CN112980886A - 一种能高效制备且应用安全的嵌合抗原受体t细胞及其制备方法与应用 - Google Patents

一种能高效制备且应用安全的嵌合抗原受体t细胞及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种能高效制备且应用安全的嵌合抗原受体T细胞及其制备方法与应用。本发明提供了一种慢病毒重组载体，其含有CAR结构编码序列和驱动所述CAR结构编码序列表达的启动子MND；所述启动子MND的核苷酸序列为序列1第2838‑3236位。本发明为了克服当前CAR T治疗过程中的转染效率低和产生细胞因子量大的缺点，通过改善启动子对CAR结构的启动，即用MND启动子启动CAR结构，制备出新的嵌合抗原受体，并制备表达该嵌合抗原受体的T细胞，该T细胞具有影响CAR分子在细胞表面表达较少的特性，与CD19阳性细胞结合时，有着使细胞杀伤作用较缓和的优点，如此可大大降低细胞因子风暴的发生，有效提高了安全性。

Description

一种能高效制备且应用安全的嵌合抗原受体T细胞及其制备 方法与应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种能高效制备且应用安全的嵌合抗原受体T细胞及其制备方法与应用。
背景技术
CAR-T疗法就是嵌合抗原受体T细胞免疫疗法，英文全称Chimeric AntigenReceptor T-Cell Immunotherapy。这是一种治疗肿瘤的新型精准靶向疗法，近几年通过优化改良在临床肿瘤治疗上取得很好的效果，是一种非常有前景的，能够精准、快速、高效，且有可能治愈癌症的新型肿瘤免疫治疗方法。
尽管CAR-T在临床效果上取得了巨大的成功，其商业化推广上仍有不小的问题：其一，价格昂贵，诺华的KymriahTM上市定价高达47.5万美元，支付方式可以创新，生产制备成本却因无法规模化而居高不下。影响生产成本的因素有很多，其中转染率低是很重要的一个原因，并且在通用性CAR-T中依然会面临转染效率低的问题，提高转染效率可以有效促进临床级别细胞生产的工艺开发，显著降低制备成本；其二，一些施用CAR-T细胞疗法的患者会发生危险且有时常常是危及生命的副作用，该副作用称为细胞因子释放综合征(CRS)或细胞因子风暴，其中输注的活化T细胞产生的细胞因子快速且大量释放到血流中的全身炎症反应，从而导致危险的低血压，高烧和寒战。在严重的CRS情况下，患者会发生生命危险。
针对CAR-T转染效率低制备成本高问题，目前常规解决办法是为采用合适的转染试剂、保持最佳的细胞状态或选择最佳的转染方法；但是这些改变转染效率还是低，制备成本还是高。
关于施用CAR-T细胞疗法的患者的细胞因子风暴副作用产生，目前研究发现，CAR-T细胞上CAR分子的数量会严重影响到对靶细胞的结合效率与活化效率；如果CAR分子表达效率低，可能导致CAR-T细胞不能有效活化，从而影响治疗效果；但是细胞表面的CAR分子密度过高，在治疗过程中反应强度激烈，会导致大量的细胞因子产生，提高细胞因子风暴(CRS)发生的风险。
因此，寻求一种可以高效低成本制备且在治疗同时可以降低细胞因子风暴的抗原受体T细胞是目前急需要解决的难题。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种慢病毒重组载体。
本发明提供的慢病毒重组载体，其含有CAR结构编码序列和驱动所述CAR结构编码序列表达的启动子MND；
所述启动子MND的核苷酸序列为序列1第2838-3236位；
所述CAR结构依次包括胞外结合结构域、一个或多个铰链结构域或间隔结构域、跨膜结构域、一个或多个胞内共刺激信号转导结构域以及初级信号转导结构域。
上述慢病毒重组载体中，所述胞外结构域选自如下靶抗原的抗体或其抗原结合片段、束缚配体或者共受体的胞外结构域中至少一种：α叶酸受体、5T4、αvβ6整合素、BCMA、B7-H3、B7-H6、CAIX、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、包括ErbB2(HER2)的EGFR家族、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎儿型AchR、FRα、GD2、GD3、磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)、HLA-A1+MAGE1、HLA-A2+MAGE1、HLA-A3+MAGE1、HLA-A1+NY-ESO-1、HLA-A2+NY-ESO-1、HLA-A3+NY-ESO-1、IL-11Rα、IL-13Rα2、λ、Lewis-Y、κ、间皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D配体、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSMA、ROR1、SSX、生存素、TAG72、TEM和VEGFR2；但不限于此；
所述铰链结构域或间隔结构域选自CD8α、CD4、CD45、PD1和CD152的跨膜结构域中的至少一种；但不限于此；
所述跨膜结构域选自CD8、CD4、CD45、PD1和CD152的跨膜结构域中的至少一种；但不限于此；
所述胞内共刺激信号转导结构域选自CD28、CD54(ICAM)、CD134(OX40)、CD137(41BB)、CD152(CTLA4)、CD273(PD-L2)、CD274(PD-L1)和CD278(ICOS)中至少一种；但不限于此；
所述初级信号转导结构域选自CD3ζ的初级信号转导结构域和FcRγ的初级信号转导结构域中至少一种；但不限于此。
上述慢病毒重组载体中，所述抗原特异性结合结构域包括CD19抗体的轻链可变区和CD19抗体的重链可变区；
所述铰链结构域为CD8铰链结构域；
所述跨膜结构域为CD8跨膜结构域；
所述胞内共刺激信号转导结构域为4-1BB；
所述初级信号转导结构域为CD3ζ。
上述慢病毒重组载体中，
所述CD19抗体的轻链可变区的氨基酸序列为序列表中序列3第23-129位；
所述CD19抗体的重链可变区的氨基酸序列为序列表中序列3第148-267位；
所述CD8铰链结构域的氨基酸序列为序列表中序列3第268-307位；
所述CD8跨膜结构域的氨基酸序列为序列表中序列3第308-335位；
所述胞内共刺激信号转导结构域4-1BB的氨基酸序列为序列表中序列3第336-377位；
所述初级信号转导结构域CD3ζ的氨基酸序列为序列表中序列3第378-489位。
上述慢病毒重组载体中，所述CAR结构编码序列的核苷酸序列为序列1第3251-4717位。
在本发明的实施例中，所述慢病毒重组载体为将序列1第2838-5863位的DNA分子同源重组到慢病毒表达载体中，得到表达所述CAR结构；在本发明的实施例中，具体采用的慢病毒表达载体为pDBR载体。本发明实施例中的慢病毒重组载体为慢病毒重组质粒pLV-M19BBz(M19BBz)，其核苷酸序列为序列1。
由上述慢病毒重组载体包装得到的重组病毒也是本发明保护的范围。
上述重组病毒为能够表达序列1第3251-4717位所示的CAR结构，且能够侵染免疫效应细胞的病毒。所述病毒为慢病毒、疱疹病毒、巨噬细胞病毒、EB病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒或艾滋病毒。
含有上述的慢病毒重组载体的重组细胞也是本发明保护的范围。
上述重组细胞为表达上述的慢病毒重组载体的免疫效应细胞；
所述免疫效应细胞为细胞毒性T淋巴细胞、NKT细胞、NK细胞、辅助性T细胞或gammadelta T细胞。
本发明另一个目的是提供一种制备CAR-T细胞的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：将由上述慢病毒重组载体包装得到的重组病毒转染T细胞得到的重组细胞。
本发明还提供了如下应用：
本发明提供了上述的慢病毒重组载体、上述重组病毒或上述重组细胞在制备治疗肿瘤的产品中的应用；
或，本发明提供了上述的慢病毒重组载体、上述重组病毒或上述重组细胞在制备具有治疗肿瘤且低细胞因子风暴功能的产品中的应用。
在不同的实施方案中，本发明提供基因工程化的免疫效应细胞，其包含设计以表达使细胞毒性定向至肿瘤细胞的嵌合抗原受体的载体。这些基因工程化的受体在本文中称作CAR，CAR是这样的分子：将基于对靶抗原(例如肿瘤抗原)特异性的抗体与T细胞受体活化胞内结构域组合，以产生显示出特异性的抗肿瘤细胞免疫活性的嵌合蛋白。本文使用的术语“嵌合的”描述了由不同蛋白的部分组成或者由来自不同来源的DNA组成。
本文考虑的载体包含如MND、EF1α、CMV、PGK等启动子和编码CAR的多核苷酸(包括集落刺激因子信号肽、FMC63单链抗体序列、CD8的绞链区与跨膜区序列、4-1BB共刺激信号域以及CD3ζ信号域以及T2A和tEGFR)。本文考虑的CAR包含与特异性的靶抗原结合的胞外结构域(也被称为结合结构域或者抗原特异性结合结构域)、跨膜结构域和胞内信号转导结构域。CAR的抗原结合结构域与其在靶细胞表面上的靶抗原的结合导致CAR的聚集，并向包含CAR的细胞递送活化刺激。CAR的主要特性是其使免疫效应细胞的特异性重定向的能力，从而引发增殖、细胞因子的产生、吞噬作用或者能够以不依赖主要组织相容性复合物(MHC)的方式介导表达靶抗原的细胞死亡的分子的产生，利用单克隆抗体、可溶性配体或细胞特异性共受体的细胞特异性靶向能力。
本发明的实验证明，本发明为了克服当前CAR T治疗过程中的转染效率低和产生细胞因子量大的缺点，实现显著提升转染率，临床级别细胞生产的工艺开发较容易进行，能够降低制备成本；通过降低细胞表面的CAR分子密度，降低反应的强度，从而降低CRS的发生，使CAR-T治疗更加安全。具体如下：通过改善启动子对CAR结构的启动，即用MND启动子启动CAR结构，制备出新的嵌合抗原受体，并制备表达该嵌合抗原受体的T细胞，该T细胞具有影响CAR分子在细胞表面表达较少的特性，与CD19阳性细胞结合时，有着使细胞杀伤作用较缓和的优点，如此可大大降低细胞因子风暴的发生，有效提高了安全性，同时该制备方法得到的嵌合抗原受体T细胞还具有较高的转导效率，并且能在T细胞表面稳定、持久的表达，如此在与靶细胞表面的抗原结合时，可发挥杀伤靶细胞效应，另外持久的表达还能使其杀伤效果持久；使其对用于治疗癌症的临床上更为安全。
附图说明
图1为不同启动子EF1α和MND的CAR载体构建，(a)使用EF1α启动子的CAR载体图谱；(b)使用MND启动子的CAR载体谱图。
图2为转染效率的测定。
图3为转染效率的测定流式图。
图4为转导E19BBz、M19BBz后的T细胞中CAR分子的表达差异。
图5为利用不同启动子表达CAR的T细胞进行的抗原特异性肿瘤清除以及相对应的实验中CAR-T细胞产生细胞因子的量。
图6为不同启动子下CAR修饰的T细胞在过继性转移之后，在肿瘤模型小鼠中对肿瘤细胞的消退作用。
图7为临床试验中两种CAR-T细胞的转染效率，Relative MFI，T细胞体外培养扩增倍率以及CAR-T体内扩增倍率。
图8为临床试验中患者治疗后出现反应的总结，(a)患者回输后14天内的体温变化；(b)患者治疗后发烧温度的最高值；(c)患者治疗后CRS的级数统计。
图9为采用两种启动子生产的CAR-T细胞，患者治疗后的长期临床结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、慢病毒重组质粒的构建
1、含有MND启动子的慢病毒重组质粒pLV-M19BBz(M19BBz)
含有MND启动子的慢病毒重组质粒pLV-M19BBz(M19BBz)(如图1b)，其核苷酸序列为序列1(全基因合成)，该重组质粒也可以将序列1第2838-5863位的DNA分子同源重组到pDBR载体(Calderón-Gómez,E.,et al.,Reprogrammed quiescent B cells provide aneffective cellular therapy against chronic experimental autoimmuneencephalomyelitis.European Journal of Immunology,2011.41(6):p.1696-1708.)中得到。
其中，序列1第2838-3236位为MND启动子，第3251-3316位为集落刺激因子信号肽编码核酸(氨基酸序列为序列3第1-22位)、第3317-3637位为膜外抗原结合区CD19抗体的轻链可变区VL19编码核酸(氨基酸序列为序列3第23-129位)、第3638-3691位为Linker、第3692-4051位为膜外抗原结合区CD19抗体的重链可变区VH19编码核酸(VH19氨基酸序列为序列3第148-267位；序列1第3317-4051位为FMC63单链抗体编码核酸)，第4052-4171位为CD8铰链区编码核酸(氨基酸序列序列3第268-307位)、第4172-4255位为CD8跨膜区编码核酸(氨基酸序列序列3第308-335位)，第4256-4381位为胞内共刺激信号转导结构域4-1BB编码核酸(氨基酸序列序列3第336-377位)，第4382-4717位为初级信号转导结构域CD3ζ编码核酸(氨基酸序列序列3第378-489位)；第4718-4789位为自切割序列T2A编码核酸(编码氨基酸序列3第490-513位)，第4790-5863位为tEGFR(编码核酸氨基酸序列3第514-870)，慢病毒重组质粒pLV-M19BBz(M19BBz)表达car结构(序列3第1-489位)。
2、含有EF1α启动子的慢病毒重组质粒pLV-E19BBz(E19BBz)
含有EF1α启动子的慢病毒重组质粒pLV-E19BBz(E19BBz)(如图1a)，其核苷酸序列为序列2，该重组质粒为将序列1第2838-3236位为MND启动子替换为启动子EF1α(序列2第2838-4131位为启动子EF1α)，且其余核苷酸序列不变，得到的片段。
上述重组载体按照如下方法制备：分别克隆合成启动子序列和CAR的多核苷酸序列，设计引物通过重叠PCR将其两部分进行连接，将上述序列拼接成功后，克隆到pDBR的载体上(GenBank:FR822201.1)，构建出pLV-E19BBz。通过序列合成与克隆的方式，将pLV-E19BBz(E19BBz)的启动子EF1α更换为MND，命名为pLV-M19BBz(M19BBz)。载体各部分元件如图1所示。
实施例2、CAR T细胞的制备
一、CAR T细胞的制备
1、慢病毒重组质粒的包装
分别将慢病毒重组质粒pLV-E19BBz(E19BBz)和pLV-M19BBz(M19BBz)进行包装，分别得到对应的慢病毒颗粒。具体步骤如下：
(1)将已长到80％-90％的293FT细胞(赛业(广州)HEKFT-30001)培养瓶(T175)从37℃、5％CO2的细胞培养箱中取出，消化后收集洗涤细胞，每10cm细胞培养皿中加入4.5×106个细胞和9mL DMEM完全培养基(购于Gibco公司，产品目录号11965-084)，轻轻摇匀，放入37℃、5％CO2培养箱中培养。第2天，每个培养皿加入如下试剂：500μL buffer(购于Polyplus Transfection公司，产品目录号B161116)、6μg实施例1制备的慢病毒重组质粒pLV-E19BBz(E19BBz)或pLV-M19BBz(M19BBz)、3μg psPAX2(购于武汉淼灵生物科技有限公司，产品目录号P026)和1.5μg pMD2.G(购于广州吉赛生物科技股份有限公司，产品目录号161220L08)，混合均匀，然后再向体系中加入(购于Polyplus Transfection公司，产品目录号114-15)，25μL/10cm培养皿，再次混合均匀，室温静置10min，得到混合液。
(3)将用于包装病毒的293FT细胞从37℃、5％CO2的细胞培养箱中取出，将混合液平均加到每个培养皿中，轻轻摇匀，放入37℃、5％CO2培养箱中继续培养。培养4h后，弃旧培养基，加入5mL已预热的PBS清洗细胞，再加入9mL新鲜的已预热的含10％(体积分数)FBS的DMEM完全培养基，放入37℃、5％CO2培养箱中培养。
(4)继续培养48-72h后收取培养上清作为病毒原液，并将收集的病毒原液用0.45μm过滤器过滤到50mL离心管中，4℃、18500g高速离心2h。弃上清液，向沉淀中加入DMEM完全培养基(加入的培养基与病毒原液的体积比为1:500)重悬病毒颗粒，此即为病毒浓缩液。
(5)将病毒浓缩液按200μL/管分装，另外留取10μL进行病毒滴度测定。将分装好的浓缩液置于-80℃冰箱保存，得到E19BBz病毒和M19BBz病毒。
检测病毒滴度，E19BBz病毒和M19BBz病毒的滴度分别为2.6X108/ml与4.3X108/ml。
检测利用p24的ELISA试剂盒(TAKARA,632200)定量(4)得到的E19BBz病毒原液和M19BBz病毒原液，结果如图2b所示，可以看出，M19BBz病毒原液的p24量大于E19BBz病毒原液。
2、T细胞的分选
(1)将健康供者新鲜外周血样本转移至离心管中，用等体积的0.9％生理盐水稀释并混合均匀；
(2)将15ml淋巴细胞分离液(东方华辉；25710)置入新的离心管中，随后将2倍体积(即30ml)步骤(1)中稀释的血样缓慢加到淋巴细胞分离液上层，进行离心，离心参数为2000rpm，20min，升7降4，25℃；
(3)离心结束后，会分为四层：稀释的血浆层、单核细胞层、淋巴细胞分离液层以及红细胞层，将单核细胞层转移至新的离心管中，并用生理盐水洗涤；
(4)将步骤(3)中得到的单核细胞用试剂盒进行CD3+ T细胞的纯化(美天旎：130-050-101)。
3、慢病毒颗粒转染靶细胞制备嵌合抗原受体T细胞
(5)取纯化后1×107的CD3+ T细胞铺培养瓶，同时加入CTS CD3/CD28Dynabeads(Gibco：40203D)刺激活化培养；
(6)培养的第二天，在室温下向有CD3+ T细胞的培养瓶中加入一定量的上述1步骤(5)制备的E19BBz病毒或M19BBz病毒(MOI分别为0.25、0.5、1、2、4、8)，随后将培养瓶放至在离心机中，在2000rpm，2h，升4降4，35℃离心参数下进行离心以完成慢病毒转导，得到不同MOI的M19BBz的CAR T细胞和不同MOI的E19BBz的CAR T细胞；
(7)培养的第三天对培养瓶中的细胞进行半量补液(加入含200IU IL-2的TexMACS(美天旎：130-097-748与170-076-309))；
(8)培养的第五天，采用流式细胞仪检测嵌合抗原受体在T细胞中的表达情况；
(9)继续扩大培养，在培养的第十二天时，采用流式细胞术进行转导率检测；
(10)继续培养至14天，收集细胞，完成嵌合抗原受体T细胞制备。
二、CAR T细胞的鉴定检测
1、转导率检测
将上述一中的(8)步骤培养的第五天的细胞进行流式细胞术检测，其中，通过CD4-FITC(Biolegend；357405)、7AAD(Biolegend；420403)检测转导率。
不同MOI值的转导率结果如图2a所示，可以看出，M19BBz的T细胞转导率较E19BBz高。
不同MOI值的阳性CAR+的细胞百分比(代表转导率)结果如图2c所示，可以看出，等量的T细胞分别转导不同MOI的E19BBz病毒与M19BBz病毒，检测转导率后发现E19BBz转导率无法像M19BBz一样随著MOI的提高，而有相应的转导率增加。表明，M19BBz的T细胞转导率较E19BBz高。
图3为MOI值为0.25的代表图，可以看出M19BBz的T细胞转导率较E19BBz高。
2、检测CAR分子表达
将上述一中的(8)步骤培养的第五天的细胞(MOI值为0.5)进行流式细胞术检测，通过生物素化的Erbitux(anti-EGFR单抗，默克：爱必妥)与SA-PE(Biolegend:405204)或SA-APC(Biolegend:405207)检测tEGFR表达，以及用抗原CD19Fc-FITC(ACRO：P15391-1)和FMC63scFv(Bioswan:019-01-647M)的特异性抗体检测CAR分子表达。以未转导的T细胞作为对照。
结果如图4a所示，可以看出，使用不同的启动子均可以使CAR正常表达；tEGFR分子的确与CAR分子共表达，且表达效率成正相关。
进一步分析流式结果的平均萤光强度(Mean Fluorescence Intensity,MFI)(流式分析软件可以直接产生MFI数据)。
结果如图4b所示：检测tEGFR的表达(EGFR)，表达M19BBz的CAR T细胞表面上tEGFR的相对MFI值(阳性细胞MFI/阴性细胞MFI)(12.19±1.30)较表达E19BBz的CAR T细胞(10.47±1.16)略高，但两者的差异约为16％。通过检测tEGFR，显示二者之间的表达无明显差异。
在检测CAR分子的表达上，用CD19Fc检测时，表达E19BBz的CAR T细胞与表达M19BBz的CAR T细胞的相对MFI(4.37±0.59vs 1.13±0.08)，两者的差异是-74％。用FMC63scFv抗体检测时，E19BBz与M19BBz的相对MFI(2.26±0.37vs 1.24±0.07)，两者的差异是-46％；两种抗体检测都显示了，CAR分子在E19BBz表面表达量较高。
实施例3、嵌合抗原受体T细胞的体外功能性实验测定
1、杀伤和细胞因子的检测
A.特异性杀伤效率检测
将实施例2的一的3制备的M19BBz的CAR T细胞(MOI值为0.25)和E19BBz的CAR T细胞(MOI值为0.25)分别各自与三种不同的肿瘤靶细胞(NALM-6、Raji、697：依序为广州赛库生物：B系急性淋巴细胞白血病CC1928；ATCC：Burkitt’s淋巴瘤细胞CCL86；上海宾穗：人前B细胞白血病细胞系BSC-5209479641-01)共培养，具体如下：
实验组：靶细胞先用1mg/ml的钙黄绿素(Calcein-AM,Invitrogen,C3099)染色后，在200ul的细胞培养基(RPMI 1640,Gibco,22400-089+10％FBS ExCell Bio,FND500)中，靶细胞加入2X10^4，每种CART细胞各加入2X10^5，37度培养四小时后，检测上清液中释放的钙黄绿素(用酶标仪Multiskan Sky检测，检测条件激发波长490nm，发射波长515nm。)。
自发释放组：靶细胞在相同时间后直接检测上清，该组数值为自发释放萤光；
完全释放组：靶细胞加入2％Triton X-100每孔100μl，在相同时间后后直接检测上清，该数值为完全释放组。
特异性杀伤效率(％)＝(实验组荧光值-自发释放组荧光值)/(完全释放组荧光值-自发释放组荧光值)×100％
结果如图5a所示，可以看出在NAML-6与697两种细胞系中，E19BBz的CAR T细胞与M19BBz的CAR T细胞的杀伤能力没有显著差异，而在Raji细胞系上，M19BBz的CAR T细胞较E19BBz的CAR T细胞为高。结合实施例2的结果，显示M19BBz的CAR T细胞的CAR-T细胞表面的CAR分子数虽然减少了，但是对于肿瘤细胞的杀伤能力，并未随之降低。
B.细胞因子风暴检测
在200ul的细胞培养基(RPMI 1640,Gibco,22400-089+10％FBS ExCell Bio,FND500)中，靶细胞加入2X10^4，CART细胞加入6X10^4，37度培养20小时后，取上清液用BioLegend LEGENDplex#740118进行细胞因子检测。
结果如图5b和5c所示，发现M19BBz的CAR T细胞中的细胞因子TNFα和IFNγ的表达量比E19BBz的CAR T细胞显著降低，结合图5a的结果，说明M19BBz的CAR T细胞能在不降低肿瘤杀伤能力的情况下，相比E19BBz的CAR T细胞更加的安全，有效降低细胞因子风暴。
2、动物实验检测体内杀瘤效果
采用NOD-SCID小鼠来建立Raji-luciferase的肿瘤模型，此模型的构建是通过输注含有luc(荧光素酶)标记的Raji人B细胞淋巴瘤细胞(由亦康(北京)医药科技有限公司提供)，将处于对数生长期的肿瘤细胞通过小鼠尾静脉注射进到小鼠血管内构建，具体如下：
用PBS将Raji-luciferase的肿瘤模型细胞制备成浓度为1x107/ml的细胞悬液，通过尾静脉接种至小鼠体内，100μl/鼠；每只小鼠接种1×106细胞，第三天老鼠会注射luciferin，麻醉后在设备(IVIS Lumina,Series III,PE)上进行萤光强度检测，检测后筛选荧光强度一致的小鼠再进行随机分组并给药(每组六只)。
对照组(no treatment)：注射200μl含2％(质量体积百分含量，单位为g/ml)人类白蛋白(河北大安制药有限公司，国药准字S200443042)的生理盐水；
M19BBz组(CART M19BBz)：注射200μl含有5×106M19BBz的CAR T细胞(MOI值为0.25)的溶液(根据转染率换算总细胞数，并将细胞重悬于含2％人类白蛋白的生理盐水中)；
E19BBz组(CART E19BBz)：注射200μl含有5×106E19BBz的CAR T细胞(MOI值为0.25)的溶液(根据转染率换算总细胞数，并将细胞重悬于含2％人类白蛋白的生理盐水中)；
每隔七天量测一次发光信号，并观察小鼠存活情况。
测定分析的结果如图6所示，(a)：使用体内成像系统，检测对比未治疗组、E19BBz和M19BBz治疗之后肿瘤负荷；(b)(纵坐标是平均光强度代表肿瘤负荷量)：对a图进行量化处理，并进行统计学分析；M19BBz的CAR T细胞的小鼠体内杀瘤效果明显优于E19BBz的CART细胞，并且具有统计学上的差异。
3、临床水平上的实验测定
通过临床实验结果，来统计产品质量与安全性。难治复发的急性B细胞白血病患者，经过医师筛选后由患者代表签署知情同意，入组进行临床试验，在医院内采集白细胞后进行细胞生产。
表1入组详情
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白细胞按照实施例1的一的3的方法，分别制备了多批次的M19BBz的CAR T细胞(某一批次MOI值为1)和E19BBz的CAR T细胞(某一批次MOI值为1)(各为不同批次细胞)，在第十四天回输前CAR-T细胞进行流式细胞术检测转导率(通过生物素化的Erbitux(anti-EGFR单抗，默克：爱必妥)与SA-PE(Biolegend:405204)或SA-APC(Biolegend:405207)检测tEGFR表达)，以及MFI数值。患者在医院进行回输后留院观察直到出院，住院时每日监测体温变化并观察反应，并根据对应状况进行对症治疗，在固定时间检测外周血，计算CAR-T细胞扩增情况。治疗后14-28日进行治疗效果的早期评估。
结果如图7a和7b所示，可以看出，E19BBz的转导率平均较M19BBz低。而tEGFR相对萤光强度，在这两种结构中都没有显著差异。说明在进行临床细胞制备时，两种病毒的转导率与tEGFR的表达情况和先前体外功能结果相符。
体外培养时计算收获细胞数量后，统计培养扩增倍数(图7c)，以及细胞在体内扩增后最大数值与起始回输剂量的倍数(图7d)，都显示E19BBz和M19BBz没有显著统计差异。
但是在观察两组受试者每日的体温变化情况，M19BBz的平均体温上升较缓(图8a)，发烧温度的最高数值也较低(图8b)，发生2级以上CRS的比例也较低(图8c)。对患者进行长期随访后，M19BBz的总体生存期与E19BBz并没有显著差异(图9)，代表副反应较和缓的M19BBzCAR-T细胞在治疗效果上与E19BBz相似。
总结而言，通过更换启动子，可以改变CAR-T细胞表面的嵌合抗原受体数量，进一步调整产品的安全性降低细胞因子风暴，提供更安全的产品。
SEQUENCE LISTING
<110>河北森朗生物科技有限公司
<120>一种能高效制备且应用安全的嵌合抗原受体T细胞及其制备方法与应用
<160>3
<170>PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 8953
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
acaccccttg tattactgtt tatgtaagca gacagtttta ttgttcatga ccaaaatccc 60
ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta gaaatccgcg cacatttccc 120
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acaggatatc tgtggtaagc agttcctgcc ccggctcagg gccaagaaca gttggaacag 3000
cagaatatgg gccaaacagg atatctgtgg taagcagttc ctgccccggc tcagggccaa 3060
gaacagatgg tccccagatg cggtcccgcc ctcagcagtt tctagagaac catcagatgt 3120
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tcgcttctcg cttctgttcg cgcgcttctg ctccccgagc tcaataaaag agcccattaa 3240
ttaagccacc atgctgctgc tggtgaccag cctgctgctg tgcgagctgc cccaccccgc 3300
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ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga 8640
ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg 8700
gctacactag aagaacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa 8760
aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg 8820
tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt 8880
ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagat 8940
tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct 9000
aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca gctagaaaaa ctcatcgagc atcaaatgaa 9060
actgcaattt attcatatca ggattatcaa taccatattt ttgaaaaagc cgtttctgta 9120
atgaaggaga aaactcaccg aggcagttcc ataggatggc aagatcctgg tatcggtctg 9180
cgattccgac tcgtccaaca tcaatacaac ctattaattt cccctcgtca aaaataaggt 9240
tatcaagtga gaaatcacca tgagtgacga ctgaatccgg tgagaatggc aaaagtttat 9300
gcatttcttt ccagacttgt tcaacaggcc agccattacg ctcgtcatca aaatcactcg 9360
catcaaccaa accgttattc attcgtgatt gcgcctgagc gagacgaaat acgcgatcgc 9420
tgttaaaagg acaattacaa acaggaatcg aatgcaaccg gcgcaggaac actgccagcg 9480
catcaacaat attttcacct gaatcaggat attcttctaa tacctggaat gctgttttcc 9540
cagggatcgc agtggtgagt aaccatgcat catcaggagt acggataaaa tgcttgatgg 9600
tcggaagagg cataaattcc gtcagccagt ttagtctgac catctcatct gtaacatcat 9660
tggcaacgct acctttgcca tgtttcagaa acaactctgg cgcatcgggc ttcccataca 9720
atcgatagat tgtcgcacct gattgcccga cattatcgcg agcccattta tacccatata 9780
aatcagcatc catgttggaa tttaatcgcg gcctagagca agacgtttcc cgttgaatat 9840
ggctcata 9848
<210>3
<211> 870
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400>3
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser
20 25 30
Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser
35 40 45
Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly
50 55 60
Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val
65 70 75 80
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr
85 90 95
Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln
100 105 110
Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
115 120 125
Thr Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser
130 135 140
Thr Lys Gly Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala
145 150 155 160
Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu
165 170 175
Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu
180 185 190
Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser
195 200 205
Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln
210 215 220
Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr
225 230 235 240
Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr
245 250 255
Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Pro Ala Pro
260 265 270
Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu
275 280 285
Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
290 295 300
Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly
305 310 315 320
Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys
325 330 335
Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg
340 345 350
Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro
355 360 365
Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser
370 375 380
Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu
385 390 395 400
Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg
405 410 415
Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln
420 425 430
Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr
435 440 445
Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp
450 455 460
Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala
465 470 475 480
Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Leu Glu Gly Gly Gly Glu Gly
485 490 495
Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro
500 505 510
Arg Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His
515 520 525
Pro Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile
530 535 540
Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His
545 550 555 560
Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val
565 570 575
Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln
580 585 590
Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu
595 600 605
Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn
610 615 620
Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu
625 630 635 640
Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys
645 650 655
Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys
660 665 670
Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln
675 680 685
Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr
690 695 700
Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro
705 710 715 720
Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu
725 730 735
Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val
740 745 750
Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala
755 760 765
Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys
770 775 780
Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly
785 790 795 800
Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly
805 810 815
His Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly
820 825 830
Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile
835 840 845
Ala Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu
850 855 860
Gly Ile Gly Leu Phe Met
865 870

Claims (10)

1.慢病毒重组载体，其含有CAR结构和驱动所述CAR结构表达的启动子MND；
所述启动子MND的核苷酸序列为序列1第2838-3236位；
所述CAR结构依次包括胞外结合结构域、一个或多个铰链结构域或间隔结构域、跨膜结构域、一个或多个胞内共刺激信号转导结构域以及初级信号转导结构域。
2.根据权利要求1所述的慢病毒重组载体，其特征在于：
所述胞外结构域选自如下靶抗原的抗体或其抗原结合片段、束缚配体或者共受体的胞外结构域中至少一种：α叶酸受体、5T4、αvβ6整合素、BCMA、B7-H3、B7-H6、CAIX、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、包括ErbB2(HER2)的EGFR家族、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎儿型AchR、FRα、GD2、GD3、磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)、HLA-A1+MAGE1、HLA-A2+MAGE1、HLA-A3+MAGE1、HLA-A1+NY-ESO-1、HLA-A2+NY-ESO-1、HLA-A3+NY-ESO-1、IL-11Rα、IL-13Rα2、λ、Lewis-Y、κ、间皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D配体、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSMA、ROR1、SSX、生存素、TAG72、TEM和VEGFR2；
所述铰链结构域或间隔结构域选自CD8α、CD4、CD45、PD1和CD152的跨膜结构域中的至少一种；
所述跨膜结构域选自CD8、CD4、CD45、PD1和CD152的跨膜结构域中的至少一种；
所述胞内共刺激信号转导结构域选自CD28、CD54(ICAM)、CD134(OX40)、CD137(41BB)、CD152(CTLA4)、CD273(PD-L2)、CD274(PD-L1)和CD278(ICOS)中至少一种；
所述初级信号转导结构域选自CD3ζ的初级信号转导结构域和FcRγ的初级信号转导结构域中至少一种。
3.根据权利要求1或2所述的慢病毒重组载体，其特征在于：
所述抗原特异性结合结构域包括CD19抗体的轻链可变区和CD19抗体的重链可变区；
所述铰链结构域为CD8铰链结构域；
所述跨膜结构域为CD8跨膜结构域；
所述胞内共刺激信号转导结构域为4-1BB；
所述初级信号转导结构域为CD3ζ。
4.根据权利要求3所述的慢病毒重组载体，其特征在于：
所述CD19抗体的轻链可变区的氨基酸序列为序列表中序列3第23-129位；
所述CD19抗体的重链可变区的氨基酸序列为序列表中序列3第148-267位；
所述CD8铰链结构域的氨基酸序列为序列表中序列3第268-307位；
所述CD8跨膜结构域的氨基酸序列为序列表中序列3第308-335位；
所述胞内共刺激信号转导结构域4-1BB的氨基酸序列为序列表中序列3第336-377位；
所述初级信号转导结构域CD3ζ的氨基酸序列为序列表中序列3第378-489位。
5.根据权利要求1-4中任一所述的慢病毒重组载体，其特征在于：
所述CAR结构的核苷酸序列为序列1第3251-4717位；
所述慢病毒重组载体为将序列1第2838-5863位的DNA分子同源重组到慢病毒表达载体中，得到表达所述CAR结构。
6.根据权利要求5所述的慢病毒重组载体，其特征在于：
所述慢病毒表达载体为pDBR载体；
所述慢病毒重组载体的核苷酸序列为序列1。
7.由权利要求1-6中任一所述的慢病毒重组载体包装得到的重组病毒。
8.含有权利要求1-6中任一所述的慢病毒重组载体的重组细胞。
9.根据权利要求8所述的重组细胞，其特征在于：所述重组细胞为表达权利要求1-6中任一所述的慢病毒重组载体的免疫效应细胞；
所述免疫效应细胞为细胞毒性T淋巴细胞、NKT细胞、NK细胞、辅助性T细胞或gammadelta T细胞。
10.一种制备CAR-T细胞的方法，包括如下步骤：将由权利要求1-6中任一所述的慢病毒重组载体包装得到的重组病毒转染T细胞得到的重组细胞；
或，权利要求1-6中任一所述的慢病毒重组载体、权利要求7所述重组病毒或权利要求8或9所述重组细胞在制备治疗肿瘤的产品中的应用；
或，权利要求1-6中任一所述的慢病毒重组载体、权利要求7所述重组病毒或权利要求8或9所述重组细胞在制备具有治疗肿瘤且低细胞因子风暴功能的产品中的应用。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111315402A (zh) * 2017-08-15 2020-06-19 艾达普特免疫有限公司 T细胞修饰

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10774343B2 (en) * 2014-04-25 2020-09-15 Bluebird Bio, Inc. MND promoter chimeric antigen receptors
AU2015292590B2 (en) 2014-07-24 2020-01-16 2Seventy Bio, Inc. BCMA chimeric antigen receptors

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106536549A (zh) * 2014-04-25 2017-03-22 蓝鸟生物公司 Mnd启动子嵌合抗原受体
WO2018170390A1 (en) * 2017-03-17 2018-09-20 Senti Biosciences, Inc. Immunomodulating cell circuits
WO2018191619A1 (en) * 2017-04-13 2018-10-18 Senti Biosciences, Inc. Combinatorial cancer immunotherapy
CN109311984A (zh) * 2016-03-11 2019-02-05 蓝鸟生物公司 基因组编辑的免疫效应细胞
CN109415687A (zh) * 2016-04-07 2019-03-01 蓝鸟生物公司 嵌合抗原受体t细胞组合物
WO2019118937A1 (en) * 2017-12-15 2019-06-20 Juno Therapeutics, Inc. Anti-cct5 binding molecules and methods of use thereof

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
LT3230321T (lt) * 2014-12-12 2019-12-10 Bluebird Bio Inc Bcma chimeriniai antigeno receptoriai
EP3714042A4 (en) * 2017-11-22 2021-08-04 La Jolla Institute for Allergy and Immunology USE AND PRODUCTION OF MODIFIED IMMUNE CELLS

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106536549A (zh) * 2014-04-25 2017-03-22 蓝鸟生物公司 Mnd启动子嵌合抗原受体
CN109311984A (zh) * 2016-03-11 2019-02-05 蓝鸟生物公司 基因组编辑的免疫效应细胞
CN109415687A (zh) * 2016-04-07 2019-03-01 蓝鸟生物公司 嵌合抗原受体t细胞组合物
WO2018170390A1 (en) * 2017-03-17 2018-09-20 Senti Biosciences, Inc. Immunomodulating cell circuits
WO2018191619A1 (en) * 2017-04-13 2018-10-18 Senti Biosciences, Inc. Combinatorial cancer immunotherapy
WO2019118937A1 (en) * 2017-12-15 2019-06-20 Juno Therapeutics, Inc. Anti-cct5 binding molecules and methods of use thereof

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CALDERÓN-GÓMEZ,E.等: "Reprogrammed quiescent B cells provide an effective cellular therapy against chronic experimental autoimmune encephalomyelitis", 《EUROPEAN JOURNAL OF IMMUNOLOGY》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111315402A (zh) * 2017-08-15 2020-06-19 艾达普特免疫有限公司 T细胞修饰
CN111315402B (zh) * 2017-08-15 2024-05-07 艾达普特免疫有限公司 T细胞修饰

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