CN105658668A - 分子 - Google Patents

分子 Download PDF

Info

Publication number
CN105658668A
CN105658668A CN201480055817.7A CN201480055817A CN105658668A CN 105658668 A CN105658668 A CN 105658668A CN 201480055817 A CN201480055817 A CN 201480055817A CN 105658668 A CN105658668 A CN 105658668A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
bispecific molecule
bcma
molecule
bispecific
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201480055817.7A
Other languages
English (en)
Inventor
M.普尔
K.龙
L.李
N.查普林
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
UCL Business Ltd
Original Assignee
UCL Business Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by UCL Business Ltd filed Critical UCL Business Ltd
Publication of CN105658668A publication Critical patent/CN105658668A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/53—Hinge
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor

Abstract

本发明提供了双特异性分子，该双特异性分子包含：(i)第一域，其结合B细胞成熟抗原(BCMA)，并且包含增殖诱导性配体(APRIL)的至少一部分；和(ii)能够活化T细胞的第二域。本发明还提供了此类分子在治疗浆细胞介导的疾病，诸如多发性骨髓瘤中的用途。

Description

分子
发明领域
本发明涉及结合B细胞成熟抗原(BCMA)并且活化T细胞的双特异性分子。分子可用于治疗浆细胞疾病，诸如多发性骨髓瘤。
发明背景
多发性骨髓瘤
多发性骨髓瘤(骨髓瘤)是一种浆细胞骨髓恶性。异常浆细胞的集合积累于骨髓中，在那里它们干扰正常血细胞的生成。骨髓瘤是美国的第二常见的血液学恶性(在非何杰金淋巴瘤后)，并且构成血液学恶性的13％和所有癌症的1％。由于该疾病在死亡前引起病理性骨折、对感染的易感性、肾衰竭及然后骨髓衰竭，它就痛苦及医学费用而言是沉重的。
与许多淋巴瘤不一样，骨髓瘤目前是不能治愈的。淋巴瘤中使用的标准化学疗法药剂在很大程度上对骨髓瘤无效。另外，由于浆细胞中丧失CD20表达，不能针对此疾病使用利妥昔单抗(Rituximab)。新药剂，诸如硼替佐米(Bortezamib)和雷利度胺(Lenolidomide)是部分有效的，但是不能导致长效消退。
如此，需要具有增加的效力和改善的长效效果的用于治疗骨髓瘤的备选药剂。
双特异性抗体
已经开发出极其多种分子，其基于具有两种抗体样结合域的基本构思。
双特异性T细胞结合(engaging)分子是已经开发出的一类双特异性抗体类型分子，主要用作抗癌药物。它们指导宿主的免疫系统(更具体是T细胞的细胞毒性活性)针对靶细胞，诸如癌细胞。在这些分子中，一种结合域经由CD3受体结合T细胞，而另一种结合靶细胞，诸如肿瘤细胞(经由肿瘤特异性分子)。由于双特异性分子结合靶细胞和T细胞两者，它使靶细胞与T细胞接近，从而T细胞能对癌细胞施加其效应，例如细胞毒性效应。T细胞:双特异性Ab:癌细胞复合物的形成诱导T细胞中的信号传导，从而导致例如细胞毒性介质的释放。理想上，药剂仅在存在靶细胞的情况下诱导期望的信号传导，从而导致选择性杀伤。
已经以许多不同形式开发出双特异性T细胞结合分子，但是最常见之一是由不同抗体的两种单链可变片段(scFvs)组成的融合物。这些有时称为BiTE(Bi双特异性T细胞结合剂)。
WO2012/066058和WO2013/072415都描述了包含结合B细胞成熟抗原(BCMA)的scFv的BiTE。
BCMA是一种在成熟淋巴细胞(即记忆B细胞、浆母细胞和骨髓浆细胞)中优先表达的跨膜蛋白。多发性骨髓瘤细胞上也表达BCMA。
虽然BCMA是一种用于治疗多发性骨髓瘤的有希望的靶抗原，但是骨髓瘤细胞上BCMA的低密度表达阻碍了传统的靶向方法。因此，不可能的是，传统治疗性抗体会在骨髓瘤细胞表面上实现足够的密度，从而触发有效的ADCC/CDC。类似地，考虑到靶向性摄取和非特异性摄取之间较小的差别，mAb与毒素或化疗剂的缀合物不可能导致有用的治疗窗。
如此，需要能将低BCMA密度分辨到有效的治疗作用中的备选药剂。
附图简述
图1：BAFF和APRIL的配体特异性和功能分配
BAFF与BAFF-R、BCMA和TACI相互作用，而APRIL与BCMA、TACI和蛋白聚糖相互作用。BAFF-R活化影响外周B细胞存活，而BCMA可以影响浆细胞存活。APRIL与蛋白聚糖的相互作用牵涉APRIL的酸性硫酸化的0糖胺聚糖(glycol-saminoglycan)侧链氨基端。
图2A：设计和构建的不同形式
(1)通过IgG1铰链与截短的APRIL连接的OKT3scFv；(2)经由(SGGGGS)3接头与截短的APRIL连接的OKT3scFv；(3)经由CD8茎与截短的APRIL连接的OKT3scFv；(4)经由IgG1铰链与OKT3scFv连接的截短的APRIL；(5)经由(SGGGGS)3接头与OKT3scFv连接的截短的APRIL；(6)经由CD8间隔物与OKT3scFv连接的截短的APRIL。构建体(3)和(6)应当经由CD8间隔物中的二硫键而形成同二聚体。
B：在结合APRILiTE后依靠细胞与细胞相互作用进行细胞聚簇的示意图。
图3：来自用不同APRILiTE构建体转染的293T细胞的上清液的Western印迹。用抗APRIL完成印迹法。
图4(a)：APRILiTES1、3和6对野生型SupT1细胞和工程化改造为表达BCMA和TACI的SupT1细胞的结合。用抗APRIL生物素/链霉亲合素APC染色。Aprilites没有显示对WTSupT1细胞的结合，但是结合BCMA表达细胞，并且在较小程度上结合TACI表达细胞。
图4(b)：APRILiTE对野生型Jurkats，而不对没有T细胞受体的Jurkats的结合。这证明了APRILiTES结合T细胞受体。
图5：在存在空白培养基或3APRILiTES的情况下共培养T细胞1:1非转导或工程化SupT1细胞。
图6：在存在APRILiTE1、3和6的情况下共培养3天后观察到BCMA表达性SupT1细胞的完全消除。
图7：原发性骨髓瘤上的BCMA表达的例子。显示了用大鼠抗人BCMAmAbVicky1染色的骨髓瘤样品的4个例子。第一幅小图显示了浆细胞白血病(骨髓瘤的不常见、晚期和攻击性形式)患者中的鲜明BCMA染色。其它3例病例是临床和形态学上典型的骨髓瘤。它们显示通常看到的中间或暗淡染色。重叠用同种型对照的染色(灰色)。
图8：APRILiTE的氨基酸序列
A：APRILiTE#01；B：APRILiTE#03；C：APRILiTE#06
图9：在同种型对照上覆盖的对骨髓瘤样品的BCMA染色。这些骨髓瘤细胞表达BCMA，但是以低水平表达。
图10：在第1天时共培养物和对照的低放大率显微术。当在存在APRILiTE的情况下与骨髓瘤细胞一起培养时可以看到T细胞的清楚凝聚/活化。
图11：在单独的，与外周血T细胞共培养的骨髓瘤细胞的情况下的干扰素-gamma释放，两者一起都在缺乏和存在APRILiTES#3和#6的情况下。
图12：培养中的骨髓瘤细胞共培养物在第6天的存活。测试的这两种APRILiTES在存在PBMC的情况下导致原发性骨髓瘤细胞的有效杀伤。
发明概述
B细胞膜抗原(BCMA)是一种在几乎所有多发性骨髓瘤(MM)上表达的表面蛋白。BCMA在其它情况下仅在浆细胞上表达，因此靶向此抗原可以证明骨髓瘤的有效治疗。然而，BCMA的低水平表达是在靶向此抗原时的考虑因素。
令人惊讶地，本发明人已经发现了如果在双特异性T细胞活化性(BTA)分子中使用基于增殖诱导性配体(APRIL)，而不是BCMA结合抗体的结合域，分子能够在存在骨髓瘤细胞的情况下引起T细胞活化。
不希望受限于理论，本发明人预测这是因为本发明的双特异性分子在三重对称的情况下结合BCMA：即BCMA和本发明的BTA之间的相互作用需要每个结合配偶体的三聚体(参见图2B)。这在蛋白质水平上诱导T细胞活化域的聚簇。
使用传统BiTE方法，仅当足够数目的CD3/TCR复合物被BiTE结合时发生T细胞活化。这继而依赖于靶细胞上的抗原密度。必须发生足够的结合以克服触发T细胞活化级联的阈值。若结合是不足的(例如由于靶抗原的表达水平在靶细胞上太低)，则未满足此阈值，并且不发生T细胞活化。
凭借本发明的双特异性分子，靶细胞上的BCMA分子表达引起三个本发明的双特异性分子聚簇，从而为T细胞活化提供三个CD3结合域。在本发明的双特异性抗体以同二聚体存在的实施方案(例如包含CD8茎的实施方案，参见图2(a)(3))中，对于结合的每个BCMA，BTA可以募集2个CD3/TCR复合物，从而进一步增加此信号放大。此化学计量学足以提供导致T细胞活化的CD3结合的阈值水平。
如此，在第一个方面中，本发明提供了双特异性分子，其包含：
(i)第一域，其结合B细胞成熟抗原(BCMA)，并且包含增殖诱导性配体(APRIL)的至少一部分；和
(ii)能够活化T细胞的第二域。
第二域可以通过结合T细胞表面上的CD3活化T细胞。在此方面中，第二域可以包含CD3或TCR特异性抗体或其部分。
第二域可以包含来自以SEQIDNo.9所示的scFv序列的互补决定区(CDR)。
第二域可以包含scFv序列，诸如以SEQIDNo.9所示的scFv序列。第二域可以包含具有至少80％序列同一性并且结合CD3的此类序列的变体。
第一域可以包含截短的APRIL，其包含BCMA结合位点，但是缺乏负责蛋白聚糖结合的APRIL的氨基端部分。此类分子可以包含以SEQIDNo.2所示的序列。或者，分子可以包含具有至少80％序列同一性且结合BCMA的所述序列的变体。
第一和第二结合域可以由间隔物(诸如包含IgG1铰链、丝氨酸-甘氨酸接头或CD8茎的间隔物)连接。
间隔物可以引起BTA形成同二聚体，例如由于间隔物中一个或多个半胱氨酸残基的存在，所述间隔物可以与包含相同间隔物的另一个分子实现双硫键。
双特异性分子可以包含以SEQIDNo.10、11或12所示的序列或其具有至少80％序列同一性但是保留i)结合BCMA并且ii)活化T细胞的能力的变体。
双特异性分子可以以三聚体结合BCMA，浆细胞表面上的此类BCMA。
在第二个方面中，本发明提供了核酸序列，其编码根据本发明的第一个方面的双特异性分子。
核酸序列可以包含以SEQIDNo19、20或21所示的序列或其具有至少80％序列同一性的变体。
在第三个方面中，本发明提供了载体，其包含根据本发明的第二个方面的核酸序列。
在第四个方面中，本发明提供了宿主细胞，其包含根据本发明的第二个方面的核酸序列，并且生成根据本发明的第一个方面的双特异性分子。
在第五个方面中，本发明提供了用于生成本发明的第一个方面的双特异性分子的方法，其包括在使得生成所述双特异性分子的条件下培养根据本发明的第四个方面的宿主细胞的步骤。
在第六个方面中，本发明提供了药物组合物，其包含根据本发明的第一个方面的双特异性分子以及药学可接受载体、稀释剂或赋形剂。
在第七个方面中，本发明提供了治疗浆细胞病症的方法，其包括对受试者施用根据本发明的第一个方面的双特异性分子的步骤。
例如，浆细胞病症可以是浆细胞瘤(plasmacytoma)、浆细胞白血病、多发性骨髓瘤、巨球蛋白血症(macroglobulinemia)、淀粉样变(amyloidosis)、沃尔登斯特伦(Waldenstrom)氏巨球蛋白血症、孤立性骨浆细胞瘤、髓外浆细胞瘤、骨硬化性骨髓瘤(osteoscleroticmyeloma)、重链疾病、意义未定的单克隆γ球蛋白血症(monoclonalgammopathyofundeterminedsignificance)和郁积型多发性骨髓瘤(smolderingmultiplemyeloma)。
浆细胞病症可以是多发性骨髓瘤。
在第八个方面中，本发明提供了根据本发明的第一个方面的双特异性分子，其用于治疗浆细胞病症。
在第九个方面中，本发明提供了根据本发明的第一个方面的双特异性分子在制备用于治疗浆细胞病症的药物中的用途。
在第十个方面中，本发明提供了双特异性分子，其包含第一结合域和第二结合域，其中所述第一和第二结合域由间隔物连接，所述间隔物是CD8茎或包含CD8茎。
发明详述
B细胞膜抗原(BCMA)
本发明的第一个方面的双特异性分子包含结合B细胞成熟抗原(BCMA)的第一域。
BCMA(又称为TNFRSF17)是一种仅在B谱系造血细胞或树突细胞上表达的浆细胞特异性表面抗原。它是TNF受体家族的成员。BCMA不在幼稚B细胞上表达，但是在B细胞分化成浆母细胞期间上调，并且在记忆B细胞、浆母细胞和骨髓浆细胞上鲜明表达。在大多数的原代骨髓瘤细胞上也表达BCMA。
BCMA在图1中示意性显示的相互连接的配体和受体的网络内发挥功能。两种其它TNF受体与BCMA共享配体APRIL和BAFF-TACI(TNFRSF13B)(其存在于活化的T细胞和所有B细胞上)和BAFF-R(TNFRSF13C)(其主要在B淋巴细胞上表达)。多发性骨髓瘤细胞表达TACI(在一些情况中)和BCMA(在大多数情况中)，但是绝不表达BAFF-R。
APRIL
本发明的双特异性分子的第一域包含增殖诱导性配体(APRIL)的至少一部分。APRIL又称为TNFSF13。
APRIL的野生型序列以UNIPROT/O75888可得到，并且在下文显示(SEQIDNo.1)。它不是一种典型的分泌性蛋白，因为它没有信号肽。它具有弗林蛋白酶切割位点“KQKKQK”(在SEQIDNo.1中加下划线)。氨基端参与蛋白聚糖结合。
第一结合域可以包含APRIL的BCMA结合位点。第一结合域可以包含APRIL的片段，其包含BCMA结合位点。
第一结合域可以包含截短的APRIL，其缺乏分子的氨基端末端。截短的APRIL可以保留BCMA和TACI结合，但是丧失蛋白聚糖结合。可以在弗林蛋白酶切割位点处或刚好在弗林蛋白酶切割位点后切割截短的APRIL。截短的APRIL可以缺乏来自以SEQIDNo.2所示的野生型APRIL分子的氨基端116个氨基酸。截短的APRIL可以包含以SEQIDNo.2所示的序列(其对应于以粗体显示的SEQIDNo.1的部分)或其变体。这对应于BCMA和TACI结合需要的分子的部分。
SEQIDNo.1
SEQIDNo.2
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQ
DVTFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVII
PRARAKLNLSPHGTFLGFVKL
本发明的双特异性分子可以包含以SEQIDNo.2所示的截短的APRIL分子的变体，其具有至少80％氨基酸序列同一性，并且具有相同或改善的BCMA结合能力。变体序列可以与SEQIDNo.2具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性。
可以通过程序(诸如BLAST，其在http://blast.ncbi.nlm.nih.gov免费可获得)容易地测定两种多肽序列之间的百分比同一性。
T细胞活化
本发明的分子的第二域能够活化T细胞。T细胞具有在细胞表面上的T细胞受体(TCR)，其识别在由抗原呈递细胞的表面上的MHC分子呈递时的抗原性肽。此类抗原识别导致Src家族激酶对免疫受体基于酪氨酸的活化基序(ITAM)的磷酸化，从而触发其它激酶的募集，这导致T细胞活化，包括Ca2+释放。
第二域可以通过触发由TCR的抗原特异性识别触发的相同途径引起T细胞活化。
分化簇3(CD3)
本发明的双特异性分子的第二域可以结合CD3。
CD3是一种由四个独特的链构成的蛋白质复合物：CD3γ链、CD3δ链、和两个CD3ε链。CD3与T细胞表面上的T细胞受体(TCR)和ζ-链结合以产生活化信号。TCR、ζ-链和CD3分子一起构成TCR复合物。
T细胞上的CD3聚簇(例如通过固定化的抗CD3抗体)导致类似于T细胞受体结合，但是不依赖于其克隆典型的特异性的T细胞活化。
由于其在调控T细胞活性中的中心作用，已经有开发能够结合TCR/CD3的分子的尝试。大量此项工作已经聚焦于产生对人CD3抗原特异性的抗体。
第二域可以包含特异性结合CD3，诸如OKT3、WT32、抗leu-4、UCHT-1、SPV-3TA、TR66、SPV-T3B或其亲和力微调变体的抗体或其部分。
如本文中使用的，“抗体”意指具有包含至少一个互补决定区CDR的抗原结合位点的多肽。抗体可以包含3个CDR，并且具有抗原结合位点，其等同于域抗体(dAb)的。抗体可以包含6个CDR，并且具有抗原结合位点，其等同于典型抗体分子的。多肽的剩余部分可以是任何下述序列，其提供适合于抗原结合位点的支架，并且以适合于它结合抗原的方式展示它。抗体可以是完整免疫球蛋白分子或其部分，诸如Fab、F(ab)’2、Fv、单链Fv(ScFv)片段、Nanobody或单链可变域(其可以是具有3个CDR的VH或VL链)。抗体可以是双功能性抗体。抗体可以是非人的、嵌合的、人源化的或完全人的。
或者，第二域可以包含不源自或基于免疫球蛋白的CD3结合分子。已经开发出许多“抗体模拟性”设计重复蛋白(DRP)以利用非抗体多肽的结合能力。此类分子包括锚蛋白或富含亮氨酸的重复蛋白，例如DARPins(设计锚蛋白重复蛋白)、Anticalins、Avimers和Versabodies。
本发明的双特异性分子的第二域可以包含整个或部分的单克隆抗体OKT3，其是得到FDA批准的第一种单克隆抗体。OKT3可获自ATCCCRL8001。US7,381,803中公布了抗体序列。
第二域可以包含来自OKT3的一个或多个CDR。第二结合域可以包含来自OKT3重链的CDR3和/或来自OKT3轻链的CDR3。第二结合域可以包含如下文显示的来自OKT3的所有6个CDR。
重链
CDR1:(SEQIDNo.3)KASGYTFTRYTMH
CDR2:(SEQIDNo.4)INPSRGYTNYNQKFKD
CDR3:(SEQIDNo.5)YYDDHYCLDY
轻链
CDR1:(SEQIDNo.6)SASSSVSYMN
CDR2:(SEQIDNo.7)RWIYDTSKLAS
CDR3:(SEQIDNo.8)QQWSSNPFT
第二结合域可以包含scFv，其包含来自OKT3的CDR序列。第二结合域可以包含下文以SEQINNo.9所示的scFv序列或其具有至少80％序列同一性且保留结合CD3的能力的变体。
SEQIDNo.9
QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSSGGGGSGGGGSGGGGSQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINR
来自SEQIDNo.9的变体序列可以与以SEQIDNo.9所示的序列具有至少80、85、90、95、98或99％序列同一性，并且具有等同或改善的CD3结合和/或TCR活化能力。
双特异性T细胞结合剂(BiTES)
BiTES是与T细胞受体(TCR)一起接近靶抗原的新一类治疗剂。初始设计是通过接头连接在一起的两个scFv的，其中一个scFv靶向抗原，而另一个活化T细胞。
通常通过经由短的5个残基的肽接头(GGGGS)将抗CD3scFv与抗靶抗原scFv融合生成BiTEs。在1995年，生成了靶向CHO细胞中的EpCAM(表皮17-1A抗原)和人CD3的串联scFv。在缺乏共信号传导的情况下使用未刺激的人PBMC，此新种类的双特异性抗体形式证明针对各种细胞系在纳摩尔浓度是高度细胞毒性的。后来，创建了鼠抗-CD19scFv和鼠抗CD3scFv之间的融合物。此分子表明了在不需要共信号传导(例如经由CD28)的情况下突出的体外特性，包括有效的细胞毒性。
Blinatumomab(一种鼠抗人CD3×抗人CD19)是开发的第一种BiTE，并且是临床试验中的最先进BiTE。正在研究候选物作为淋巴瘤和白血病的治疗。
MT110(一种抗人EpCAM×抗人CD3TaFv)是在临床试验中测试的第二种BiTE和针对一大批实体瘤的第一种。MT110的体外表征已经重演了对肿瘤细胞系用MT103获得的结果，从而证明了BiTE形式的一般性。MT110目前在临床试验上用于肺癌、结肠直肠癌和胃肠癌患者。
本发明的双特异性分子基于BiTE样形式，但是替代具有结合靶抗原的scFv或其它基于抗体的结合域，它具有基于针对BCMA的配体(即APRIL)的结合域。
出于各种原因，此“APRILiTE”形式与典型的scFv-scFv形式相比是有利的：(a)单域-scFv融合物比其它形式可能更稳定且更易于生成；(b)细胞表面上BCMA和APRIL的装配需要每个结合配偶体的三聚化。这在蛋白质水平上诱导T细胞活化域的聚簇，从而使蛋白质变得更具特异性且高度有力。
本发明的分子可以包含下述氨基酸序列之一：
SEQIDNo.10
METDTLLLWVLLLWVPGSTGQVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSSGGGGSGGGGSGGGGSQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINRSDPAEPKSPDKTHTCPPCPKDPKSGGGGSVLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKL
SEQIDNo.11
METDTLLLWVLLLWVPGSTGQVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSSGGGGSGGGGSGGGGSQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINRSDPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDSGGGGSVLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKL
SEQIDNo.12
MGTSLLCWMALCLLGADHADGVLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKLSGGGSDPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDSGGGGSQVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSSGGGGSGGGGSGGGGSQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINRS
本发明的分子可以包含具有至少80、85、90、95、98或99％序列同一性的以SEQIDNo.10、11或12所示的序列的变体，只要变体序列是如本发明的第一个方面限定的分子，即双特异性分子，其包含：
(i)第一域，其结合B细胞成熟抗原(BCMA)，并且包含增殖诱导性配体(APRIL)的至少一部分；和
(ii)能够活化T细胞的第二域。
信号肽
本发明的双特异性分子可以包含信号肽以帮助其生成。信号肽可以使双特异性分子被宿主细胞分泌，从而可以从宿主细胞上清液中收获双特异性分子。
信号肽的核心可以含有疏水性氨基酸的长区段，其具有形成单一alpha-螺旋的趋势。信号肽可以以氨基酸的短的带正电荷的区段开始，该区段有助于在移位期间执行多肽的正确拓扑学。在信号肽的末端，通常有被信号肽酶识别并切割的氨基酸区段。信号肽酶可以在移位期间或在完成移位后切割以生成游离的信号肽和成熟蛋白。然后，游离的信号肽被特定的蛋白酶消化。
信号肽可以在分子的氨基端。
双特异性分子可以具有通式：
信号肽-第一域-第二域。
信号肽可以包含SEQIDNo.13或14或其具有5、4、3、2或1个氨基酸突变(插入、取代或添加)的变体，只要信号肽仍发挥功能以引起双特异性分子分泌。
SEQIDNo.13:METDTLLLWVLLLWVPGSTG
SEQIDNo.14:MGTSLLCWMALCLLGADHADG
SEQIDNo.13和14的信号肽是紧密且高度有效的。预测它们在末端甘氨酸后给出约95％切割，从而给出被信号肽酶的有效除去。
间隔物
本发明的分子可以包含间隔物序列以连接第一域与第二域，并且在空间上分开两个域。
例如，间隔物序列可以包含IgG1铰链或CD8茎。或者，接头可以包含备选接头序列，其与IgG1铰链或CD8茎具有相似的长度和/或域间隔特性。
间隔物可以是短间隔物，例如包含小于100、小于80、小于60或小于45个氨基酸的间隔物。间隔物可以是或包含IgG1铰链或CD8茎或其经修饰的形式。
下文给出这些接头的氨基酸序列的例子：
SEQIDNo.15(IgG1铰链)：AEPKSPDKTHTCPPCPKDPKSGGGGS
SEQIDNo.16(CD8茎)：
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD
CD8茎具有使得它能诱导同二聚体形式的序列(参见图2)。若这不是期望的，则可以从CD8茎序列中取代或除去一个或多个半胱氨酸残基。本发明的双特异性分子可以包含间隔物，该间隔物包含或组成为(consistof)以SEQIDNo.16所示的序列或其具有至少80、85、90、95、98或99％序列同一性的变体，只要变体序列是引起第一和第二域的大致等同间隔的分子和/或变体序列引起双特异性分子的同二聚化。
本发明的分子可以具有通式：
信号肽-第一域-间隔物-第二域。
间隔物也可以包含一个或多个接头基序以引入链中断(chain-break)。链中断分开两个截然不同的域，但是容许不同角度的取向。此类序列包括序列SDP和序列SGGGSDP(SEQIDNo.17)。
接头可以包含丝氨酸-甘氨酸接头，诸如SGGGGS(SEQIDNo.18)。
核酸序列
本发明的第二个方面涉及编码本发明的第一个方面的双特异性分子的核酸序列。
核酸序列可以是或包含下述序列之一：
SEQIDNo.19(APRILiTE#01)
ATGGAGACCGACACCCTGCTGCTGTGGGTGCTGCTGCTGTGGGTGCCAGGCAGCACCGGCCAGGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGAGCCGAGCTGGCCAGACCAGGCGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCCGGTACACCATGCACTGGGTGAAGCAGCGGCCAGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCTACATCAACCCCAGCAGAGGCTACACCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACCCTGACCACCGACAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCAGATACTACGACGACCACTACTGCCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCCTGACCGTGAGCAGCTCTGGCGGAGGCGGCTCTGGCGGAGGCGGCTCTGGCGGAGGCGGCAGCCAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCAGCCATCATGAGCGCCAGCCCAGGCGAGAAGGTGACCATGACCTGCAGCGCCAGCAGCAGCGTGAGCTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGAGCGGCACCAGCCCCAAGCGGTGGATCTACGACACCAGCAAGCTGGCCAGCGGCGTGCCAGCCCACTTCAGAGGCAGCGGCAGCGGCACCAGCTACAGCCTGACCATCAGCGGCATGGAGGCCGAGGATGCCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTGGAGCAGCAACCCCTTCACCTTCGGCAGCGGCACCAAGCTGGAGATCAACCGGTCGGATCCCGCCGAGCCCAAATCTCCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAAAAGATCCCAAATCTGGCGGAGGCGGCAGCGTGCTGCACCTGGTGCCCATCAACGCCACCAGCAAGGACGACTCTGATGTGACCGAGGTGATGTGGCAGCCAGCCCTGAGACGGGGCAGAGGCCTGCAGGCCCAGGGCTACGGCGTGAGAATCCAGGACGCTGGCGTGTACCTGCTGTACTCCCAGGTGCTGTTCCAGGACGTGACCTTCACAATGGGCCAGGTGGTGAGCCGGGAGGGCCAGGGCAGACAGGAGACCCTGTTCCGGTGCATCCGGAGCATGCCCAGCCACCCCGACAGAGCCTACAACAGCTGCTACAGCGCTGGCGTGTTTCACCTGCACCAGGGCGACATCCTGAGCGTGATCATCCCCAGAGCCAGAGCCAAGCTGAACCTGTCCCCCCACGGCACCTTTCTGGGCTTCGTGAAGCTGTGA
SEQIDNo.20(APRILiTE#03)
ATGGAGACCGACACCCTGCTGCTGTGGGTGCTGCTGCTGTGGGTGCCAGGCAGCACCGGCCAGGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGAGCCGAGCTGGCCAGACCAGGCGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCCGGTACACCATGCACTGGGTGAAGCAGCGGCCAGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCTACATCAACCCCAGCAGAGGCTACACCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACCCTGACCACCGACAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCAGATACTACGACGACCACTACTGCCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCCTGACCGTGAGCAGCTCTGGCGGAGGCGGCTCTGGCGGAGGCGGCTCTGGCGGAGGCGGCAGCCAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCAGCCATCATGAGCGCCAGCCCAGGCGAGAAGGTGACCATGACCTGCAGCGCCAGCAGCAGCGTGAGCTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGAGCGGCACCAGCCCCAAGCGGTGGATCTACGACACCAGCAAGCTGGCCAGCGGCGTGCCAGCCCACTTCAGAGGCAGCGGCAGCGGCACCAGCTACAGCCTGACCATCAGCGGCATGGAGGCCGAGGATGCCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTGGAGCAGCAACCCCTTCACCTTCGGCAGCGGCACCAAGCTGGAGATCAACCGGTCGGATCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATTCTGGCGGAGGCGGCAGCGTGCTGCACCTGGTGCCCATCAACGCCACCAGCAAGGACGACTCTGATGTGACCGAGGTGATGTGGCAGCCAGCCCTGAGACGGGGCAGAGGCCTGCAGGCCCAGGGCTACGGCGTGAGAATCCAGGACGCTGGCGTGTACCTGCTGTACTCCCAGGTGCTGTTCCAGGACGTGACCTTCACAATGGGCCAGGTGGTGAGCCGGGAGGGCCAGGGCAGACAGGAGACCCTGTTCCGGTGCATCCGGAGCATGCCCAGCCACCCCGACAGAGCCTACAACAGCTGCTACAGCGCTGGCGTGTTTCACCTGCACCAGGGCGACATCCTGAGCGTGATCATCCCCAGAGCCAGAGCCAAGCTGAACCTGTCCCCCCACGGCACCTTTCTGGGCTTCGTGAAGCTGTGA
SEQIDNo.21(APRILiTE#06)
ATGGGCACCTCCCTGCTGTGCTGGATGGCCCTGTGCCTGCTGGGAGCCGACCACGCCGACGGCGTGCTGCACCTGGTGCCCATCAACGCCACCAGCAAGGACGACTCTGATGTGACCGAGGTGATGTGGCAGCCAGCCCTGAGACGGGGCAGAGGCCTGCAGGCCCAGGGCTACGGCGTGAGAATCCAGGACGCTGGCGTGTACCTGCTGTACTCCCAGGTGCTGTTCCAGGACGTGACCTTCACAATGGGCCAGGTGGTGAGCCGGGAGGGCCAGGGCAGACAGGAGACCCTGTTCCGGTGCATCCGGAGCATGCCCAGCCACCCCGACAGAGCCTACAACAGCTGCTACAGCGCTGGCGTGTTTCACCTGCACCAGGGCGACATCCTGAGCGTGATCATCCCCAGAGCCAGAGCCAAGCTGAACCTGTCCCCCCACGGCACCTTTCTGGGCTTCGTGAAGCTGTCTGGAGGCGGCTCGGATCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATAGCGGTGGCGGTGGCAGCCAGGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGAGCCGAGCTGGCCAGACCAGGCGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCCGGTACACCATGCACTGGGTGAAGCAGCGGCCAGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCTACATCAACCCCAGCAGAGGCTACACCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACCCTGACCACCGACAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCAGATACTACGACGACCACTACTGCCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCCTGACCGTGAGCAGCTCTGGCGGAGGCGGCTCTGGCGGAGGCGGCTCTGGCGGAGGCGGCAGCCAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCAGCCATCATGAGCGCCAGCCCAGGCGAGAAGGTGACCATGACCTGCAGCGCCAGCAGCAGCGTGAGCTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGAGCGGCACCAGCCCCAAGCGGTGGATCTACGACACCAGCAAGCTGGCCAGCGGCGTGCCAGCCCACTTCAGAGGCAGCGGCAGCGGCACCAGCTACAGCCTGACCATCAGCGGCATGGAGGCCGAGGATGCCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTGGAGCAGCAACCCCTTCACCTTCGGCAGCGGCACCAAGCTGGAGATCAACCGGTCGTGA
核酸序列可以编码与由SEQIDNo.19、20或21编码的氨基酸序列相同的氨基酸序列，但是由于遗传密码的简并性而可以具有不同核酸序列。核酸序列可以与以SEQIDNo.19、20或21所示的序列具有至少80、85、90、95、98或99％同一性，只要它编码如本发明的第一个方面中限定的分子。
载体
本发明还提供了载体，其包含根据本发明的核酸序列。可以使用此类载体来将核酸序列引入宿主细胞中，从而它表达并生成根据本发明的第一个方面的分子。
例如，载体可以是质粒或病毒载体。
宿主细胞
本发明还提供了宿主细胞，其包含根据本发明的核酸。宿主细胞可以能够生成根据本发明的第一个方面的分子。
宿主细胞可以是哺乳动物细胞，诸如人胚胎肾细胞系293。
本发明还提供生成根据本发明的第一个方面的分子的方法，其包括在适合于生成分子的条件下培养本发明的宿主细胞，然后从宿主细胞或上清液中收获细分子的步骤。
可以在胞内(例如在胞质溶胶中，在周质中或在包含体中)生成如上文列出的细胞中生成的本发明的双特异性分子，然后从宿主细胞中分离并且任选进一步纯化该双特异性分子；或者可以在胞外(例如培养宿主细胞的培养基中)生成它们，然后从培养基中分离并且任选地进一步纯化它们。
药物组合物
本发明还涉及药物组合物，其含有作为活性成分的至少一种本发明的双特异性分子以及药学可接受载体、稀释剂或赋形剂和/或佐剂，和任选地一种或多种其它药学活性多肽和/或化合物。例如，此类配制剂可以为适合于口服施用或胃肠外施用(诸如通过静脉内、肌肉内或皮下注射或静脉内输注)的形式。
治疗方法
可以使用本发明的分子来治疗癌性疾病，特别是浆细胞病症或与增强的BCMA表达关联的B细胞病症。
浆细胞病症包括浆细胞瘤、浆细胞白血病、多发性骨髓瘤、巨球蛋白血症、淀粉样变、沃尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、孤立性骨浆细胞瘤、髓外浆细胞瘤、骨硬化性骨髓瘤(POEMS综合征)和重链疾病及意义未定的单克隆γ球蛋白血症/郁积型多发性骨髓瘤。
疾病可以是多发性骨髓瘤。
与升高的BCMA表达水平相关联的B细胞病症的例子是CLL(慢性淋巴细胞性白血病)和非何杰金淋巴瘤(NHL)。也可以在自身免疫性疾病，如系统性红斑狼疮(SLE)、多发性硬化(MS)和类风湿性关节炎(RA)的疗法中使用本发明的双特异性结合剂。
本发明的方法可以用于治疗癌性疾病，特别是浆细胞病症或与增强的BCMA表达相关的B细胞病症。
用于治疗疾病的方法涉及本发明的方法的治疗性用途。在本文中，可以对具有现有疾病或状况的受试者施用分子以减轻、降低或改善至少一种与疾病有关的症状和/或减缓、降低或阻断疾病的进展。本发明的分子或药物组合物可以引起或促进T细胞介导的对BCMA表达细胞，诸如浆细胞的杀伤。
本发明现在会通过实施例进一步描述，所述实施例意图用来帮助本领域普通技术人员实施本发明，而不以任何方式意图限制本发明的范围。
实施例
实施例1：构建一系列“APRILITES”
本发明人已经构建了一系列双特异性结合剂，其将来自OKT3的scFv与APRIL的胞外域连接，如图2A中所示。在这些分子的构建期间进行几个设计考虑：(a)截短APRIL的蛋白聚糖结合氨基端以阻止非特异性结合；(b)在构建体4、5和6中，将信号肽附着于APRIL的成熟胞外域；(c)将OKT3重新设计为具有连接重链和轻链可变区的接头的scFv；(d)在scFv和APRIL之间尝试各种不同间隔物。
各种不同形式如下：
(1)通过IgG1铰链与截短的APRIL连接的OKT3scFv；
(2)经由(SGGGGS)3接头与截短的APRIL连接的OKT3scFv；
(3)经由CD8茎与截短的APRIL连接的OKT3scFv；
(4)经由IgG1铰链与OKT3scFv连接的截短的APRIL；
(5)经由(SGGGGS)3接头与OKT3scFv连接的截短的APRIL；和
(6)经由CD8间隔物与OKT3scFv连接的截短的APRIL。
构建体(3)和(6)经由CD8间隔物中的二硫键形成同二聚体。
图8中显示了构建体(1)、(3)和(6)的氨基酸序列。
实施例2：在293T细胞中表达APRILiTEs
用编码上文列出的APRILiTE构建体的表达质粒转染293T细胞。在丙烯酰胺凝胶上运行来自293T细胞的上清液，并且将蛋白质转移到膜。然后，用识别APRIL的抗体染色膜。图3中显示了结果。在预期的分子量检出蛋白质1、3和6。没有检出蛋白2、4和5，这指示这些构造是不稳定的。
实施例3：对TCR和BCMA的结合
然后，调查了这些蛋白质是否可以在一个末端结合T细胞受体(TCR)和在另一个末端结合BCMA。使用来自经转染的293T细胞的上清液来染色JurkatT细胞和具有TCRαβ敲除的JurkatT细胞克隆。这证明了APRILiTE结合TCR(图4b)。然后，使用二级抗APRIL生物素，接着是链霉亲合素PE，用上述上清液染色工程化改造为表达BCMA的SupT1细胞和工程化改造为表达TACI的SupT1细胞。图4a中显示了结果。发现了APRILiTES1、3和6结合BCMA，和TACI(在较低程度上)。
实施例4：稳定的APRILITE触发IFNγ释放
将正常供体T细胞以1:1与不同SupT1s一起培养。使用的SupT1s是非转导的，工程化改造为表达BCMA或工程化改造为表达TACI。图5中显示了结果。发现了T细胞仅在存在任一种APRILiTE的情况下在与工程化改造为具有BCMA或TACI的SupT1细胞一起暴露时释放IFNγ。对BCMA的应答大于用TACI的应答。
实施例5：稳定的APRILITEs触发T细胞介导的对BCMA+靶物的杀伤
在缺乏或存在APRILiTEs1、3和6的情况下将T细胞以1:1与野生型SupT1细胞、表达BCMA的SupT1细胞和表达TACI的SupT1细胞一起培养。图6中显示了结果。剩余的T细胞以在不添加APRILiTE的条件下存在的SupT1细胞的比例显示。
实施例6：调查原发性骨髓瘤细胞上的BCMA表达
用大鼠抗人BCMAmAbVicky1染色4份不同骨髓瘤样品。在图7中显示了结果。在临床和形态学典型骨髓瘤(小图2至4)中，看到中等或暗淡的染色。
实施例7：调查APRILiTEs对原发性骨髓瘤细胞的影响
使用来自两名具有已知多发性BCMA+骨髓瘤的患者的诊断用骨髓抽吸物的剩余材料。进行CD138磁珠选择以从抽吸物纯化骨髓瘤细胞。在完全培养基中静置48小时，并且进行BCMA染色以检查它们实际上呈BCMA阳性。发现了骨髓瘤细胞表达BCMA，但是以低水平表达(图9)。
接着，对已经使用OKT3和CD28.2刺激的正常供体外周单核细胞消减CD56以除去NK细胞。在缺乏或存在APRILITE#03和#06中任一的情况下进行经CD56消减的PBMC和经CD138选择的原发性骨髓瘤细胞的1:1共培养。存在的材料不足以测试APRILiTE#01。通过显微术观察共培养物。通过ELISA测量对上清液的干扰素gamma释放。通过膜联蛋白V/PI染色和珠计数受控流式细胞术测量骨髓瘤细胞的存活。
在共培养后看到清楚的凝聚(T细胞活化的迹象)(参见图10)。在存在APRILiTES的情况下与骨髓瘤细胞一起培养PBMC的条件下观察到干扰素-gamma释放，尽管比在与SupT1共培养时以更小的绝对量观察。BCMA细胞(图11)。当共培养6天后PBMC与APRILiTE一起存在时也观察到骨髓瘤细胞的杀伤(图12)。
这些发现证明了APRILiTEs在以足以引起T细胞介导的骨髓瘤细胞杀伤的水平在存在原发性骨髓瘤细胞的情况下引起T细胞活化。
实施例8：在体内测试APRILiTES
使用huSCID模型：NSG(nod-scidgamma,NOD-scidIL2Rgammanull)小鼠异种移植有骨髓瘤细胞系，所述骨髓瘤细胞系表达典型的BCMA水平。这些系工程化改造为表达萤火虫萤光素酶以通过生物发光成像测量疾病。在伴随腹膜内施用APRILiTEs期间经由尾静脉施用正常供体PBMC。序贯测量下列各项：(1)APRILiTEs的血清水平；(2)人干扰素-gamma的血清水平；(3)通过流式细胞术测量外周血T细胞扩增、植入和活化；(4)肿瘤的生物发光测量。在取下(take-down)时，测量下列各项：(1)通过骨髓组织学测量肿瘤负荷；(2)通过骨髓、脾、血液和淋巴结的流式细胞术测量T细胞增殖和植入；和(3)以肉眼和免疫组织化学对剩余的组织检查任何毒性。
通过提及将上述说明书中提及的所有出版物收入本文。本发明的描述的方法和系统的各种修改和变型在不偏离本发明的范围和精神的前提下对于本领域技术人员会是明显的。虽然本发明已经结合具体的优选实施方案进行了描述，但是应当理解，如要求保护的发明不应过度限于此类具体实施方案。实际上，对于分子生物学、细胞免疫学或相关领域的技术人员明显的用于实施发明的描述的模式的各种修改意图在所附权利要求书的范围内。

Claims (27)

1.一种双特异性分子，其包含：
(i)第一域，其结合B细胞成熟抗原(BCMA)，并且包含增殖诱导性配体(APRIL)的至少一部分；和
(ii)能够活化T细胞的第二域。
2.根据权利要求1的双特异性分子，其中所述第二域通过结合T细胞表面上的CD3活化T细胞。
3.根据权利要求2的双特异性分子，其中所述第二域包含CD3特异性抗体或其部分。
4.根据权利要求3的双特异性分子，其中所述第二域包含来自以SEQIDNo.9所示的scFv序列的互补决定区(CDR)。
5.根据权利要求3的双特异性分子，其中所述第二域包含以SEQIDNo.9所示的scFv序列或其具有至少80％序列同一性并且结合CD3的变体。
6.根据前述权利要求中任一项的双特异性分子，其中所述第一域包含截短的APRIL，其包含BCMA结合位点，但是缺乏负责蛋白聚糖结合的APRIL的氨基端部分。
7.根据权利要求2的双特异性分子，其包含以SEQIDNo.2所示的序列或其具有至少80％序列同一性并且结合BCMA的变体。
8.根据前述权利要求中任一项的双特异性分子，其中所述第一和第二结合域由间隔物连接。
9.根据权利要求8的双特异性分子，其中所述间隔物包含IgG1铰链或CD8茎。
10.根据前述权利要求中任一项的双特异性分子，其包含以SEQIDNo.10、11或12所示的序列或其具有至少80％序列同一性但是保留i)结合BCMA并且ii)活化T细胞的能力的变体。
11.根据前述权利要求中任一项的双特异性分子，其以三聚体结合BCMA。
12.一种核酸序列，其编码根据前述权利要求中任一项的双特异性分子。
13.根据权利要求12的核酸序列，其包含以SEQIDNo19、20或21所示的序列或其具有至少80％序列同一性的变体。
14.一种载体，其包含根据权利要求12或13的核酸序列。
15.一种宿主细胞，其包含根据权利要求12或13的核酸序列，并且生成根据权利要求1至11中任一项的双特异性分子。
16.一种用于生成权利要求1至11中任一项的双特异性分子的方法，其包括在使得生成所述双特异性分子的条件下培养根据权利要求15的宿主细胞的步骤。
17.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至11中任一项的双特异性分子以及药学可接受载体、稀释剂或赋形剂。
18.一种用于治疗浆细胞病症的方法，其包括对受试者施用根据权利要求1至11中任一项的双特异性分子的步骤。
19.根据权利要求18的方法，其中所述浆细胞病症选自浆细胞瘤(plasmacytoma)、浆细胞白血病、多发性骨髓瘤、巨球蛋白血症(macroglobulinemia)、淀粉样变(amyloidosis)、沃尔登斯特伦(Waldenstrom)氏巨球蛋白血症、孤立性骨浆细胞瘤、髓外浆细胞瘤、骨硬化性骨髓瘤(osteoscleroticmyeloma)、重链疾病、意义未定的单克隆γ球蛋白血症(monoclonalgammopathyofundeterminedsignificance)和郁积型多发性骨髓瘤(smolderingmultiplemyeloma)。
20.根据权利要求18的方法，其中所述浆细胞病症是多发性骨髓瘤。
21.根据权利要求1至11中任一项的双特异性分子，其用于治疗浆细胞病症。
22.根据权利要求1至11中任一项的双特异性分子在制备用于治疗浆细胞病症的药物中的用途。
23.一种双特异性分子，其包含第一结合域和第二结合域，其中所述第一和第二结合域由间隔物连接，所述间隔物是CD8茎或包含CD8茎。
24.根据权利要求23的双特异性分子，其中所述第一结合域结合靶分子，并且所述第二结合域能够活化T细胞。
25.根据权利要求23或24的双特异性分子，其中所述间隔物包含以SEQIDNo.16所示的序列或其变体或者由以SEQIDNo.16所示的序列或其变体组成。
26.根据权利要求23至25中任一项的双特异性分子，其中所述间隔物引起所述双特异性分子同二聚化。
27.根据权利要求23至26中任一项的双特异性分子的同二聚体形式。
CN201480055817.7A 2013-10-10 2014-10-10 分子 Pending CN105658668A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB1317928.8A GB201317928D0 (en) 2013-10-10 2013-10-10 Molecule
GB1317928.8 2013-10-10
PCT/GB2014/053056 WO2015052536A1 (en) 2013-10-10 2014-10-10 Molecule

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105658668A true CN105658668A (zh) 2016-06-08

Family

ID=49679853

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201480055817.7A Pending CN105658668A (zh) 2013-10-10 2014-10-10 分子

Country Status (6)

Country Link
US (1) US11492408B2 (zh)
EP (1) EP3055330B1 (zh)
JP (1) JP6557657B2 (zh)
CN (1) CN105658668A (zh)
GB (1) GB201317928D0 (zh)
WO (1) WO2015052536A1 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020088164A1 (zh) * 2018-11-01 2020-05-07 山东新时代药业有限公司 双特异性抗体及其用途
RU2785292C2 (ru) * 2018-11-01 2022-12-06 Шаньдун Нью Тайм Фармасьютикал Ко., Лтд. Биспецифическое антитело и его применение

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3243831A1 (en) * 2014-02-27 2017-11-15 Ucl Business Plc Variants of the proliferation-inducing ligand (april)
WO2016166630A1 (en) 2015-04-13 2016-10-20 Pfizer Inc. Chimeric antigen receptors targeting b-cell maturation antigen
KR102405104B1 (ko) 2015-04-13 2022-06-07 화이자 인코포레이티드 치료 항체 및 그의 용도
GB201507119D0 (en) * 2015-04-27 2015-06-10 Ucl Business Plc Nucleic Acid Construct
WO2019035938A1 (en) 2017-08-16 2019-02-21 Elstar Therapeutics, Inc. MULTISPECIFIC MOLECULES BINDING TO BCMA AND USES THEREOF
EP3691682A1 (en) 2017-09-14 2020-08-12 GlaxoSmithKline Intellectual Property Development Limited Combination treatment for cancer
BR112020005028A2 (pt) 2017-09-14 2020-09-15 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited tratamento em combinação para câncer
BR112020005079A2 (pt) 2017-09-14 2020-09-15 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited tratamento de combinação para câncer
EP3818083A2 (en) 2018-07-03 2021-05-12 Elstar Therapeutics, Inc. Anti-tcr antibody molecules and uses thereof
CN112955748A (zh) 2018-10-31 2021-06-11 葛兰素史密斯克莱知识产权发展有限公司 治疗癌症的方法
MA55372A (fr) 2019-03-21 2022-01-26 Regeneron Pharma Combinaison d'inhibiteurs de la voie il-4/il-13 et d'ablation de plasmocytes pour traiter une allergie
JP7137696B2 (ja) 2019-05-14 2022-09-14 プロヴェンション・バイオ・インコーポレイテッド １型糖尿病を予防するための方法および組成物
EP4010372A2 (en) 2019-08-06 2022-06-15 GlaxoSmithKline Intellectual Property Development Limited Biopharmacuetical compositions and related methods
CN116249548A (zh) 2020-05-11 2023-06-09 詹森生物科技公司 用于治疗多发性骨髓瘤的方法
GB202103706D0 (en) * 2021-03-17 2021-04-28 Ucl Business Ltd CD160 binding domain
AU2022255506A1 (en) 2021-04-08 2023-11-09 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules binding to tcr and uses thereof
WO2022248870A1 (en) 2021-05-28 2022-12-01 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Combination therapies for treating cancer
CA3227515A1 (en) 2021-08-03 2023-02-09 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Biopharmaceutical compositions and stable isotope labeling peptide mapping method
CA3233953A1 (en) 2021-10-05 2023-04-13 Matthew Bruce Combination therapies for treating cancer
WO2023144702A1 (en) 2022-01-25 2023-08-03 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Combination therapy for cancer

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102372778A (zh) * 2010-08-19 2012-03-14 上海抗体药物国家工程研究中心有限公司 抗人vegf和opn双特异性抗体、其制备方法及用途
CN102574921A (zh) * 2009-09-29 2012-07-11 罗切格利卡特公司 双特异性死亡受体激动型抗体
WO2013072406A1 (en) * 2011-11-15 2013-05-23 Amgen Research (Munich) Gmbh Binding molecules for bcma and cd3

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5540926A (en) 1992-09-04 1996-07-30 Bristol-Myers Squibb Company Soluble and its use in B cell stimulation
GB9526131D0 (en) 1995-12-21 1996-02-21 Celltech Therapeutics Ltd Recombinant chimeric receptors
AU2003270715A1 (en) 2002-09-19 2004-04-08 Biogen Idec Ma Inc. Improved methods for preparing highly active april ligand polypeptides
GB0328261D0 (en) 2003-12-05 2004-01-07 Univ Groningen Improved cytokine design
US20070264687A1 (en) 2005-12-15 2007-11-15 Min-Yuan Chou Recombinant triplex scaffold-based polypeptides
MX363905B (es) 2006-06-12 2019-04-08 Aptevo Res & Development Llc Proteinas de union multivalentes monocatenarias con funcion efectora.
EP2356150A2 (en) 2008-10-10 2011-08-17 Emergent Product Development Seattle, LLC Tcr complex immunotherapeutics
EP2332994A1 (en) 2009-12-09 2011-06-15 Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Trispecific therapeutics against acute myeloid leukaemia
EP3974453A3 (en) * 2010-11-16 2022-08-03 Amgen Inc. Agents and methods for treating diseases that correlate with bcma expression
JP6047142B2 (ja) 2011-04-01 2016-12-21 ウニヴェルズィテート シュトゥットガルト 抗体結合ドメインを有する組換えｔｎｆリガンドファミリーメンバーポリペプチドおよびそれらの使用
CN102219856B (zh) 2011-05-18 2013-03-27 哈尔滨医科大学 一种抗血管内皮细胞生长因子受体2/抗cd3双特异单链抗体
CN110981964B (zh) * 2013-01-14 2023-09-15 Xencor股份有限公司 新型异二聚体蛋白
PL2953972T3 (pl) * 2013-02-05 2021-03-08 Engmab Sàrl Metoda wyboru przeciwciał przeciwko bcma
GB201317929D0 (en) * 2013-10-10 2013-11-27 Ucl Business Plc Chimeric antigen receptor
EP3858378A1 (en) * 2013-11-21 2021-08-04 Autolus Limited Cell
EP3243831A1 (en) * 2014-02-27 2017-11-15 Ucl Business Plc Variants of the proliferation-inducing ligand (april)
EP2982692A1 (en) * 2014-08-04 2016-02-10 EngMab AG Bispecific antibodies against CD3epsilon and BCMA
US10227411B2 (en) * 2015-03-05 2019-03-12 Xencor, Inc. Modulation of T cells with bispecific antibodies and FC fusions
AU2016308567B2 (en) * 2015-08-17 2022-10-27 Janssen Biotech, Inc. Anti-BCMA antibodies, bispecific antigen binding molecules that bind BCMA and CD3, and uses thereof
MA43955B1 (fr) * 2016-02-03 2022-02-28 Amgen Inc Anticorps anti-bcma et anti-cd3 bispécifiques de format bite
MX2021003636A (es) * 2018-09-27 2021-07-21 Autolus Ltd Receptor antigenico quimerico.
GB201817172D0 (en) * 2018-10-22 2018-12-05 Autolus Ltd Antibody
US20220041718A1 (en) * 2018-10-31 2022-02-10 Autolus Limited Binding domain

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102574921A (zh) * 2009-09-29 2012-07-11 罗切格利卡特公司 双特异性死亡受体激动型抗体
CN102372778A (zh) * 2010-08-19 2012-03-14 上海抗体药物国家工程研究中心有限公司 抗人vegf和opn双特异性抗体、其制备方法及用途
WO2013072406A1 (en) * 2011-11-15 2013-05-23 Amgen Research (Munich) Gmbh Binding molecules for bcma and cd3

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KIMBERLEY ET AL: "The proteoglycan (heparan sulfate proteoglycan) binding domain of APRIL serves as a platform for ligand multimerization and cross-linking", 《THE FASEB JOURNAL》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020088164A1 (zh) * 2018-11-01 2020-05-07 山东新时代药业有限公司 双特异性抗体及其用途
RU2785292C2 (ru) * 2018-11-01 2022-12-06 Шаньдун Нью Тайм Фармасьютикал Ко., Лтд. Биспецифическое антитело и его применение

Also Published As

Publication number Publication date
EP3055330A1 (en) 2016-08-17
US20160311915A1 (en) 2016-10-27
EP3055330B1 (en) 2020-07-29
JP6557657B2 (ja) 2019-08-07
WO2015052536A1 (en) 2015-04-16
JP2016537966A (ja) 2016-12-08
US11492408B2 (en) 2022-11-08
GB201317928D0 (en) 2013-11-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105658668A (zh) 分子
JP6707496B2 (ja) Ａｐｒｉｌバリアント
JP6433498B2 (ja) 細胞
JP7280827B2 (ja) Ａｘｌまたはｒｏｒ２に対するキメラ抗原受容体およびその使用方法
RU2684713C2 (ru) Химерный антигенный рецептор
US11732043B2 (en) Antibodies that modulate a biological activity expressed by a cell
CN109641049A (zh) Cd3结合抗体
AU2017310163B2 (en) Heterodimeric Fc-fused cytokine and pharmaceutical composition comprising the same
KR20200015713A (ko) 항-trbc1 항원 결합 도메인
US20230357407A1 (en) Bispecific anti pd1-anti tim3 antibodies
BR112021007995A2 (pt) molécula de anticorpo antagonista, sequência de nucleotídeos isolada, plasmídeo, vírus, célula, uso de uma molécula de anticorpo, composição farmacêutica, método para tratar câncer ou uma infecção causada por um patógeno intracelular em um paciente
TW202309083A (zh) 抗ｃｌｄｎ４－抗ｃｄ１３７雙特異性抗體
CN112166185A (zh) 用于t细胞恶性肿瘤的免疫治疗的cd2表面表达和嵌合抗原受体表达的阻断
CN116234559A (zh) 抗cd22单结构域抗体和治疗性构建体
TW202404638A (zh) 抗ｔｓｐａｎ８－抗ｃｄ３雙特異性抗體之與ｐｄ－１訊息抑制劑之組合在癌治療的用途
WO2023177821A2 (en) Binding domains and methods of use thereof
JP2024513485A (ja) 免疫細胞活性を制御する方法
CA3184394A1 (en) Methods and compositions for the reduction of chimeric antigen receptor tonic signaling

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB02 Change of applicant information

Address after: England Atsushi

Applicant after: UCL business Limited

Address before: England Atsushi

Applicant before: UCL Business Co., Ltd.

CB02 Change of applicant information
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20160608

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication