JP2022529618A - 腫瘍抗原認識受容体を有する免疫細胞とその応用 - Google Patents
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Abstract
本出願は、改変された免疫エフェクター細胞およびその用途に関し、前記改変された免疫エフェクター細胞S1PR1タンパク質の発現および／または活性がアップレギュレートされることを特徴とする。また、本出願は、前記免疫エフェクター細胞を含む細胞集団および医薬組成物も提供する。【選択図】図１１
Description
本出願はバイオ製薬分野に関し、より具体的には、改変された免疫エフェクター細胞とその応用、特にS1PR1タンパク質の発現および/または活性がアップレギュレートされた免疫エフェクター細胞に関するものである。
CAR-T（またはTCR-T）の治療では、メモリーCAR-T細胞は、メモリーT細胞と同様に、リンパ節にホーミングする傾向がある（https://doi.org/10.1124/jpet.118.252858）。一方、CAR-T細胞の活性化は、抗原認識領域による標的細胞膜抗原の直接認識に依存するため、リンパ節にホーミングするメモリーCAR-T細胞は効果的に活性化できないことがしばしばある。また、リンパ節内に長時間留まり、標的細胞にアクセスできないためは、効果が損なわれる。
セントラルメモリーTリンパ球は、ホーミング受容体CCR7や接着分子受容体CD62Lなどの発現により、末梢循環において、リンパ節にホーミングする傾向が強い。リンパ節に入った後、抗原提示細胞（DC細胞など）によって活性化されると、それらは増殖および分化してエフェクター細胞を形成し、ホーミング受容体の発現を低下させ、S1PR1（スフィンゴシン1リン酸受容体1）の発現をアップレギュレートさせ、リンパ節から移動して、治療部位に到達する。方、CAR-T細胞では、活性化条件が抗原提示細胞に依存せず、標的細胞との結合に依存するため、リンパ節内に標的細胞がない場合、活性化してリンパ節外に移動することが難しく、機能しないままリンパ節内に留まってしまう。
それにもかかわらず、CAR-T（またはTCR-T）細胞のリンパ節外への移動を促進する方法を記載した先行技術は存在しない。
本出願は、改変された免疫エフェクター細胞及びその用途を提供するものであり、前記改変された免疫エフェクター細胞のS1PR1タンパク質の発現および/または活性がアップレギュレートされており、本出願の免疫エフェクター細胞は、リンパ節からの移行能力が高く、より容易に治療部位に到達して機能し、且つ、免疫エフェクター機能が強化され、結果的に抗腫瘍力の強化にもつながる。また、本出願は、前記免疫エフェクター細胞を含む細胞集団および医薬組成物も提供する。
さらに、本出願は、前記改変されていない免疫エフェクター細胞に比べ、S1PR1タンパク質の発現および/または活性が、アップレギュレートされている改変された免疫エフェクター細胞も提供する。
ある実施形態では、前記免疫エフェクター細胞はT細胞、リンパ球、顆粒球および/または末梢血単核細胞を含む。
ある実施形態では、前記免疫エフェクター細胞はメモリーT細胞を含む。
ある実施形態では、前記改変された免疫細胞では、S1PR1タンパク質をコードする核酸分子の発現および/または活性がアップレギュレートされる。
ある実施形態では、前記改変された免疫細胞はさらにS1PR1タンパク質を含む。
ある実施形態では、前記改変された免疫エフェクター細胞はさらに前記S1PR1タンパク質をコードする核酸分子を含む。
ある実施形態では、前記改変された免疫エフェクター細胞はベクターを含み、前記ベクターは前記S1PR1タンパク質をコードする核酸分子を含む。
ある実施形態では、前記免疫エフェクター細胞はキメラ抗原受容体CARを発現する。
ある実施形態では、前記改変された免疫エフェクター細胞はベクターを含み、前記ベクターは前記キメラ抗原受容体をコードする核酸分子を含む。
ある実施形態では、前記キメラ抗原受容体をコードする核酸分子と前記S1PR1タンパク質をコードする核酸分子は同一ベクターに位置する。
ある実施形態では、前記キメラ抗原受容体をコードする核酸分子は前記S1PR1タンパク質をコードする核酸分子の5’末端に位置し、または、前記キメラ抗原受容体をコードする核酸分子が前記S1PR1タンパク質をコードする核酸分子の3’末端に位置する。
ある実施形態では、前記キメラ抗原受容体は腫瘍特異的抗原を標的とするキメラ抗原受容体を含み、前記腫瘍特異的抗原が下記のEpCAM、Mesothelin（MSLN）、CEA、IL13、PDPN、VEGF、EGFR、EGFRvIII、PSMA、FAP、CD171、GD2、Glypican-2、Glypican-3、HER2、HPV抗原、cyclin D1、p53、MMP-7、IL13Ralpha2、MMP-2、MUC-1、G250、L1CAM、ROR1およびGPC3からなる群より選択される。
ある実施形態では、前記キメラ抗原受容体は腫瘍特異的抗原に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む。
ある実施形態では、前記抗原結合ドメインは一本鎖抗体を含む。
ある実施形態では、前記抗原結合ドメインはGPC3またはMSLNを標的とする一本鎖抗体を含む。
ある実施形態では、前記一本鎖抗体はSEQ ID NO: 1-2のいずれか１つに示すアミノ酸配列を含む。
ある実施形態では、前記キメラ抗原受容体は膜貫通ドメインを含む。
ある実施形態では、前記膜貫通ドメインは下記のCD3ζ、CD28、4-1BB、OX40、SLAMF4、CD127、NKG2D、ICOS和FcγRIIIaから選ばれるタンパク質由来の膜貫通ドメインを含む。
ある実施形態では、前記キメラ抗原受容体は共刺激ドメインを含む。
ある実施形態では、前記共刺激ドメインは下記CD137、CD28、OX40、ICOS、DAP10、2B4、CD27、CD30、CD40、CD40L、TIM1、CD226、DR3、SLAM、NKG2D、CD244、FceRIγ、BTLA、GITR、HVEM、CD2、NKG2C、LIGHTのDAP12のタンパク質から選ばれる共刺激ドメインまたはその組合せを含む。
ある実施形態では、前記キメラ抗原受容体はヒンジ領域を含み、前記ヒンジ領域は前記抗原結合ドメインと前記膜貫通ドメインを接続する。
ある実施形態では、前記ヒンジ領域は下記CD8、CD28、IgG、4-1BB、CD4、CD27、CD7、PD-1およびCH2CH3から選ばれるタンパク質由来のヒンジ領域を含む。
ある実施形態では、前記キメラ抗原受容体はSEQ ID NO: 5-6のいずれか１つに示すアミノ酸配列を含む。
ある実施形態では、前記免疫エフェクター細胞は前記キメラ抗原受容体をコードする核酸分子を含む。
ある実施形態では、前記キメラ抗原受容体をコードする核酸分子と前記S1PR1タンパク質をコードする核酸分子を含むベクターはSEQ ID NO: 7～9のいずれか1項に示すアミノ酸配列を含む。
さらに、本出願は前記の免疫エフェクター細胞を含む細胞集団を提供する。
さらに、本出願は前記の免疫エフェクター細胞および/または前記の細胞集団を含み、および任意に選ばれる薬学的に許容されるベクターを含む医薬組成物を提供する。
さらに、本出願は前記の免疫エフェクター細胞、前記の細胞集団および/または前記の医薬組成物の医薬品調製における用途を提供し、前記医薬品は腫瘍の治療に用いる。
ある実施形態では、前記腫瘍は固形腫瘍を含む。
ある実施形態では、前記腫瘍は膵臓癌、神経膠腫、肝臓癌および/または結腸癌を含む。
本出願の他の態様や優位性は、以下の詳細な説明から当業者が容易に察することができる。下記の詳細な説明では、本出願の例示的な実施形態のみを示し、説明する。当業者が認識するように、本出願の内容は、当業者が本出願に関連する発明の精神と範囲から逸脱することなく、開示された特定の実施形態に変更を加えることを可能にする。したがって、本出願の図面および明細書に記載は、例示的なものにすぎず、限定的なものではない。
本出願に関連する具体的に特徴は、添付の請求項に示されている。下記の実施形態および図面を参考することで、本出願が対象とする本発明の特徴および優位性は、よりよく理解することができる。図面の簡単な説明は下記の通りである。
下記の具体的な実施形態は、本願が実施される態様を示すものであり、本願における他の優位性および効果は、本明細書に開示されているように、当業者によって容易に理解され得る。
用語定義
本出願では、「S1PR1」という用語は通常スフィンゴシン-1-リン酸受容体1（sphingosine-1-phosphate receptor 1）を指し、内皮分化遺伝子1（EDG1）ともいわれる。S1PR1はGタンパク質カップル補助受容体として生物学的に活性なシグナル分子であるスフィンゴシン1-リン酸（S1P）に結合する。この用語には天然なS1PR1またはその変種、および合成のS1PR1が含まれる場合がある。前記S1PR1には、完全長のS1PR1、S1PR1の切り捨てられた形式、スプライスされた形式、またはその機能的断片を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、本出願のS1PR1は、完全長ヒトS1PR1であってもよく、完全長ヒトS1PR1遺伝子のヌクレオチド配列は、NCBIアクセッション番号NM_001400で示されてもよく、S1PR1タンパク質のアミノ酸配列は、NCBIアクセッション番号NP_001391で示されてもよい。
本出願では、「S1PR1」という用語は通常スフィンゴシン-1-リン酸受容体1（sphingosine-1-phosphate receptor 1）を指し、内皮分化遺伝子1（EDG1）ともいわれる。S1PR1はGタンパク質カップル補助受容体として生物学的に活性なシグナル分子であるスフィンゴシン1-リン酸（S1P）に結合する。この用語には天然なS1PR1またはその変種、および合成のS1PR1が含まれる場合がある。前記S1PR1には、完全長のS1PR1、S1PR1の切り捨てられた形式、スプライスされた形式、またはその機能的断片を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、本出願のS1PR1は、完全長ヒトS1PR1であってもよく、完全長ヒトS1PR1遺伝子のヌクレオチド配列は、NCBIアクセッション番号NM_001400で示されてもよく、S1PR1タンパク質のアミノ酸配列は、NCBIアクセッション番号NP_001391で示されてもよい。
本出願では、「MSLN」、「Mesothelin」と「メソテリン」という用語は同じ意味で使用されることがある。一般的には、グリコホスファチジルイノシトールに結合した細胞（腫瘍細胞など）表面の糖タンパク質を指す。「MSLN」という用語は、成熟的MSLNタンパク質、MSLNタンパク質の様々なサブタイプおよびその前駆体タンパク質、および天然のMSLNタンパク質またはその変異体、スプライスされた形態、短縮型、および合成のMSLNタンパク質を含むことができる。MSLN前駆体タンパク質には、メソセリンサブタイプ１前駆体タンパク質およびメソセリンサブタイプ２前駆体タンパク質などがあり、これらを処理（例えば、消化酵素）して、成熟ＭＳＬＮを生成することができる。MSLNは高分子細胞増強因子（MPF）にリンクすることができる。メソセリンサブタイプ1前駆体タンパク質のアミノ酸配列についてNCBIアクセッション番号NP_001170826またはNP_005814の記載を参照し、メソセリンサブタイプ2前駆体タンパク質のアミノ酸配列について、NCBIアクセッション番号NP_037536の記載を参照することができる。
ホスファチジルイノシトールプロテオグリカン3（グリピカン-3）とも呼ばれる「GPC3」という用語は、一般に、グリコシルホスファチジルイノシトール（GPI）を介して共有結合し、細胞表面に発現するタンパク質、糖、脂質の複合体を意味する。この用語は天然GPC3の様々なサブタイプ（例えば、サブタイプ1、サブタイプ2、サブタイプ3およびサブタイプ4）、変異体、前駆体、スプライスされた形態、人工合成のGPC3またはその機能性フラグメントを含むこともできる例えば、GPC3サブタイプ1の前駆体形式のアミノ酸配列は、NCBIアクセッション番号NP_001158089、、GPC3サブタイプ3の前駆体形式のアミノ酸配列は、NCBIアクセッション番号NP_001158090、GPC3サブタイプ4の前駆体形式のアミノ酸配列は、NCBIアクセッション番号NP_001158091、GPC3サブタイプ2の前駆体形式のアミノ酸配列は、NCBIアクセッション番号NP_004475の記載を参照することができる。
本出願では、「キメラ抗原受容体（Chimeric Antigen Receptor，CAR）」は通常、抗原に結合することができる細胞外ドメインおよび少なくとも１つの細胞内ドメインを含む融合タンパク質を指す。CARはキメラ抗原受容体T細胞（CAR-T）のコア成分であり、抗原（例えば、腫瘍特異的抗原および/または腫瘍関連抗原）結合ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、および細胞内シグナルドメインを含むことができる。本出願では、前記CARは抗体抗原（例えばCD70）の特異性と、Ｔ細胞受容体を活性化する細胞内ドメインとの組み合わせに基づいていてもよい。CARを発現するように遺伝子改変されたT細胞は、標的抗原を発現する悪性細胞を特異的に認識して排除することができる。CARおよびCAR-T細胞の記載について、例えば Sadelain M, Brentjens RRivi `ere I. The basicprinciples of chimeric antigen receptor design. Cancer Discov. 2013;3(4):388-398；Turtle CJ, Hudecek M, Jensen MC, Riddell SR. Engineered T cells for anti-cancer therapy. Curr Opin Immunol. 2012;24(5):633-639；Dotti G,Gottschalk S, Savoldo B, Brenner MK. Design and development of therapies using chimeric antigen receptor-expressing T cells. Immunol Rev. 2014;257(1):107-126 ；およびWO2013154760、WO2016014789を参照することができる。
本出願では、「抗原結合ドメイン」という用語は通常、標的抗原に結合できるドメインを指す。抗原結合ドメインは、抗原に特異的に結合することができるキメラ抗原受容体およびそのフラグメント、抗体またはその抗原結合フラグメントを含むことができる。抗原結合ドメインは、天然由来、合成由来、半合成由来、または組換え由来のものがある。いくつかの実施形態では、抗原結合構造は一本鎖抗体を含み得る。
本出願では、「抗体」という用語は通常、特定の抗原を特異的に認識および／または中和することができるポリペプチド分子を指す。例えば、抗体は、ジスルフィド結合により相互接続された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖からなる免疫グロブリンを含むことができ、そしてその抗原結合部分を任意に含む分子も含む。「抗体」という用語は、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単一ドメイン抗体（例えば、ｄＡｂ）、一本鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）および抗原に結合する抗体フラグメント（例えば、Fab、Fab 'および（Fab）2フラグメント）を含むがこれらに限定されない、モノクローナル抗体、抗体フラグメントまたは抗体誘導体を含む。「抗体」という用語は、また、原核細胞で発現される抗体、非グリコシル化抗体、ならびに本出願に記載される任意の抗原に結合する抗体フラグメントおよびその誘導体などの抗体のすべての組換え形態を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（VH）および重鎖定常領域から構成することができる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（VL）と軽鎖定常領域から構成することができる。VHおよびVL領域は、相補性決定領域（CDR）と呼ばれる超可変領域にさらに分割でき、これらは、フレームワーク領域（FR）と呼ばれるより保守された領域に散在している。各VHおよびVLは、3つのCDRと4つのFR領域から構成されていてもよく、これらのFR領域は、アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4の順に配置されていてもよい。重鎖と軽鎖の可変領域には、抗原と相互作用する結合ドメインが含まれている。
本出願では、「一本鎖抗体（scFv）」という用語は、抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域によって形成される抗体、またはリンカー（linker）によって接続された抗体を含み得る。
本出願では、「膜貫通ドメイン」という用語は、通常、細胞膜を通過するCAR内のドメインを指し、細胞内シグナル伝達ドメインに接続され、シグナル伝達の役割を果たす。
本出願では、「共刺激ドメイン」という用語は、通常、抗原に対するリンパ球の効果的な応答に必要な細胞表面分子である免疫共刺激分子を提供することができる細胞内ドメインを指す。
本出願では、「ヒンジ領域」という用語は、通常、抗原結合ドメインと膜貫通領域との間の接続領域を指す。
本出願では、「シグナル伝達ドメイン」という用語は、通常、細胞内でシグナルを伝達するドメインを指す。本出願では、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、シグナルを細胞内に伝達することができる。通常，シグナル伝達ドメインは、タンパク質ターゲティングを指示するために使用される任意の連続アミノ酸配列である。例えば、前記細胞内シグナル伝達ドメインは前記キメラ抗原受容体の細胞内シグナル伝達ドメインである。
本出願では、「免疫エフェクター細胞」という用語は、通常、免疫応答に関与し、エフェクター機能を行使する免疫細胞を指す。例えば、エフェクター機能の行使は、異物抗原の除去、免疫エフェクター応答の促進を含む。いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞は、標的細胞の表面上の抗原によって刺激され、免疫応答を生成することができる。例えばサイトカインを分泌するなど免疫細胞の例には、血漿細胞、T細胞、B細胞、ナチュラルキラー（NK）細胞、ナチュラルキラーT（NKT）細胞、肥満細胞、顆粒球、単球、リンパ球、樹状細胞、およびマクロファージが含まれますが、これらに限定されない。この用語はまた、細胞の全遺伝物質にＤＮＡまたはＲＮＡの形態の外因性遺伝物質を加えることによって遺伝子に改変された免疫細胞など、エンジニアリングされた免疫細胞を含む。
本出願では、「T細胞受容体（TCR）」という用語は、通常、是指T細胞表面の特異的受容体を指す。前記T細胞受容体はヘテロダイマーであり、2つの異なるサブユニットで構成されることができる。ほとんどのT細胞受容体（例えば、95％以上、96％以上、97％以上など）は、αサブユニットとβサブユニットで構成されており、各ペプチド鎖は可変領域（V領域） 、定常領域（C領域）、膜貫通領域および細胞質領域の部分に分けられる。本出願では、「ポリペプチド」、「ペプチド」、「タンパク」および「タンパク質」という用語は同一意味で使用され、通常、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。当該ポリマーは直鎖または分鎖のものであり、改変されたアミノ酸を含み、そしてそれは非アミノ酸によって中断されることができる。これらの用語には改変されたアミノ酸ポリマーも対象としている。これらの改変には、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質化（Iipidation）、アセチル化、リン酸化、またはその他の操作（標識成分への結合など）が含まれる場合がある。「アミノ酸」という用語は、グリシン、ＤおよびＬ光学異性体、ならびにアミノ酸類似体およびペプチド模倣物を含む、天然および／または非天然または合成アミノ酸を含む。
本出願では、「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」および「オリゴヌクレオチド」という用語は同一意味で使用され、通常、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、またはそれらの類似体などの任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有することができ、既知または未知の任意の機能を実行することができる。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子断片のコード領域または非コード領域、連鎖分析によって定義される複数の遺伝子座（1つの遺伝子座）、エキソン、イントロン、メッセンジャーRNA（mRNA）、トランスファーRNA、リボソームRNA、短い干渉RNA（siRNA）、ショートヘアピンRNA（shRNA）、micro-RNA（miRNA）、リボザイム、cDNA、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたDNA、任意の配列の単離されたRNA、核酸プローブ、およびプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体などの1つまたは複数の改変されたヌクレオチドを含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造の改変は、ポリマーの組み立ての前または後に実施することができる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断されることができる。ポリヌクレオチドは、標識された成分との結合などによって、重合後にさらに改変することができる。
本出願では、前記「ベクター」は、一般的に、挿入された核酸分子を宿主細胞内および／または宿主細胞間に移すために、適切な宿主内で自己複製することができる核酸分子を指す。前記ベクターは主にDNAまたはRNAを細胞に挿入するために使用されるベクター、主にDNAまたはRNAを複製するために使用されるベクター、および主にDNAまたはRNAの転写および／または翻訳の発現に使用されるベクターが含まれていてもよい。前記ベクターはまた、前記の様々な機能を有するベクターを含む。前記ベクターは、適切な宿主細胞に導入されたときに、ポリペプチドに転写または翻訳されるポリヌクレオチドである場合もある。通常、前記ベクターを含む適切な宿主細胞を培養することにより、前記ベクターは、所望の発現産物を産生することができる。
本出願では、「レンチウイルスベクター」という用語は、通常、RNAウイルスベクターを指す。レンチウイルスベクターはレンチウイルスのゲノムを元に、生物学的に安全にするためにウイルス活性に関連する複数の配列構造を削除することにより生物学的な安全性をもたせ、実験に必要な標的遺伝子の配列および発現構造をこのゲノム骨格に導入し、ベクトルに調製する。レンチウイルスベクタートランスフェクションにより、自身のゲノムとそれが運ぶ外来遺伝子をランダムかつ安定して宿主細胞のゲノムに組み込むことができる。たとえば、CAR分子を宿主細胞に組み込むことができる。
本出願では、「治療」という用語は、通常、１つまたは複数の治療法（例えば、本出願の核酸分子および/または免疫エフェクター細胞などの１つまたは複数の治療薬）により、増殖性障害の進行、重症度および/または持続時間を遅らせるまたは改善することや、増殖性障害の１つまたは複数の症状（例えば、１つまたは複数の識別可能な症状）を改善することを指す。本出願では、「治療」という用語は、また、患者によって識別可能である必要のない、腫瘍増殖などの増殖性障害の少なくとも１つの測定可能な物理的パラメータを改善することを指すこともできる。本出願では、「治療」という用語はまた、例えば、識別可能な症状を安定化することによって物理的な方法、物理的パラメータを安定化することによって生理学的な方法、またはその両方によって、増殖性障害の進行を阻害することを指すこともできる。いくつかの実施形態では、「治療」という用語は腫瘍サイズまたは癌細胞数を減少または安定化することを指すことができる。
本出願では、「および/または」という用語は、選択肢のいずれか1つまたは選択肢の2つを意味すると理解されるべきである。
本出願では、「含む」という用語は、通常、明確に指定された特徴を含むが、他の要素を排除しないことを指す。
本出願では、「約」という用語は、通常、指定された数値以上または以下の0.5%-10%範囲内で変動することを指す。例えば、指定数値以上または以下の0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%、6%、6.5%、7%、7.5%、8%、8.5%、9%、9.5%、または10%範囲内で変動する。
本出願で解決しようとする技術的問題はCAR-T（またはTCR-T）細胞がリンパ節に長期間存在し、標的細胞と接触することなく、治療効果に影響を与えるという先行技術の欠陥に対処することにより、腫瘍抗原認識受容体を含む免疫細胞とその応用を提供する。本出願では、S1PR1を過剰発現した腫瘍抗原認識受容体を含む免疫細胞（CAR/TCR-T細胞など）は、リンパ節から転出する能力が高く、治療部位に到達して機能するのが容易で、且つ免疫細胞が強い生存性を持っている。
本出願の発明者は腫瘍抗原認識受容体を含む免疫細胞（メモリーCAR-T細胞など）において創造的に同時に過剰発現することにより、CAR-T細胞のメモリーを保留する同時に、CAR-T細胞が長時間リンパ節に残り、標的細胞と接触できないことを避け、リンパ節から転出し、治療部位への到達が容易になる。さらに意外なことに、CARとS1PR1のタンパク質を接続すると、S1PR1の過剰発現はCAR-T細胞の生存性を高めることができる。先行技術に比べ、本出願の技術案はCAR-T細胞メモリーの形成および後続機能を効果的に高め、その抗腫瘍效果を強化することができる。
本出願は、主に下記の技術案で前記の技術的問題を解決する。
本出願は腫瘍抗原認識受容体を含む、S1PR1を過剰発現する免疫細胞を提供する。
前記の腫瘍抗原認識受容体は本分野におけるキメラ抗原受容体（CAR）またはT細胞受容体（TCR）の通常の腫瘍抗原認識受容体であってもよい。
前記のCARは、本分野における従来のCARであり得る。例えば、それは、細胞内領域、ヒンジ領域、および膜貫通領域を含むことができ、含まれる細胞内領域、ヒンジ領域、および膜貫通領域は、すべて本分野において従来のものであってもよい。本出願で使用される細胞内ドメインの例には、表面受容体の細胞質部分、共刺激分子、およびT細胞におけるシグナル伝達を開始するために協調して作用する任意の分子、ならびにこれらの要素の任意の誘導体または変異体、および同じ機能を備えた合成配列を含むが、これらに限定されない。
本出願に記載の例えば、TCR、CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD86、通常のFcRγ、FcRβ（FcεR1b）、CD79a、CD79b、FcγRIIa、DAP10、DAP12、T細胞受容体（TCR）、CD8、CD27、CD28、4-1BB（CD137）、OX9、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、KIRファミリータンパク質、リンパ球機能関連抗原-1（LFA-1）、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83と特異的に結合するリガンド、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM（LIGHTR）、SLAMF7、NKp80（KLRF1）、CD127、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1（CD226）、SLAMF4（CD244、2B4）、CD84、CD96（Tactile）、CEACAM1、CRTAM、Ly9（CD229）、CD160（BY55）、PSGL1、CD100（SEMA4D）、CD69、SLAMF6（NTB-A、Ly108）、SLAM（SLAMF1、CD150、IPO-3）、BLAME（SLAMF8）、SELPLG（CD162）、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D、Toll様受容体1（TLR1）、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、その他共刺激分子のフラグメントまたはドメイン由来の細胞内ドメインは、本出願に記載の任意の抗原結合ドメイン、本出願に記載の任意の膜貫通ドメイン、またはCARに含まれた本出願に記載の任意のその他の、例えば、CD3ζ、CD28、4-1BB、OX40、SLAMF4、CD127、NKG2D、ICOS及びFcγRIIIa由来のいずれか一つまたは複数のドメインと組み合せることができる。
例えば、前記のCARの細胞内領域はヒトの4-1BB細胞内領域および/またはヒトのCD28細胞内領域、およびヒトのCD3ζ細胞内領域を含み得る。例えば、前記のCARの細胞内領域は前記のヒトの4-1BB細胞内領域、ヒトのCD28細胞内領域およびヒトのCD3ζ細胞内領域を含み得る。
前記のCARの認識する抗原は本分野の通常の例えばEpCAM、Mesothelin、CEA、IL13、PDPN、VEGF、EGFR、EGFRvIII、PSMA、FAP、CD171、GD2、Glypican-2、Glypican-3、HER2、HPV抗原、cyclin D1、p53、MMP-7、IL13Ralpha2、MMP-2、MUC-1、G250、L1CAM、ROR1、GPC3またはMSLN等の抗原にすることができ、いくつかの実施形態では、本出願に記載のCARの認識する抗原はGPC3、mesothelin、EGFRVIII、IL13Ra2、GPCまたはCEAから選ばれることができる。例えば、前記GPC3に耐性のあるCAR遺伝子は配列表のSEQ ID NO: 3に示すヌクレオチド配列を含み得る。
ここで、前記のS1PR1タンパク質はNCBIアクセッション番号NP_001391に示すアミノ酸配列、前記のS1PR1遺伝子は、NCBIアクセッション番号NM_001400の配列に示すヌクレオチド配列を含み得る。
前記の免疫細胞では、前記のS1PR1の遺伝子と前記のCARまたはTCRが同じ発現ベクターに位置することができ、それぞれ異なる発現ベクターに位置することもできる。
前記のS1PR1遺伝子が前記のCARまたはTCRが同じベクターに位置する場合、前記の発現ベクターはそれぞれS1PR1をコードするベヌクレオチド配列、IRESとCARをコードするベヌクレオチド配列を含み、または順次S1PR1をコードするベヌクレオチド配列、IRESとTCRをコードするベヌクレオチド配列を含み、または順次S1PR1をコードするベヌクレオチド配列、2AとCARをコードするベヌクレオチド配列を含み、または順次S1PR1をコードするベヌクレオチド配列、2AとTCRをコードするベヌクレオチド配列を含み、または順次CARをコードするベヌクレオチド配列、IRESとS1PR1をコードするベヌクレオチド配列を含み、または順次TCRをコードするベヌクレオチド配列、IRESとS1PR1をコードするベヌクレオチド配列を含み、または順次CARをコードするベヌクレオチド配列、2AとS1PR1をコードするベヌクレオチド配列を含み、または順次TCRをコードするベヌクレオチド配列、2AとS1PR1をコードするベヌクレオチド配列を含み得る。ここで、前記IRESのベヌクレオチド配列は配列表のSEQ ID NO: 13に示され、前記2Aのベヌクレオチド配列が配列表のSEQ ID NO: 14に示すことができる。
本出願に記載されている免疫細胞は、T細胞であってもよく、例えば、メモリーT細胞であってもよい。
本出願は、前記の免疫細胞の腫瘍治療薬調製での応用を提供する。前記の腫瘍は膵臓癌、神経膠腫、肝臓癌または結腸癌を含み得る。
本出願はまた、前記の免疫細胞を含む医薬組成物を提供する。
本出願はまたS1PR1の腫瘍抗原認識受容体を含む免疫細胞調製での応用を提供する。例えば、前記の腫瘍抗原認識受容体はキメラ抗原受容体またはT細胞受容体であってもよい。
上記の条件は、本願の各実施例を得るために、当業者の常識に合致した任意の方法で組み合わせることができる。
本出願で使われる試薬および原料は市販品から入手できる。
本出願の積極的で進歩した效果は下記の通りである。
本出願ではS1PR1を過剰発現した腫瘍抗原認識受容体を含む免疫細胞（CAR/TCR-T細胞など）は、リンパ節から転出する能力が高く、治療部位に到達して機能するのが容易で、且つ免疫細胞が強い生存性を融資、且つ、腫瘍抗原認識受容体を含む免疫細胞のinvivoおよびinvitro生存力（CAR-T細胞など）を高めることができる。また、CAR-T細胞メモリーの形成および後続機能を効果的に高め、その抗腫瘍效果を強化することができる。
S1PR1
さらに、本出願は前記改変されていない免疫エフェクター細胞に比べ、S1PR1タンパク質の発現および/または活性はアップレギュレートされる改変された免疫エフェクター細胞も提供する。いくつかの実施形態では、前記改変されていない免疫エフェクター細胞はS1PR1タンパク質を発現しないことができる。いくつかの実施形態では、前記改変されていない免疫エフェクター細胞は低含有量のS1PR1タンパク質を発現することができ、S1PR1の機能的効果を発揮することさえできない。例えば、前記改変されていない免疫エフェクター細胞に比べ、前記改変された免疫エフェクター細胞のS1PR1タンパク質発現はアップレギュレートされ、S1PR1シグナル経路関連タンパク質の発現がアップレギュレートされる。タンパク質定量法は、BCA定量化、ブラッドフォード定量化、ローリー検出、分光光度法などのタンパク定量法で細胞のタンパク質発現レベルを検出することができる。例えば、前記改変されていない免疫エフェクター細胞に比べ、前記改変された免疫エフェクター細胞のS1PR1タンパク質活性が高められる。具体的に、前記改変された免疫エフェクター細胞のS1Pに対する親和性が増加し、S1PR1シグナル経路の活性がアップレギュレートされ、免疫エフェクター機能が強化される。
さらに、本出願は前記改変されていない免疫エフェクター細胞に比べ、S1PR1タンパク質の発現および/または活性はアップレギュレートされる改変された免疫エフェクター細胞も提供する。いくつかの実施形態では、前記改変されていない免疫エフェクター細胞はS1PR1タンパク質を発現しないことができる。いくつかの実施形態では、前記改変されていない免疫エフェクター細胞は低含有量のS1PR1タンパク質を発現することができ、S1PR1の機能的効果を発揮することさえできない。例えば、前記改変されていない免疫エフェクター細胞に比べ、前記改変された免疫エフェクター細胞のS1PR1タンパク質発現はアップレギュレートされ、S1PR1シグナル経路関連タンパク質の発現がアップレギュレートされる。タンパク質定量法は、BCA定量化、ブラッドフォード定量化、ローリー検出、分光光度法などのタンパク定量法で細胞のタンパク質発現レベルを検出することができる。例えば、前記改変されていない免疫エフェクター細胞に比べ、前記改変された免疫エフェクター細胞のS1PR1タンパク質活性が高められる。具体的に、前記改変された免疫エフェクター細胞のS1Pに対する親和性が増加し、S1PR1シグナル経路の活性がアップレギュレートされ、免疫エフェクター機能が強化される。
例えば、前記免疫エフェクター細胞に試薬を投与することにより、S1PR1タンパク質の発現および/または活性をアップレギュレートすることができる。前記試薬は高分子（DNA、RNA、ポリペプチドまたはタンパク質など）、ウイルス、プラスミド、有機または無機小分子、または前記の組合せであってもよい。
いくつかの実施形態では、前記改変された免疫エフェクター細胞はさらにS1PR1タンパク質を含み得る。前記免疫エフェクター細胞は改変前にS1PR1タンパク質を含まない可能性があるが、改変された後、前記改変された免疫エフェクター細胞からS1PR1タンパク質の発現を検出することができる。いくつかの実施形態では、前記改変された免疫エフェクター細胞において、前記S1PR1はタンパク質レベルで直接過剰発現する可能性がある。例えば、S1PR1タンパク質をS1PR1を発現しない免疫エフェクター細胞に導入し、S1PR1タンパク質を発現させることができる。例えば、S1PR1タンパク質をS1PR1発現量の低い免疫エフェクター細胞に導入し、S1PR1タンパク質の発現を増加させることができる。例えば、S1PR1遺伝子をS1PR1を発現しない免疫エフェクター細胞に導入し、S1PR1タンパク質を発現させることができる。例えば、S1PR1遺伝子をS1PR1発現量の低い免疫エフェクター細胞に導入し、S1PR1タンパク質の発現を増加させることができる。
本出願では、前記改変されていない免疫エフェクター細胞に比べ、前記改変された免疫エフェクター細胞においてS1PR1タンパク質をコードする核酸分子の発現および/または活性はアップレギュレートされる。いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞は改変前にS1PR1タンパク質をコードする核酸分子を含まないことができ、他の場合により、免疫エフェクタータンパク質は改変前にS1PR1タンパク質をコードする核酸分子を含むが発現しないことができ、他の場合により、免疫エフェクタータンパク質は改変前にS1PR1タンパク質をコードする核酸分子を含み得るが、発現量が低い。
いくつかの実施形態では、前記改変された免疫エフェクター細胞はさらに前記S1PR1タンパク質をコードする核酸分子を含む。例えば、S1PR1をコードする核酸分子を免疫エフェクター細胞（例えば、後述するようなベクターを介して）に導入することにより、前記改変された免疫細胞にさらに前記S1PR1タンパク質をコードする核酸分子を含むことができる。
例えば、前記免疫エフェクター細胞に試薬を投与することにより、前記試薬はS1PR1タンパク質をコードする核酸分子の翻訳または転写を強化させることができる。例えば、前記改変された免疫エフェクター細胞におけるS1PR1はDNAおよび/またはRNAで過剰発現することができる。例えば、前記試薬は高分子（DNA、RNA、ポリペプチドまたはタンパク質など）、ウイルス、プラスミド、有機または無機小分子、または前記の組合せであってもよい。
例えば、S1PR1遺伝子を免疫エフェクター細胞に導入することにより、前記免疫細胞にさらに前記S1PR1タンパク質をコードする核酸分子を含ませることができる。例えば、前記S1PR1遺伝子は完全長S1PR1タンパク質をコードする核酸分子、またはS1PR1コード領域を含む核酸分子であってもよい。例えば、S1PR1遺伝子をプラスミドまたはウイルスベクターに構築してから免疫細胞に導入する。
前記S1PR1タンパク質は完全長のS1PR1タンパク質、完全長S1PR1タンパク質の切り捨てられた形式、スプライスされた形態またはその機能フラグメントであってもよい。例えば、前記S1PR1タンパク質は完全長のヒトS1PR1タンパク質であり、完全長のヒトS1PR1タンパク質をコードする核酸分子はNCBIアクセッション番号NM_001400に示すベヌクレオチド配列を含み得る。
CAR
本出願では、本出願に記載の免疫細胞はキメラ抗原受容体（CAR）および/またはT細胞受容体（TCR）を含み得る。
本出願では、本出願に記載の免疫細胞はキメラ抗原受容体（CAR）および/またはT細胞受容体（TCR）を含み得る。
本出願では、前記CARは腫瘍特異的抗原を標的とするキメラ抗原受容体を含み、前記腫瘍特異的抗原が下記のEpCAM、Mesothelin（MSLN）、CEA、IL13、PDPN、VEGF、EGFR、EGFRvIII、PSMA、FAP、CD171、GD2、Glypican-2、Glypican-3、HER2、HPV抗原、cyclin D1、p53、MMP-7、IL13Ralpha2、MMP-2、MUC-1、G250、L1CAM、ROR1およびGPC3群からなる群より選択される。
いくつかの実施形態では、前記CARは抗原結合ドメインを含み得る。前記抗原結合ドメインは腫瘍抗原と特異的に結合することができ、ここで、前記腫瘍特異的抗原は下記のEpCAM、Mesothelin（MSLN）、CEA、IL13、PDPN、VEGF、EGFR、EGFRvIII、PSMA、FAP、CD171、GD2、Glypican-2、Glypican-3、HER2、HPV抗原、cyclin D1、p53、MMP-7、IL13Ralpha2、MMP-2、MUC-1、G250、L1CAM、ROR1およびGPC3からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは一本鎖抗体scFvを含み得る。例えば、前記一本鎖抗体はGPC3を標的とする一本鎖抗体GC33を含み得る。例えば、前記一本鎖抗体はSEQ ID NO: 1に示すアミノ酸配列を含み得る。例えば、前記一本鎖抗体はMSLNを標的とする一本鎖抗体P4G2を含み得る。例えば、前記一本鎖抗体はSEQ ID NO: 2に示すアミノ酸配列を含み得る。
本出願では、前記CARは膜貫通ドメインを含み得る。いくつかの実施形態では、前記膜貫通ドメインは下記のCD3ζ、CD28、4-1BB、OX40、SLAMF4、CD127、NKG2D、ICOS和FcγRIIIaからタンパク質由来の膜貫通ドメインを含み得る。
本出願では、前記CARは共刺激ドメインを含み得る。いくつかの実施形態では、前記共刺激ドメインは下記CD137、CD28、OX40、ICOS、DAP10、2B4、CD27、CD30、CD40、CD40L、TIM1、CD226、DR3、SLAM、NKG2D、CD244、FceRIγ、BTLA、GITR、HVEM、CD2、NKG2C、LIGHTのDAP12のタンパク質から選ばれる共刺激ドメインまたはその組合せを含む。
本出願では、前記CARはヒンジ領域を含み、前記ヒンジ領域は前記抗原結合ドメインと前記膜貫通ドメインを接続することができる。いくつかの実施形態では、前記ヒンジ領域は下記CD8、CD28、IgG、4-1BB、CD4、CD27、CD7、PD-1和CH2CH3から選ばれるタンパク質由来のヒンジ領域を含み得る。
本出願では、前記CARは抗原結合ドメイン、ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、共刺激ドメインおよび/またはシグナル伝達ドメインを含み得る。例えば、前記CARはSEQ ID NO: 5-6のいずれか１つに示すアミノ酸配列を含む。
本出願に記載の前記改変された免疫細胞は前記CARを含み得る。例えば、前記CARはSEQ ID NO：5-6のいずれか一つに記載のアミノ酸配列を含み得る。
本出願に記載の改変された免疫細胞は前記CARをコードする核酸分子を含み得る。例えば、前記CARをコードする核酸分子はSEQ ID NO: 3-4のいずれか１つに示すヌクレオチド配列を含み得る。
免疫エフェクター細胞および細胞集団
本出願では、前記改変された免疫エフェクター細胞はベクターを含み、前記ベクターは前記1PR1タンパク質をコードする核酸分子を含み得る。本出願では、前記改変された免疫エフェクター細胞はベクターを含み、前記ベクターは前記キメラ抗原受容体をコードする核酸分子を含み得る。いくつかの実施形態では、前記キメラ抗原受容体をコードする核酸分子と前記S1PR1タンパク質をコードする核酸分子は同一ベクターに位置することができる。また、特定の実施形態では、前記キメラ抗原受容体をコードする核酸分子と前記S1PR1タンパク質をコードする核酸分子は異なるベクターに位置することができる。
本出願では、前記改変された免疫エフェクター細胞はベクターを含み、前記ベクターは前記1PR1タンパク質をコードする核酸分子を含み得る。本出願では、前記改変された免疫エフェクター細胞はベクターを含み、前記ベクターは前記キメラ抗原受容体をコードする核酸分子を含み得る。いくつかの実施形態では、前記キメラ抗原受容体をコードする核酸分子と前記S1PR1タンパク質をコードする核酸分子は同一ベクターに位置することができる。また、特定の実施形態では、前記キメラ抗原受容体をコードする核酸分子と前記S1PR1タンパク質をコードする核酸分子は異なるベクターに位置することができる。
前記キメラ抗原受容体をコードする核酸分子と前記S1PR1タンパク質をコードする核酸分子が同一ベクターに位置する場合、場合により、前記キメラ抗原受容体をコードする核酸分子は前記S1PR1タンパク質をコードする核酸分子の5’末端に位置し、または前記キメラ抗原受容体をコードする核酸分子は前記S1PR1タンパク質をコードする核酸分子の3’末端に位置することができる。
前記キメラ抗原受容体をコードする核酸分子と前記S1PR1タンパク質をコードする核酸分子の間は任意の可能なリンカー（例えば、IRESまたは2Aなどの切断されたペプチド）で接続することができる。例えば、前記RESのベヌクレオチド配列は配列表のSEQ ID NO: 13に示され、前記2Aのベヌクレオチド配列が配列表のSEQ ID NO: 14に示すことができる。
例えば、前記のベクターは5’末端から3’末端へと順次前記S1PR1タンパク質をコードする核酸分子、リンカーおよび前記キメラ抗原受容体をコードする核酸分子を含み得る。例えば、前記のベクターは5’末端から3’末端へとそれぞれ前記キメラ抗原受容体をコードする核酸分子、リンカーおよび前記S1PR1タンパク質をコードする核酸分子を含み得る。例えば、前記ベクターはSEQ ID NO: 7～9のいずれか1項に示すアミノ酸配列を含む。
本出願に記載の改変された免疫エフェクター細胞は異なるリンカータイプおよび異なる接続順序を含む場合を含み、かつ、本出願に記載の有用な効果を有する。改変された免疫エフェクター細胞のベクターにおいて、前記S1PR1タンパク質をコードする核酸分子が前記抗原キメラ受容体のN末端およびC末端に接続する場合、または異なるタイプのリンカーで接続する場合、前記改変された免疫エフェクター細胞はinvivoまたはinvitroで全て抗腫瘍効果を有する。例えば、invitro殺傷実験では、前記改変された免疫エフェクター細胞は標的細胞を殺傷することができ、サイトカインの分泌能および遊走能を強化することができる。例えば、invitro実験では、前記改変された免疫エフェクター細胞は腫瘍増殖を阻害し、リンパ節から転出する効果が強化される。
前記免疫エフェクター細胞はT細胞、B細胞、ナチュラルキラー（NK）細胞、マクロファージ、NKT細胞、単球、樹状細胞、顆粒球、リンパ球、白血球および/または末梢血単核細胞を含み得る。いくつかの実施形態では、前記免疫細胞はTリンパ球を含み得る。前記Tリンパ球は括胸腺細胞、天然Tリンパ球、未成熟Tリンパ球、成熟Tリンパ球、休止Tリンパ球または活性化Tリンパ球を含み得る。前記T細胞は、ヘルパーT細胞1（Th1）、ヘルパーT細胞2（Th2）などのヘルパーT細胞（Th）であってもよい。前記Tリンパ球はCD4+ヘルパーT細胞（HTL；CD4+T細胞）、細胞傷害性T細胞（CTL；CD8+T細胞）、腫瘍浸潤性細胞傷害性T細胞（TIL；CD8+T細胞）、CD4+/CD8+T細胞、CD4-/CD8-T細胞またはその他任意Tリンパ球サブタイプであってもよい。前記Tリンパ球は、メモリーT細胞，セントラルメモリーT細胞（TCM細胞）、エフェクターメモリーT細胞（TEM細胞）、組織常在メモリーT細胞（TRM）、仮想メモリーT細胞（TVM細胞）、幹メモリーT細胞（TSCM細胞）その他のCD4+またはCD8 +であってもよい。通常は,、CD45ROを発現するが、CD45RAのメモリーT細胞を欠いている場合もある。
さらに、本出願は本出願に記載の免疫エフェクター細胞を含む細胞集団を提供する。いくつかの実施形態では、細胞集団における前記免疫エフェクター細胞が20%以上（例えば、20%以上、25%以上、30%以上、35%以上、40%以上、45%以上、50%以上、55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上またはそれ以上）に達した場合、前記細胞集団は腫瘍部位（例えば、腫瘍組織Naibu ）に移動する能力を持つことができる。例えば、invivo実験では、マウスに前記細胞集団を注射した場合、S1PR1を発現しないCAR T細胞集団に比べ、本出願に記載の細胞集団の群から検出する末梢血におけるT細胞癌流量が増加した。例えば、invitro実験では、S1PR1を発現するCAR T細胞は下部チャンバーに転移することができる。また、例えば、invivo実験では、マウスに前記細胞集団を注射し、末梢血におけるT細胞含有量を測定すると、S1PR1を発言するCAR T細胞集団におけるT細胞は末梢血及び腫瘍組織内部に分布する傾向があり、S1PR1を発現しないCAR T細胞集団におけるT細胞は末梢血、リンパ節及び腫瘍組織内部に分布する傾向があると示唆された。
医薬組成物、方法、用途およびベクター
さらに、本出願は医薬組成物を提供する。前記医薬組成物は本出願の免疫エフェクター細胞および/または本出願の細胞集団、および任意に選ばれる薬学的に許容されるベクターを含み得る。本出願では、「薬学的に許容されるベクター」という用語は、通常、本出願の免疫細胞および／または細胞集団の投与と適合性のあるすべての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤、抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤を指す。本出願の免疫エフェクター細胞および/または本出願に記載の細胞集団と適合性がないかぎり、任意の通常媒体または試薬は本出願の医薬組成物に用いることが考えられる。
さらに、本出願は医薬組成物を提供する。前記医薬組成物は本出願の免疫エフェクター細胞および/または本出願の細胞集団、および任意に選ばれる薬学的に許容されるベクターを含み得る。本出願では、「薬学的に許容されるベクター」という用語は、通常、本出願の免疫細胞および／または細胞集団の投与と適合性のあるすべての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤、抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤を指す。本出願の免疫エフェクター細胞および/または本出願に記載の細胞集団と適合性がないかぎり、任意の通常媒体または試薬は本出願の医薬組成物に用いることが考えられる。
場合により、本出願の前記方法は宿主細胞（例えば、免疫エフェクター細胞）にいずれか一つまたは複数のCARおよび/または前記CARを含むベクターを投与することを含み得る。場合により、本出願の前記方法はいずれか一つまたは複数のTARおよび/または前記TARを含むベクターを宿主細胞（例えば、免疫エフェクター細胞）に投与することを含み得る。いくつかの実施形態では、本出願の前記方法は前記S1PR1および/または前記S1PR1を含むベクターを宿主細胞（例えば、免疫エフェクター細胞）に投与することを含み得る。本出願に記載の方法は前記いずれか一つまたは複数の前記CARおよび/またはTCR、およびS1PR1を含むベクターを宿主細胞（例えば、免疫細胞）に伝達することを含み得る。場合により、本出願は前記方法で産生された細胞および前記細胞または前記細胞に産生された生物（動物、植物または真菌など）をさらに提供する。いくつかの実施形態では、S1PR1と接続するCARを細胞に伝達することができる。従来のウイルスおよび非ウイルスベースの遺伝子導入法で、哺乳動物細胞または標的組織に核酸配列を導入することができる。
さらに、本出願は前記の分離された核酸分子を含むベクターを提供する。
本出願では、前記ベクターは、プラスミド、レトロウイルスベクター、およびレンチウイルスベクターの1つまたは複数から選ぶことができる。例えば、本出願に記載のベクターは5’末端から順次下記のベヌクレオチド配列を含む：前記S1PR1をコードする遺伝子、前記IRESをコードする遺伝子、前記CARをコードする遺伝子。さらに、例えば、本出願に記載のベクターは5’末端から順次下記のベヌクレオチド配列を含む：前記S1PR1をコードする遺伝子、前記2Aをコードする遺伝子、前記CARをコードする遺伝子。さらに、例えば、本出願に記載のベクターは5’末端から順次下記のベヌクレオチド配列を含む：前記CARをコードする遺伝子、前記IRESをコードする遺伝子、前記S1PR1をコードする遺伝子。さらに、例えば、本出願に記載のベクターは5’末端から順次下記のベヌクレオチド配列を含む：前記CARをコードする遺伝子、前記2Aをコードする遺伝子、前記S1PR1をコードする遺伝子。また、前記ベクターは適切な宿主細胞において、適切な条件下で当該ベクターを選ぶマーカー遺伝子などの他の遺伝子を含み得る。また、前記ベクターはコード領域が適切な宿主において正しく発現されることを可能にする発現制御要素を含み得る。そのような制御要素は本分野の技術者に周知であり、例えば、それらは、プロモーター、リボソーム結合部位、エンハンサー、および遺伝子転写またはmRNA翻訳を調節する他の制御要素を含み得る。ある実施形態では、前記発現制御配列は、調整可能な要素である。前記発現制御配列の特定の構造は、種または細胞タイプの機能によって異なり得るが、通常、TATA、キャッピング配列、CAAT配列などの転写および翻訳開始に関与する5 '非転写配列と5'および3 '非翻訳配列を含む。例えば、5’非転写発現制御配列はプロモータ領域を含み得、プロモータ領域は転写制御のための核酸に機能的に接続するプロモータ配列を含み得る。本出願に記載の１つまたは複数の核酸分子は、発現制御要素に作動可能に連結することができる。
核酸の非ウイルス送達法は、リポフェクション、核トランスフェクション、マイクロインジェクション、遺伝子銃、ウイルス粒子、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオンまたは脂質核酸コンジュゲート、裸のDNA、人工ビリオン、およびDNA取り込みを増強する試薬が含む。RNAまたはDNAウイルスベースのシステムで核酸を送達することができる。たとえば、ウイルスを体内の特定の細胞に標的化して、ウイルスを細胞核に効果的にペイロード（payload）することができる。ウイルスベクターを患者に直接（invivo）に投与するか、または間接的な形態で投与することができ、例えば、ウイルスでをinvitroで細胞を処理し、次に処理された細胞を患者に投与する（エクスビボ）などの間接的な形態を採用することができる。従来のウイルスベースのシステムは、遺伝子導入に用いるレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、および単純ヘルペスウイルスベクターを含み得る。いくつかの実施形態では、レトロウイルス、レンチウイルス、およびアデノ随伴ウイルスを使用して、遺伝子を宿主ゲノムに移入し、挿入された遺伝子の長期発現を可能にすることができる。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞に形質導入または感染することができ、通常、より高いウイルス力価を生み出すレトロウイルスベクターです。レンチウイルスベクターは、長い末端反復配列5'LTRおよび短縮型3'LTR、RRE、rev応答エレメント（cPPT）、中央終結配列（CTS）および/または翻訳後調節エレメント（WPRE）を含み得る。前記分子はBamHIおよびXbaIで酵素切断することによりレンチウイルスベクター上に構築することができる。レトロウイルス遺伝子導入システムの選択は、標的組織に依存する。
本出願の方法は免疫エフェクター細胞に本出願に記載のベクターを導入することを含み得る。例えば、本出願に記載のベクターをT細胞、リンパ球、顆粒球および/または末梢血単核細胞などの前記免疫エフェクター細胞に導入することができる。ある実施形態では、各種または各細胞は本出願に記載の1種または1つのベクターを含み得る。ある実施形態では、各種または各細胞は本出願に記載の複数（例えば、2つ以上）または複数種類（例えば、2種類以上）のベクターを含み得る。例えば、本出願に記載のベクターを前記細胞に導入することができる。例えば、レトロウイルスベクターで免疫エフェクター細胞をトランスフェクトし、前記融合タンパク質をコードする核酸を有するウイルスゲノムを宿主ゲノムに組み込み、標的遺伝子の長期的かつ安定した発現を確保することができる。本出願では、本出願記載の前記融合タンパク質をコードする核酸を有するベクターを、エレクトロポレーション（Neon electrotransformer）、リポソーム法によるトランスフェクションなど、当業界で知られている方法で前記細胞に導入することができる。
さらに、本出願は前記の免疫エフェクター細胞、前記の細胞集団および/または前記の医薬組成物の医薬品調製における用途を提供し、前記医薬品は腫瘍の治療に用いる。いくつかの実施形態では、前記腫瘍は固形腫瘍を含み得る。例えば、前記腫瘍は膵臓癌、神経膠腫、肝臓癌および/または結腸癌を含み得る。
以下の実施例は、理論に限定されることを意図するものではなく、本出願の融合タンパク質、調製方法、用途等を説明するためにのみ使用され、本出願の範囲を限定するために使用されるものではない。
実施例１ レンチウイルスベクターの構築およびパッケージング
１．１ レンチウイルスベクターの構築
全遺伝子合成法による合成でS1PR1（S1PR1のNCBI GenBankにおけるアクセッション番号：NM_001400）、IRES（IRESのベヌクレオチド配列は配列如表のSEQ ID NO: 13に示す）、GFP遺伝子（GFPのベヌクレオチド配列は配列如表のSEQ ID NO: 15に示す）を順次直列接続し、S1PR1下流にBamHI酵素切断部位配列を加え、GFP遺伝子上流にXbaI酵素切断部位配列を加え、これをベクターpLVX-EF1α-IRES-Puro EcoRI/MluIの二つの酵素切断部位の間にクローン化し、構築により、S1PR1-IRES-GFP（ベヌクレオチド配列はSEQ ID NO: 10に示す）プラスミドを形成する。
１．１ レンチウイルスベクターの構築
全遺伝子合成法による合成でS1PR1（S1PR1のNCBI GenBankにおけるアクセッション番号：NM_001400）、IRES（IRESのベヌクレオチド配列は配列如表のSEQ ID NO: 13に示す）、GFP遺伝子（GFPのベヌクレオチド配列は配列如表のSEQ ID NO: 15に示す）を順次直列接続し、S1PR1下流にBamHI酵素切断部位配列を加え、GFP遺伝子上流にXbaI酵素切断部位配列を加え、これをベクターpLVX-EF1α-IRES-Puro EcoRI/MluIの二つの酵素切断部位の間にクローン化し、構築により、S1PR1-IRES-GFP（ベヌクレオチド配列はSEQ ID NO: 10に示す）プラスミドを形成する。
抗GPC3のCAR遺伝子GC33CARを全遺伝子で合成し、抗GPC3一本鎖抗体GC33（アミノ酸配列如SEQ ID NO: 1に示す）、CD8aヒンジ領域、CD8膜貫通領域、CD137（4-1BB）細胞内領域、CD3z細胞内領域を順次直列接続する。GC33CARのベヌクレオチド配列はSEQ ID NO: 3に示す。GC33CARでそれぞれS1PR1-IRES-GFPにおけるS1PR1とGFPを置換え、構築によりGC33CAR-IRES-GFP（ベヌクレオチド配列はSEQ ID NO: 11に示す）とS1PR1-IRES-GC33CAR（ベヌクレオチド配列はSEQ ID NO: 12に示す）プラスミドを形成する。
2A（ベヌクレオチド配列はSEQ ID NO: 14に示す）でS1PR1-IRES-GC33CARにおけるIRESを置換え、ベクターを挿入し、S1PR1-2A-GC33CAR（ベヌクレオチド配列はSEQ ID NO: 8に示す）プラスミドを得る。
S1PR1でGC33CAR-IRES-GFPにおけるGFPを置換え、ベクターを挿入し、GC33CAR-IRES-S1PR1（ベヌクレオチド配列はSEQ ID NO: 7に示す）プラスミドを得る。
GC33CAR遺伝子にベクターを挿入し、GC33CARプラスミドを得る。
抗MSLNのCAR遺伝子4G2CARを全遺伝子で合成し、抗MSLN一本鎖抗体P4G2（アミノ酸配列如SEQ ID NO: 2に示す）、CD8aヒンジ領域、CD8膜貫通領域、CD137（4-1BB）細胞内領域、CD3z細胞内領域を順次直列接続する。P4G2CARのベヌクレオチド配列はSEQ ID NO: 4に示す。P4G2CARでS1PR1-2A-GC33CARにおけるGC3CARを置き換え、S1PR1-2A-P4G2CAR（ベヌクレオチド配列はSEQ ID NO: 9に示す）プラスミドを得る。
P4G2遺伝子にベクターを挿入し、P4G2プラスミドを得る。
１．２ レンチウイルスのパッケージング
レンチウイルスのパッケージングは3つのプラスミドシステムを介して行う。
レンチウイルスのパッケージングは3つのプラスミドシステムを介して行う。
実施例２ ＣＡＲ発現検証
GC33CAR-IRES-GFP、S1PR1-IRES-GC33CAR、S1PR1-IRES-GFPレンチウイルスを使用して、活性化されたPBMC細胞（CD3とCD28を活性化する）に感染させ、CAR-T細胞を構築する。フローサイトメトリーを使用して、ウイルスに感染したCAR-T細胞のCAR陽性率を測定する。ここで、S1PR1-IRES-GFPをトランスフェクトした免疫T細胞はGFPで置き換え、CAR陽性率を測定する。結果は表1と図1に示す。測定した結果、GC33CAR-IRES-GFPを含むCAR-T細胞のCAR陽性率は56.68%（図1A）で、S1PR1-IRES-GFPをトランスフェクトした免疫T細胞（コントロール）の陽性率は50.93%（図1B）であるが、S1PR1-IRES- GC33CARを含むCAR-T細胞のCAR陽性率は30.24%（図1C）と最も低いことを示した。
GC33CAR-IRES-GFP、S1PR1-IRES-GC33CAR、S1PR1-IRES-GFPレンチウイルスを使用して、活性化されたPBMC細胞（CD3とCD28を活性化する）に感染させ、CAR-T細胞を構築する。フローサイトメトリーを使用して、ウイルスに感染したCAR-T細胞のCAR陽性率を測定する。ここで、S1PR1-IRES-GFPをトランスフェクトした免疫T細胞はGFPで置き換え、CAR陽性率を測定する。結果は表1と図1に示す。測定した結果、GC33CAR-IRES-GFPを含むCAR-T細胞のCAR陽性率は56.68%（図1A）で、S1PR1-IRES-GFPをトランスフェクトした免疫T細胞（コントロール）の陽性率は50.93%（図1B）であるが、S1PR1-IRES- GC33CARを含むCAR-T細胞のCAR陽性率は30.24%（図1C）と最も低いことを示した。
実施例３ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｓ１ＰＲ１移行機能の検証
トランスウェル実験を使用して、S1P（0、1、10、100、1000 nM）処理の勾配濃度下でのCAR-T細胞の遊走能力を検証した。S1PR1-IRES-GFPをトランスフェクトした200μlの免疫T細胞をGFP陽性率が70％（2.5×106の細胞）で3415 Transwellチャンバーの上部チャンバーに加え、培地は1640とする。500 μl濃度勾配のS1P，1.5%FBS +1640培地を下チャンパーに加える。インキュベーターで3h培養した後、フローサイトメトリーで下部チャンバーに移行した細胞GFPの陽性率を測定する。測定した結果、100 nM、1000 nMのS1P処理により、下チャンパーに移行したCAR-T細胞の割合が大幅に増加した。即ち、S1PR1を発現した免疫T細胞は細胞のS1Pの影響を受ける移行能力（図2と図3）を高められる。
トランスウェル実験を使用して、S1P（0、1、10、100、1000 nM）処理の勾配濃度下でのCAR-T細胞の遊走能力を検証した。S1PR1-IRES-GFPをトランスフェクトした200μlの免疫T細胞をGFP陽性率が70％（2.5×106の細胞）で3415 Transwellチャンバーの上部チャンバーに加え、培地は1640とする。500 μl濃度勾配のS1P，1.5%FBS +1640培地を下チャンパーに加える。インキュベーターで3h培養した後、フローサイトメトリーで下部チャンバーに移行した細胞GFPの陽性率を測定する。測定した結果、100 nM、1000 nMのS1P処理により、下チャンパーに移行したCAR-T細胞の割合が大幅に増加した。即ち、S1PR1を発現した免疫T細胞は細胞のS1Pの影響を受ける移行能力（図2と図3）を高められる。
1×106のGC33CARまたはGC33CAR-IRES-S1PR1をトランスフェクトした免疫T細胞を3415 Transwellチャンパーの上部チャンパーに取り、培地を1640とし、下部チャンパーに100nMを含むS1Pを500μlを加え、培地を1640とし、インキュベーターで3h培養する。S1Pを加えないものをコントロールとする。セルカウンターで下部チャンバー内の細胞量を計算する。移行能力%=下部チャンパーの細胞量/(1×106)×100%。計算した結果、S1PR1を発現したCAR T細胞は細胞の移行能力を高めることができ、且つ、S1P陽性でも移行効率が高いことを示した（図4）。
実施例４ 標的細胞に対する殺傷能力検証
４．１ S1PR1-IRES-GFP、GC33CAR-IRES-GFPとS1PR1-IRES-GC33CARに感染したT細胞の殺傷能力
T細胞殺傷実験でS1PR1-IRES-GFP、GC33CAR-IRES-GFPとS1PR1-IRES-GC33CARレンチウイルスに感染したT（またはCAR-T）細胞のルシフェラーゼタンパク質（Luc）を発現した標的細胞Huh7（中科院細セルバンクより購入）に対する殺傷能力を検証する。エフェクター細胞と標的細胞の割合は20:1、10:1、5:1、2.5:1、1.25:1および0.625:1である。DMEM（2%FBS）培地ブランクコントロール群、CAR-Tエフェクター細胞群、エフェクター細胞とHuh7標的細胞群を設定する。ここで、標的細胞はウェルあたり1×104の細胞、エフェクター細胞は実効目標比率で加え、標的細胞群（Huh7）及び最大分解率群（Huh7-max）はウェルあたり1×104の細胞をくわえる。37℃で4時間培養する。3.5時間処理し、Huh7-max群の各ウェルに20 μlのLysis Bufferを加える。さらに30分培養し、ウェルを300gで5分間遠心分離する。元ウェルの順序に従い、各ウェルから50 μlの上清を取り、COSTAR 3300ウェルプレートに加える。50μlの基質を加え、常温で30min反応させた後に50μl のSTOP Buffer（cytoTox 96 Non-radioactive Cytotoxicity kit，promega）を加え、装置にセットし、OD490の読み数を測定し、CAR-T細胞の標的細胞に対する殺傷効率を計算する[計算式：特異的殺傷%=（実験群-エフェクター細胞の自己放出-標的細胞の自己放出）/（標的細胞の最大放出-標的細胞の自己放出）×100%]。計算した結果、S1PR1-IRES-GC33CARを含む（またはトランスフェクトした）CAR-T細胞の標的細胞に対する殺傷能力が最も強く、その次はGC33CAR-IRES-GFPを含むCAR-T細胞で、S1PR1-IRES-GFPをトランスフェクトした免疫T細胞は標的細胞に有意な殺傷能力が示さなかった（図5）。
４．１ S1PR1-IRES-GFP、GC33CAR-IRES-GFPとS1PR1-IRES-GC33CARに感染したT細胞の殺傷能力
T細胞殺傷実験でS1PR1-IRES-GFP、GC33CAR-IRES-GFPとS1PR1-IRES-GC33CARレンチウイルスに感染したT（またはCAR-T）細胞のルシフェラーゼタンパク質（Luc）を発現した標的細胞Huh7（中科院細セルバンクより購入）に対する殺傷能力を検証する。エフェクター細胞と標的細胞の割合は20:1、10:1、5:1、2.5:1、1.25:1および0.625:1である。DMEM（2%FBS）培地ブランクコントロール群、CAR-Tエフェクター細胞群、エフェクター細胞とHuh7標的細胞群を設定する。ここで、標的細胞はウェルあたり1×104の細胞、エフェクター細胞は実効目標比率で加え、標的細胞群（Huh7）及び最大分解率群（Huh7-max）はウェルあたり1×104の細胞をくわえる。37℃で4時間培養する。3.5時間処理し、Huh7-max群の各ウェルに20 μlのLysis Bufferを加える。さらに30分培養し、ウェルを300gで5分間遠心分離する。元ウェルの順序に従い、各ウェルから50 μlの上清を取り、COSTAR 3300ウェルプレートに加える。50μlの基質を加え、常温で30min反応させた後に50μl のSTOP Buffer（cytoTox 96 Non-radioactive Cytotoxicity kit，promega）を加え、装置にセットし、OD490の読み数を測定し、CAR-T細胞の標的細胞に対する殺傷効率を計算する[計算式：特異的殺傷%=（実験群-エフェクター細胞の自己放出-標的細胞の自己放出）/（標的細胞の最大放出-標的細胞の自己放出）×100%]。計算した結果、S1PR1-IRES-GC33CARを含む（またはトランスフェクトした）CAR-T細胞の標的細胞に対する殺傷能力が最も強く、その次はGC33CAR-IRES-GFPを含むCAR-T細胞で、S1PR1-IRES-GFPをトランスフェクトした免疫T細胞は標的細胞に有意な殺傷能力が示さなかった（図5）。
４．２ GC33CAR-IRES-S1PR1、S1PR1-2A-GC33CARとGC33CARに感染したT細胞の殺傷能力
4.1の方法に従い、GC33CAR-IRES-S1PR1、S1PR1-2A-GC33CARとGC33CARレンチウイルスに感染したT（またはCAR-T）細胞の標的細胞Huh7-Lucに対する殺傷能力を検証した。GC33CARに感染したT細胞と野生型T細胞をコントロールとした。結果は図6に示された通りで、5’末端でS1PR1を発現したCARと3’末端でS1PR1を発現したCARのT細胞は標的細胞に対し、殺傷能力を有し、S1PR1とCARの間に異なる接続ペプチドを採用したT細胞は標的細胞に対し、全て殺傷能力を有する。
4.1の方法に従い、GC33CAR-IRES-S1PR1、S1PR1-2A-GC33CARとGC33CARレンチウイルスに感染したT（またはCAR-T）細胞の標的細胞Huh7-Lucに対する殺傷能力を検証した。GC33CARに感染したT細胞と野生型T細胞をコントロールとした。結果は図6に示された通りで、5’末端でS1PR1を発現したCARと3’末端でS1PR1を発現したCARのT細胞は標的細胞に対し、殺傷能力を有し、S1PR1とCARの間に異なる接続ペプチドを採用したT細胞は標的細胞に対し、全て殺傷能力を有する。
４．３ S1PR1-2A-P4G2CARに感染したT細胞の殺傷能力
4.1の方法に従い、S1PR1-2A-P4G2CARレンチウイルスに感染したT細胞の標的細胞Huh7-Lucに対する殺傷能力を検証した。P4G2CARに感染したT細胞をコントロールとした。結果は図7に示された通りで、S1PR1を発現したCAR T細胞は標的細胞に対し殺傷能力を有し、且つコントロールであるCAR T細胞より高かったことを示した。
4.1の方法に従い、S1PR1-2A-P4G2CARレンチウイルスに感染したT細胞の標的細胞Huh7-Lucに対する殺傷能力を検証した。P4G2CARに感染したT細胞をコントロールとした。結果は図7に示された通りで、S1PR1を発現したCAR T細胞は標的細胞に対し殺傷能力を有し、且つコントロールであるCAR T細胞より高かったことを示した。
実施例５ ｉｎ ｖｉｔｒｏサイトカイン分泌検証
P4G2、S1PR1-2A-P4G2CARレンチウイルスを試用して、活性化されたPBMC細胞（CD3とCD28を活性化する）に感染させ、CAR-T細胞を構築することにより、T細胞のin vitroサイトカイン分泌能力を検証した。
P4G2、S1PR1-2A-P4G2CARレンチウイルスを試用して、活性化されたPBMC細胞（CD3とCD28を活性化する）に感染させ、CAR-T細胞を構築することにより、T細胞のin vitroサイトカイン分泌能力を検証した。
簡単に言えば、まずMSLNを発現するCF-APC-1細胞CF-APC-1-MSLNを構築し、NCBIデータベースのアクセッション番号NM_005823からMSLNベヌクレオチド配列を入手し、MSLN-IRES-puroを合成する。MSLN-IRES-puroを過剰発現するレンチウイルスをパッケージングし、取得したレンチウイルス感染CF-APC-1細胞（中科院細セルバンク，TCHu112）を5ug/mlのプロマイシンで48時間スクリーニングした後、安定したトランスジェニック株が得られた。
CF-APC-1細胞（中科院セルバンク，TCHu112）、CF-APC-1-MSLN細胞、ヒト膵臓癌細胞PANC（中科院セルバンクより）、MSLNを発現するPANC細胞（中科院セルバンク，TCHu 98）を標的細胞とし、洗浄してから1×105細胞/mLでDMEM（2%FBSを含む）培地に懸濁し、各標的細胞を1×105細胞/ウェルで96ウェルプレートに加える。CAR-T細胞を洗浄し、1×105細胞/ウェルでDMEM（含2%FBS）培地に懸濁する。また、CARを発現しない野生型T細胞をコントロールとする。96ウェルプレートを37℃で24時間インキュベートする。次に、上清を回収し、ヒトTH1/TH2サイトカイン検出キット（BD CBA，Cat#551809）を使用して、IL-2およびIFN-γのフローサイトメトリーを実施した。
その結果、MSLNを発現する標的細胞の刺激により、P4G2CARだけを発現するT細胞に比べ、S1PR1-2A-P4G2CARを発現するT細胞がサイトカインIL-2（図8A）とIFN-γ（図8B）を分泌する能力は強化されたことを示した。
実施例６ ｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍抑制実験の検証
GC33CAR、GC33CAR-IRES- S1PR1レンチウイルスを使用して、活性化されたPBMC細胞（CD3とCD28を活性化する）に感染させ、CAR-T細胞を構築する。
GC33CAR、GC33CAR-IRES- S1PR1レンチウイルスを使用して、活性化されたPBMC細胞（CD3とCD28を活性化する）に感染させ、CAR-T細胞を構築する。
簡単に言えば、ルシフェラーゼを発現する自己構築標的腫瘍細胞を皮下注射によりNSGマウスに接種して腫瘍を形成し、前記の標的細胞の2×106を100μlのリン酸緩衝塩溶液に再懸濁し、皮下注射した。または、ルシフェラーゼを発現する自己構築標的腫瘍細胞を整脈注射によりNSGマウスに接種して腫瘍を形成し前記の標的細胞の2×106を100μlのリン酸緩衝塩溶液に再懸濁し、マウスの皮下に注射した。ノギスを使用して、3～4日ごとに腫瘍を測定する。
腫瘍の体積=長*幅*幅/ 2
腫瘍の体積=長*幅*幅/ 2
腫瘍形成の14日後、PBSで洗浄したCAR T細胞を無血清培地に再懸濁して細胞密度を1×107/mlに調整し、マウスに静脈内注射（i.v.）、200μl/マウス、または細胞密度を1×108/mlに調整し、腫瘍内注射（i.t.）、50μl/マウスでマウスに注射する。野生型T細胞をコントロールとする。注射後、3日ごとに腫瘍体積を測定する。腫瘍体積計算方法：腫瘍体積（mm3）= 0.5×腫瘍長径×腫瘍短径2。28日目にマウスの末梢血を採取し、フローサイトメトリーにより末梢血中のCD3+細胞含有量を検出した。
その結果、GC33CAR T細胞とGC33CAR-IRES-S1PR1 T細胞は全て腫瘍増殖を効果的に阻害できることを示した（図8）。図9A-9BはCAR T細胞が異なる注射経路で注射された後、マウスの腫瘍体積が減少したことを示した。
実施例７ ｉｎ ｖｉｖｏ Ｓ１ＰＲ１移行機能の検証
実施例６の方法に従って検証マウスモデルを確立し、グループ化する。腫瘍形成の14日後にそれぞれGC33CAR T細胞とGC33CAR-IRES-S1PR1 T細胞を注射する。28日目にマウスの末梢血を採取し、フローサイトメトリーにより末梢血中のCD3+細胞含有量を検出した。
実施例６の方法に従って検証マウスモデルを確立し、グループ化する。腫瘍形成の14日後にそれぞれGC33CAR T細胞とGC33CAR-IRES-S1PR1 T細胞を注射する。28日目にマウスの末梢血を採取し、フローサイトメトリーにより末梢血中のCD3+細胞含有量を検出した。
その結果、GC33CAR-IRES-S1PR1 T細胞が投与されたマウスの末梢血におけるT細胞含有量はGC33CAR T細胞投与群より高かった（図10）。S1PR1を発現したCAR T細胞は細胞の移行能力を高めることができることを示した。
実施例８ Ｓ１ＰＲ１とＣＡＲの相乗効果の検証
実施例７および８の方法に従って検証マウスモデルを確立し、腫瘍形成の14日後にCAR T細胞を注射する。そして3日ごとに腫瘍体積を測定し、且つ、末梢血を採取し、CD3+T細胞の含有量を検出した。
実施例７および８の方法に従って検証マウスモデルを確立し、腫瘍形成の14日後にCAR T細胞を注射する。そして3日ごとに腫瘍体積を測定し、且つ、末梢血を採取し、CD3+T細胞の含有量を検出した。
図11は、マウス腫瘍形成後の腫瘍体積の変化を示したもので、本出願に記載のCAR T細胞の注射後、腫瘍体積は減少した。GC33CAR-IRES-S1PR1 T細胞群では、末梢血中のCD3+T細胞含有量は腫瘍体積と負の相関があり（図12B）、これはGC33CAR-IRES-S1PR1T細胞の末梢血及腫瘍組織内部への分布がより多くなる傾向があることが示唆された。一方、GC33CAR T細胞には相関関係がなく（図12A）、GC33CAR T細胞が末梢血、リンパ節、腫瘍組織内部に分布する傾向があるためと考えられる。これらのデータは、S1PR1とCARがin vivoで抗腫瘍相乗効果を持っていることを示した。
Claims (30)
- 改変されていない免疫エフェクター細胞と比較して、S1PR1タンパク質の発現および／または活性がアップレギュレートされている、改変された免疫エフェクター細胞。
- T細胞、リンパ球、顆粒球および／または末梢血単核細胞を含む、請求項１に記載の免疫エフェクター細胞。
- 前記免疫エフェクター細胞がメモリーT細胞を含む、請求項１又は２に記載の免疫エフェクター細胞。
- 前記改変された免疫細胞において、S1PR1タンパク質をコードする核酸分子の発現および／または活性がアップレギュレートされている、請求項１～３のいずれか1項に記載の免疫エフェクター細胞。
- 前記改変された免疫細胞がS1PR1タンパク質をさらに含む、請求項１～４のいずれか1項に記載の免疫エフェクター細胞。
- 前記改変された免疫エフェクター細胞が、S1PR1タンパク質をコードする前記核酸分子をさらに含む、請求項１～５のいずれか1項に記載の免疫エフェクター細胞。
- 前記改変された免疫エフェクター細胞がベクターを含み、前記ベクターが前記S1PR1タンパク質をコードする核酸分子を含む、請求項１～６のいずれか1項に記載の免疫エフェクター細胞。
- 前記免疫エフェクター細胞が、キメラ抗原受容体CARおよび／またはT細胞受容体（TCR）を発現している、請求項１～７のいずれか1項に記載の免疫エフェクター細胞。
- 前記改変された免疫エフェクター細胞がベクターを含み、前記ベクターが前記キメラ抗原受容体をコードする核酸分子を含む、請求項１～８のいずれか1項に記載の免疫エフェクター細胞。
- キメラ抗原受容体をコードする前記核酸分子が、S1PR1タンパク質をコードする前記核酸分子と同じベクター内に配置されている、請求項９に記載の免疫エフェクター細胞。
- 前記キメラ抗原受容体をコードする核酸分子が、前記S1PR1タンパク質をコードする核酸分子5’末端に位置する、または、前記キメラ抗原受容体をコードする核酸分子が前記S1PR1タンパク質をコードする核酸分子の3’末端に位置することを特徴とする、請求項１０に記載の免疫エフェクター細胞。
- 前記キメラ抗原受容体が腫瘍特異的抗原を標的とするキメラ抗原受容体を含み、前記腫瘍特異的抗原が、EpCAM、Mesothelin（MSLN）、CEA、IL13、PDPN、VEGF、EGFR、EGFRvIII、PSMA、FAP、CD171、GD2、Glypican-2、Glypican-3、HER2、HPV抗原、cyclin D1、p53、MMP-7、IL13Ralpha2、MMP-2、MUC-1、G250、L1CAM、ROR1およびGPC3からなる群より選択される、請求項８～１１のいずれかの1項に記載の免疫エフェクター細胞。
- 前記キメラ抗原受容体が、腫瘍特異的抗原に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む、請求項８～１２のいずれか１項に記載の免疫エフェクター細胞。
- 前記抗原結合ドメインが一本鎖抗体を含む、請求項１３に記載の免疫エフェクター細胞。
- 前記抗原結合ドメインがGPC3またはMSLNを標的とする一本鎖抗体を含む、請求項１３又は１４に記載の免疫エフェクター細胞。
- 前記一本鎖抗体がSEQ ID NO: 1-2のいずれか１つに示すアミノ酸配列を含む、請求項１５に記載の免疫エフェクター細胞。
- 前記キメラ抗原受容体が膜貫通ドメインを含む、請求項８～１６のいずれか１項に記載の免疫エフェクター細胞。
- 前記膜貫通ドメインが下記CD3ζ、CD28、4-1BB、OX40、SLAMF4、CD127、NKG2D、ICOS和FcγRIIIaから選ばれるタンパク質由来の膜貫通ドメインを含む、請求項１７に記載の免疫エフェクター細胞。
- 前記キメラ抗原受容体が共刺激ドメインを含む、請求項８～１８のいずれか１項に記載の免疫エフェクター細胞。
- 前記共刺激ドメインが下記CD137、CD28、OX40、ICOS、DAP10、2B4、CD27、CD30、CD40、CD40L、TIM1、CD226、DR3、SLAM、NKG2D、CD244、FceRIγ、BTLA、GITR、HVEM、CD2、NKG2C、LIGHTおよびDAP12のタンパク質から選ばれる共刺激ドメインまたはその組合せを含む、請求項１９に記載の免疫エフェクター細胞。
- 前記キメラ抗原受容体がヒンジ領域を含み、前記ヒンジ領域が前記抗原結合ドメインと前記膜貫通ドメインを接続する、請求項８～２０のいずれか1項に記載の免疫エフェクター細胞。
- 前記ヒンジ領域が下記のタンパク質 CD8、CD28、IgG、4-1BB、CD4、CD27、CD7、PD-1およびCH2CH3から選ばれるタンパク質由来のヒンジ領域を含む、請求項２１に記載の免疫エフェクター細胞。
- 前記キメラ抗原受容体がSEQ ID NO: 5-6のいずれか１つに示すアミノ酸配列を含む、請求項８～２２に記載の免疫エフェクター細胞。
- 前記キメラ抗原受容体をコードする核酸分子を含む、請求項８～２３のいずれか１項に記載の免疫エフェクター細胞。
- 前記キメラ抗原受容体をコードする核酸分子および前記S1PR1タンパク質をコードする核酸分子のベクターがSEQ ID NO: 7～9のいずれか1項に示すアミノ酸配列を含む、請求項２４に記載の免疫エフェクター細胞。
- 請求項１～２５のいずれか１項に記載の免疫エフェクター細胞を含む細胞集団。
- 請求項１～２５のいずれか１項に記載の免疫エフェクター細胞および／または請求項２６に記載の細胞集団、および任意に選ばれる薬学的に許容されるベクターを含む医薬組成物。
- 請求項１～２５のいずれか１項に記載の免疫エフェクター細胞、請求項２６に記載の細胞集団および／または請求項２７に記載の医薬組成物の医薬品調製における用途、前記医薬品は腫瘍の治療に用いる。
- 前記腫瘍が固形腫瘍を含む、請求項２８に記載の用途。
- 前記腫瘍が、膵臓癌、神経膠腫、肝臓癌および／または結腸癌を含む、請求項２８又は２９に記載の用途。
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