVLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGV
RIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMGQWSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPDRAYNSC
YSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKL
SEQ ID NO: 67
M E T D T LLLW V LLLW V P G S T G Q V Q LQ Q S G A E LA R P G A S V K M S C K A S G Y T F T R Y T M H
W V K Q R P G Q G LE W IG Y IN P S R G Y T N Y N Q K F K D K A T LT T D K S S S T A Y M Q LS S LTS E D S
A V Y Y C A R Y Y D D H Y C LD Y W G Q G TT LT V S S S G G G G S G G G G S G G G G S Q IV LTQ S P A I
M S A S P G E K V TM T C S A S S S V S Y M N W Y Q Q K S G T S P K R W IY D T S K LA S G V P A H F R G S
G S G TS Y S LT IS G M E A E D A A T Y Y C Q Q W S S N P F TF G S G T K LE IN R S D P TT T P A P R P P T
P A P T IA S Q P LS LR P E A C R P A A G G A V H T R G LD F A C D S G G G G S V LH LV P IN A T S K D D S
D V T E V M W Q P A LR R G R G LQ A Q G Y G V R IQ D A G V Y LLY S Q V LF Q D V T F T M G Q W S R E
G Q G R Q E T LF R C IR S M P S H P D R A Y N S C Y S A G V F H LH Q G D ILS V IIP R A R A K LN LS P H G
T F LG F V K L SEQ ID NO: 68
M G T S LLC W M A LC LLG A D H A D G V LH LV P IN A T S K D D S D V T E V M W Q P A LR R G R G LQ A
Q G Y G V R IQ D A G V Y LL Y S Q V L F Q D V T F T M G Q W S R E G Q G R Q E T LF R C IR S M P S H P D
R A Y N S C Y S A G V F H LH Q G D ILS V IIP R A R A K LN LS P H G T F LG F V K LS G G G S D P T T T P A P
R P P TP A P T IA S Q P LS LR P E A C R P A A G G A V H T R G LD F A C D S G G G G S Q V Q LQ Q S G A E
LA R P G A S V K M S C K A S G Y T F T R Y T M H V W K Q R P G Q G LE W IG Y IN P S R G Y T N Y N Q K F K
D K A TLT T D K S S S T A Y M Q LS S LT S E D S A V Y Y C A R Y Y D D H Y C LD Y W G Q G T T LT V S S S G
G G G S G G G G S G G G G S Q IV LT Q S P A IM S A S P G E K V T M T C S A S S S V S Y M N W Y Q Q K S G
T S P K R W IY D T S K LA S G V P A H F R G S G S G T S Y S LT IS G M E A E D A A T Y Y C Q Q W S S N P F T
F G S G T K LE IN R S
La molécula de la invención puede comprender una variante de la secuencia mostrada como las SEQ ID NO: 66, 67 o 68, que tiene al menos el 80, 85, 90, 95, 98 o 99 % de identidad de secuencia, siempre que la secuencia variante sea una molécula como se define en el primer aspecto de la invención, es decir, una molécula biespecífica que comprende:
(i) un primer dominio que se une al antígeno de maduración de linfocitos B (BCMA) y comprende al menos parte de un ligando inductor de la proliferación (APRIL); y
(ii) un segundo dominio que tiene la capacidad de activar un linfocito T.
PÉPTIDO SEÑAL
La molécula biespecífica de la invención puede comprender un péptido señal para ayudar en su producción. El péptido señal puede provocar que la molécula biespecífica sea secretada por una célula hospedadora, de tal manera que la molécula biespecífica se pueda recoger del sobrenadante de la célula hospedadora.
El núcleo del péptido señal puede contener un largo tramo de aminoácidos hidrófobos que tiene tendencia a formar una única hélice alfa. El péptido señal puede empezar con un tramo corto de aminoácidos cargado positivamente, que ayuda a garantizar la topología apropiada del polipéptido durante la traslocación. Al final del péptido señal normalmente hay un tramo de aminoácidos que reconoce y escinde la peptidasa señal. La peptidasa señal puede escindir durante o después de completarse la traslocación, para generar un péptido señal libre y una proteína madura. Después, los péptidos señal libres se digieren por proteasas específicas.
El péptido señal puede estar en el extremo amino de la molécula.
La molécula biespecífica puede tener la fórmula general:
Péptido señal - primer dominio - segundo dominio.
El péptido señal puede comprender la SEQ ID NO: 69 o 70, o una variante de la misma que tiene 5, 4, 3, 2 o 1 mutaciones de aminoácido (inserciones, sustituciones o adiciones) siempre que el péptido señal aún funcione para provocar la secreción de la molécula biespecífica.
SEQ ID NO: 69: METDTLLLWVLLLWVPGSTG
SEQ ID NO: 70: MGTSLLCWMALCLLGADHADG
Los péptidos señal de las SEQ ID NO: 69 y 70 son compactos y altamente eficaces. Se predice que proporcionan aproximadamente el 95 % de escisión después de la glicina terminal, proporcionando una eliminación eficaz por la peptidasa señal.
ESPACIADOR
La molécula de la presente invención puede comprender una secuencia espadadora para conectar el primer dominio con el segundo dominio, y separar espacialmente los dos dominios.
La secuencia espaciadora puede comprender, por ejemplo, una bisagra de IgG1 o un tallo de CD8. El enlazador puede comprender, alternativamente, una secuencia de enlazador alternativa que tiene propiedades de longitud y/o de espaciado de dominios similares a las de una bisagra de IgG1 o un tallo de CD8.
El espaciador puede ser un espaciador corto, por ejemplo, un espaciador que comprenda menos de 100, menos de 80, menos de 60 o menos de 45 aminoácidos. El espaciador puede ser o comprender una bisagra de IgG1 o un tallo de CD8, o una versión modificada de los mismos.
A continuación, se proporcionan ejemplos de secuencias de aminoácidos para estos enlazadores:
SEQ ID NO: 71 (bisagra de IgG1): AEPKSPDKTHTCPPCPKDPKSGGGGS
SEQ ID NO: 72 (tallo de CD8):
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD
El tallo de CD8 tiene una secuencia tal que puede inducir la formación de homodímeros (véase la Figura 2). Si esto no se desea, uno o más restos de cisteína pueden sustituirse o eliminarse de la secuencia del tallo de CD8. La molécula biespecífica de la invención puede incluir un espaciador que comprenda o consista en la secuencia mostrada como la SEQ ID NO: 72 o una variante de la misma que tenga al menos el 80, 85, 90, 95, 98 o 99 % de identidad de secuencia, siempre que la secuencia variante sea una molécula que provoque un espaciado aproximadamente equivalente del primer y segundo dominios y/o que la secuencia variante provoque la homodimerización de la molécula biespecífica. La molécula de la invención puede tener la fórmula general:
Péptido señal - primer dominio - espaciador - segundo dominio.
El espaciador también puede comprender uno o más motivos enlazadores para introducir una ruptura de cadena. Una ruptura de cadena separa dos dominios distintos pero permite la orientación en ángulos distintos. Dichas secuencias incluyen la secuencia SDP y la secuencia SGGGSDP (SEQ ID NO: 73).
El enlazador puede comprender un enlazador de serina-glicina, tal como SGGGGS (SEQ ID NO: 74).
RECEPTORES QUIMÉRICOS PARA ANTÍGENOS (los CAR)
Los receptores quiméricos para antígenos (los CAR), también conocidos como receptores quiméricos de linfocitos T, receptores artificiales de linfocitos T e inmunorreceptores quiméricos, son receptores diseñados técnicamente, que injertan una especificidad arbitraria en una célula efectora inmunitaria. En un CAR clásico (Figura 3), la especificidad de un anticuerpo monoclonal se injerta en un linfocito T o un linfocito citolítico natural (NK cell). Los ácidos nucleicos que codifican un CAR pueden introducirse en linfocitos T o linfocitos citolíticos naturales utilizando, por ejemplo, vectores retrovíricos. De esta manera, puede generarse una gran cantidad de linfocitos T o linfocitos citolíticos naturales específicos de cáncer para transferencia celular adoptiva. Los primeros estudios clínicos de esta estrategia han demostrado eficacia en algunos cánceres, principalmente cuando se dirigen al antígeno CD19 omnipresente en linfocitos B para tratar neoplasias malignas de linfocitos B.
El dominio de unión a antígeno diana de un CAR se fusiona habitualmente a través de un espaciador y dominio transmembrana a un endodominio de señalización. Cuando el CAR se une al antígeno diana, esto da como resultado la transmisión de una señal de activación al linfocito T en el que se expresa.
El CAR puede comprender:
(i) un APRIL variante, que actúa como el dominio de unión al antígeno de maduración de linfocitos B (BCMA); (ii) un espaciador opcional
(iii) un dominio transmembrana; y
(iv) un endodominio.
El endodominio puede comprender o asociarse con un dominio de señalización intracelular de linfocitos T.
El CAR de la presente invención puede comprender una de las siguientes secuencias de aminoácidos, pero con una de las siguientes mutaciones individuales en la porción de la secuencia correspondiente a APRIL (con referencia a la numeración de posiciones mostrada en la SEQ ID NO: 1): M200C, M200L, M200G, M200S, M200A, M200N.
SEQ ID NO: 75 (dAPRIL-HCH2CH3pvaa-CD28OXZ)
METDTLLLWVLLLWVPGSTGSVLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQ
DAGVYLLYSQVLFQDVTFTMGQWSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQ
GDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKLSGGGSDPAEPKSPDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFL
FPPKPKDTLMIARTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSV
LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCL
VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEA
LHNHYTQKSLSLSPGKKDPKFWVLWVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMT
PRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKIRV
KFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKD
KMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR SEQ ID NO: 76 (dAPRIL-CD8STK-CD28OXZ)
METDTLLLWVLLLWVPGSTGSVLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQ
DAGVYLLYSQVLFQDVTFTMGQWSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQ
GDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKLSGGGSDPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEAC
RPAAGGAVHTRGLDFACDIFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTP
RRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKIRVK
FSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDK
MAEAYS EIGMKGERRRGKGHDGLYQGL STATKDT YDALHMQAL PPR SEQ ID NO: 77 (dAPRIL-HNG-CD28OXZ)
METDTLLLWVLLLWVPGSTGSVLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQ
DAGVYLLYSQVLFQDVTFTMGQWSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQ
GDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKLSGGGSDPAEPKSPDKTHTCPPCPKDPKFWVLWV
GGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRD
QRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKIRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRR
EEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQG
LSTATKDTYDALHMQALPPR SEQ ID NO: 78 (dAPRIL-HCH2CH3pvaa-CD28OXZ)
MGTSLLCWMALCLLGADHADGKPIPNPLLGLDSTSGGGGSVLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQ
PALRRGRGLQAQG YGVRIQDAGVYLL YS QVL FQDVT FTMGQWS REGQGRQETLFRCIRSMPS
HPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKLSGGGSDPAEPKSPDK
THTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMIARTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHN
AKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVY
TLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV
DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDPKFWVLWVGGVLACYSLLVTVAFII
FWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRDQRLPPDAHKPPGGGSFR
TPIQEEQADAHSTLAKIRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMG
GKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQAL
PPR SEQ ID NO: 79 (dAPRIL-CD8STK-CD28OXZ)
MGTSLLCWMALCLLGADHADGKPIPNPLLGLDSTSGGGGSVLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQ
PALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPS
HPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKLSGGGSDPTTTPAPRP
PTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIF
WVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRDQRLPPDAHKPPGGGSFRT
PIQEEQADAHSTLAKIRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGG
KPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALP
PR
SEQ ID NO: 80 (dAPRIL-HNG-CD28OXZ)
MGTSLLCWMALCLLGADHADGKPIPNPLLGLDSTSGGGGSVLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQ
PALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPS
HPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKLSGGGSDPAEPKSPDK
THTCPPCPKDPKFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTR
KHYQPYAPPRDFAAYRSRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKIRVKFSRSADA
PAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSE
IGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
La molécula de la invención puede comprender una variante de la secuencia mostrada como las SEQ ID NO: 75, 76, 77, 78, 79 u 80, que tiene al menos el 80, 85, 90, 95, 98 o 99 % de identidad de secuencia, siempre que la secuencia variante sea una molécula como se define en el primer aspecto de la invención, es decir, un CAR que comprende: (i) un dominio de unión a BCMA;
(ii) un dominio espaciador opcional
(iii) un dominio transmembrana; y
(iv) un endodominio;
y comprende una de las siguientes mutaciones individuales en la porción de la secuencia correspondiente a APRIL (con referencia a la numeración de posiciones mostrada en la SEQ ID NO: 1): M200C, M200L, M200G, M200S, M200A, M200N.
El porcentaje de identidad entre dos secuencias polipeptídicas puede determinarse fácilmente por programas tales como BLAST, que está libremente disponible en http://blast.ncbi.nlm.nih.gov.
SECUENCIA DE ÁCIDO NUCLEICO
La presente invención también proporciona una secuencia de ácido nucleico que codifica un APRIL variante, un CAR que comprende un APRIL variante o un BiTE que comprende un APRIL variante como se define anteriormente.
La secuencia de ácido nucleico puede ser ARN o ADN, puede ser de monocatenaria o bicatenaria.
Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican los APRIL-BiTE se muestran como las SEQ ID NO: 81-83. La secuencia de ácido nucleico de la presente invención puede codificar la secuencia de aminoácidos codificada por la SEQ ID NO: 81, 82 u 83, pero con una de las siguientes mutaciones individuales en la porción de la secuencia correspondiente a APRIL (con referencia a la numeración de posiciones mostrada en la SEQ ID NO: 1): M200C, M200L, M200G, M200S, M200A, M200N.
SEQ ID NO: 81 (APRILiTE#01)
ATGGAGACCGACACCCTGCTGCTGTGGGTGCTGCTGCTGTGGGTGCCAGGCAG
CACCGGCCAGGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGAGCCGAGCTGGCCAGACCAGGC
GCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCCGGTACAC
CATGCACTGGGTGAAGCAGCGGCCAGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCTAC
ATCAACCCCAGCAGAGGCTACACCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCC
ACCCT G ACCACCG ACAAG AGCAGCAGCACCGCCT ACATGCAGCT G AGCAGCCT
G ACCAGCG AGG ACAGCGCCGT GT ACT ACTGCGCCAG AT ACT ACG ACG ACCACT
ACTGCCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCCTGACCGTGAGCAGCTCTGGC
GGAGGCGGCTCTGGCGGAGGCGGCTCTGGCGGAGGCGGCAGCCAGATCGTGC
T G ACCCAG AGCCCAGCCAT CAT G AGCGCCAGCCCAGGCG AG AAGGT G ACCAT G
ACCTGCAGCGCCAGCAGCAGCGTGAGCTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGAG
CGGCACCAGCCCCAAGCGGTGGATCTACGACACCAGCAAGCTGGCCAGCGGC
GTGCCAGCCCACTTCAGAGGCAGCGGCAGCGGCACCAGCTACAGCCTG ACCAT
CAGCGGCATGGAGGCCGAGGATGCCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTGGAGCA
GCAACCCCTTCACCTTCGGCAGCGGCACCAAGCTGGAGATCAACCGGTCGGAT
CCCGCCGAGCCCAAATCTCCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAAAA
G AT CCCAAAT CT GGCGG AGGCGGCAGCGTGCTGCACCT GGTGCCCAT CAACG
CCACCAGCAAGGACGACT CT GATGT GACCGAGGT GAT GT GGCAGCCAGCCCT G
AGACGGGGCAGAGGCCTGCAGGCCCAGGGCTACGGCGTGAGAATCCAGGACG
CTGGCGTGTACCTGCTGTACTCCCAGGTGCTGTTCCAGGACGTGACCTTCACAA
TGGGCCAGGTGGTGAGCCGGGAGGGCCAGGGCAGACAGGAGACCCTGTTCCG
GTGCATCCGGAGCATGCCCAGCCACCCCGACAGAGCCTACAACAGCTGCTACA
GCGCTGGCGTGTTTCACCTGCACCAGGGCGACATCCTGAGCGTGATCATCCCC
AGAGCCAGAGCCAAGCT GAACCT GT CCCCCCACGGCACCTTT CT GGGCTT CGT
GAAGCTGTGA
SEQ ID NO: 82 (APRILiTE#03)
ATGGAGACCGACACCCTGCTGCTGTGGGTGCTGCTGCTGTGGGTGCCAGGCAG
CACCG G CCAG GTG C AG CT G CAG CAG AG CG GAG CCGAGCT G G CCAG AC C AG G C
GCCAG CGT GAAGAT GAG CT GCAAGG CC AG CGGCTACACCTT CACCCG GTACAC
CATGCACTGGGTGAAGCAGCGGCCAGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCTAC
ATCAACCCCAGCAGAGGCTACACCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCC
ACCCTGACCACCGACAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCT
GACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCAGATACTACGACGACCACT
ACTGCCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCCTGACCGTGAGCAGCTCTGGC
GGAGGCGGCTCTGGCGGAGGCGGCTCTGGCGGAGGCGGCAGCCAGATCGTG
CTGACCCAGAGCCCAGCCATCATGAGCGCCAGCCCAGGCGAGAAGGTGACCAT
GACCTGCAGCGCCAGCAGCAGCGTGAGCTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGA
GCGGCACCAGCCCCAAGCGGTGGATCTACGACACCAGCAAGCTGGCCAGCGG
CGTGCCAGCCCACTTCAGAGGCAGCGGCAGCGGCACCAGCTACAGCCTGACCA
TCAGCGGCATGGAGGCCGAGGATGCCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTGGAGC
AGCAACCCCTTCACCTTCGGCAGCGGCACCAAGCTGGAGATCAACCGGTCGGA
TCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGT
CGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCG
CAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATTCTGGCGGAGGCGGCAG
CGT GCTGCACCT GGT G CCCAT CAACGCCACCAG CAAGGACGACT CT GAT GT GA
CC G AG GT GAT GTGGCAGCCAGCCCT G AG ACG G G G C AGAG G CCTG CAG G C C CA
GGGCTACGGCGTGAGAATCCAGGACGCTGGCGTGTACCTGCTGTACTCCCAGG
TGCTGTTCCAGGACGTGACCTTCACAATGGGCCAGGTGGTGAGCCGGGAGGGC
CAGGGCAGACAGGAGACCCTGTTCCGGTGCATCCGGAGCATGCCCAGCCACCC
CGACAGAGCCTACAACAGCTGCTACAGCGCTGGCGTGTTTCACCTGCACCAGG
GCGACATCCTGAGCGTGATCATCCCCAGAGCCAGAGCCAAGCTGAACCTGTCC
CCCCACGGCACCTTTCT GGGCTT CGT GAAGCT GT GA
SEQ ID NO: 83 (APRILiTE#06)
ATGGGCACCTCCCTGCTGTGCTGGATGGCCCTGTGCCTGCTGGGAGCCGACCA
CGCCGACGGCGTGCTGCACCTGGTGCCCATCAACGCCACCAGCAAGGACGACT
CTGATGTGACCGAGGTGATGTGGCAGCCAGCCCTGAGACGGGGCAGAGGCCT
GCAGGCCCAGGGCTACGGCGTGAGAATCCAGGACGCTGGCGTGTACCTGCTGT
ACT CCCAGGTGCT GTT CCAGG ACGT G ACCTT CACAAT GGGCCAGGTGGT G AGC
CGGGAGGGCCAGGGCAGACAGGAGACCCTGTTCCGGTGCATCCGGAGCATGC
CCAGCCACCCCG ACAG AGCCT ACAACAGCTGCT ACAGCGCTGGCGT GTTT CAC
CT GCACCAGGGCG ACAT CCT G AGCGT G AT CAT CCCCAG AGCCAG AGCCAAGCT
GAACCTGTCCCCCCACGGCACCTTTCTGGGCTTCGTGAAGCTGTCTGGAGGCG
GCTCGGATCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCAC
CATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCG
GGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATAGCGGTGGCG
GTGGCAGCCAGGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGAGCCGAGCTGGCCAGACCAGG
CGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCCGGTACA
CCAT GCACTGGGT G AAGCAGCGGCCAGGCCAGGGCCTGG AGT GG AT CGGCT A
CATCAACCCCAGCAGAGGCTACACCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGC
CACCCT G ACCACCG ACAAG AGCAGCAGCACCGCCT ACATGCAGCT G AGCAGCC
T G ACCAGCG AGG ACAGCGCCGT GT ACT ACTGCGCCAG AT ACT ACG ACG ACCAC
TACTGCCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCCTGACCGTGAGCAGCTCTGG
CGGAGGCGGCTCTGGCGGAGGCGGCTCTGGCGGAGGCGGCAGCCAGATCGTG
CT G ACCCAG AGCCCAGCCAT CAT G AGCGCCAGCCCAGGCG AG AAGGT G ACCA
T G ACCT GCAGCGCCAGCAGCAGCGT G AGCT ACAT G AACT GGT ACCAGCAG AAG
AGCGGCACCAGCCCCAAGCGGTGGATCTACGACACCAGCAAGCTGGCCAGCG
GCGTGCCAGCCCACTTCAGAGGCAGCGGCAGCGGCACCAGCTACAGCCTGAC
CAT CAGCGGCATGG AGGCCG AGG ATGCCGCCACCT ACT ACT GCCAGCAGTGG A
GCAGCAACCCCTT CACCTT CGGCAGCGGCACCAAGCT GG AG AT CAACCGGT CG
TGA
Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican los CAR con APRIL se muestran como las SEQ ID NO: 84-89. La secuencia de ácido nucleico de la presente invención puede codificar la secuencia de aminoácidos codificada por la SEQ ID NO: 84, 85, 86, 87, 88 u 89, pero con una de las siguientes mutaciones individuales en la porción de la secuencia correspondiente a APRIL (con referencia a la numeración de posiciones mostrada en la SEQ ID NO: 1): M200C, M200L, M200G, M200S, M200A, M200N.
SEQ ID NO: 84 (dAPRIL-HCH2CH3pvaa-CD28OXZ)
ATGGAGACCGACACCCTGCTGCTGTGGGTGCTGCTGCTGTGGGTGCCAGGCAGCACCGGCAGC
GTGCTCCACCTGGTGCCCATCAACGCCACCAGCAAGGACGACTCTGATGTGACCGAGGTGATG
TGGCAGCCAGCCCTGAGACGGGGCAGAGGCCTGCAGGCCCAGGGCTACGGCGTGAGAATCCAG
GACGCTGGCGTGTACCTGCTGTACTCCCAGGTGCTGTTCCAGGACGTGACCTTCACAATGGGC
CAGGTGGTGAGCCGGGAGGGCCAGGGCAGACAGGAGACCCTGTTCCGGTGCATCCGGAGCATG
CCCAGCCACCCCGACAGAGCCTACAACAGCTGCTACAGCGCTGGCGTGTTTCACCTGCACCAG
GGCGACATCCTGAGCGTGATCATCCCCAGAGCCAGAGCCAAGCTGAACCTGTCCCCCCACGGC
ACCTTTCTGGGCTTCGTGAAGCTGTCTGGAGGCGGCTCGGATCCCGCCGAGCCCAAATCTCCT
GACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTCCCGTGGCCGGCCCGTCAGTCTTCCTC
TTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCGCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTG
GTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTG
CATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTC
CTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAA
GCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAG
GTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTG
GTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAACCGGAGAAC
AACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTC
ACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCT
CTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAAAAGATCCCAAATTT
TGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTT
ATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACT
CCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCA
GCCTATCGCTCCAGGGACCAGAGGCTGCCCCCCGATGCCCACAAGCCCCCTGGGGGAGGCAGT
TTCCGGACCCCCATCCAAGAGGAGCAGGCCGACGCCCACTCCACCCTGGCCAAGATCAGAGTG
AAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAG
CTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAG
ATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGAT
AAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCAC
GATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAG
GCCCTGCCTCCTCGCTAA
SEQ ID NO: 85 (dAPRIL-CD8STK-CD28OXZ) ATGGAGACCGACACCCTGCTGCTGTGGGTGCTGCTGCTGTGGGTGCCAGGCAGCACCGGCAGC GTGCTCCACCTGGTGCCCATCAACGCCACCAGCAAGGACGACTCTGATGTGACCGAGGTGATG TGGCAGCCAGCCCTGAGACGGGGCAGAGGCCTGCAGGCCCAGGGCTACGGCGTGAGAATCCAG GACGCTGGCGTGTACCTGCTGTACTCCCAGGTGCTGTTCCAGGACGTGACCTTCACAATGGGC CAGGTGGTGAGCCGGGAGGGCCAGGGCAGACAGGAGACCCTGTTCCGGTGCATCCGGAGCATG CCCAGCCACCCCGACAGAGCCTACAACAGCTGCTACAGCGCTGGCGTGTTTCACCTGCACCAG
GGCGACATCCTGAGCGTGATCATCCCCAGAGCCAGAGCCAAGCTGAACCTGTCCCCCCACGGC
ACCTTTCTGGGCTTCGTGAAGCTGTCTGGAGGCGGCTCGGATCCCACCACGACGCCAGCGCCG
CGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGC
CGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTTTTGG
GTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATT
ATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCC
CGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCC
TATCGCTCCAGGGACCAGAGGCTGCCCCCCGATGCCCACAAGCCCCCTGGGGGAGGCAGTTTC
CGGACCCCCATCCAAGAGGAGCAGGCCGACGCCCACTCCACCCTGGCCAAGATCAGAGTGAAG
TTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTC
AATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATG
GGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAG
ATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGAT
GGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCC
CTGCCTCCTCGCTAA SEQ ID NO: 86 (dAPRIL-HNG-CD28OXZ)
ATGGAGACCGACACCCTGCTGCTGTGGGTGCTGCTGCTGTGGGTGCCAGGCAGCACCGGCAGC GTGCTCCACCTGGTGCCCATCAACGCCACCAGCAAGGACGACTCTGATGTGACCGAGGTGATG TGGCAGCCAGCCCTGAGACGGGGCAGAGGCCTGCAGGCCCAGGGCTACGGCGTGAGAATCCAG GACGCTGGCGTGTACCTGCTGTACTCCCAGGTGCTGTTCCAGGACGTGACCTTCACAATGGGC CAGGTGGTGAGCCGGGAGGGCCAGGGCAGACAGGAGACCCTGTTCCGGTGCATCCGGAGCATG CCCAGCCACCCCGACAGAGCCTACAACAGCTGCTACAGCGCTGGCGTGTTTCACCTGCACCAG GGCGACATCCTGAGCGTGATCATCCCCAGAGCCAGAGCCAAGCTGAACCTGTCCCCCCACGGC ACCTTTCTGGGCTTCGTGAAGCTGTCTGGAGGCGGCTCGGATCCCGCCGAGCCCAAATCTCCT GACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAAAAGATCCCAAATTTTGGGTGCTGGTGGTGGTT GGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGG AGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCC ACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGGGAC CAGAGGCTGCCCCCCGATGCCCACAAGCCCCCTGGGGGAGGCAGTTTCCGGACCCCCATCCAA GAGGAGCAGGCCGACGCCCACTCCACCCTGGCCAAGATCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCA GACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGA GAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGA AGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTAC AGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGT CTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCTCCTCGCTAA SEQ ID NO: 87 (dAPRIL-HCH2CH3pvaa-CD28OXZ)
ATGGGCACCTCCCTGCTGTGCTGGATGGCCCTGTGCCTGCTGGGAGCCGACCACGCCGACGGC
AAGCCCATTCCCAACCCCCTGCTGGGCCTGGACTCCACCTCTGGCGGAGGCGGCAGCGTGCTG
CACCTGGTGCCCATCAACGCCACCAGCAAGGACGACTCTGATGTGACCGAGGTGATGTGGCAG
CCAGCCCTGAGACGGGGCAGAGGCCTGCAGGCCCAGGGCTACGGCGTGAGAATCCAGGACGCT
GGCGTGTACCTGCTGTACTCCCAGGTGCTGTTCCAGGACGTGACCTTCACAATGGGCCAGGTG
GTGAGCCGGGAGGGCCAGGGCAGACAGGAGACCCTGTTCCGGTGCATCCGGAGCATGCCCAGC
CACCCCGACAGAGCCTACAACAGCTGCTACAGCGCTGGCGTGTTTCACCTGCACCAGGGCGAC
ATCCTGAGCGTGATCATCCCCAGAGCCAGAGCCAAGCTGAACCTGTCCCCCCACGGCACCTTT
CTGGGCTTCGTGAAGCTGTCTGGAGGCGGCTCGGATCCCGCCGAGCCCAAATCTCCTGACAAA
ACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTCCCGTGGCCGGCCCGTCAGTCTTCCTCTTCCCC
CCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCGCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGAC
GTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAAT
GCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACC
GTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTC
CCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTAC
ACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAA
GGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAACCGGAGAACAACTAC
AAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTG
GACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCAC
AACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAAAAGATCCCAAATTTTGGGTG
CTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATT
TTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGC
CGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTAT
CGCTCCAGGGACCAGAGGCTGCCCCCCGATGCCCACAAGCCCCCTGGGGGAGGCAGTTTCCGG
ACCCCCATCCAAGAGGAGCAGGCCGACGCCCACTCCACCCTGGCCAAGATCAGAGTGAAGTTC
AGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAAT
CTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGG
GGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATG
GCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGC
CTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTG
CCTCCTCGCTAA SEQ ID NO: 88 (dAPRIL-CD8STK-CD28OXZ)
ATGGGCACCTCCCTGCTGTGCTGGATGGCCCTGTGCCTGCTGGGAGCCGACCACGCCGACGGC
AAGCCCATTCCCAACCCCCTGCTGGGCCTGGACTCCACCTCTGGCGGAGGCGGCAGCGTGCTG
CACCTGGTGCCCATCAACGCCACCAGCAAGGACGACTCTGATGTGACCGAGGTGATGTGGCAG
CCAGCCCTGAGACGGGGCAGAGGCCTGCAGGCCCAGGGCTACGGCGTGAGAATCCAGGACGCT
GGCGTGTACCTGCTGTACTCCCAGGTGCTGTTCCAGGACGTGACCTTCACAATGGGCCAGGTG
GTGAGCCGGGAGGGCCAGGGCAGACAGGAGACCCTGTTCCGGTGCATCCGGAGCATGCCCAGC
CACCCCGACAGAGCCTACAACAGCTGCTACAGCGCTGGCGTGTTTCACCTGCACCAGGGCGAC
ATCCTGAGCGTGATCATCCCCAGAGCCAGAGCCAAGCTGAACCTGTCCCCCCACGGCACCTTT
CTGGGCTTCGTGAAGCTGTCTGGAGGCGGCTCGGATCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCA
CCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCA
GCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTTTTGGGTGCTG
GTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTC
TGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGC
CCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGC
TCCAGGGACCAGAGGCTGCCCCCCGATGCCCACAAGCCCCCTGGGGGAGGCAGTTTCCGGACC
CCCATCCAAGAGGAGCAGGCCGACGCCCACTCCACCCTGGCCAAGATCAGAGTGAAGTTCAGC
AGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTA
GGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGA
AAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCG
GAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTT
TACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCT
SEQ ID NO: 89 (dAPRIL-HNG-CD28OXZ)
ATGGGCACCTCCCTGCTGTGCTGGATGGCCCTGTGCCTGCTGGGAGCCGACCACGCCGACGGC
AAGCCCATTCCCAACCCCCTGCTGGGCCTGGACTCCACCTCTGGCGGAGGCGGCAGCGTGCTG
CACCTGGTGCCCATCAACGCCACCAGCAAGGACGACTCTGATGTGACCGAGGTGATGTGGCAG
CCAGCCCTGAGACGGGGCAGAGGCCTGCAGGCCCAGGGCTACGGCGTGAGAATCCAGGACGCT
GGCGTGTACCTGCTGTACTCCCAGGTGCTGTTCCAGGACGTGACCTTCACAATGGGCCAGGTG
GTGAGCCGGGAGGGCCAGGGCAGACAGGAGACCCTGTTCCGGTGCATCCGGAGCATGCCCAGC
CACCCCGACAGAGCCTACAACAGCTGCTACAGCGCTGGCGTGTTTCACCTGCACCAGGGCGAC
ATCCTGAGCGTGATCATCCCCAGAGCCAGAGCCAAGCTGAACCTGTCCCCCCACGGCACCTTT
CTGGGCTTCGTGAAGCTGTCTGGAGGCGGCTCGGATCCCGCCGAGCCCAAATCTCCTGACAAA
ACTCACACATGCCCACCGTGCCCAAAAGATCCCAAATTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGA
GTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAG
AGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGC
AAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGGGACCAGAGG
CTGCCCCCCGATGCCCACAAGCCCCCTGGGGGAGGCAGTTTCCGGACCCCCATCCAAGAGGAG
CAGGCCGACGCCCACTCCACCCTGGCCAAGATCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCC
CCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAG
TACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAG
AACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAG
ATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGT
ACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCTCCTCGCTAA
La secuencia de ácido nucleico puede codificar la misma secuencia de aminoácidos que la codificada por la SEQ ID NO: 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88 u 89, que comprende la variación mencionada anteriormente, pero puede tener una secuencia de ácido nucleico distinta, debido a la degeneración del código genético. La secuencia de ácido nucleico puede tener al menos el 80, 85, 90, 95, 98 o 99 % de identidad con la secuencia mostrada como la SEQ ID NO: 81 a 89, siempre que codifique una molécula como se define en el primer aspecto de la invención.
La secuencia de ácido nucleico descrita en el presente documento puede codificar la secuencia de aminoácidos codificada por la SEQ ID NO: 81 a 89, pero con una de las siguientes mutaciones individuales (las SEQ ID 22 a 27, 34 a 45):
A125T,
V174T, V174G,
T175H, T175S, T175G,
P201V, P201A, P201G, P201R, P201Y, P201W,
S202G, S202F, S202D, S202V, S202P, D205P.
El ácido nucleico puede codificar la secuencia de aminoácidos codificada por la SEQ ID NO: 81 a 89, pero con una de las siguientes mutaciones individuales (las SEQ ID 28 a 33): M200C, M200L, M200G, M200S, M200A, M200N.
La secuencia de ácido nucleico puede codificar la secuencia de aminoácidos codificada por la SEQ ID NO: 81 a 89, pero con una combinación de mutaciones en las siguientes posiciones: V174 y T175; o V174 y M200; o V174 y S202; o T175 y M200, o T175 y S202; o D205 y R206; o V174, T175 y M200; o V174, T175 y S202; o T175, D205 y R206; o M200, D205 y R206; o V174, T175, M200 y S202; o T175, S202, D205 y R206;
La secuencia de ácido nucleico descrita en el presente documento puede codificar la secuencia de aminoácidos codificada por la SEQ ID NO: 81 a 89, pero con una de las siguientes combinaciones de mutación específicas:
V174T y T175A; o V174S y S202G; o
V174T y S202V; o V174G y S202G, o V174G y S202E; o
V174G y S202A; o V174G y S202G; o V174E y S202Y; o
T175A y S202E; o T175G y S202G; o T175G y S202V; o
T175A y S202P; o T175S y S202G; o
S202V y H203N; o D205H y R206L; o D205P y R206K; o
D205P y R206N; o D205S y R206P; o D205R y R206G; o
D205P y R206I; o D205S y R206H; o
V174T, T175A y S202E; o
T175A, D205P y R206N; o T175A, D205S y R206H; o
M200G, D205P y R206N; o
V174T, T175A, M200G y S202E; o
T175A, S202E, D205P y R206N; o
T175A, S202E, D205S y R206H.
La secuencia de ácido nucleico puede codificar la secuencia de aminoácidos codificada por la SEQ ID NO: 84 a 89, pero con una de las siguientes combinaciones de mutaciones específicas: V174T y M200G; o T175A y M200G; o V174T, T175A y M200G; o M200G, D205A y R206H.
VECTOR
La presente invención también proporciona un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención. Dicho vector puede usarse para introducir la secuencia de ácido nucleico en una célula hospedadora de manera que exprese y produzca un APRIL variante de acuerdo con el primer aspecto de la invención.
El vector puede, por ejemplo, ser un plásmido o ARNm sintético o un vector vírico, tal como un vector retrovírico o lentivírico.
El vector puede tener la capacidad de transfectar o transducir una célula efectora.
CÉLULA
La invención también proporciona una célula hospedadora que comprende un ácido nucleico de acuerdo con la invención.
La invención también proporciona una célula que comprende un CAR de acuerdo con la invención.
La célula puede ser una célula inmunitaria, tal como un linfocito T o un linfocito citolítico natural (NK). Puede ser una célula primaria o una célula de una línea celular.
La invención también proporciona una composición de células que comprende una pluralidad de células que expresan CAR de la invención.
La invención también proporciona un método para la fabricación de una célula de acuerdo con la presente invención que comprende la etapa de transducir o transfectar una célula con un vector de la invención, que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un receptor quimérico para antígeno.
La célula puede transfectarse o transducirse ex vivo y luego reimplantarse en el mismo sujeto o en uno distinto. AGENTES TERAPÉUTICOS
La presente divulgación proporciona un agente terapéutico que comprende un APRIL variante, un ácido nucleico, un vector, una célula que expresa CAR o un BiTE como se define anteriormente.
El agente terapéutico puede comprender un APRIL variante como porción de direccionamiento, para dirigir el agente a las células que expresan BCMA, tal como las células plasmáticas. El agente terapéutico también puede comprender un dominio funcional que ejerce un efecto terapéutico, por ejemplo, actuando directamente sobre la célula plasmática o reclutando otras células del sistema inmunitario para que actúen sobre la célula plasmática.
El APRIL variante puede conjugarse con un fármaco, tal como un fármaco citotóxico.
El APRIL variante puede ser parte de un receptor quimérico para antígeno o un captador biespecífico de linfocitos T (BiTE)
COMPOSICIÓN FARMACÉUTICA
La presente invención también se refiere a una composición farmacéutica que contiene un agente terapéutico de la invención junto con un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable, y opcionalmente uno o más polipéptidos y/o compuestos farmacéuticamente activos adicionales. Dicha formulación puede, por ejemplo, estar en una forma adecuada para infusión intravenosa).
MÉTODO DE TRATAMIENTO
El agente terapéutico y la composición farmacéutica se pueden usar para el tratamiento de una enfermedad cancerosa, en particular, un trastorno de células plasmáticas o un trastorno de los linfocitos B que se correlacione con una expresión potenciada de BCMA.
Los trastornos de células plasmáticas incluyen plasmocitoma, leucemia de células plasmáticas, mieloma múltiple, macroglobulinemia, amiloidosis, macroglobulinemia de Waldenstrom, plasmocitoma óseo solitario, plasmocitoma extramedular, mieloma osteosclerótico (síndrome de POEMS, forma siglada de OEMS: polyneuropathy, organomegaly, endocrinopathy, monoclonal protein, skin changes polineuropatía, organomegalia, endocrinopatía, gammapatía monoclonal y cambios en la piel) y las enfermedades de la cadena pesada, así como la gammapatía monoclonal de importancia incierta clínicamente poco clara/mieloma múltiple latente.
La enfermedad puede ser mieloma múltiple.
Los ejemplos de trastornos de linfocitos B que se correlacionan con niveles elevados de expresión de BCMA son la LLC (leucemia linfocítica crónica) y el linfoma no Hodgkin (LNH). Los agentes de unión biespecíficos de la invención también pueden usarse en la terapia de enfermedades autoinmunitarias como el lupus eritematoso sistémico (LES), la esclerosis múltiple (EM) y la artritis reumatoide (AR).
El método de la presente divulgación puede ser para el tratamiento de una enfermedad cancerosa, en particular, un trastorno de células plasmáticas o un trastorno de los linfocitos B que se correlacione con una expresión potenciada de BCMA.
Un método para el tratamiento de enfermedad se refiere al uso terapéutico de un agente de la invención. A este respecto, el agente se puede administrar a un sujeto que tenga una enfermedad o afección existente para disminuir, reducir o mejorar al menos un síntoma asociado con la enfermedad y/o para desacelerar, reducir o bloquear la progresión de la enfermedad. El método de la divulgación puede provocar o propiciar la destrucción mediada por linfocitos T de células que expresan BCMA, tal como las células plasmáticas.
DIAGNÓSTICO
La presente invención también proporciona un agente de diagnóstico para la detección de células plasmáticas que comprende un APRIL variante de la invención.
El agente de diagnóstico también puede comprender un marcador detectable, tal como un marcador radioactivo o fluorescente, o un colorante.
El agente de diagnóstico puede ser para el diagnóstico de un trastorno de células plasmáticas.
El método de diagnóstico se lleva a cabo in vitro. En un método in vivo, el agente de diagnóstico se administra al sujeto.
En el método in vitro, el APRIL variante se añade a una muestra del sujeto. in vitro. La muestra puede comprender células plasmáticas. La muestra puede ser, o proceder de, una muestra de sangre, tal como una muestra de CMSP.
La invención se describirá adicionalmente a continuación por medio de ejemplos, que pretenden servir para ayudar a un experto en la materia a poner en práctica la invención y que de ninguna manera pretenden limitar el alcance de la invención.
Ejemplos
Ejemplo 1 - caracterización de BCMA como una diana para mieloma
Se aislaron células primarias de mieloma realizando una selección inmunomagnética de CD138 en muestras de médula ósea fresca de pacientes con mieloma múltiple que se sabía que tenían enfermedad franca. Estas células se tiñeron con el Acm J6MO específico para BCMA (GSK) que se conjugó con PE. Al mismo tiempo, se generó un patrón de perlas con cantidades conocidas de sitios de unión utilizando el kit de perlas PE Quantibrite (Becton Dickenson), según las instrucciones del fabricante. El número de copias de BCMA en las células de mieloma pudo obtenerse correlacionando la intensidad de fluorescencia media de las células de mieloma con la curva patrón obtenida a partir de las perlas. Se descubrió que el intervalo del número de copias de BCMA en una superficie de célula de mieloma es bajo: 348,7-4268,4 copias de BCMA por célula con una media de 1181 y una mediana de 1084,9 (Figura 2). Esto es considerablemente más bajo que, por ejemplo, CD19 y GD2, dianas clásicas para los CAR. La presencia de expresión de BCMA en células primarias de mieloma también se confirmó con el anticuerpo Vicky-1 (Abcam Ab17323), cuyos ejemplos se muestran en la figura 18.
Ejemplo 2 - Diseño y construcción de los CAR basados en APRIL.
APRIL en su forma natural es una proteína secretada de tipo II. El uso de APRIL como un dominio de unión a BCMA para un CAR precisa la conversión de esta proteína secretada de tipo II en una proteína unida a membrana de tipo I, y que esta proteína sea estable y conserve la unión a BCMA en esta forma. Para generar moléculas candidatas, el extremo amino de APRIL se delecionó para eliminar la unión a proteoglucanos. A continuación, se añadió un péptido señal para dirigir la proteína naciente al retículo endoplásmico y, por lo tanto, a la superficie celular. Además, debido a que la naturaleza del espaciador utilizado puede alterar la función de un c Ar , se probaron tres dominios espaciadores distintos: se generó una CAR basado en APRIL que comprendía (i) un espaciador de IgG1 humana modificado para eliminar los motivos de unión al Fc; (ii) un tallo de CD8; y (iii) la bisagra de IgG1 sola (viñeta en la Figura 4 y secuencias de aminoácidos en la Figura 5, y también secuencias de aminoácidos en la figura 19, que difieren de las secuencias en la figura 5 al tener un péptido señal distinto y la etiqueta del epítopo V5). Estos CAR se expresaron en un vector retrovírico bicistrónico (Figura 6A) de manera que pudiera expresarse como un gen marcador conveniente un CD34 truncado como proteína marcadora.
Ejemplo 3 - Expresión y función de los CAR basados en APRIL.
El objetivo de este estudio fue probar si los CAR basados en APRIL que se habían construido se expresaban en la superficie celular y si APRIL se había plegado para formar la proteína nativa. Se transdujeron linfocitos T con estas construcciones de distintos CAR y se tiñeron usando un Acm anti-APRIL disponible en el mercado, junto con la tinción para el gen marcador, y se analizó por citometría de flujo. Los resultados de este experimento se muestran en la Figura 6B, donde la unión de APRIL se representa frente a la fluorescencia del gen marcador. Estos datos muestran que, en este formato, los CAR basados en APRIL se expresan en la superficie celular y APRIL se pliega de forma suficiente como para ser reconocido por un Acm anti-APRIL.
A continuación, se determinó si APRIL en este formato podía reconocer a BCMA y TACI. Se generaron BCMA y TACI recombinantes como fusiones con Fc de IgG2a de ratón. Estas proteínas recombinantes se incubaron con los linfocitos T transducidos. Después de esto, las células se lavaron y se tiñeron con un anticuerpo conjugado con fluoróforo anti­ ratón y un anticuerpo para detectar el gen marcador conjugado con un fluoróforo distinto. Las células se analizaron mediante citometría de flujo y los resultados se presentan en la Figura 6C. Los distintos CAR tuvieron la capacidad de unirse tanto a BCMA como a TACI. Sorprendentemente, los CAR fueron más capaces de unirse a BCMA que a TACI. Además, sorprendentemente, los CAR con un tallo de CD8 o un espaciador de bisagra de IgG1 fueron más capaces de unirse a BCMA y TACI que el CAR con un espaciador de Fc.
Ejemplo 4 - Los receptores quiméricos para antígenos basados en APRIL son activos contra las células que expresan BCMA
Los linfocitos T de los donantes normales se transdujeron con los distintos CAR con APRIL y se probaron frente a células SupT1 de tipo silvestre o técnicamente diseñadas para expresar BCMA y TACI. Se utilizaron varios ensayos distintos para determinar la función. Se realizó un ensayo clásico de liberación de cromo. En este caso, las células diana (las células SupT1) se marcaron con 51Cr y se mezclaron con los efectores (los linfocitos T transducidos) en distintas relaciones. La lisis de las células diana se determinó contando 51Cr en el sobrenadante de cocultivo (la Figura 6A muestra los datos acumulados, los datos de ejemplo de un solo ensayo con distintas relaciones de efector:diana se muestran en la figura 16).
Además, el sobrenadante de linfocitos T cultivados 1:1 con células SupT1 se sometió a ensayo por ELISA para interferón gamma (la Figura 6B muestra datos acumulados, los datos de ejemplo de un solo ensayo se muestran en la figura 17). Además, se realizó la medición de la expansión de linfocitos T después de una semana de cocultivo con células SupT1 (Figura 6C). Los linfocitos T se contaron mediante citometría de flujo calibrada con perlas de recuento. Estos datos experimentales muestran que los CAR basados en APRIL pueden destruir a las dianas que expresan BCMA. Adicionalmente, estos datos muestran que los CAR basados en el tallo de CD8 o la bisagra de IgG1 se desempeñaron mejor que los CAR basados en Fc-pvaa.
Ejemplo 5: los CAR basados en APRIL pueden destruir células primarias de mieloma
Los datos anteriores son alentadores ya que demuestran que, en principio, es posible fabricar un CRA basado en APRIL. Sin embargo, dado que la mayoría de las células primarias de mieloma expresan un bajo número de moléculas de BCMA en su superficie, se investigó si tal CAR basado en APRIL causaría la destrucción de células primarias de mieloma, particularmente en casos con expresión de baja densidad. Se seleccionaron tres casos que representaban el intervalo de expresión de BCMA descrito en la Figura 2: el primero tuvo una expresión tenue (menor que la media); el segundo caso tuvo una expresión intermedia (aproximadamente la expresión media) y el tercero tuvo una expresión intensa (por encima de la media). La Figura 8 muestra un histograma de tinción para BCMA frente al control de isotipo para los tres casos de la izquierda, para ilustrar la expresión de BCMA. Dado que al comparar los CAR basados en APRIL con distintos espaciadores se determinó que los CAR con el espaciador de tallo de CD8 y el espaciador de bisagra de IgG1 se desempeñaron mejor que el CAR con espaciado con Fc-pvaa, en este ensayo, solo se probaron los CAR con tallo de CD8 y bisagra de APRIL. A la izquierda, la supervivencia de las células de mieloma en comparación con los números iniciales se muestra el día 3 y el día 6 después de un cocultivo 1:1 de células de mieloma y linfocitos T CAR. Para el día 6, se había eliminado > 95 % de las células de mieloma, incluyendo las que presentaban una expresión de BCMA tenue. Las células de mieloma que expresan BCMA de forma tenue pueden ser objetivo de los CAR con APRIL aunque con un ritmo de destrucción más lento que las que expresan de forma más alta.
Ejemplo 6 - Construcción de una serie de "APRILITE"
Los presentes inventores han construido una serie de captadores biespecíficos que conectan un scFv de OKT3 al dominio extracelular de APRIL, como se muestra en la Figura 24A. Se hicieron varias consideraciones de diseño durante la construcción de estas moléculas: (a) el extremo amino de unión a proteoglucanos de APRIL se truncó para impedir la unión no específica; (b) en las construcciones 4, 5 y 6, se unió un péptido señal al ectodominio maduro de APRIL; (c) el OKT3 se volvió a formatear como scFv con un enlazador que conecta las regiones variables de las cadenas pesada y ligera; (d) se probaron diversos espaciadores distintos entre scFv y APRIL.
Los diversos distintos formatos fueron los siguientes:
(1) scFv de OKT3 conectado a APRIL truncado mediante la bisagra de IgG1;
(2 ) scFv de OKT3 conectado a APRIL truncado a través del enlazador (SGGGGS)3;
(3) scFv de OKT3 conectado a APRIL truncado a través del tallo de CD8;
(4) APRIL truncado conectado al scFv de OKT3 a través de una bisagra IgG1;
(5) APRIL truncado conectado al scFv de OKT3 a través de un enlazador (SGGGGS)3; y
(6) APRIL truncado conectado al scFv de OKT3 a través de un espaciador de CD8.
Las construcciones (3) y (6) forman homodímeros a través de enlaces disulfuro en el espaciador CD8. Las secuencias de aminoácidos para las construcciones (1), (3) y (6) se muestran en la Figura 30.
Ejemplo 7 - Expresión de los APRILiTE en células 293T
Las células 293 T se transfectaron con plásmidos de expresión que codificaban las construcciones de APRILiTE enumeradas anteriormente. El sobrenadante de las células 293T se corrió en un gel de acrilamida y las proteínas se transfirieron a una membrana. La membrana se tiñó a continuación con un anticuerpo que reconocía APRIL. Los resultados se muestran en la Figura 25. Las proteínas 1, 3 y 6 se detectaron en el peso molecular esperado. Las proteínas 2, 4 y 5 no se detectaron, lo que indica que estas configuraciones son inestables.
Ejemplo 8 - Unión al TCR y BCMA
A continuación, se investigó si estas proteínas podían unirse al receptor de linfocitos T (TCR) por un extremo y a BCMA por el otro. El sobrenadante de las células 293T transfectadas se usó para teñir linfocitos T Jurkat y un clon de linfocitos T Jurkat que tiene el TCRap suprimido. Esto demuestra que APRILiTE se une al TCR (Figura 26b). Las células SupTI técnicamente diseñadas para expresar BCMA y las células SupTI técnicamente diseñadas para expresar TACI se tiñeron después con el sobrenadante anterior, utilizando un secundario anti-APRIL biotina seguido de estreptavidina PE. Los resultados se muestran en la Figura 26a. Se descubrió que los APRILiTE 1,3 y 6 se unen a BCMA, y en menor medida a TACI.
Ejemplo 9 - Los APRILiTE estables desencadenan la liberación de IFNy
Se cultivaron linfocitos T de donante normales 1:1 con distintas SupTI s. Las SupTI s utilizadas eran no transducidas, técnicamente diseñadas para expresar BCMA o técnicamente diseñadas para expresar TACI. Los resultados se muestran en la Figura 27. Se descubrió que los linfocitos T solo liberaban IFNy en presencia de APRILiTE cuando se exponían a células SupT1 técnicamente diseñadas con BCMA o TACI. La respuesta a BCMA fue mayor que con TACI.
Ejemplo 10 - Los APRILITE estables desencadenan la destrucción mediada por linfocitos T de dianas BCMA+
Los linfocitos T se cultivaron 1:1 con células SupT1 de tipo silvestre, células SupT1 que expresaban BCMA y células SupT1 que expresaban TACI en ausencia o en presencia de los APRILiTE 1, 3 y 6. Los resultados se muestran en la Figura 28. Los linfocitos T restantes se muestran como una proporción de células SupT1 presentes en la condición sin APRILiTE añadido.
Ejemplo 11 - Investigación de la expresión de BCMA en células primarias de mieloma
Se tiñeron cuatro muestras de mieloma con el Acm de rata anti-BCMA humano Vicky1. Los resultados se muestran en la Figura 29. En los mielomas clínica y morfológicamente típicos (paneles 2 a 4) se observa una tinción intermedia o tenue.
Ejemplo 12 - Investigación del efecto de los APRILiTE sobre células primarias de mieloma
Se utilizó material restante de un aspirado de médula ósea de diagnóstico de dos pacientes con mieloma múltiple BCMA+ conocido. Se realizó una selección por perlas magnéticas de CD138 para purificar células de mieloma del aspirado. Estas células se dejaron reposar en un medio de cultivo completo durante 48 horas y se realizó una tinción para BCMA para comprobar que de hecho eran positivas para BCMA. Se descubrió que las células de mieloma expresan BCMA pero en niveles bajos (Figura 31).
A continuación, las células mononucleares periféricas de donante normal que se habían estimulado usando OKT3 y CD28.2 se empobrecieron en CD56 para eliminar los linfocitos citolíticos naturales. Se realizó un cocultivo 1:1 de CMSP empobrecidas en CD56 y células primarias de mieloma seleccionadas por CD138 en ausencia o presencia de APRILITE#03 y #06. Para probar APRILiTE#01 hubo material insuficiente. Los cocultivos se observaron por microscopía. La liberación de interferón gamma en el sobrenadante se midió mediante ELISA. La supervivencia de las células de mieloma se midió mediante tinción con anexina V/PI y citometría de flujo controlada por recuento de perlas.
Se observó un agrupamiento claro (un signo de activación de linfocitos T) en el cocultivo (ver Figura 32). Se observó liberación de interferón gamma en las condiciones en que se cultivaron CMSP con células de mieloma en presencia de los APRILiTE, aunque en cantidades absolutas menores que cuando se cocultivan con células SupT1. BCMA (Figura 33). También se observó destrucción de células de mieloma cuando las CMSP estaban presentes con APRILiTE después de 6 días de cocultivo (Figura 34).
Estos hallazgos demuestran que los APRILiTE provocan la activación de linfocitos T en presencia de células primarias de mieloma a un nivel suficiente como para provocar la destrucción mediada por linfocitos T de las células de mieloma.
Ejemplo 13 - Prueba de los APRILiTE in vivo
Se utiliza un modelo huSCID: Se xenoinjertan ratones NSG (nod-scid gamma, NOD-scid IL2Rgammanulos) con una línea celular de mieloma que expresa niveles típicos de BCMA. Estas líneas están técnicamente diseñadas para expresar la luciferasa de luciérnaga, para medir la enfermedad mediante obtención de imágenes por bioluminiscencia. Las CMSP de donantes normales se administran a través de la vena de la cola durante administración simultánea intraperitoneal de los APRILiTE. Se mide de forma secuencial lo siguiente (1) niveles séricos de los APRILiTE; (2) niveles séricos de interferón gamma humano; (3) expansión, injertado y activación de linfocitos T de sangre periférica por citometría de flujo; (4) medición de la bioluminiscencia del tumor. En el desmontado, se miden lo siguiente: (1) carga tumoral por histología de la médula; (2) proliferación e injertado de linfocitos T por citometría de flujo de la médula ósea, el bazo, sangre y los ganglios linfáticos; y (3) los tejidos restantes se examinan macroscópicamente y por inmunohistoquímica para detectar cualquier toxicidad.
Ejemplo 14 - Producción de mutantes de APRIL particularmente adecuados para dirigirse a BCMA
El objetivo era generar mutantes de APRIL cuya unión pudiera ser más adecuada para los CAR. Utilizando los datos cristalográficos descritos por Hymowitz et al., 2004, The Journal of biological chemistry: Volumen 280; Número 8; Páginas 7218-27 y de los depósitos RCSB 1XU1 y 1XU2, se seleccionaron varios restos que pueden alterar la unión a BCMA o pueden aumentar la especificidad por BCMA con respecto a TACI.
En la Figura 31B se describe una estrategia para identificar mutaciones en estos restos con propiedades útiles. Usando corte y empalme por PCR solapante con oligonucleótidos degenerados en los codones para la mutación, se generaron bibliotecas de APRIL mutantes aleatorizadas con respecto a los mutantes clave. Estas bibliotecas se ligaron en un armazón que se muestra en la Figura 31A, que presenta al APRIL en un tallo de CD8 y coexpresa CD34 con un péptido 2A del virus de la fiebre aftosa. La expresión típica de esta construcción se muestra en la Figura 9. Estos productos de ligamiento se transformaron en bacterias competentes, se tomaron colonias individuales, se expandieron de forma individual y el ADN se extrajo y transfectó en células 293T.
Posteriormente, se incubaron células 293T por separado con BCMA-Fc o con TACI-Fc humano recombinante. A continuación, las células se lavaron y se tiñeron de manera secundaria con policlonal anti-Fc Alexa flúor 488 de Jackson y el gen marcador se tiñó con anti-CD34 APC. Los mutantes de APRIL se exploraron de esta manera en lotes con solo APRIL de tipo silvestre y un CD34 como controles en cada lote. Los sucesos CD34+ se dividieron en 4 ventana de adquisición numeradas como se muestra en la Figura 31. El índice de fluorescencia mediana (IFM) de Alexa flúor 488 se calculó para cada ventana de adquisición y el gradiente promedio entre el IFM de diversas ventanas de adquisición se calculó utilizando la fórmula: [(IFM.1-IFM.2)+ (IFM.2-IFM.3)+ (IFM.3-IFM.4)]/3 (ilustrado en la Figura 31C).
De esta manera, se calculó un gradiente de IFM promedio para la unión a BCMA y TACI para cada mutante de APRIL. Para cada mutante, el gradiente de IFM promedio de la unión a BCMA y TACI se convirtió a una relación de unión al control de APRIL TS en cada lote. Los plásmidos que dieron lugar a mutantes potencialmente útiles se secuenciaron mediante secuenciación capilar.
Los resultados de esta exploración inicial se resumen en la Tabla 1 y se ilustran en la Figura 10.
Las clases de mutantes se combinaron después mediante una estrategia similar a la descrita para mutantes individuales, pero se usó como molde para introducir mutaciones adicionales el plásmido codificante de APRIL mutante. Los resultados de este trabajo se resumen en la Tabla 2 y se ilustran en la Figura 11. Fue posible generar mutantes con una afinidad mucho mayor para BCMA que el tipo silvestre: por ejemplo, el mutante D205R, R206G; los inventores pudieron generar mutantes con una unión a BCMA igual que APRIL de tipo silvestre pero sin unión a TACI - por ejemplo el mutante T175A, S202P. Además, pudieron generar mutantes con menor unión a BCMA que el tipo silvestre (lo que paradójicamente puede mejorar el reconocimiento del antígeno a baja densidad), pero sin unión de TACI - por ejemplo, el mutante V174T, T175A, M200G, S202E.
Se generó ADN plasmídico a mayor escala y de mayor calidad a partir de los mutantes más promisorios, y se realizaron transfecciones repetidos y datos de expresión. Estos datos se muestran en la Figura 12.
Ejemplo 15: APRIL secretado y truncado fusionado con un espaciador de Fc reconoce a BCMA y TACI
Para investigar si el APRIL truncado en un formato CAR (es decir, fusionado a un dominio transmembrana y anclado a una membrana celular) podía unirse a BCMA y TACI, se diseñó técnicamente un CAR básico en marco con el péptido 2A de autoescisión del virus de la fiebre aftosa con CD34 truncado, como gen marcador conveniente. Se estableció una línea celular SUPT1 estable que expresa esta construcción. Además, se generó BCMA y TACI truncados secretados fusionados al Fc de Ig humana (y otras especies, no se muestra) y se produjo una proteína recombinante. Se demostró que tanto BCMA-Fc como TACI-Fc se unen a la línea celular SUPT1 técnicamente diseñada. Solo se encontró que se unían a BCMA-Fc y TACI-Fc las células que expresaban el gen marcador CD34 (Figura 9).
Ejemplo 16 - Los receptores quiméricos para antígeno basados en APRIL se expresan de forma estable en la superficie de linfocitos T
El dominio espaciador del CAR puede alterar la sensibilidad y la especificidad. Se generaron tres versiones de un CAR basado en APRIL con tres dominios espaciadores: (i) un espaciador de IgG1 humana modificado para eliminar los motivos de unión a Fc; (ii) un tallo de CD8; y (iii) la bisagra de IgG1 sola (Figura 14B). Los linfocitos T humanos primarios se transdujeron con estos distintos CAR y se tiñeron usando un Acm anti-APRIL disponible en el mercado (Figura 15).
Ejemplo 17 - Los receptores quiméricos para antígenos basados en APRIL son activos contra las células que expresan una diana afín
Los linfocitos T de los donantes normales se transdujeron con los distintos CAR con APRIL y se probaron frente a células SupT1 de tipo silvestre o técnicamente diseñadas para expresar BCMA y TACI. Se utilizaron varios ensayos distintos para determinar la función. Se realizó un ensayo clásico de liberación de cromo. En este caso, las células diana (las células SupT1) se marcaron con 51Cr y se mezclaron con los efectores (los linfocitos T transducidos) en distintas relaciones. La lisis de las células diana se determinó contando 51Cr en el sobrenadante del cocultivo (Figura 16).
Además, el sobrenadante de linfocitos T cultivados 1:1 con células SupT1 se analizó mediante ELISA para interferón gamma (Figura 17).
Además, se realizó la medición de la expansión de linfocitos T después de una semana de cocultivo con células SupT1. Los linfocitos T se contaron mediante citometría de flujo calibrada con perlas de recuento. Los datos iniciales (no mostrados) parecen indicar que la construcción basada en el tallo de CD8 da como resultado más proliferación de linfocitos T que las otras construcciones.
Ejemplo 18 - Producción de mutantes de APRIL específicos para BCMA
Se generaron mutantes de APRIL utilizando cebadores degenerados dirigidos a codones específicos. Los codones se identificaron a través de análisis in silico de la unión APRIL-BCMA y APRIL-TACI. A partir de este análisis, se tomaron como objetivo los restos que parecían estar implicados en la unión a TACI pero no en la unión a BCMA.
Se produjeron plásmidos que codificaban (i) CD34 expresado en la superficie celular y (ii) mutantes de APRIL. Después, los plásmidos se transformaron en bacterias, se sembró en placas, se tomaron colonias individuales, se expandieron de forma individual y el ADN se extrajo y transfectó en células 293T.
Los linfocitos T que expresaban un mutante de APRIL individual y CD34 se dividieron en dos alícuotas cada uno y se incubaron por separado con 0,1 |jg de RND humano quimera BCMA-Fch o TACI-Fch de ser humano. A continuación, las células se lavaron y se tiñeron de manera secundaria con policlonal aFch Alexa flúor 488 de Jackson y aCD34 APC de BD.
Los mutantes de APRIL se exploraron de esta manera en lotes con APRIL de tipo silvestre como control en cada lote. Los sucesos CD34+ se dividieron en 4 ventana de adquisición numeradas como se muestra en la Figura 9. El índice de fluorescencia mediana (IFM) de Alexa flúor 488 se calculó para cada ventana de adquisición y el gradiente promedio entre el IFM de diversas ventanas de adquisición se calculó utilizando la fórmula: [(IFM.1-IFm .2)+ (IFM.2-IFM.3)+ (IFM.3-IFM.4)]/3.
De esta manera, se calculó un gradiente de IFM promedio para la unión a BCMA y TACI para cada mutante de APRIL. Para cada mutante, el gradiente de IFM promedio de la unión a BCMA y TACI se convirtió a una relación de unión al control de APRIL TS en el lote explorado pertinente. Después, se secuenciaron los mutantes que mostraron una mayor relación de unión BCMA:TACI que el tipo silvestre.
Los resultados se muestran en las Figuras 20 y las secuencias de mutantes clave se muestran en la Figura 21.
A continuación, se examinó el efecto de la sustitución de glicina en los restos seleccionados. Los resultados, que se muestran en la Figura 22, muestran que los restos S202, P201, M200, T175, V174, A125, H203, D205 y R206 en APRILts son comparativamente más importantes para la unión a TACI que a BCMA.
Ejemplo 19 - Demostración de la función in vivo de los linfocitos T CAR con APRIL
Para demostrar la función de los linfocitos T CAR con APRIL in vivo, los linfocitos T CAR con APRIL se probaron en un modelo quimérico de humano/ratón.
MM1.s (ATCC CRL-2974) es una línea celular de mieloma humano que expresa niveles intermedios de BCMA. Los inventores diseñaron técnicamente esta línea celular para que exprese luciferasa de luciérnaga, para obtener la línea celular MM1.s.FLuc.
Los ratones NOD scid gamma (NSG: NOD.Cg-Prkdcscid II2rgtm1Wjl/SzJ) son ratones profundamente inmunodeprimidos susceptibles del injerto de varias líneas celulares humanas y de linfocitos de sangre periférica humana. Ratones NSG hembra de tres meses recibieron un vial de 1x 107 células MM1.s.FLuc por inyección en la vena de la cola sin terapia preparativa. El injerto se determinó mediante la obtención de imágenes seriadas por bioluminiscencia (Figura 23). Se observó un injerto intramedular robusto y creciente en todos los ratones. En el día 13, se administró un vial 5x106 linfocitos T c Ar APRIL-HNG-CD280XZ mediante inyección en la vena de la cola. Se realizó una bioluminiscencia

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Un ligando inductor de la proliferación (APRIL) variante, que tiene una mayor afinidad de unión a BCMA que APRIL de tipo silvestre; y/o una mayor relación de unión BCMA:TACi (activador transmembrana, modulador de calcio y agente de interacción con el ligando de la ciclofilina) que APRIL de tipo silvestre; y que comprende una de las siguientes mutaciones individuales: M200C, M200L, M200G, M200S, M200a , M200N.
2. Un APRIL variante de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende una de las siguientes combinaciones de mutaciones:
V174T y M200G; o T175A y M200G; o V174T, T175A y M200G; o M200G, D205S y R206H.
3. Un ligando inductor de la proliferación (APRIL) variante de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende la mutación M200G.
4. Un receptor quimérico para antígeno (CAR) que comprende un dominio de unión a antígeno, un dominio transmembrana y un endodominio, en donde el dominio de unión a antígeno comprende un APRIL variante de acuerdo con cualquier reivindicación precedente.
5. Un captador biespecífico de linfocitos T (BiTE) que comprende un dominio de unión a antígeno y un dominio de activación de linfocitos T, en donde el dominio de unión a antígeno comprende un APRIL variante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
6. Una secuencia de ácido nucleico que codifica un APRIL variante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, un receptor quimérico para antígeno de acuerdo con la reivindicación 4 o un captador biespecífico de linfocitos T de acuerdo con la reivindicación 5.
7. Un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 6.
8. Una célula que comprende un receptor quimérico para antígeno de acuerdo con la reivindicación 4.
9. Un método para la fabricación de una célula de acuerdo con la reivindicación 8, que comprende la etapa de transducir o transfectar una célula ex vivo con un vector de acuerdo con la reivindicación 7, que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un receptor quimérico para antígeno.
10. Una célula de acuerdo con la reivindicación 8 o un captador biespecífico de linfocitos T de acuerdo con la reivindicación 5, para su uso en el tratamiento de un trastorno de células plasmáticas.
11. Un agente de diagnóstico para la detección de células plasmáticas que comprende un APRIL variante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
12. Un agente de diagnóstico de acuerdo con la reivindicación 11, para el diagnóstico de un trastorno de células plasmáticas.
13. Un método para el diagnóstico de un trastorno de células plasmáticas en un sujeto, que comprende la etapa de añadir in vitro un APRIL variante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 a una muestra procedente del sujeto.
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Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201317929D0 (en) 2013-10-10 2013-11-27 Ucl Business Plc Chimeric antigen receptor
GB201317928D0 (en) * 2013-10-10 2013-11-27 Ucl Business Plc Molecule
US10752665B2 (en) 2014-02-27 2020-08-25 Ucl Business Ltd April variants
CN107980046B (zh) 2015-04-13 2021-12-24 辉瑞公司 靶向b细胞成熟抗原的嵌合抗原受体
JP2019527537A (ja) * 2016-06-07 2019-10-03 マックス−デルブリュック−セントルム フュール モレキュラー メディツィン イン デア ヘルムホルツ−ゲマインシャフト キメラ抗原受容体と、ｂｃｍａに結合するｃａｒ−ｔ細胞
CN109963590B (zh) 2016-09-02 2024-03-15 加利福尼亚大学董事会 涉及白介素-6受体α结合单链可变片段的方法和组合物
CN108277205B (zh) * 2016-12-30 2022-12-20 四川大学 表达cxcr4的嵌合抗原受体修饰的淋巴细胞及制备方法和用途
AU2018352984B2 (en) * 2017-10-18 2024-02-01 Precigen, Inc. Polypeptide compositions comprising spacers
GB201720426D0 (en) * 2017-12-07 2018-01-24 Hummingbird Bioscience Pte Ltd CD47 and BCMA antigen-binding molecules
US20220298254A1 (en) 2017-11-01 2022-09-22 Hummingbird Bioscience Holdings Pte. Ltd. Cd47 antigen-binding molecules
JP2021510076A (ja) * 2018-01-10 2021-04-15 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション キメラ抗原受容体を発現する免疫細胞
US20200054675A1 (en) * 2018-06-01 2020-02-20 Washington University Suppression of cytokine release syndrome in chimeric antigen receptor cell therapy
WO2019241358A2 (en) * 2018-06-12 2019-12-19 The Regents Of The University Of California Single-chain bispecific chimeric antigen receptors for the treatment of cancer
WO2020202674A1 (ja) 2019-04-01 2020-10-08 パナソニックセミコンダクターソリューションズ株式会社 高周波増幅器
EP3980454A4 (en) * 2019-06-04 2023-09-20 The General Hospital Corporation ANTIBODIES AND CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS AGAINST TACI
CN110642953B (zh) * 2019-10-12 2021-09-17 华夏源（上海）细胞基因工程股份有限公司 一种靶向bcma的t细胞受体融合蛋白和应用
US20230411316A1 (en) * 2021-04-07 2023-12-21 Mitsubishi Electric Corporation Doherty amplifier
AU2022325232A1 (en) 2021-08-11 2024-02-08 Sana Biotechnology, Inc. Genetically modified primary cells for allogeneic cell therapy
WO2023019226A1 (en) 2021-08-11 2023-02-16 Sana Biotechnology, Inc. Genetically modified cells for allogeneic cell therapy
WO2023019227A1 (en) 2021-08-11 2023-02-16 Sana Biotechnology, Inc. Genetically modified cells for allogeneic cell therapy to reduce complement-mediated inflammatory reactions
AU2022325955A1 (en) 2021-08-11 2024-02-08 Sana Biotechnology, Inc. Genetically modified cells for allogeneic cell therapy to reduce instant blood mediated inflammatory reactions
WO2023158836A1 (en) 2022-02-17 2023-08-24 Sana Biotechnology, Inc. Engineered cd47 proteins and uses thereof

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7381803B1 (en) 1992-03-27 2008-06-03 Pdl Biopharma, Inc. Humanized antibodies against CD3
US6812327B1 (en) 1996-10-25 2004-11-02 Human Genome Sciences, Inc. Neutrokine-alpha polypeptides
EP1666052B1 (en) 2000-02-16 2011-06-08 Genentech, Inc. Anti-APRIL monoclonal antibody and its use for the treatment of an immune related disease or cancer
CA2438682A1 (en) 2001-02-20 2002-08-29 Zymogenetics, Inc. Antibodies that bind both bcma and taci
WO2004020593A2 (en) 2002-08-30 2004-03-11 Incyte Corporation Immune response associated proteins
US20060014248A1 (en) * 2003-01-06 2006-01-19 Xencor, Inc. TNF super family members with altered immunogenicity
WO2004089982A2 (en) * 2003-01-06 2004-10-21 Xencor April variants and methods thereof
US20050003480A1 (en) * 2003-01-06 2005-01-06 Xencor April variants and methods thereof
AT503861B1 (de) 2006-07-05 2008-06-15 F Star Biotech Forsch & Entw Verfahren zur manipulation von t-zell-rezeptoren
WO2008045437A2 (en) 2006-10-09 2008-04-17 The General Hospital Corporation Chimeric t-cell receptors and t-cells targeting egfrviii on tumors
US8003335B2 (en) 2008-04-30 2011-08-23 Universite Paris-SUD11 Levels of APRIL in serum and use in diagnostic methods
DK3415531T3 (da) 2011-05-27 2023-09-18 Glaxo Group Ltd Bcma (cd269/tnfrsf17)-bindende proteiner
TWI679212B (zh) 2011-11-15 2019-12-11 美商安進股份有限公司 針對ｂｃｍａ之e3以及ｃｄ３的結合分子
CA2869562C (en) 2012-04-11 2023-09-12 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Chimeric antigen receptors targeting b-cell maturation antigen
GB201317928D0 (en) * 2013-10-10 2013-11-27 Ucl Business Plc Molecule
GB201317929D0 (en) 2013-10-10 2013-11-27 Ucl Business Plc Chimeric antigen receptor
US10752665B2 (en) 2014-02-27 2020-08-25 Ucl Business Ltd April variants
AU2017357649A1 (en) 2016-11-11 2019-05-23 Autolus Limited Chimeric antigen receptor

Also Published As

Publication number Publication date
JP2017514787A (ja) 2017-06-08
CA2939411A1 (en) 2015-09-03
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US10611811B2 (en) 2020-04-07
WO2015128653A2 (en) 2015-09-03

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